Αφηρημένο

Niemann-Pick τύπου C2 (NPC2) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης χοληστερόλης μέσω άμεσης δέσμευσης με ελεύθερη χοληστερόλη. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη σημασία της NPC2 στον καρκίνο. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε εντοπίσει την επίδραση των διαφόρων μορφών καρκίνου στην έκφραση NPC2. Μια σειρά από αντι-NPC2 μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) με τον ισότυπο IgG2a παράχθηκαν και διαλογή πεπτιδικών απέδειξαν ότι η αντιδραστική επίτοπος ήταν υπολείμματα αμινοξέων 31-40 της ανθρώπινης πρωτεΐνης NPC2. Η ιδιαιτερότητα αυτών των mAbs επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western με τη χρήση shRNA μεσολάβηση knock-down της NPC2 σε ανθρώπινα κύτταρα SK-ΗΕΡ1. Με ανοσοϊστοχημική χρώση, NPC2 εκφράζεται σε φυσιολογικό νεφρό, το ήπαρ, του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του οισοφάγου, της μήτρας του τραχήλου της μήτρας, του παγκρέατος και του ιστού του στομάχου. Ισχυρή έκφραση του NPC2 βρέθηκε στο άπω και εγγύς ελικοειδές σωληνάριο του νεφρού και των ηπατοκυττάρων του ήπατος. Κανονική οισοφάγου, της μήτρας του τραχήλου της μήτρας, του παγκρέατος, του στομάχου, του μαστού, του παχέος εντέρου και του πνευμονικού ιστού χρωματίστηκαν μέτρια έως ασθενώς. Σε σύγκριση με την κανονική ισοδύναμα ιστού τους, NPC2 υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε καρκίνους του μαστού, του παχέος εντέρου και του πνεύμονα. Όσον αφορά τον καρκίνο του μαστού, NPC2 πάνω ρύθμιση συνδέεται με τον υποδοχέα οιστρογόνου (-), υποδοχέα προγεστερόνης (-) και του υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (+). Από την άλλη πλευρά, NPC2 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα, κίρρωση του ήπατος και των ιστών ηπατώματος. Με ανοσοδοκιμασία ενζύμου ELISA σύλληψης αντιγόνου, το NPC2 ορού είναι αυξημένη σε ασθενείς με κίρρωση και καρκίνο του ήπατος. Σύμφωνα με τα στοιχεία κηλίδος western, η αλλαγή του τρόπου διεξαγωγής των γλυκοσυλιωμένων NPC2 στον ορό συνδέεται με κίρρωση και καρκίνο του ήπατος. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη ολοκληρωμένη ανοσοϊστοχημική και ορολογική μελέτη που διερεύνησε την έκφραση NPC2 σε μια ποικιλία διαφορετικών ανθρώπινων καρκίνων. Αυτά τα νέα μονοκλωνικά αντισώματα θα πρέπει να βοηθήσει με την αποσαφήνιση των ρόλων της NPC2 στην ανάπτυξη όγκων, ιδιαίτερα στο ήπαρ και του μαστού

Παράθεση:. Liao YJ, Lin MW, γεν CH, Lin ΥΤ, Wang CK, Huang SF, et al. (2013) Χαρακτηρισμός της Niemann-Pick τύπου Έκφραση C2 Protein σε πολλαπλές Καρκίνοι Χρησιμοποιώντας μια νέα NPC2 μονοκλωνικό αντίσωμα. PLoS ONE 8 (10): e77586. doi: 10.1371 /journal.pone.0077586

Επιμέλεια: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: May 30, 2013? Αποδεκτές: 4 του Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 του Οκτώβρη 2013

Copyright: © 2013 Liao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Δημοκρατίας της Κίνας (χορηγήσουν NSC100-2325-B-010-008 και NSC102-2320-Β-038-003) και Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο (χορηγήσουν TMU101-AE1-Β29). TLCN έχει υποστηριχθεί από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο από το 2005 (NSC 100-2325-Β 182-006) και των Εθνικών Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα, την Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Niemann-Pick τύπου C2 (NPC2) πρωτεΐνη είναι μια μικρή διαλυτή γλυκοπρωτεΐνη που περιέχει δεκαεννέα αμινοξέα σήμα πεπτιδίου. Η πρωτεΐνη χαρακτηρίστηκε πρώτα ως μια σημαντική εκκριτική πρωτεΐνη στον ανθρώπινο επιδιδυμίδα [1]. NPC2 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης χοληστερόλης μέσω άμεσης σύνδεσης με ελεύθερη χοληστερόλη [2]. Μια ανεπάρκεια σε NPC2 έχει σαν αποτέλεσμα την συσσώρευση ελεύθερης χοληστερόλης στο λυσόσωμα [3]. Ανάλυση NPC2 mRNA με κηλίδωση Northern αποκάλυψε ένα μοναδικό μετάγραφο 0.9 kb του σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν, με τα υψηλότερα επίπεδα mRNA στους όρχεις, νεφρό και το ήπαρ [4]. Η ώριμη ανθρώπινη πρωτεΐνη NPC2 αποτελείται από 132 αμινοξέα και εκφράζεται ως διαφορετικές ισομορφές? αυτοί ποικίλουν σε μέγεθος από 19 να 23 kD σε ένα ιστό-ειδικό τρόπο [5,6]. Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι NPC2 ενεργεί συντονισμένα με γλυκίνη Ν-μεθυλτρανσφεράσης για τη ρύθμιση της ηπατικής ομοιόσταση της χοληστερόλης και λιπαρά ηπατική νόσο εξέλιξης [7]. Επιπλέον, NPC2 είναι απαραίτητη για το σχηματισμό θηλών και διαμορφώνει θηλώδη ανάπτυξη [8]. NPC2 εκφράζεται επίσης σε κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα τύπου II από τον πνεύμονα [9]. Από NPC2 ρυθμίζει αρνητικά ενεργοποιημένης πρωτεϊνικής κινάσης (ΜΑΡΚ) φωσφορυλίωση ERK1 /2 μιτογόνο σε κύτταρα ινοβλαστών [10], μια διαταραχή στην έκφραση NPC2 μπορεί να σχετίζεται με σημαντικές ανθρώπινες ασθένειες συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Ωστόσο, οι εκφράσεις του NPC2 σε ανθρώπινους καρκίνους που δεν έχουν διερευνηθεί διεξοδικά. Ως εκ τούτου, η έρευνα μας στόχοι ήταν (α) να αναπτύξει ένα πάνελ μονοκλωνικών αντισωμάτων (mAbs) στοχεύουν έναντι της πρωτεΐνης NPC2 και (β) για τον χαρακτηρισμό τους ιδιότητες και τις πιθανές κλινικές εφαρμογές. Με τη χρήση του ανοσοϊστοχημική χρώση, ισχυρά επίπεδα της έκφρασης του NPC2 βρέθηκαν στο άπω και εγγύς ελικοειδές σωληνάριο του νεφρού και στα ηπατοκύτταρα του ήπατος. Η έκφραση του NPC2 βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ανθρώπινους καρκίνους του μαστού, του παχέος εντέρου και του πνεύμονα, ενώ, αντίθετα, δεν υπήρξε ρύθμιση προς τα κάτω της έκφρασης NPC2 σε νεφρούς και το ήπαρ καρκίνων. Τέλος, αποδεικνύεται περαιτέρω ότι ο προς τα πάνω ρύθμιση του NPC2 συσχετίζεται με την ιδιότητα του υποδοχέα οιστρογόνου (ER), υποδοχέα προγεστερόνης (PR) και ανθρώπινο υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (HER-2) έκφραση. Επιπλέον, απορύθμιση των ορών NPC2 συνδέεται με κίρρωση του ήπατος και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC).

Υλικά και Μέθοδοι

Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι NPC2

Για να δημιουργήσετε μια σειρά του mAb κατά NPC2, καθαρισμένη GST-NPC2 ή καθαρισμένο His-NPC2 (Σχήμα 1Α) ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη (RP) αναμίχθηκαν με πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund (για την αρχική ανοσοποίηση) ή ατελές ανοσοενισχυτικό του Freund (για τις ενέσεις αναμνηστική) (Sigma Co., St. Louis, Μο, USA) και το μίγμα που προέκυψε χρησιμοποιήθηκε ως ανοσογόνο. His-NPC2 RP χρησιμοποιήθηκε ως αντιγόνο διαλογής για αντισώματα προέκυψε από την GST-NPC2 RP. Mouse mAbs παρήχθησαν με την τεχνική υβριδώματος [11]. Τα υβριδώματα διανεμήθηκαν σε έξι πλάκες των 96 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν σε επιλεγμένο μέσο [12]. Τα υπερκείμενα καλλιέργειας υποβλήθηκαν σε διαλογή χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο ανοσοδοκιμασία με GST-NPC2 RP και His-NPC2 RP όπως τα αντιγόνα. Υβριδώματος κύτταρα που έχουν υψηλή πυκνότητα οπτικών με ανοσοδοκιμασία ενζύμου επιβεβαιώθηκαν με προσδιορισμό στυπώματος Western αμέσως. Κάθε φρεάτιο των κυττάρων που παρήγαγαν ένα θετικό αποτέλεσμα ήταν υπο-κλωνοποιήθηκε σε ένα πλακίδιο 96 φρεατίων με πυκνότητα κυττάρων 0.5 κύτταρο ανά φρεάτιο. Τα προκύπτοντα απλούς κλώνους με ένα θετικό αποτέλεσμα στη συνέχεια εμβολιάστηκαν σε μια δοσολογία 2 χ 10

6 σε έναν ποντικό BALB /c που είχαν υποστεί έναρξη με 0.5 ml ατελούς ανοσοενισχυτικό (Sigma) προηγουμένως. Το μονοκλωνικό αντίσωμα καθαρίστηκε από το ασκητικό υγρό ποντικού χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη G συν πρωτεΐνη Α αγαρόζης (Calbiochem, San Diego, CA, USA) και στη συνέχεια συμπυκνώθηκε με Vivaspin 20 (GE Healthcare). Ο ισότυπος εκάστου mAb

(Α) Κατασκευή των πλασμιδίων έκφρασης του GST-NPC2 και His-NPC2 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ισοτύπου Αντιδραστήρια (Sigma).. (Β) πρωτεΐνες σύντηξης Βακτηριακές NPC2 εκφράστηκαν σε κύτταρα BL21 και στη συνέχεια επάγεται με τη χρήση 1 mM IPTG. SDS-PAGE και χρώση με κυανό Coomassie χρησιμοποιήθηκαν για να δείξουν τα μοριακά βάρη των δύο πρωτεϊνών ήταν περίπου 43,3 kD για GST-NPC2 και 17 kD για His-NPC2. (C) ανάλυση κηλίδος Western, χρησιμοποιώντας τα μονοκλωνικά αντισώματα (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7D, 1-5Β και 1-2G) έναντι GST-NPC2 και His-NPC2 . (D) ανάλυση κηλίδας Western με τη χρήση των mAb κατά επιδιδυμίδα ποντίκι.

Η

Cells και πλασμίδια

κύτταρα SK-ΗΕΡ1, που αγοράστηκε από την ATCC, καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco BRL, Grand Island , ΝΥ) με 10% ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα εμβρυϊκό ορό (HyClone, Logan, UT, USA), πενικιλλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), μη απαραίτητα αμινοξέα (0.1 mM), και L-γλουταμίνη (2 mM) σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Το πλασμιδιακό DNA επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο TurboFect ™ (Fermentas, Hanover, MD, USA). Οι αλληλουχίες εκκινητή και τα ένζυμα περιορισμού που χρησιμοποιούνται για την πλήρους μήκους και διαφορετικά μήκη των ανθρώπινων γονιδίων NPC2 έχουν προηγουμένως descried από Liao, et al [7]. Πλασμίδιο που κωδικοποιεί shRNA για NPC2 (TRCN0000029323) λήφθηκε από το Μηχανισμό Εθνικού RNAi πυρήνα (Academia Sinica, Ταϊβάν).

Ανθρώπινα δείγματα

Οι διαφάνειες ιστού HCC (n = 50) και ορών (n = 165) ελήφθησαν από την Ταϊβάν ήπατος Δίκτυο για τον Καρκίνο (TLCN) και Taipei City Hospital. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών αυτών φαίνονται στον Πίνακα S1 και S2 Πίνακα. Υγιή ελέγχου και ασθενείς με χρόνια λοίμωξη από ηπατίτιδα, λιπώδες ήπαρ, κίρρωση και ΗΚΚ είχαν προσληφθεί μεταξύ 2008 και 2010 από το Τμήμα Διεθνούς Ιατρικής, Taipei City Hospital, Ran-Αϊ Branch, Ταϊπέι, Ταϊβάν και TLCN. Σύνολο 33 επεμβατική θέματα καρκίνου του μαστού εντοπίστηκαν στο Kaohsiung Δημοτικό Ta-Tung Νοσοκομείο. Εμείς επεξεργασία όλων των δειγμάτων ιστού κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Η Επιτροπή Δεοντολογίας του Συμβουλίου Institutional Review του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Yang-Ming (IRB Νο 1000041) και Ταϊπέι Διοικητικό City Hospital Institutional Review (IRB Νο TCHIRB980509) ενέκρινε τις κλινικές έρευνες, καθώς και όλα τα θέματα που έδωσαν γραπτή συγκατάθεση. Η διάγνωση του HCC επιβεβαιώθηκε με ιστολογική εξέταση. Το στήθος (BR721), κόλον (CO803), του πνεύμονα (LC1006), νεφρό (KD991), πολλαπλή καρκίνου (BCN721), πολλαπλές ασθένειες του ήπατος (LV1201) και κίρρωση του ήπατος και ηπατίτιδα (LV805) ιστούς συστοιχίες αγοράστηκαν από Biomax, US . Κλινικά και παθολογικά πληροφορίες σχετικά με τα μεμονωμένα δείγματα καρκίνου είναι διαθέσιμα και ελήφθησαν από τον κατασκευαστή συστοιχία.

διαλογής Peptide, κηλίδωση Western και η ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση

πλάκα Μια ELISA επικαλυμμένη με πεπτίδια χρησιμοποιήθηκε για τη χαρτογράφηση επιτόπων των διαφόρων αντι-NPC2 mAbs. Αυτά τα πεπτίδια (το καθένα με μήκος 10 αμινοξέα) που καλύπτει το πλήρες μήκος του 1-40 α.α. περιοχή της πρωτεΐνης NPC2. Για κηλίδωση Western, κυτταρική ή ποντίκι πρωτεΐνες επιδιδυμίδα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. φωσφο-ERK1 /2 και ERK1 /2? φωσφο-p38 και p38? φωσφο-ΙΝΚ και JNK αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). σήματα Ανοσοκηλίδωση ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας α-τουμπουλίνης ή β-ακτίνης και ποσοτικοποιείται με πυκνομετρική σάρωση. ανίχνευση IHC της πρωτεΐνης NPC2 διεξήχθη χρησιμοποιώντας NPC2 μονοκλωνικό Ab (3-6B) σε αραίωση 1: 200 [7]. τομές ιστού παραφίνης-ενσωματωμένο επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα και ανιχνεύεται με τη χρήση καθολικής LSAB

κιτ ΤΜ2 (DakoCytomation) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ανοσοδοκιμασία ενζύμου ELISA σύλληψης αντιγόνου

Εν συντομία, 100 μΐ πολυκλωνικού αντισώματος NPC2 (5 μg /ml) σε 0.1 Μ ρυθμιστικό ανθρακικού (ρΗ 9.6) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας μικροτίτλου 96-φρεατίων (Corning Costar, Acton, μΑ) και επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Στη συνέχεια, μπλοκάροντας με 5% BSA σε PBST (PBS ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.05% Tween) στους 37 ° C για 2 ώρες. ορό κάθε ασθενή (100 μΙ σε αραίωση 1: 1) προστέθηκε σε 96 φρεατίων πλάκες και επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά από τρεις εκτεταμένες πλύσεις με PBST, μονοκλωνικό NPC2 αντίσωμα (αραίωση 1: 1000) προστέθηκε και επωάστηκε στους 37 ° C για 1 ώρα, ακολουθούμενη από επώαση με 200 μΙ υποστρώματος (0.015% ο-φαινυλενοδιαμίνης διϋδροχλωριδίου) (Sigma-Aldrich) για άλλα 30 min στους 37 ° C. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με την προσθήκη 3Ν HCl? απορρόφηση μετρήθηκε με φασματοφωτόμετρο στα 490 nm.

γλυκοσιδάση Πέψη

Εξήντα μικρογραμμάρια ήπατος πρωτεΐνες από ανθρώπινο ορό επωάστηκαν με ή χωρίς Ν-γλυκοσιδάση F (PNGase F) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (ΒΑ Biolabs, Beverly, ΜΑ). Τα προϊόντα της αντίδρασης υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδας western.

Στατιστικές αναλύσεις

Chi-square καλής προσαρμογής, μη παραμετρικές Wilcoxon Signed Ranks test ή Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ NPC2 έκφραση και κλινικές ασθένειες. Ένα

σ

αξία των ≦ 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Δημιουργία και χαρακτηρισμός των mAb κατά NPC2

Για να αναπτυχθεί NPC2 mAbs που θα ανιχνεύσει έκφραση NPC2 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και ιστούς, αρχικά κλωνοποιήθηκε ένα πλήρες θραύσμα NPC2 και εξέφρασε την GST-NPC2 και πρωτεϊνών σύντηξης-NPC2 His σε ένα βακτηριακό σύστημα (Σχήμα 1Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, το GST-NPC2 και ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες His-NPC2, με μεγέθη 43.3 και 17 kD, αντίστοιχα, εμφανίστηκε στα IPTG επαγόμενη βακτηριακά προϊόντα λύσης. Το καθαρισμένο GST-NPC2 και ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες His-NPC2 χρησιμοποιήθηκαν ως τα αντιγόνα κατά την διάρκεια της παραγωγής mAb κατά NPC2. Συνολικά, οκτώ mAbs (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7B, 1-5Β και 1-2G) έχουν τελικά παράγονται και βρέθηκαν να αντιδρούν με την GST-NPC2 ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες και His-NPC2 (Σχήμα 1 C). Δεδομένου NPC2 είναι μια σημαντική εκκριτική πρωτεΐνη που εκφράζεται σε επιδιδυμίδας υγρό [1], εφαρμόσαμε NPC2 mAbs μας να ανιχνεύσουμε την έκφραση NPC2 σε επιδιδυμίδα ποντικού χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, NPC2 ανιχνεύθηκε σε συνολικό επιδιδυμίδα εκχυλίσματα σαν πρωτεΐνη λωρίδες περίπου 16 έως 22 kD. προσδιορισμός ισοτόπου προσδιορίζονται όλα τα μονοκλωνικά αντισώματα ανήκουν στο ισότυπο IgG2a και ελαφριές αλυσίδες τους αναγνωρίστηκαν ως κ αλυσίδες.

Για να χαρτογραφήσει την αντιδραστική περιοχή που αναγνωρίζεται από το NPC2 μονοκλωνικά αντισώματα, που επιμολύνονται ένα ξεχωριστό σύνολο των πλασμιδίων που εκφράζουν διαφορετικά μήκη NPC2 -HA (συμπεριλαμβανομένης της πλήρους μήκους NPC2 [1-151 αα], τομέας Α και Β [1-80 αα], περιοχή Β και Γ [40-105 αα], και τον τομέα Γ και Δ [81-151 αα]) για 24 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, όλα οκτώ NPC2 mAbs μπορεί να αναγνωρίσει πλήρους μήκους και το Ν-τερματικό ήμισυ (1-80 αμινοξέα) του pNPC2-ΗΑ. Ενώ, θραύσματα που περιέχουν το 41-105 α.α. περιοχή της NPC2 και το C-τερματικό ήμισυ (81 έως 151 αμινοξέα) του NPC2 δεν αντιδρούν με το NPC2 mAbs. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το σύνολο της NPC2 mAbs αναγνωρίζουν αμινοξέα 1-40 της πρωτεΐνης NPC2. Για την περαιτέρω χαρτογράφηση της αντιδραστικά επιτόπια που αναγνωρίζονται από το NPC2 mAbs, ένα ELISA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα πάνελ πεπτίδιο που αποτελείται από τέσσερα πεπτίδια που καλύπτουν τα αμινοξέα 1-40 της πρωτεΐνης NPC2. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μόνο ένα πεπτίδιο (αμινοξέα 31-40) αναγνωρίστηκε από έξι του επιλεγμένου NPC2 μονοκλωνικά αντισώματα (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7B, 1-5Β και 1-2G) (Σχήμα 2Β). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ, η ευαισθησία και η ειδικότητα της NPC2 mAbs (3-6B, 14-8D, 5-4B και 2-7B) στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα SK-ΗΕΡ1 επιμολυσμένα με ή χωρίς shNPC2. Μεταξύ αυτών NPC2 μονοκλωνικά αντισώματα, επιλέξαμε ένα NPC2 mAb (3-6B) ως το καλύτερο για την περαιτέρω έρευνα και χρήση σε κλινικές εφαρμογές.

χαρτογράφηση (Α) περιοχή επιτόπου των μονοκλωνικών αντισωμάτων NPC2. Διαφορετικές μήκος pNPC2-ΗΑ συμπεριλαμβανομένης της πλήρους μήκους pNPC2-HA, Ν-τερματικό ήμισυ (1-80 αμινοξέα), C-τερματικό ήμισυ (81-151 αμινοξέα) και 41 έως 105 Α.Α. διαμολύνθηκαν σε κύτταρα 293Τ και 24 ώρες αργότερα συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western. Διαδρομή 1, 1-2G? Οικόπεδο 2, 1-5Β? Λωρίδα 3, 2-7B? Λωρίδα 4, 3-6B? Λωρίδα 5, mAb-HA? Λωρίδα 6, 4-12C? Διαδρομή 7, 5-4B, Lane 8, 5-5B? Lane 9, 14-8D. πλάκα (Β) Μία ELISA επικαλυμμένη με τέσσερα πεπτίδια που καλύπτουν το 1-40 α.α. περιοχή της πρωτεΐνης NPC2 χρησιμοποιήθηκε για χαρτογράφηση επιτόπου. Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τα μονοκλωνικά αντισώματα (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7D, 1-5Β και 1-2G) εμφανίζονται. (Γ) Το νοκ ντάουν επίδραση της shNPC2 σε κύτταρα SK-ΗΕΡ1 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντι-NPC2 μονοκλωνικά αντισώματα (3-6B, 14-8D, 5-4B και 2-7B).

Η

Η διαφορική έκφραση των NPC2 σε ανθρώπινο φυσιολογικών και καρκινικών ιστών

προκειμένου να διερευνηθεί η κλινική εφαρμογή των NPC2 mAb, ανιχνεύσαμε την έκφραση NPC2 σε διάφορα φυσιολογικά και καρκίνος ιστούς χρησιμοποιώντας χρώση IHC. Κανονική οισοφάγου, του τραχήλου της μήτρας της μήτρας, του παγκρέατος, του στομάχου, του μαστού, του παχέος εντέρου και του πνευμονικού ιστού έδειξε μέτρια έως ασθενής χρώση ένταση NPC2 (Σχήματα 3Α και 3C). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, ισχυρή έκφραση της NPC2 βρέθηκε σε φυσιολογικά ηπατοκύτταρα του ήπατος. Στο νεφρό, NPC2 εκφράστηκε τόσο στην άπω και εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο, αλλά όχι στο σπείραμα (Σχήμα 3Β)

Μεγέθυνση:. 200x. (Α) NPC2 ήταν ρυθμισμένα σε δείγματα του μαστού, του παχέος εντέρου και του όγκου του πνεύμονα. (Β) NPC2 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε δείγματα νεφρών και του ήπατος του όγκου. (Γ) Η έκφραση της NPC2 παρέμεινε αμετάβλητη στο παγκρέατος, του οισοφάγου, της μήτρας του τραχήλου της μήτρας και του στομάχου ζεύγη δείγμα ιστού.

Η

Η σύγκριση μεταξύ αυτών των φυσιολογικών ιστών (Ν) και το αντίστοιχο ιστούς όγκων τους (Τ) διεξήχθη έξω και διαπιστώθηκε ότι ήταν σημαντικά NPC2 up-ρυθμίζονται στο στήθος, του παχέος εντέρου και του πνεύμονα (Σχήμα 3Α). Μεταξύ των 23 ζεύγη όγκου μαστού και φυσιολογικούς ιστούς που ελέγχθηκαν, 18 (78%) των καρκινικών ιστών έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης NPC2 από φυσιολογικούς ιστούς τους (

ρ

& lt? 0,0001, Πίνακας 1). Από 44 συμφωνημένα μη μικροκυτταρικό ζεύγη καρκίνωμα του πνεύμονα, δείγματα ιστού 30 του όγκου (68%) είχαν μεγαλύτερη έκφραση NPC2 από το κανονικό τους ομολόγους τους (

σ

= 0,02, Πίνακας 1). Σε αντίθεση, NPC2 σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων και ο καρκίνος του ήπατος (Εικόνα 3Β). Μεταξύ 33 ζεύγη νεφρών όγκου και φυσιολογικούς ιστούς, 31 (94%) δείγματα ιστού όγκου είχε μια πολύ χαμηλότερη έκφραση NPC2 από το αντίστοιχο κανονικό δείγμα ιστού (

ρ

& lt? 0,0001, Πίνακας 1). Μεταξύ 50 ζεύγη ιστός ήπατος ιστό όγκου και όγκου-παρακείμενο, δείγματα ιστού 36 του όγκου (72%) παρουσίασαν πολύ χαμηλότερη έκφραση NPC2 από δείγμα ιστού όγκου τους γειτονικά (

σ

= 0,02, Πίνακας 1). Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία διαφορά μεταξύ της κανονικής και του καρκίνου δείγματα ιστού για καρκίνωμα του οισοφάγου, τραχήλου της μήτρας, του παγκρέατος, και του στομάχου (Σχήμα 3C). . Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι παρεκκλίνουσα έκφραση NPC2 συνδέεται με διαφορετικές μορφές καρκίνου και ότι η αλλαγή στην έκφραση μπορεί να είναι είτε πάνω ή κάτω, ανάλογα με τον ιστό

Καρκίνοι

T & gt? Ν n (%)

T = n n (%)

T & lt? Ν n (%)

σ

αξία

Αύξηση του όγκου tissuesBreast (n = 23) 18 (78%) 4 (17%) 1 (4%) & lt? 0.0001Colon (n = 38) 18 (47%) 14 (37%) 6 (16%) 0.0523Lung

# (n = 44) 30 (68%) 5 (11%) 9 (20%) σε όγκο 0.02Decrease tissuesKidney (n = 33) 2 (6%) 031 (94%) & lt? 0.0001Liver (n = 50) 2 (4%) 12 (24%) 36 (72%) 0,02 . Πίνακας 1. αποτελέσματα Η ανοσοϊστοχημεία της έκφρασης NPC2 σε ανθρώπινα μαστού, κόλου, πνεύμονα, νεφρού και ήπατος καρκίνος αντιστοιχισμένο ιστούς

Τ, ιστοί όγκου? Ν, φυσιολογικούς ιστούς?

#, μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. CSV Λήψη CSV

Σχέση μεταξύ της έκφρασης NPC2 και το καθεστώς του ER, PR και HER-2

Όσον αφορά τον καρκίνο του μαστού, έχουμε τις πληροφορίες που συγκεντρώθηκαν 33 επεμβατική θέματα καρκίνου του μαστού που εντοπίζονται στην Kaohsiung Δημοτικό Ta-Tung Νοσοκομείο και ανέλυσε τη σχέση μεταξύ της έκφρασης NPC2 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Μεταξύ 33 ασθενείς, 18 (54,5%) δείγματα ιστού όγκου είχε μια πολύ υψηλότερη έκφραση NPC2 από το αντίστοιχο κανονικό δείγμα ιστού (

σ

= 0,002, Πίνακας 2). Άτομα με NPC2 πάνω ρύθμιση ήταν πιο πιθανό να έχουν ένα μεταγενέστερο στάδιο παθολογία (

σ

= 0,018), ER (-) (

σ

= 0,007), PR (-) (

σ

= 0,005), HER-2 (+) (

σ

= 0,006), ER (-) συν PR (-) (

σ

= 0,011) και ER /PR (-) συν HER-2 (+) (

σ

= 0,011)

Η Συνολική

T & gt?. Ν n (%)

T = n n (%)

T & lt? Ν n (%)

σ

αξία

Σύνολο patients3318 (55%) 13 (39%) 2 (6%) 0.002 ΤΝΜ stageI95 (56%) 4 (44 %) 0 0.043 II166 (38%) 8 (50%) 2 (12%) 0.233 III87 (88%) 1 (12%) 0 0.018 ERPositive209 (45%) 9 (45%) 2 (10%) 0.090 Negative139 ( 69%) 4 (31%) 0 0.007 PRPositive188 (44%) 8 (44%) 2 (11%) 0.092 Negative1510 (67%) 5 (33%) 0 0.005 HER-2 ScorePositive (3), 2.012 (60%) 7 (35%) 1 (5%) 0,006 Αρνητική (0-2) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0.091 CombinationER (+), PR (+) 167 (44%) 7 (44 %) 2 (12%) 0.171 ER (+), PR (-) 42 (50%) 2 (50%) 0 0.180 ER (-), PR (+) 21 (50%) 1 (50%) 0 0.317 ER (-), PR (-) 118 (73%) 3 (27%) 0 0.011 ER /PR (+), HER-2 (+) 94 (44%) 4 (44%) 1 (11%) 0,076 ER /PR (+), HER-2 (-) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0.091 ER /PR (-), HER-2 (+) 118 (73%) 3 (27 %) 0 0.011 ER /PR (-), 2 HER-(-) 000 0 N /ΑΠίνακας 2. έκφραση NPC2 και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του μαστού

Τ, ιστούς όγκων.? Ν, φυσιολογικούς ιστούς? ER, υποδοχέα οιστρογόνου? PR, υποδοχέα προγεστερόνης? HER-2, παράγοντας υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού 2? (+), Θετικά? (-), Αρνητικά. CSV Λήψη CSV

Δυσλειτουργία της έκφρασης NPC2 στην ανθρώπινη κίρρωση και ΗΚΚ

Επειδή το ήπαρ είναι η κύρια πηγή του πλάσματος και των χοληφόρων NPC2 [13], μπορούμε επόμενο εξέτασε κατά πόσον το επίπεδο NPC2 στον ορό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως νέο βιοδείκτη για τις ασθένειες του ήπατος. Μετρήσαμε την ποσότητα του επιπέδου NPC2 ορού από 42 υγιείς μάρτυρες, 20 ασθενείς με HBV χρόνια λοίμωξη, 2 ασθενείς με HCV χρόνια λοίμωξη, 27 ασθενείς με λιπώδες ήπαρ, 28 ασθενείς με κίρρωση και 46 HCC χρησιμοποιώντας μία ELISA (Σχήμα 4Α). Τα επίπεδα NPC2 σε ομάδες με υγιή ελέγχου, χρόνια λοίμωξη HBV, χρόνια λοίμωξη HCV, λιπώδες ήπαρ, κίρρωση και HCC ήταν 3,29 ± 1,43 ng /ml, 4,51 ± 1,88 ng /ml, 9,66 ng /ml (μέγιστη τιμή, 15,81 και ελάχιστες αξία, 3,504), 7,49 ± 2,30 ng /ml, 15,30 ± 2,02 ng /ml και 7,26 ± 2,11 ng /ml, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, τα επίπεδα του NPC2 ήταν καμία διαφορά μεταξύ υγιών ελέγχου, χρόνια ηπατίτιδα (HBV και HCV) και σε ασθενείς με λιπώδη νόσο του ήπατος. Είναι σημαντικό, οι ασθενείς με κίρρωση και ΗΚΚ είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα NPC2 από τους υγιείς μάρτυρες. Από την άλλη πλευρά, η χρώση IHC απέδειξε ότι NPC2 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε ιστούς κίρρωση, ενώ δεν υπήρχε καμία διαφορά μεταξύ της κανονικής και της ηπατίτιδας ιστούς (Σχήματα 4Β και 4C).

(Α) ELISA ανάλυση του ορού επίπεδα NPC2 σε 42 υγιείς μάρτυρες, 20 ασθενείς με χρόνια λοίμωξη HBV, 2 ασθενείς με χρόνια λοίμωξη HCV, 27 ασθενείς με λιπώδες ήπαρ, 28 κίρρωση και 46 ασθενείς HCC. (Β) IHC χρώση έκφρασης πρωτεΐνης σε κανονικούς NPC2, χρόνια ηπατίτιδα και κίρρωση ιστούς. (Γ) IHC ανάλυση της ηπατικής έκφρασης NPC2 σε 44 κανονικό, 21 χρόνια ηπατίτιδα και κίρρωση 60 δείγματα ιστών (*,

ρ

& lt? 0,05, Mann-Whitney test U). (D) Ανθρώπινοι οροί (60 μg) επωάστηκαν με πεπτίδιο Ν-γλυκοσιδάση F (PNGase F) και υποβλήθηκε σε ανάλυση κηλίδας Western. (Ε) Ανάλυση Western blot της έκφρασης NPC2 ορού σε 14 υγιείς μάρτυρες, 7 λιπώδες ήπαρ, 4 κίρρωση και 4 ασθενείς HCC. Κάθε γραμμή φορτώθηκε 100 μg πρωτεΐνης.

Η

Από το Ν-γλυκοζυλίωση είναι σημαντική για τη σωστή στόχευση και τη λειτουργία της NPC2 [14], θα χρησιμοποιηθούν για την επόμενη πέψης PNGase F για να επιβεβαιώσει εάν πρωτεΐνη ορού NPC2 ετερογένεια οφείλεται για τροποποίηση γλυκοζυλίωση μετα-μεταφραστική. Μετά την επεξεργασία με ΡΝΟάση F, NPC2 οπτικοποιήθηκε ως μία ανοσοαντιδραστική ζώνη (Σχήμα 4D). Για την περαιτέρω εξετάστηκε αν γλυκοζυλιωμένη μορφή του NPC2 σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του ήπατος, δείγματα ορού υποβλήθηκαν σε ανάλυση western αποτύπωση. Γλυκοζυλιωμένη και εν τω γεννάσθαι NPC2 εκφράστηκαν σε αναλογία 1: 1 σε κανονικούς ανθρώπινους ορούς (Σχήμα 4Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και δεν βρήκαμε καμία διαφορά στην έκφραση NPC2 ορό μεταξύ των ασθενών υγιή και λιπώδες ήπαρ, γλυκοζυλιωμένη έκφραση NPC2 ήταν η κύρια μορφή τόσο κίρρωση και ασθενείς HCC (Σχήμα 4Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα ποσά και οι αλλαγές της γλυκοζυλιωμένης μοτίβο NPC2 συνδέονται με κίρρωση και την ανάπτυξη HCC.

Επιδράσεις της NPC2 για ΜΑΡΚ σηματοδότησης

Για τον προσδιορισμό του μηχανισμού NPC2-εξαρτώμενη, τονίσαμε σχετικά με την κατάσταση της ΜΑΡΚ σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, παρατεταμένη φωσφορυλίωση των ERK1 /2 έχει παρατηρηθεί σε NPC2 knockdown κυττάρων. Ωστόσο, p38 και JNK δεν ενεργοποιούν το NPC2 νοκ ντάουν κύτταρα.

Συνολικός και φωσφορυλιωμένη ERK1 /2, p38, JNK ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western από τα κύτταρα SK-ΗΕΡ1. Νοκ ντάουν των αποτελεσμάτων NPC2 στην ενεργοποίηση των ERK1 /2.

Η

Συζήτηση

πρωτεΐνη NPC2 δεσμεύεται με ελεύθερη χοληστερόλη και ελέγχει την ενδοκυτταρική ομοιοστασία της χοληστερόλης [2]. Μετάλλαξη του γονιδίου NPC2 αποτελέσματα σε συσσώρευση χοληστερόλης στα τέλη ενδοσωμιακό /λυσοσωμιακό διαμέρισμα του κυττάρου [6]. Ωστόσο, οι ρόλοι της έκφρασης NPC2 σε ανθρώπινους καρκίνους δεν είναι πλήρως κατανοητές παρά γνωστές ρόλο της στην χοληστερίνη δεσμευτική. Σε αυτή τη μελέτη, που παράγεται και που χαρακτηρίζεται από έναν αριθμό NPC2 mAbs και στη συνέχεια αξιολογούνται ανοσοαντιδραστικότητα τους με τη χρήση πολλαπλών συστοιχιών ιστού όγκου. Από τα δεδομένα χαρτογράφησης επιτόπου, βρήκαμε ότι η NPC2 mAbs στοχευόμενων υπολειμμάτων αμινοξέων 31-40 της ανθρώπινης πρωτεΐνης NPC2 (Σχήμα 2Β). Επειδή τα κατάλοιπα αμινοξέων 31-40 είναι εξαιρετικά διατηρημένες μεταξύ των διαφόρων ορθόλογα θηλαστικού [2], αυτές NPC2 mAbs θα πρέπει να είναι πρόθυμα κατά τη διενέργεια έρευνας σχετικά με το ρόλο του NPC2 σε ένα ευρύ φάσμα ειδών θηλαστικών στο μέλλον. Η ευαισθησία και η ειδικότητα της NPC2 mAbs αξιολογήθηκε με knock-down της πρωτεΐνης NPC2 σε κύτταρα SK-ΗΕΡ1 (Σχήμα 2C).

Η χρώση IHC έδειξε ότι η έκφραση NPC2 αυξήθηκε στο στήθος, του παχέος εντέρου και του πνεύμονα (Εικόνα 3Α). Από ισχυρή έκφραση της NPC2 παρατηρείται σε ανθρώπινα ενδοπορικού θηλώματος του μαστού, πολυπόδων του παχέος εντέρου, του καρκινώματος των πνευμόνων θηλώδες και κροσσούς ωοθήκης [8,15], NPC2 πρωτεΐνη μπορεί να συμβάλει στη θηλές σχηματισμού. Επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν ότι HER-2 υποτύπο [HER-2 (+), ER (-), και PR (-)] και τριπλά αρνητικά [HER-2 (-), ER (-), και PR (-)] είχε η χειρότερη επιβίωση, κακή πρόγνωση και υψηλότερα τοποπεριοχική υποτροπής [16-19]. Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι NPC2 υπερέκφραση συνδέεται με HER-2 υποτύπου (Πίνακας 2), γεγονός που υποδηλώνει ότι NPC2 πάνω ρύθμιση μπορεί να είναι ένα ευνοϊκό προγνωστικό πρόγνωση για τον καρκίνο του μαστού.

ομοιόσταση της χοληστερόλης, είναι σημαντικό να πεταλοειδή σώματα των κυττάρων II που χρησιμεύουν για την παραγωγή επιφανειοδραστικού πνεύμονα κυψελιδικού τύπου. πρωτεΐνη NPC2 είναι παρούσα στον τύπο κυψελιδικά κύτταρα πνεύμονα II και κυψελιδικά μακροφάγα και ρυθμίζει επιφανειοδραστικό περιεκτικότητα σε χοληστερόλη [9,20]. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι NPC2 ενισχύεται σε ιστό αδενοκαρκινώματος πνεύμονα (Εικόνα 3Α). ανάλυση πρωτεομική απέδειξε επίσης ότι η έκφραση του NPC2 αυξάνεται σε πνεύμονα αδενώματος και υπεζωκοτική συλλογή [21,22]. Αν και δεν είναι ακόμη σαφές εάν NPC2 παίζει ένα ρόλο στην αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, η παρουσία πρωτεΐνης NPC2 σε πλευριτική συλλογή των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα δείχνει ότι μπορεί να έχει μια χρήση ως πιθανή διαγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του πνεύμονα.

μειωμένη έκφραση του NPC2 παρατηρήθηκε ειδικά στο νεφρό και το ήπαρ όγκου ιστών, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς. Από το NPC2 knockdown κυττάρων ινοβλαστών έχει αποδειχθεί μία παρατεταμένη φωσφορυλίωση των ERK1 /2 ΜΑΡΚ [10], NPC2 μπορεί να ρυθμίζει αρνητικά την ενεργοποίηση ΜΑΡΚ ΕΚΚ1 /2. Πράγματι, η ενεργοποίηση του ERK1 /2 παρατηρήθηκε στο NPC2 knockdown SK-ΗΕΡ1 κύτταρα (Σχήμα 5). Όσον αφορά την επίδραση της θεραπείας αντικατάστασης NPC2 σε NPC2 – /- ποντίκια, βρέθηκε ότι οι ηπατικές διήθηση μακροφάγων και ο αριθμός των λίπος-φορτωμένο κύτταρα βελτιώθηκαν σημαντικά [23]. Δεδομένου ότι η συσσώρευση λιπιδίων και στη συνέχεια φλεγμονή επιταχύνει την εξέλιξη της κίρρωση και καρκίνο του ήπατος [24,25], η χορήγηση NPC2 μπορεί να βελτιώσει την ανάπτυξη καρκίνου του ήπατος. Δεδομένου ότι το ήπαρ είναι η κύρια πηγή του πλάσματος και των χοληφόρων NPC2 [13], η αύξηση των ορών NPC2 σε κίρρωση και οι ασθενείς HCC μπορεί να σχετίζεται με την σοβαρή βλάβη των ηπατοκυττάρων. Στην παρούσα μελέτη παρατηρήσαμε επίσης αλλαγές στη γλυκοζυλιωμένη πρότυπα έκφρασης NPC2 στους ορούς τόσο κίρρωση και ασθενείς HCC, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αλλαγές αυτές μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης της κίρρωσης του ήπατος και του καρκίνου. Ν-γλυκοζυλίωσης είναι σημαντική για τη σωστή στόχευση και τη λειτουργία των NPC2 [14]. Περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να αποσαφηνιστούν οι ρόλοι της γλυκοζυλιωμένης NPC2 χρησιμοποιούν περισσότερο κίρρωση και περιπτώσεις HCC.

Στους νεφρούς, NPC2 είναι άφθονα ρητή στο άπω και εγγύς εσπειραμένο σωληνάριο (Εικόνα 3Β). Από NPC2 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε νεφρό ιστούς από Dahl άλας ευαίσθητα αρουραίο δίνεται μια δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε αλάτι [26], έχει προταθεί ότι NPC2 μπορούσε ρυθμίζουν επαναρρόφηση νατρίου στο νεφρώνα. Παρ ‘όλα αυτά, η λειτουργική συνάφεια των NPC2 σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων παραμένει ασαφής και χρειάζονται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί ο ρόλος των NPC2 στο νεφρό, τόσο φυσιολογικά και παθολογικά.

Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι NPC2 μονοκλωνικό αντίσωμα μας έχει δυνητικά χρήσιμες εφαρμογές στους τομείς της κλινικής διάγνωσης και της εξέλιξης του καρκίνου σε πολλούς ιστούς.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1.

#, HBV ή HCV δείχνουν περιπτώσεις μολύνθηκαν με HBV και τον ιό HCV, αντίστοιχα

μη-Β & amp.? μη-C δείχνουν οι ασθενείς δεν είχαν μολυνθεί από τον ιό HBV και HCV. * Η ταξινόμηση των σταδίων της παθολογίας ήταν σύμφωνα με AJCC, UICC, και CUPI

doi:. 10.1371 /journal.pone.0077586.s001

(DOC)

Πίνακας S2.

#, HBV ή HCV υποδεικνύουν περιπτώσεις μολύνθηκαν με HBV και τον ιό HCV, αντίστοιχα.

doi: 10.1371 /journal.pone.0077586.s002

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε TLCN για την παροχή των δειγμάτων ιστού HCC και συναφή κλινικά δεδομένα. Το δίκτυο αυτό περιλαμβάνει σήμερα πέντε μεγάλα ιατρικά κέντρα (Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν Νοσοκομείο, Chang-Gung Memorial Hospital-Linko, βετεράνος του Γενικού Νοσοκομείου-Taichung, Memorial Hospital Chang-Gung, Kaohsiung και βετεράνος Γενικό Νοσοκομείο, Kaohsiung).