Αφηρημένο

Παρά τις βιοδείκτες με βάση το αίμα που χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση ασθενών με καρκίνο του προστάτη, ο καρκίνος του προστάτη παραμένει ως η δεύτερη συχνότερη αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες. Αυτό οφείλεται στην έλλειψη κατανόησης των μοριακών οδών που είναι υπεύθυνες για τις επιθετικές μορφές καρκίνου του προστάτη, του ευνουχισμού ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη και του μεταστατικό καρκίνο του προστάτη σε μεγάλο βαθμό. Κυτταρική σηματοδότηση μονοπατιών που ενεργοποιούνται από το

ΕΚΒΒ2

ογκογονιδίου ή το

RAS

ογκογονίδιο είναι συχνά βρέθηκε να μεταβάλλεται σε μεταστατικούς καρκίνους του προστάτη. Να αξιολογήσει και να καθορίσει το ρόλο του συμπλέγματος ErbB2 /RAS μονοπάτι στη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη, έχουμε αξιολογήσει τον αντίκτυπο των

ΕΚΒΒ2

– ή

RAS

-overexpression στις μεταστατικό δυναμικό για καρκινικό κύτταρο τέσσερις προστάτη γραμμές που προέρχονται από όγκους με διαφορετικές ευαισθησίες ανδρογόνων. Για να γίνει αυτό, θα επιμολυνθεί την ανθρώπινη DU145, LnCaP, και καρκινικά κύτταρα προστάτη PC3 και τα μυϊκά Myc-Cap καρκινικών κυττάρων του προστάτη με την ενεργοποιημένη μορφή του

ΕΚΒΒ2

ή

H-RAS

και να αξιολογούνται μεταστατικό δυναμικό τους με τρία συμπληρωματικά δοκιμασίες, μία δοκιμασία επούλωσης πληγών, μία δοκιμασία Transwell κινητικότητα, και μια δοκιμασία transwell εισβολή. Δείξαμε ότι ενώ η υπερέκφραση του

ERBB2

αύξησε την μεταστατικό δυναμικό των ανδρογόνων-insensitive κύτταρα καρκίνου προστάτη (δηλαδή PC3 και DU145), αυτό δεν επηρέασε μεταστατικό δυναμικό των ανδρογόνων ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα προστάτη (δηλαδή LnCaP και myc-Cap). Σε αντίθεση, η υπερέκφραση του

H-RAS

αυξήθηκε μόνο το κύτταρο κινητικότητα των κυττάρων Myc-Cap, που υπερεκφράζουν την ανθρώπινη

c-myc

ογκογονίδιο. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ΕΚΒΒ2 συνεργάζεται με ανδρογόνων σηματοδότησης για την προώθηση του προστάτη μετάσταση του καρκίνου, και ότι αν και RAS είναι ένα από τα κρίσιμα κατάντη δράστες του ErbB2, δεν phenocopy ΕΚΒΒ2 για τις επιπτώσεις της στα μεταστατικό δυναμικό του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών σειρών.

Παράθεση: Tome-Garcia J, Li D, Ghazaryan S, Shu L, Wu L (2014) ΕΚΒΒ2 Αυξάνει Μεταστατικό Δυναμικά Συγκεκριμένα σε κύτταρα ανδρογόνων-αναίσθητος καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (6): e99525. doi: 10.1371 /journal.pone.0099525

Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, Κίνα

Ελήφθη: 11 του Απρίλη 2014? Αποδεκτές: 15 Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 17 του Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Tome-Garcia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. είναι διαθέσιμα στο χαρτί όλα τα δεδομένα

Χρηματοδότηση:. Start-up κεφάλαια από το Rutgers του New Jersey Medical School. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μη-δερματικό καρκίνο και η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας καρκίνου στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Παρά την αυξημένη προσυμπτωματικού ελέγχου για την έγκαιρη διάγνωση και την παρακολούθηση, προστάτη ειδική θνησιμότητα λόγω καρκίνου παρέμεινε στο ίδιο επίπεδο [2]. Αυτό είναι πιθανό να οφείλεται τόσο η ανικανότητα διαγνωστικά διάκριση μεταξύ των μη επεμβατική, νωχελικός εντοπισμένο καρκίνοι του προστάτη και των πολύ επιθετική εντοπισμένη καρκίνους με υψηλού μεταστατικού δυναμικού, και η κακή κατανόηση της κυτταρικής και μοριακής βάσης για μεταστατικούς καρκίνους του προστάτη [3].

Ένα από τα καλύτερα μελετημένα γονίδια στο ανθρώπινο κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, είναι η

ΕΚΒΒ2

ή

HER2

ή

NEU

ογκογονίδιο. ERBB2 είναι ένα μέλος της οικογένειας υποδοχέων του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), το οποίο αποτελείται από τέσσερα μέλη (EGFR, erbB2, erbB3 και erbB4) που δρουν ως υποδοχείς κινάσης τυροσίνης [4] – [7]. Θεωρούνται ως ισχυροί μεσολαβητές της κυτταρικής ανάπτυξης και της ανάπτυξης του καρκίνου [8] – [10]. Στον καρκίνο του μαστού, ενίσχυση ή υπερέκφραση του

ERBB2

είναι ένα κοινό συμβάν που εμφανίζεται στο 15-30% όλων των δειγμάτων [11], και

ERBB2

γονιδιακή ενίσχυση και /ή υπερέκφραση έχουν συσχετισθεί με μια φτωχή κλινική έκβαση [12], [13]. Συνεπής με σημαντικό ρόλο του ErbB2 στην μετάσταση του καρκίνου του μαστού, η υπερέκφραση ενός ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένη μορφή του

ERBB2

(δηλαδή

NeuT

) [14] σε ποντίκια είναι επαρκής για να προκαλέσει μεταστατικών όγκων του μαστού [15 ]. Ωστόσο, το δυναμικό ρόλο του ErbB2 στην ανάπτυξη του μεταστατικό καρκίνο του προστάτη είναι ασαφής εν μέρει επειδή διάφορες προσπάθειες για την εκτίμηση της συχνότητας των

ERBB2

ενίσχυση /υπερέκφραση σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου προστάτη απέδωσε αντιφατικά αποτελέσματα [16] – [25]. Είναι ενδιαφέρον,

ΕΚΒΒ2

υπερέκφραση έχει εμπλακεί σε μεταστατικούς καρκίνους του προστάτη ανδρογόνο-ανθεκτική [26], γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή ρόλο για ΕΚΒΒ2 στην απόκτηση του μεταστατικού δυναμικού των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Η υπερέκφραση του

ERBB2

αποτελέσματα στην επαγωγή διαφόρων οδών σηματοδότησης, όπως η κινάση φωσφοϊνοσιτιδίου-3-κινάση /πρωτεΐνη Β (ΡΙ3Κ /ΑΚΤ) οδό και η ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση (ΜΑΡΚ) [27]. Τόσο η ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού και η οδός ΜΑΡΚ ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων, και έχουν εμπλακεί σε μετάσταση καρκίνου [28] – [30]. Ο κύριος καθοδικός τελεστής του ErbB2 που ρυθμίζει τις δύο αυτές οδούς κινάσης είναι το ογκογόνο

RAS

, αν ΕΚΒΒ2 είναι επίσης σε θέση να ενεργοποιήσει PI3K /AKT ανεξάρτητα από το

RAS

ενεργοποίησης [31]. Είναι σημαντικό, PI3K /AKT και ΜΑΡΚ είναι οι μόνες οδούς RAS-τελεστές συνήθως μεταλλαγμένα σε καρκίνους του ανθρώπου [32].

RAS

ογκογονίδια κωδικοποιούν τρία μονομερή GTPases, H-RAS, Ν-RAS, και K-RAS, τα οποία ενεργοποιούνται όταν δεσμεύεται σε GTP. Ενώ η αναστολή της

RAS

σε ανδρογόνα ανεξάρτητο καρκίνο του προστάτη PC3 κύτταρα και εξαρτώμενων από ανδρογόνα LnCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη οδήγησε σε διακοπή αύξησης και απόπτωση [33], συστατική ενεργοποίηση του /ΜΑΡΚ μονοπάτι RAS σε LnCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη προωθείται ανδρογόνων υπερευαισθησίας [34]. Επιπλέον, ανοσοϊστοχημική ανάλυση της ορμονικά ευαίσθητο και ορμόνες πυρίμαχων δείγματα καρκίνου του προστάτη έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση του

N-RAS

συνδέθηκε με ορμόνες πυρίμαχο καρκίνους του προστάτη, και συσχετίστηκε με μικρότερο χρόνο για υποτροπή του όγκου και μειωμένο ασθένεια-ειδικές επιβίωση [35]. Σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, η ενεργοποίηση του δύο οδούς τελεστή RAS,

Raf /ERK

και

RalGEF

, στην μέτρια μεταστατικό DU145 καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή προωθείται μετάσταση στον εγκέφαλο και τα οστά, αντίστοιχα [ ,,,0],36]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έναν πιθανό ρόλο της RAS στην προώθηση της μετάστασης σε ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη.

Για να καθορίσει περαιτέρω τους πιθανούς ρόλους του ΕΚΒΒ2 /RAS μονοπάτι για την προώθηση της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη, έχουμε εξετάσει τις επιδράσεις της υπερέκφρασης της

ERBB2

ή

RAS

στις μεταστατικές ιδιότητες των τριών ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών καρκίνου του προστάτη και έναν προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή ποντικού με διάφορα επίπεδα ανδρογόνων και ευαισθησίες διαφορετικές μεταστατικό δυναμικό. Για να γίνει αυτό, επιμολύναμε πρώτα τρία που χρησιμοποιούνται συνήθως ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη (DU145, LnCaP και PC3) και μία προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή ποντικού (Myc-CAP) με την ενεργοποιημένη μορφή του

ERBB2

ή

H-RAS

. Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν τα μεταστατικά δυναμικά των γενετικώς τροποποιημένων κυττάρων με τρεις διαφορετικές συμπληρωματικές δοκιμασίες, μία δοκιμασία επούλωσης πληγών, μία δοκιμασία Transwell κινητικότητα, και μία δοκιμασία εισβολή. Βρήκαμε ότι, ενώ η υπερέκφραση του

ΕΚΒΒ2

αυξημένο μεταστατικό δυναμικό ειδικά για ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη ανδρογόνα-ευαίσθητο, η υπερέκφραση του

RAS

δεν έχουν παρόμοιες επιπτώσεις στο μεταστατικό δυναμικό αλλά ειδικά αυξημένη κυτταρική κινητικότητα των

κύτταρα c-myc

υπερεκφράζουν ποντικού Myc-Cap.

Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

Myc-Cap είναι ένας μη μεταστατικό, ανδρογόνων ευαίσθητου ποντικού καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή που καθιερώθηκε από πρωτογενείς όγκους του προστάτη που απομονώνονται από το

Pb-Hi-Μγο

ποντικούς [37]. LnCaP [38], DU145 [39], και PC3 [40] είναι τρία ανθρώπινα μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές με διαφορετικές ευαισθησίες ανδρογόνων και διαφορετικές μεταστατικές ιδιότητες (Πίνακας 1). LnCaP και κυτταρικές σειρές PC3 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640, και τα κύτταρα Myc-cap αναπτύχθηκαν σε DMEM. Αμφότερα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). κύτταρα DU145 διατηρήθηκαν σε DMEM: μέσου Ham F12 (1:01) συμπληρωμένο με 10% ορό νεογέννητου μοσχαριού. κύτταρα Αμφοτροπικά Phoenix χρησιμοποιήθηκαν για ρετροϊική επιμόλυνση και διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 12,5% FBS. Γηρασμένα BJ κύτταρα ινοβλαστών ανθρώπινου δέρματος παρήχθησαν από την κυτταρική γήρανση [41] και χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για δοκιμασία δραστικότητας β-γαλακτοσιδάσης. Αυτά διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε επωαστήρα με υγρασία στους 37 ° C με 5% CO

2.

Η

ρετροϊικοί Επιμόλυνση

Οι ρετροϊικοί φορείς υπερέκφραση

pBabe-πουρομυκίνη Η- Ras

και

pBabe-πουρομυκίνης-ΕΛΒ2

, η οποία υπερεκφράζουν μία μεταλλαγμένη μορφή της ανθρώπινης

H-RAS

γονίδιο (

H-RAS

G12V

) και μια συστατική ενεργοποιημένη μορφή της ανθρώπινης

ΕΚΒΒ2

γονίδιο (

NeuT

), αντίστοιχα, ήταν δώρα από τον Dr. Gustavo Λεόνε. ιοί υψηλού τίτλου παρήχθησαν με φωσφορικό ασβέστιο παροδική επιμόλυνση των ρετροϊικών κατασκευασμάτων σε αμφίτροπα κύτταρα πακεταρίσματος Phoenix όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Εμείς μολυσμένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη με φρέσκο ​​ρετροϊούς χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους, παρουσία πολυβρενίου (4 μg /ml). Τα μολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επιλογή με πουρομυκίνη (2,5 μg /ml) για πέντε ημέρες. Πουρομυκίνη ανθεκτικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​ϋΜΕΜ χωρίς πουρομυκίνη για μία ημέρα πριν να είναι είτε η συγκομιδή προετοιμαστούν κυτταρολύματα για ανάλυση Western blotting, ή την εκ νέου επίστρωση για πειράματα. Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται συλλέχθηκαν με τη χρήση κυττάρων από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες ρετροϊικών επιμολύνσεων που απέδωσαν παρόμοια επίπεδα

ΕΚΒΒ2

και

RAS

υπερέκφραση.

Western Blot

κυτταρολύματα με ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (30 μ§) διαχωρίστηκαν σε 8% SDS-PAGE, με εξαίρεση την ERK και pERK, για τις οποίες κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης 0,45 μΜ (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK), το οποίο στη συνέχεια μπλοκάρει στους 4 ° C για 1 ώρα με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε TBST (50 mM Tris, ρΗ 7,5, 0,15 Μ NaCl, 0,1% Tween 20 (β /ο)). Οι κηλίδες κατόπιν επωάστηκαν με κατάλληλες αραιώσεις πρωτογενών αντισωμάτων επί μία νύκτα στους 4 ° C σε TBST που περιείχε 3% άπαχο ξηρό γάλα. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται για ανάλυση κηλίδος Western περιλαμβάνουν πολυκλωνικά αντισώματα για H-RAS (sc-520), E2F1 (sc-193), E2F2 (sc-633), ERK1 /2 (sc-135 900), και ρ-ERK1 /2 ( sc-81492) από την Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)? ακτίνης (A2066) από την Sigma (St Louis, ΜΟ)? ΕΚΒΒ2 (MS-730-PI) από Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA)? ΑΚΤ (4691S), π-ΑΚΤ (4060S), ρ38 (9212S), και p-p38 (9211S) από την Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). Μετά πλύση 10 λεπτών για τρεις φορές σε TBST, τα στυπώματα επωάστηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο από την Perkin Elmer (Boston, ΜΑ) είτε κατά κουνελιού (NEF 812001EA) ή κατά ποντικού (NEF 822001EA) με αραίωση 1:3000 σε TBST με 3% γάλα. Μετά από τρεις πλύσεις με TBST για 10 λεπτά η κάθε μία, οι κηλίδες επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με ECL από Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL), και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ για αυτοραδιογραφία. Αντισώματα έναντι ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. Ποσοτικοποίηση των επιπέδων πρωτεΐνης με βάση εντάσεις μπάντα σε κηλίδες Western διεξήχθη με το λογισμικό Image J (ΝΙΗ, MD, USA, https://rsb.info.nih.gov/ij/).

πληγών θεραπεία δοκιμασία

Η ικανότητα μετανάστευση των κυττάρων αξιολογήθηκε με τη χρήση ενός τραύματος δοκιμασία επούλωσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελαφρές τροποποιήσεις [43]. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 35 mm και αφήνονται να αναπτυχθούν μέχρι να φτάσει το 100% συρροή. Συρρέοντα κύτταρα διατηρήθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας για 48 ώρες για να προκληθεί σύλληψη πυκνότητα και να ελαχιστοποιήσει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. συρρέουσες πλάκες ήταν γδαρμένο κάτω τρεις φορές με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μl, δημιουργώντας αριστερά, στο κέντρο και δεξιά γρατσουνιές /πληγές που διέσχιζε με δύο οριζόντιες γραμμές στο παρελθόν που ως ορόσημα για ποσοτικούς προσδιορισμούς. Μετά την ξύσιμο, τα τρυβλία πλύθηκαν μία φορά με μέσο για να απομακρυνθεί επιπλέοντα κύτταρα και αντικαταστάθηκαν με φρέσκο ​​μέσο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω των πληγών και φωτογραφίες ελήφθησαν σε διάφορα χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης μέχρις ότου η πληγή ήταν τελείως κλειστό. Τα χρονικά σημεία στα οποία ελήφθησαν οι εικόνες εξαρτάται από την μεταναστευτική ικανότητα των διαφορετικών κυτταρικών σειρών που μελετήθηκαν. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκε τουλάχιστον μία φορά για την επικύρωση των αρχικών στοιχείων.

Δοκιμασία Κινητικότητα (Δοκιμασία Boyden τμήμα)

Η κινητικότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας καλλιέργεια κυττάρων ένθετα από BD Falcon (Franklin Lakes, NJ), και ακολουθώντας το πρωτόκολλο που είχε καθοριστεί προηγουμένως με μικρές τροποποιήσεις [44]. Τα κύτταρα που είχαν προηγουμένως διατηρήθηκαν σε μέσο λιμοκτονίας με 0,2% FBS για 24 ώρες για την ελαχιστοποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 2 × 10

5 κύτταρα /ml σε μέσο που περιέχει 0.2% FBS. 1 × 10

5 κύτταρα ή 500 μΙ κυτταρικά εναιωρήματα επιστρώθηκαν πάνω σε κάθε ένθετο, το οποίο είχε προηγουμένως επικαλυφθεί με 3 μg /ml του διαλύματος κολλαγόνου ουράς αρουραίου από την BD (Bedford, ΜΑ) για όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου. Το κάτω θάλαμος περιείχε μέσο με 10% FBS ως χημειο-προσελκυστικό. Τα κύτταρα αφέθηκαν να περάσουν διαμέσου της πορώδους μεμβράνης και συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία που εμπειρικά προσδιορίζεται με βάση την μεταναστευτική ικανότητα κάθε κυτταρική γραμμή. Μη μεταναστευτικά κύτταρα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν από την επιφάνεια των μεμβρανών χρησιμοποιώντας μπατονέτες. Κύτταρα που πέρασαν μέσα από τους πόρους της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με τη χρήση των Diff-Quick πυρήνες και κιτ χρώσης κυτόπλασμα (Dade Behring, Newark, DE). Βιτρώ μεταναστευτικά κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκε τουλάχιστον μία φορά για την επικύρωση των αρχικών στοιχείων.

Εισβολή Δοκιμασία

Η ικανότητα εισβολής των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας από την BD Falcon (Franklin Lakes, NJ) ακολουθώντας μία προηγουμένως περιγραφέν πρωτόκολλο με μικρές τροποποιήσεις [45]. Όπως και στην δοκιμασία κινητικότητος transwell με βάση που περιγράφεται ανωτέρω, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο λιμοκτονίας με 0,2% FBS για 24 ώρες πριν από την σπορά για την ελαχιστοποίηση κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Εισάγει επικαλύφθηκαν με 50 μg /ml του διαλύματος κολλαγόνου ουράς αρουραίου από την BD (Bedford, ΜΑ) για 5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την επώαση, τα ένθετα πλύθηκαν τρεις φορές με μέσο χωρίς ορό και αφέθηκαν να στεγνώσουν στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Μόλις ξηράνθηκαν, οι μεμβράνες καλύφθηκαν με 100 μΙ διαλύματος κολλαγόνου σε τελική συγκέντρωση 1,3 mg /ml (για όλα τα κύτταρα) ή με 100 μΐ Matrigel (Cat. # 356231) από BD (Bedford, ΜΑ) σε μια τελική συγκέντρωση του 300 μg /ml (μόνο για τα κύτταρα Myc-CAP), και αφέθηκαν να στερεοποιηθούν σε θερμοκρασία 37 ° C. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 2 × 10

5 κύτταρα /ml σε μέσο που περιέχει 0.2% FBS. 1 × 10

5 κύτταρα ή 500 μΙ κυτταρικά εναιωρήματα επιστρώθηκαν πάνω σε κάθε ένθεμα. Το υπόλοιπο διαδικασία διεξήχθη όπως περιγράφεται παραπάνω στο τμήμα ανιχνεύσεως κινητικότητος. Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκε τουλάχιστον μία φορά για την επικύρωση των αρχικών στοιχείων.

Αξιολόγηση γήρανσης που σχετίζονται με β-γαλακτοσιδάση Δραστηριότητα

Η ενδογενής δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη ήταν αξιολογούνται με χρώση X-gal όπως περιγράφηκε προηγουμένως [46]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 35mm πιάτα εις τριπλούν σταθεροποιήθηκαν για τρεις λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε 1Χ PBS που περιείχε 2% φορμαλδεΰδη και 0,2% γλουταραλδεΰδη. Μετά από δύο διαδοχικές πλύσεις με 1Χ PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν για 16 ώρες στους 37 ° C με διάλυμα χρώσης (2 ml ανά πιάτο), που αποτελείται από Χ-gal σε μια τελική συγκέντρωση 1 mg /ml σε διμεθυλοφορμαμίδιο, 40 mM κιτρικό οξύ /ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου ρΗ 5.7 (0.1 Μ κιτρικό οξύ /0,2 Μ φωσφορικό νάτριο), 5 mM σιδηροκυανιούχο κάλιο, 5 mM σιδηρικυανιούχο κάλιο, 150 mM χλωριούχο νάτριο, και 2 mM χλωριούχο μαγνήσιο. Εικόνες ελήφθησαν κάτω από ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Θετικά και αρνητικά κύτταρα μετρήθηκαν από τουλάχιστον τρία διαφορετικά πεδία.

Cell Growth Rate Εκτίμηση

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων εις τριπλούν. Η πυκνότητα της αρχικής σποράς ήταν εμπειρικά αποφασισμένος να μας επιτρέψει να μετρήσει τουλάχιστον τέσσερα χρονικά σημεία πριν από κύτταρα έφτασε το 100% συρροή. Έτσι, τα κύτταρα σπάρθηκαν ως εξής: 70,000 κύτταρα για PC3, 35.000 κύτταρα για LnCaP, 120.000 κυττάρων για DU145, και 70,000 κύτταρα για Μγο-Cap. Δώδεκα ώρες μετά την σπορά, τα κύτταρα απαριθμήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο (Häusser Scientific, Horsham, ΡΑ) για να ομαλοποιηθούν ως τον αντίστοιχο αριθμό σπορά των κυττάρων και να χρησιμοποιηθεί ως το πρώτο χρονικό σημείο. Τα κύτταρα στη συνέχεια υπολογίζονται κάθε 12 ώρες για κυτταρικές γραμμές Myc-CAP PC3 και ή κάθε 24 ώρες για κυτταρικές γραμμές DU145 και LnCaP. Οι ρυθμοί ανάπτυξης υπολογίστηκαν με τον υπολογισμό και τη σύγκριση της γραμμικής κλίσης για κάθε καμπύλη ανάπτυξης.

Στατιστική Ανάλυση

Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε μέσω του Student

t-test

με ένα όριο σημαντικότητας του

P

& lt? 0,05. Σε όλα τα σχήματα, τις στατιστικές έννοιες ήταν συμβολίζεται ως

*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 και ***

P

& lt? 0.001.

Αποτελέσματα

η υπερέκφραση του

ΕΚΒΒ2

και

RAS

ογκογονίδια στον καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές από ρετροϊική μόλυνση

Για να υπερεκφράζουν

ΕΚΒΒ2

και

RAS

ογκογονιδίων σε καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές, εμείς επιμολυσμένα κύτταρα καρκίνου προστάτη με

pBabe-Puromycin-

(

PBP-

) ρετροϊούς που βασίζονται υπερεκφράζουν μια ενεργοποιημένη μορφή του

ΕΚΒΒ2

(

PBP-ΕτοΒ2

) ή μια μεταλλαγμένη μορφή του

H-RAS

(

PBP-RAS

). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, ανάλυση Western blotting έδειξε ότι επιμόλυνση των κυττάρων με

PBP-RAS

ρετροϊούς οδήγησε σε μέτρια up-κανονισμούς του

RAS

που κυμαίνονται από 1.5 φορές (για LnCaP) έως 4,7 φορές (για PC3), και ότι η επιμόλυνση των κυττάρων με

PBP-ΕrbΒ2

ρετροϊούς οδήγησε σε μέτρια up-κανονισμούς του

ERBB2

που κυμαίνονται από 2.5 φορές (για DU145) έως 4,0 φορές (για Myc- CaP) Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και

RAS

υπερέκφραση δεν άλλαξε τα επίπεδα πρωτεΐνης του ErbB2,

ERBB2

υπερέκφραση αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης του RAS (2,9 φορές) ειδικώς στα κύτταρα Myc-Cap (Σχήμα 1), το οποίο υπερεκφράζει το ανθρώπινο

c-myc ογκογονίδιο

[37].

ErbB2 και τα επίπεδα πρωτεΐνης RAS αξιολογήθηκαν με κηλίδες Western χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι H-RAS ή ERBB2 για συνολικά κυτταρολύματα παρασκευάζονται από καρκίνο του προστάτη κύτταρα επιμολυσμένα είτε με ρετροϊούς ελέγχου (

PBP

), ή ρετροϊών που υπερεκφράζουν

PBP

–

H-RAS

(

RAS

) ή

PBP -ERBB2

(

ΕΚΒΒ2

). Οι κηλίδες με αντισώματα έναντι ακτίνης χρησίμευσαν ως μάρτυρες φόρτωσης. Οι αριθμοί σε λευκό αντιπροσωπεύουν φορές αλλαγές στη ΕΚΒΒ2 ή τα επίπεδα της πρωτεΐνης RAS στο

ΕΚΒΒ2

– ή

RAS

κύτταρα που υπερεκφράζουν σε σχέση με εκείνες που αντιστοιχούν

PBP

κύτταρα ελέγχου τους μετά την ακτίνη εξομάλυνση.

η

η υπερέκφραση του

ΕΚΒΒ2

οδηγεί σε μέτριες αυξήσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων σε LnCaP, DU145 και PC3 κύτταρα

Θεωρώντας ότι η ενεργοποίηση του

ΕΚΒΒ2

/

RAS

οδού στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη σηματοδότησης μπορεί να επηρεάσει τα ποσοστά ανάπτυξής τους, η οποία θα μπορούσε να επηρεάσει την ανάλυση για την αξιολόγηση μεταστατικό δυναμικό τους, θα διεξαχθεί μια δοκιμασία καμπύλη ανάπτυξης που χρησιμοποιούν ασύγχρονη κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2,

ERBB2

υπερέκφραση οδήγησε σε μέτριες αυξήσεις σε ρυθμούς ανάπτυξης για το σύνολο των τριών ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών καρκίνου του προστάτη: κατά μέσο όρο αύξηση 43% για LNCaP κυττάρων, 33% αύξηση για τα κύτταρα DU145, και αύξηση κατά 25% για τα κύτταρα PC3. Ωστόσο, η υπερέκφραση του

ERBB2

δεν επηρέασε το ρυθμό ανάπτυξης της κυτταρικής σειράς ποντικού καρκίνου του προστάτη, Myc-Cap. Σε αντίθεση,

RAS

υπερέκφραση δεν έχει σημαντικές επιπτώσεις επί των ρυθμών ανάπτυξης οποιασδήποτε από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2).

ρυθμούς ανάπτυξης κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση κυττάρων κάθε 12 ώρες ή 24 ώρες για τα διάφορα κύτταρα καρκίνου του προστάτη που επιμολύνθηκαν με ρετροϊούς ελέγχου (

ΡΒΡ

), ή ρετροϊοί που υπερεκφράζουν είτε

PBP-H-RAS

(

RAS

) ή

PBP-ΕτοΒ2

(

ΕΚΒΒ2

).

Η

Η υπερέκφραση του

RAS

Μειώνει κυττάρων μετανάστευση Ποσοστά LnCaP και DU145 Γραμμές κυττάρων

τα αποτελέσματα του

ERBB2

και

RAS

υπερέκφραση στις μεταστατικό δυναμικό του LnCaP, DU145, PC3, και καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές Myc-Cap αρχικά αξιολογήθηκαν με την εκτέλεση μιας πληγής δοκιμασίας επούλωσης. Για να ξεπεραστούν πιθανές επιδράσεις της αυξημένης κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε

ERBB2

κύτταρα που υπερεκφράζουν (Σχήμα 2) πάνω στην πληγή δοκιμασία επούλωσης, εμείς επάγεται σύλληψης πυκνότητα κυττάρων με τη διατήρηση συρρεόντων πλάκες για 48 ώρες πριν από την πραγματοποίηση γρατσουνιές /πληγών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η υπερέκφραση του

ERBB2

και

RAS

έδειξε διάφορες επιδράσεις στις τρεις ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Συγκεκριμένα, ενώ η υπερέκφραση του

ΕΚΒΒ2

δεν είχε σημαντική επίδραση στις τιμές μετανάστευση όλων των τριών καρκίνου του προστάτη ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, η υπερέκφραση του

RAS

μειώθηκαν σημαντικά τα ποσοστά μετανάστευσης των LnCaP και DU145 κυττάρων γραμμές. Σε σύγκριση με τις καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές του ανθρώπου, η ποντικού καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή Myc-Cap φάνηκε να έχουν χαμηλότερα ποσοστά μετανάστευσης, όπως αποδεικνύεται από το γεγονός ότι δεν κατάφεραν να κλείσει εντελώς το τραύμα πριν αρχίσει να αυξάνεται και πάλι γύρω από το χρονικό σημείο 32 ώρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), ανεξάρτητα από το καθεστώς του

ΕΚΒΒ2

– ή

RAS

-overexpression (Σχήμα 3). Παρ ‘όλα αυτά,

ΕΚΒΒ2

-. Ή

RAS

υπερεκφράζουν Myc-Cap κύτταρα είχαν μια μέτρια αλλά στατιστικά ασήμαντη αύξηση στα ποσοστά μετανάστευσης σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3)

ποσοστά μετανάστευσης κυττάρων εκτιμήθηκαν με ένα τραύμα δοκιμασία επούλωσης για τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα που επιμολύνθηκαν με είτε ρετροϊούς ελέγχου (

ΡΒΡ

), ή ρετροϊοί που υπερεκφράζουν

ΡΒΡ

–

H-RAS

(

RAS

) ή

PBP-ΕτοΒ2

(

ΕΚΒΒ2

). Αριστερό πάνελ έδειξαν ποσοστά των πληγών παρέμεινε σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Τα ποσοστά των πληγών εκτιμήθηκαν με βάση τον μέσο όρο των 12 μετρήσεων σε κάθε πλάκα αντικατοπτρίζει μετρήσεις των τεσσάρων ομοιόμορφα κατανεμημένη ενότητες σε καθεμία από τις τρεις πληγές /γρατσουνιές σε κάθε πλάκα. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσο ± SD από τρεις επαναλήψεις. Δεξιά πάνελ έδειξαν αντιπροσωπευτικών εικόνων που λαμβάνονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Όλες οι εικόνες ελήφθησαν με την ίδια κλίμακα με κλίμακα bar 200 μΜ εμφανίζεται στην πρώτη εικόνα.

Η

ΕΚΒΒ2

υπερέκφραση Αυξάνει κυττάρων Motilities της ανδρογόνα-ευαίσθητο DU145 και PC3 κύτταρα και

RAS

υπερέκφραση Αυξάνει την κυτταρική κινητικότητα των Myc-Cap κύτταρα

Για να συμπληρωθεί η επούλωση των πληγών στοιχεία που παρουσιάζονται παραπάνω, αξιολογήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της υπερέκφρασης του

ΕΚΒΒ2

και

RAS

στην κυτταρική κινητικότητα των καρκινικών κυτταρικών σειρών προστάτη με μία δοκιμασία κυτταρικής κινητικότητας transwell-based χρησιμοποιώντας πορώδη μεμβράνη ένθετα σε transwells. Ενώ επούλωσης πληγών δοκιμασία μετρά την πλευρική κινητικότητα κυττάρου προέκυψαν από την διάσπαση του κυττάρου-κυττάρου αλληλεπιδράσεις [47], θαλάμους Boyden Transwell δοκιμασία μετρά χημειο-ελκυστική μετανάστευση, η οποία σε αντίθεση με δοκιμασία επούλωσης πληγών, είναι ανεξάρτητη από θραύσεις σε διασταυρώσεις κυττάρου-κυττάρου [48]. Ως εκ τούτου, αυτές οι δύο προσδιορισμοί είναι συμπληρωματικές και συχνά χρησιμοποιούνται παράλληλα να αποκτήσουν βιολογική γνώσεις σε διάφορους τύπους κυτταρικής μετανάστευσης. Για να ελαχιστοποιηθεί ο αντίκτυπος των διαφορικών ρυθμών ανάπτυξης των κυττάρων του

ΕΚΒΒ2

υπερέκφραση για τη δοκιμασία κινητικότητας, εμείς που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου διατηρώντας τα κύτταρα κάτω από συνθήκες ορό πείνας για 24 ώρες πριν την εκτέλεση της δοκιμασίας κινητικότητα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η υπερέκφραση του

ERBB2

αυξηθεί σημαντικά κύτταρο motilities των δύο πιο μεταστατικό, ανδρογόνο αναίσθητη κυτταρικές σειρές, κύτταρα DU145 και τα κύτταρα PC3, με αύξηση κατά 30% και ένα 6-πλάσια αύξηση, αντίστοιχα . Σε αντίθεση,

ΕΚΒΒ2

υπερέκφραση μείωσε σημαντικά τις motilities των δύο ταπεινούς ή μη μεταστατικό, ανδρογόνα-ευαίσθητο κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, LnCaP και Myc-Cap. Επιπλέον, ενώ η

RAS

υπερέκφραση μείωσε σημαντικά τα motilities των LNCaP κυττάρων και των κυττάρων PC3, αύξησε σημαντικά την κινητικότητα των κυττάρων Myc-Cap, που υπερεκφράζουν το

c-myc

ογκογονίδιο.

motilities κυττάρων αξιολογήθηκαν με δοκιμασία κινητικότητος transwell-based για καρκίνο του προστάτη κύτταρα που επιμολύνθηκαν με είτε ρετροϊούς ελέγχου (

ΡΒΡ

), ή ρετροϊοί που υπερεκφράζουν

ΡΒΡ

–

H-RAS

(

RAS

) ή

PBP-ΕτοΒ2

(

ΕΚΒΒ2

). Κάθε γράφημα ράβδου έδειξε τα σχετικοί αριθμοί των κυττάρων που έχουν περάσει από τα ένθετα Transwell /μεμβράνες, οι οποίες χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο για τουλάχιστον 10 πεδία ανά ένθετο. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσο ± SD από τρεις επαναλήψεις. Εκπρόσωπος εικόνες που λαμβάνονται σε μια δεδομένη χρονική στιγμή είχαν δείξει κάτω από κάθε γράφημα μπαρ. Όλες οι εικόνες ελήφθησαν με την ίδια κλίμακα με κλίμακα bar 200 μΜ εμφανίζεται στην πρώτη εικόνα.

Η

ΕΚΒΒ2

υπερέκφραση Προωθεί ικανότητα εισβολής των κυττάρων στην ανδρογόνα-ευαίσθητο DU145 και PC3 κύτταρα

Οι μεταστατικό δυναμικό του

ΕΚΒΒ2

– ή

RAS

-overexpression σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη περαιτέρω αξιολογήθηκαν από την αξιολόγηση σχετική εισβολής τους με μία δοκιμασία εισβολή φρεατίων που βασίζεται σε χρήση ένθετα κύτταρο επικαλυμμένα με μήτρα κολλαγόνου. Αυτή η δοκιμασία εισβολής επιτρέπει στα κύτταρα να περάσουν από μια 100 μΜ πάχους μήτρα κολλαγόνου από το χαμηλό ορό που περιέχει μέσο σε ένα περιβάλλον χωρίς ορό εμπλουτισμένο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, η διηθητικότητα των κυττάρων DU145 ανδρογόνα αναίσθητη και PC3 κύτταρα ήταν ουσιαστικά αυξηθεί με την παρουσία

ERBB2

υπερέκφραση αλλά όχι με την παρουσία του

RAS

υπερέκφραση. Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με τα δεδομένα από την δοκιμασία κινητικότητος transwell-based που δείχνουν ότι η υπερέκφραση του

ERBB2

σε κύτταρα DU145 και PC3 κύτταρα οδήγησε σε αυξημένη κινητικότητα κυττάρου (Σχήμα 4). Συνεπής με χαμηλή ή καθόλου τους μεταστατικό δυναμικό, ούτε Myc-cap κύτταρα ούτε LNCaP κύτταρα φάνηκε να είναι σε θέση να διεισδύσουν στην μήτρα κολλαγόνου ακόμα και μετά από 96 ώρες επώασης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σημαντικά, η υπερέκφραση του

ERBB2

ή

RAS

ήταν ανεπαρκής για να επιτρέψει είτε κύτταρα Myc-cap ή LNCaP κύτταρα να περάσουν διαμέσου της μήτρας κολλαγόνου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Κυττάρων διηθητικότητα εκτιμήθηκε με δοκιμασία εισβολή transwell-based για καρκίνο του προστάτη κύτταρα που επιμολύνθηκαν με είτε ρετροϊούς ελέγχου (

ΡΒΡ

), ή ρετροϊοί που υπερεκφράζουν

ΡΒΡ

–

H-RAS

(

RAS

) ή

PBP-ΕτοΒ2

(

ΕΚΒΒ2

). Κάθε ραβδόγραμμα έδειξε τον αριθμό των κυττάρων που έχουν περάσει από τη μήτρα κολλαγόνου είτε 72 ώρες (για κύτταρα PC3) ή 96 ώρες (για κύτταρα DU145) μετά την επίστρωση. Transwell ένθετα χρωματίστηκαν και εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκαν για το σύνολο ένθετα. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσο ± SD από τρεις επαναλήψεις. Εκπρόσωπος εικόνες εμφανίζονται κάτω από κάθε γράφημα μπαρ. Όλες οι εικόνες ελήφθησαν με την ίδια κλίμακα με κλίμακα bar 200 μΜ εμφανίζεται στην πρώτη εικόνα.

Η

Από την υπερέκφραση του

RAS

αύξησε την κινητικότητα των κυττάρων ειδικά στις Myc-Cap κύτταρα (Σχήμα 4), πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία εισβολή transwell που βασίζεται σε κύτταρα Myc-cap χρησιμοποιώντας Matrigel για να αντικαταστήσει το κολλαγόνο. Σε σύγκριση με την μήτρα κολλαγόνου, η μήτρα Matrigel είναι ένα ανασυσταθέν βασική μεμβράνη παρασκευάζεται από ένα σάρκωμα ποντικού που καλύτερα μιμείται το εξωκυτταρικό περιβάλλον ενός καρκίνου. Όπως και στην περίπτωση της μήτρας κολλαγόνου, δεν παρατηρήθηκε κύτταρο να περάσει μέσα από τη μήτρα Matrigel είτε στα κύτταρα ελέγχου ή στα

RAS

κύτταρα υπερεκφράζουν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

μέτρια επίπεδα του

RAS

υπερέκφραση δεν προάγει την κυτταρική γήρανση στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η παρατεταμένη έκφραση των ογκογόνων

RAS

σε τρωκτικά πρωτογενή κύτταρα ινοβλαστών ανθρώπινου και

in vitro

[49] ή υψηλά επίπεδα υπερέκφρασης oncognic

RAS

σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού

in vivo

[50] οδήγησε σε αύξηση της κυτταρικής γήρανσης. Δεδομένου ότι

RAS

υπερεκφράζουν LNCaP κύτταρα και κύτταρα DU145 παρουσίασαν μειωμένη ικανότητα να κλείσει μια πληγή που προκάλεσε (Σχήμα 3), και από το

RAS

υπερεκφράζουν LNCaP κύτταρα και τα κύτταρα PC3 έδειξαν μειωμένη motilities κυττάρων στο δοκιμασία κινητικότητα transwell (Σχήμα 4), επιδιώξαμε να καθοριστεί αν η μειωμένη κινητικότητα σε αυτές

RAS

υπερεκφράζουν ανθρώπινο κύτταρα καρκίνου του προστάτη μπορεί να εξηγηθεί από μια πιθανή αύξηση της κυτταρικής γήρανσης σε αυτά τα κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε

in vitro

χρώση X-gal για την αξιολόγηση των δραστηριοτήτων β-γαλακτοσιδάσης γήρανση που σχετίζεται, ένα κοινώς χρησιμοποιούνται βιοδείκτη για την κυτταρική γήρανση [51]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α και το Σχήμα 6Β, μέτρια επίπεδα

RAS

υπερέκφραση σε πειραματικό περιβάλλον μας (Σχήμα 1) δεν αύξησε σημαντικά την κυτταρική γήρανση σε LnCaP, PC3 και DU145 κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από το γεγονός ότι το

RAS

κύτταρα που υπερεκφράζουν έδειξαν παρόμοια ποσοστά των X-gal-θετικών κυττάρων τα οποία αντιστοιχούν

PBP

κύτταρα ελέγχου τους. Σε αντίθεση, PC3 κυττάρων με ένα πολύ υψηλότερο επίπεδο του

RAS

υπερέκφραση (δηλαδή 13,6 φορές? Σχήμα 6C, «

Hi-Ras»

) έδειξαν σημαντική αύξηση στο ποσοστό των X-gal -θετικό κύτταρα είτε από τα κύτταρα PC3 μολύνθηκαν με τον φορέα ελέγχου (Σχήμα 6C, «

PBP»

) ή τα κύτταρα PC3 με μια μέτρια έκφραση του

RAS

(δηλαδή 4,2 φορές? Σχήμα 6C «

RAS»

) (Σχήμα 6Α και 6Β). Το αυξημένο ποσοστό των X-gal θετικά κύτταρα PC3 με ένα υψηλότερο επίπεδο

RAS

υπερέκφραση είναι σύμφωνο τόσο με τη γήρανση, όπως η μορφολογία τους (δηλαδή μεγάλες και επίπεδες) (Σχήμα 6Α) και με προηγούμενη έκθεση ότι τα υψηλά επίπεδα του

Ras

υπερέκφραση οδήγησε σε αύξηση της κυτταρικής γήρανσης [50]. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η ανικανότητα των RAS για την προώθηση κυτταρική κινητικότητα ή διεισδυτικότητα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου προστάτη δεν οφείλεται στην πρόωρη κυτταρική γήρανση.

(Α) Γήρανση σχετιζόμενη δραστηριότητες β-γαλακτοσιδάσης αξιολογήθηκε με χρώση X-gal για ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη επιμολύνθηκαν είτε με ρετροϊούς ελέγχου (

ΡΒΡ

) ή ρετροϊούς που υπερεκφράζουν

PBP-H-RAS

(

RAS

). κύτταρα PC3 που εκφράζουν ένα εξαιρετικά υψηλό επίπεδο του

RAS

(

Hi-RAS

) συμπεριλήφθηκαν για συγκρίσεις. Γηρασμένα BJ κύτταρα ινοβλαστών ανθρώπινου δέρματος χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για χρώση X-gal. Αντιπροσωπευτικές εικόνες δείχθηκε με αντιπροσωπευτικές X-gal-θετικών κυττάρων σημειώνεται με κόκκινα βέλη. Ένθετα σε κάθε εικόνα παρουσίασαν μεγεθύνεται, εκπρόσωπος X-gal-θετικά κύτταρα. (Β) ποσοτικοποίησης των δεδομένων που συλλέγονται από τον πίνακα (Α). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσο ± SD από τρεις επαναλήψεις.