Αφηρημένο

Ιστορικό

Ανάδοχος και 5 ‘άκρο ρύθμιση μεθυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό πολλών μορφών καρκίνου. Τέτοια περιστατικά συχνά οδηγούν στην αποσιώπηση αυτών των βασικών γονιδίων και έτσι μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Για να προσδιοριστούν οι αλλαγές μεθυλίωσης στον προστάτη καρκίνο, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο της μεθυλίωσης του DNA με τη χρήση ανθρώπινου νησί συστοιχίες CpG Agilent. Χρησιμοποιώντας υπολογιστική και γονίδιο-ειδική επικύρωση προσεγγίσεις έχουμε ταυτοποιήσει έναν μεγάλο αριθμό πιθανών επιγενετικών βιοδείκτες του καρκίνου του προστάτη. Περαιτέρω επικύρωση των υποψηφίων γονιδίων σε ξεχωριστή ομάδα των καρκίνων του προστάτη χαμηλής και υψηλής ποιότητας από την ποσοτική ανάλυση MethyLight μας επέτρεψε να επιβεβαιώσει DNA υπερμεθυλίωση

HOXD3

και

BMP7

, δύο γονίδια που μπορεί να διαδραματίσει ένα ρόλο στην ανάπτυξη υψηλής όγκων βαθμού. Δείχνουμε επίσης ότι η υπερμεθυλίωση υποστηρικτής είναι υπεύθυνος για την κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης αυτών των γονιδίων στην κυτταρική σειρά DU-145 του προστάτη.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτή η μελέτη προσδιορίζει νέα επιγενετική βιοδείκτες του καρκίνου του προστάτη και του καρκίνου του προστάτη εξέλιξης, και παρέχει μια συνολική αξιολόγηση της μεθυλίωσης του DNA στον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Kron K, Pethe V, Briollais L, Σαντίκοβιτς Β, Ozcelik Η Sunderji A, et al. (2009) ανακάλυψη νέων υπερμεθυλίωση Τα γονίδια για τον καρκίνο του προστάτη χρησιμοποιώντας Genomic CpG νησί μικροσυστοιχίες. PLoS ONE 4 (3): e4830. doi: 10.1371 /journal.pone.0004830

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Νοέμ, 2008? Αποδεκτές: 17 Φεβρουαρίου, 2009? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2009

Copyright: © 2008 Kron et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Καναδική προστάτη Πρωτοβουλία Έρευνας του Καρκίνου, του National Cancer Institute of Canada (# 18568). Οντάριο Student Ταμείο Opportunity, Scace καρκίνο του προστάτη Fellowship. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις ΗΠΑ [1]. Μελέτες έχουν δείξει ότι PCA είναι μια πολύπλοκη ασθένεια επηρεάζεται από γενετικούς και μη γενετικούς επιδημιολογικών παραγόντων, και η έγκαιρη διάγνωση είναι κρίσιμη στην κλινική αντιμετώπιση της νόσου. Μια κοινή παθολογική μεταβλητή δίνεται κατά τη διάρκεια του καρκίνου του προστάτη, με υψηλότερες βαθμολογίες αντικατοπτρίζουν κακώς διαφοροποιημένο καρκίνωμα. Gleason σκορ είναι ≤6 καρκινώματα θεωρούνται χαμηλής ποιότητας, Gleason 7 είναι μεσαίου βαθμού, καθώς και τα άτομα με Gleason σκορ 8 και πάνω θεωρούνται ως υψηλής ποιότητας (για πρόσφατη ανασκόπηση σχετικά με το σύστημα βαθμολόγησης, βλέπε [3]).

Επιγενετική οι τροποποιήσεις έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης και συχνά συμβάλλουν στην παθογένεση πολλών καρκίνων [4]. Παραδείγματα επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών περιλαμβάνουν μεθυλίωση ειδικών υπολειμμάτων λυσίνης, ακετυλίωση /αποακετυλίωση των καταλοίπων λυσίνης, φωσφορυλίωση και ουρές των ιστονών, το καθένα έχοντας ποικίλες επιδράσεις στη ρύθμιση της γονιδιακής μεταγραφής. Αυτές οι τροποποιήσεις επάγουν μη κανονικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης και ως εκ τούτου θεωρείται ότι συμβάλλουν στην ανάπτυξη του καρκίνου [5], [6]. Παρεκκλίνουσα CpG δινουκλεοτίδιο μεθυλίωση είναι μια καλά οργανωμένη επιγενετική χαρακτηριστικό πολλών μορφών καρκίνου. Παγκόσμια γενωμική υπομεθυλίωση βρίσκεται σε συνδυασμό με εντοπισμένες περιοχές υπερμεθυλίωση, τυπικά σε CpG νησίδες που συχνά συμβαίνουν σε υποκινητών ή 5 ‘περιοχές των αλληλουχιών γονιδίων [7]. Υποστηρικτής υπερμεθυλίωση δρα μαζί με συγκεκριμένες τροποποιήσεις των ιστονών να φιμώσουν γονίδια με άμεση αναστολή του μεταγραφικού παράγοντα biding [8], μέσω της σύνδεσης των πρωτεϊνών περιοχή δέσμευσης μεθυλο CpG [9], ή μέσω αλληλεπιδράσεων με ιστόνης τροποποιητικά ένζυμα [10]. Αυτή η επιγενετική μηχανισμός μπορεί να προσδώσει ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα με υπερμεθυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Κατά συνέπεια, τα γεγονότα της μεθυλίωσης του DNA μπορεί να χρησιμεύσει ως χρήσιμο βιοδείκτες [11], προωθώντας μια αναζήτηση για τις δύο διαγνωστικούς και προγνωστικούς δείκτες.

CpG νησί υπερμεθυλίωση στο PCA είναι μια κοινή εκδήλωση με πάνω από 30 υπερμεθυλιωμένων τόπους που προσδιορίζονται σήμερα [12]. Το καλύτερο που χαρακτηρίζεται από αυτά τα γεγονότα,

GSTP1

μεθυλίωση προαγωγού, εμφανίζεται σε & gt? 90% των καρκίνων και το 70% του προδρόμου υψηλού βαθμού προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) αλλοιώσεις [13], [14] και μπορεί επίσης να είναι ανιχνεύθηκαν σε δείγματα αίματος και ούρων [15]. Έτσι,

GSTP1

μεθυλίωση μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα χρήσιμο διαγνωστικό δείκτη για την PCA. Πρόσφατα, σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στον τομέα της υψηλής απόδοσης Γενετικής προσυμπτωματικού ελέγχου για τον προσδιορισμό νέων στόχων της μεθυλίωσης του DNA [16]. Στη συνέχεια, έχουν άλλα καλά χαρακτηρίζεται υπερμεθυλιωμένων γονίδια έχουν εντοπιστεί σε προστάτη συμπεριλαμβανομένων των

RASSF1A

,

Cdh1

, και

CDKN2A

, για να αναφέρουμε μερικές. Ωστόσο, κανένα γονίδιο μελετηθεί μέχρι σήμερα έχει χαρακτηριστεί ως ειδική διαγνωστική /προγνωστική βιοδείκτη σε προστάτη είναι παρόμοια με

GSTP1

[17], [18].

Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να αναλύσουμε μεθυλίωσης σε ευρεία κλίμακα γονιδιώματος με χρήση ανθρώπινων νησί μικροσυστοιχίες CpG να αποκαλύψει νέα methylatled τόπους στο εσωτερικό του καρκίνου του προστάτη. Μεταξύ μιας ομάδας νέων ή /και διαφορικά μετουσιωμένο τόπους που εντοπίσαμε, χαρακτηρίσαμε περαιτέρω

HOXD3

και

BMP7

χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό ανάλυσης MassARRAY® EpiTYPER και ποσοτική ανάλυση MethyLight, και αξιολογούνται έκφραση σε κύτταρα DU-145 του προστάτη.

Μέθοδοι

δείγματα Ασθενών

20 δείγματα φρέσκου κατεψυγμένου προστάτη ιστού (10 Gleason σκοράρει 6 ή καθαρό μοτίβο 3 (PP3), και 10 σκορ Gleason 8 ή καθαρό μοτίβο 4 (ΔΜΠ4)) που λαμβάνονται από δείγματα προστατεκτομή σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη διαγνώστηκε μεταξύ 2001 και 2007 συλλέχθηκαν από την τράπεζα ιστών στο Πανεπιστημιακό Δίκτυο Υγείας (UHN), Τορόντο. Οι ασθενείς οι οποίοι είχαν θεραπεία πριν την επέμβαση αποκλείστηκαν. Μια άλλη σειρά δειγμάτων που αποτελείται από 39 φορμόλη-σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη δείγματα (FFPE) προστάτη (20 ΔΜΠ3 και 19 ΔΜΠ4) από τους ασθενείς διαγνώστηκαν μεταξύ 2006 και 2008 ήταν παρομοίως που συλλέγονται για το σύνολο επικύρωσης. Όλοι οι ασθενείς συναινέσει στην δωρεά αφαιρεθεί ιστού στην τράπεζα ιστών UHN και τα δείγματα ελήφθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας Έρευνας από το Mount Sinai Hospital (MSH) και UHN, Toronto, ON, Καναδάς. δείγματα προστάτη υποβλήθηκαν σε ιστολογική εξέταση από έναν παθολόγο εμπειρογνωμόνων (TVDK) για την ανεξάρτητη επιβεβαίωση των βαθμών Gleason.

Οι κυτταρικές σειρές και DNA εξόρυξη

Ανθρώπινο προστάτη κυτταρικές σειρές LNCaP (ATCC # CRL- 1740 ), DU-145 (ATCC # ΗΤΒ-81), PC-3 (ATCC # 59500) και 22RV1 (ATCC # CRL- 2505) ελήφθησαν από τους Drs. Μ Zielinska, R. Bristow, και E. Διαμαντή. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ως μονοστοιβάδες σε RPMI 1640 (Life Technologies), και συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C. DNA εκχυλίστηκε μετά τη συγκομιδή των κυττάρων με θρυψινοποίηση ακολουθούμενο από εκχύλιση του DNA χρησιμοποιώντας DNA QIAamp μίνι κιτ (Qiagen Inc, Mississauga, ΟΝ, Canada), χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που συνιστάται από τον προμηθευτή.

5-αζα 2 ‘-deoxycitidine (ΕΑΒ) θεραπεία και RT-PCR

Ένα ml διαλύματος 250 μg /απόθεμα 5- αζα- 2-δεοξυκιτιδίνη (DAC) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Καναδάς) παρασκευάστηκε σε νερό και διατηρούνται σε -80 ° C μέχρι τη χρήση. DU-145 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 6 πιάτα cm και επωάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας με 2 μg /ml DAC για 4 ημέρες με αλλαγή μέσου κάθε 2 ημέρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που συνιστάται από τον προμηθευτή.

Primer αλληλουχίες για RT-PCR του

BMP7

και

HOXD3

έχουν περιγραφεί στο παρελθόν [19], [20] και έχουν ως εξής: (

BMP7

προς τα εμπρός) 5′-AGA GCA TCA ACC CCA AGT-3 ‘, (

BMP7

αντίστροφη) 5′-CTA CTC ΑΓΓ CCC CAG CTT-3 ‘? (

HOXD3

προς τα εμπρός) 5′-ΑΟΟ ATC CTG GTC TGA ACT CAG AGC AGC AGC3 », (

HOXD3

αντίστροφη) 5′-ACT CGA Γ.Ο.Σ. CAT CCG CCG Γ.Ο.Σ. CTG GAA CCA-3 ‘.

DNA απομόνωση

Φρέσκα κατεψυγμένα αρχειοθετημένα ιστού ήταν καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο, συνθλίβονται, και γενωμικό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp DNA mini (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κιτ. FFPE ιστός χωρισμένο (7 μm) και ξηραίνεται στον αέρα επάνω σε διαφάνειες. Περιοχές με μια ξεχωριστή βαθμό Gleason στην H & amp? Ε βάφονται διαφάνειες με τουλάχιστον 80% ή περισσότερο νεοπλασματικά κύτταρα σημειώνονται και οι αντίστοιχες περιοχές εντοπίστηκαν σε τμήματα FFPE για τα κύτταρα συγκομιδή. Ξεχωριστά δείγματα με ιστολογικά επιβεβαιωμένο φυσιολογικό ιστό χαρακτηρίστηκαν επίσης. Τα εμπλουτισμένα κυτταρικοί πληθυσμοί από επισημανθεί περιοχές στη συνέχεια με το χέρι μικροτομή και γενωμικό DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ QIAamp DNA μίνι χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο με εκτεταμένη πέψη με πρωτεϊνάση Κ. Εν συντομία, σε μικροδιατομή ιστός υπέστη πέψη σε 30 μL πρωτεϊνάσης Κ στους 56 ° C όλη τη νύκτα, ακολουθούμενο από την πρόσθεση 20 μL πρωτεϊνάση Κ και πέψης για μία ώρα στους 56 ° C την επόμενη ημέρα. Η Qiagen συνιστώμενο πρωτόκολλο για FFPE ιστός στη συνέχεια ακολούθησε.

Διαφορική μεθυλίωση Hybridization (DMH) και Ανθρωπίνων CpG νησί μικροσυστοιχίες

Η τεχνική υβριδισμού μεθυλίωση απόκλιση για την παρασκευή μεθυλιωμένων αμπλικονίων διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, γονιδιακό DNA (0.2 μg) από ΔΜΠ3 και ΔΜΠ4 περιπτώσεις υπέστη πέψη με

MSE

I. Τα διασπασμένα άκρα συνδέθηκαν με ανόπτηση H-12 /H-24 συνδετήρες, που ακολουθείται από περαιτέρω πέψη με δύο διαδοχικούς γύρους πέψη με ευαίσθητων σε μεθυλίωση ενζύμων, δηλαδή

Ηρ

II και

Bst

UI . Αντιδράσεις PCR Linker διεξήχθησαν στη συνέχεια με προ-επεξεργασία του DNA για να δημιουργήσει τα τελικά αμπλικόνια-στόχους για υβριδισμό μικροσυστοιχιών. Τελική αμπλικόνια καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ καθαρισμού QIAquick PCR (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το δείγμα αναφοράς απετελείτο από DNA που απομονώθηκε από λεμφοκύτταρα έξι υγιείς ίδιας ηλικίας με τους ασθενείς PCa άνδρες. δείγματα αναφοράς παρόμοια επεξεργασία για την τελική παραγωγή στόχου και συγκεντρώθηκαν αμπλικόνια ήταν συν-υβριδοποιήθηκαν στις περιπτώσεις δοκιμών για μεμονωμένες συστοιχίες.

Ανάλυση Δεδομένων

Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών που παράγεται είναι συμβατό με τα ισχύοντα πρότυπα MIAME σύμφωνα με Brazma

et al

[22].

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το στατιστικό πακέτο

limma

του

R

[23]. Η αρχή είναι να χωρέσει ένα γραμμικό μοντέλο για κάθε ανιχνευτή, όπου το αρχείο καταγραφής

2 αναλογία των ερυθρών έντασης του καναλιού και το πράσινο ένταση κανάλι υποχώρησε σε μια μεταβλητή δείκτης όγκου (Ι). Πραγματοποιήσαμε τρεις συγκρίσεις: Αγνό Pattern 3, Gleason 6 (ΔΜ3) (I = 1) έναντι αναφοράς (I = 0), Pure Pattern 4, Gleason 8 (ΔΜΠ4) (I = 1) έναντι αναφοράς (I = 0) και ΔΜΠ4 (I = 1), εναντίον ΔΜΠ3 (I = 0), για να βρουν γονίδια που έχουν διαφορετικά προφίλ μεθυλίωσης μεταξύ των δύο ομάδων σε σύγκριση. Οι συγκρίσεις αυτές είναι ανάλογες με μια κλασική δύο δειγμάτων

t-test

ανάλυση. Εναλλακτικά, χρησιμοποιήσαμε επίσης μια εμπειρική Bayes

t-test

. Αυτό έχει την ίδια ερμηνεία όπως ένα συνηθισμένο

t

-statistic εκτός από το ότι έχουν τα τυπικά σφάλματα έχουν μετριαστεί σε όλη γονίδια (συρρικνωθεί προς μια κοινή αξία) χρησιμοποιώντας ένα απλό Bayesian μοντέλο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να δανείζονται στοιχεία από το σύνολο των γονιδίων για να κάνουν το συμπέρασμα για κάθε γονίδιο πιο ισχυρή. Η συντόνισε

t

-statistic έχει αυξημένο αριθμό των βαθμών ελευθερίας σε σχέση με τη συνήθη

t

-statistic, αντανακλώντας τη μεγαλύτερη αξιοπιστία που συνδέεται με την ομαλοποιημένη τυπικό σφάλμα. Οι αναλύσεις μας έγιναν μετά την προ-επεξεργασία των δεδομένων. Στην πρώτη περίπτωση, θα χρησιμοποιηθεί μια μέθοδος διόρθωσης υποβάθρου που παρέχεται από Agilent. Στη δεύτερη περίπτωση, θα χρησιμοποιηθεί μια μέθοδος εμφυτεύεται στο

limma

. Ένα συνέλιξη των φυσιολογικών και εκθετική κατανομή είναι εφοδιασμένο στις εντάσεις προσκήνιο χρησιμοποιώντας τις εντάσεις φόντο ως συμμεταβλητή, και το αναμενόμενο σήμα δίνεται η παρατηρούμενη προσκήνιο γίνεται η διορθωμένη ένταση. Αυτό οδηγεί σε μια ομαλή μονοτονική μεταμόρφωση του φόντου αφαιρείται εντάσεις έτσι ώστε όλες οι διορθωμένες εντάσεις είναι θετικές. Και οι δύο μέθοδοι απέδωσε καλά για τα δεδομένα μας. Στη συνέχεια εφαρμόζεται ένα loess διαδικασία κανονικοποίησης μέσα συστοιχίες για να απομακρύνετε τυχόν συστηματικές τάσεις που προκύπτουν από την τεχνολογία μικροσυστοιχιών από τα μέτρα μεθυλίωση [24].

Partek Ανάλυση Δεδομένων και Ολοκλήρωσης

Τα στοιχεία από την Agilent εξαγωγή χαρακτηριστικών λογισμικό .txt αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την Partek Genomic Suite Software (PGS) χρησιμοποιώντας μία τροποποίηση των προηγουμένως περιγραφέντων πρωτοκόλλων [25], [26]. Τα δεδομένα που υποβάλλονται σε επεξεργασία R και στήλη G από 10 ΔΜΠ3 και 10 ΔΜΠ4 εισήχθησαν PGS. Το επεξεργασμένο σήμα R αντιστοιχεί στην DNA όγκου και επεξεργασμένου σήματος G αντιστοιχεί στην κανονική DNA των λεμφοκυττάρων. Το σήμα του καρκίνου ειδικά σε όλους τους ανιχνευτές ομαλοποιήθηκε ως αναλογία με την αρχική τιμή με τη χρήση αναγωγής σε Baseline Εργαλείο PGS, όπου τα δεδομένα βάσης αντιστοιχεί στην κανονική DNA ανθρώπινων λεμφοκυττάρων. Τα δεδομένα στη συνέχεια συνδεθείτε

2 μετασχηματίζονται χρησιμοποιώντας την PGS Κανονικοποίηση και κλιμάκωση Tool.

Αυτές οι κανονικοποιημένες και να μετατραπεί σύνολο δεδομένων στη συνέχεια χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του καρκίνου συγκεκριμένα προφίλ μεθυλίωσης, και δευτερευόντως να γίνει διάκριση μεταξύ ΔΜΠ4 και ΔΜΠ3 ειδικών προφίλ μεθυλίωσης. Προκειμένου να εντοπίσει σημαντικές ειδική για τον καρκίνο του εμπλουτισμού /εξάντληση, πραγματοποιήσαμε Hidden Markov Model (HMM) ανίχνευσης περιοχή σε όλη περίπου 244.000 ανιχνευτές με τις ακόλουθες παραμέτρους: ελάχιστη ανιχνευτές: 5, τα κράτη ανίχνευσης: -2 & amp? 2? αγνοούν τα κρατικά: 0, μέγιστη πιθανότητα: 0.95, γονιδιωματική αποσύνθεσης: 10.000, Sigma: 1. Οι εν λόγω ανιχνεύεται περιοχές του γονιδιώματος σχολιάστηκαν με τα αντίστοιχα γονίδια, χρησιμοποιώντας το εργαλείο γονίδιο σχολιασμού PGS με Affymetrix HuGene-1_0-st-v1.na24.hg18.transcript .csv αρχείο. Εκτός από τα άμεσα επικαλυπτόμενα γονίδια, γονίδια εγγύς (μέχρι και κατάντη 1000 νουκλεοτίδια) του εμπλουτισμένου /εξαντλημένο περιοχές ήταν επίσης σχολιασμένη.

Σημαντικές διαφορές στην εμπλουτισμό μεταξύ ΔΜΠ3 και οι όγκοι ΔΜΠ4 ταυτοποιήθηκαν με τον υπολογισμό της μέσης διαφοράς φορές μεταξύ του PP3 και κανονικοποιημένο σήμα ΔΜΠ4 σε όλους τους ανιχνευτές, χρησιμοποιώντας το εργαλείο PGS ANOVA, και επακόλουθη ανίχνευση περιοχή ΗΜΜ και σχολιασμό γονιδίων χρησιμοποιώντας τις προαναφερθείσες παραμέτρους. Τέτοιες περιοχές του γονιδιώματος περαιτέρω διηθήθηκαν να περιλαμβάνουν αλληλουχίες με ελάχιστο εμπλουτισμό 1,3 φορές, και η ελάχιστη -1,3 φορές εξάντληση. Η οπτικοποίηση των δεδομένων με τη χρήση χαρτών θερμότητας, .wig αρχεία για UCSC γονιδίωμα Browser, προβολή αρχείων γονιδιώματος, και των αντίστοιχων πινάκων δεδομένων /κατάλογοι πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας PGS όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [26].

MassARRAY EpiTYPER Ανάλυση

η ποσοτική ανάλυση των CpG δινουκλεοτιδίου μεθυλίωσης διεξήχθη χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας προσέγγιση ως διαθέσιμα με ανάλυση MassARRAY® EpiTYPER (Sequenom). ανάλυση EpiTYPER είναι μια MALDI TOF φασματομετρία μάζας μέθοδος που βασίζεται η οποία παρέχει μια ποσοτική άποψη των CpG δινουκλεοτιδίου μεθυλίωσης σε μία ή πολλαπλές ανάλυση δινουκλεοτίδιο. DNA αρχικά όξινο θειώδες τροποποιηθεί, με ετικέτα με έναν προωθητή Τ7, και μεταγράφεται σε RNA. Αυτό στη συνέχεια διασπάται με RNase Α και τα προϊόντα διάσπασης της διαφορετικής μάζας μπορεί να επιλυθεί από το όργανο MS. Η ανάλυση διεξήχθη με την αναλυτική Genetics Technology Centre (AGTC), Princess Margaret Hospital, Toronto, ON σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα υποσύνολο των νωπών DNA κατεψυγμένου ιστού που χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση CpG νησί μικροσυστοιχιών. Περιοχές που αναλύθηκαν από EpiTYPER αντιστοιχούσαν σε εκείνες που έδειξαν εμπλουτισμένο σήμα στα CpG αποτελέσματα συστοιχία νησιού. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και οι μέσοι όροι και τα τυπικά σφάλματα υπολογίστηκαν.

όξινο θειώδες νάτριο Τροποποίηση και MethyLight

όξινο θειώδες νάτριο τροποποίηση του γενωμικού DNA διεξήχθη με τη χρήση του EZ μεθυλίωσης του DNA Gold Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας 0.8 μα παραφινώδη ενσωματωμένων DNA ιστού.

επίπεδα μεθυλίωσης των δύο γονιδίων που ενδιαφέρουν προσδιορίστηκαν με ποσοτική μεθυλίωση ειδική PCR (MSP), το MethyLight δοκιμασία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν ειδικά για θειώδους μετατροπή, μεθυλιωμένο DNA και έχουν ως εξής: (

BMP7

προς τα εμπρός) 5′-CGT ΤΤΤ ΤΤΤ GGT TCG GAT CGC-3 ‘, (

BMP7

καθετήρα ) 6FAM-5′-ΟΤΟ ΤΕΕ AGA GGG TAG GGT CGG ΤΤΤ CG-3′-BHQ1, (

BMP7

αντίστροφη) 5′-CTA ΑΑΑ ΚΔ AAC GAA ACG TCG CG-3 ‘? (

HOXD3

προς τα εμπρός) 5′-GTT TTG GTA ΤΤΤ CGG GTT ΤΤΤ ATC G-3 ‘, (

HOXD3

καθετήρα) 6FAM-5′-AAG AGC Γ.Ο.Σ. TGG GGG AGG GGG GC- 3′-BHQ1, (

HOXD3

αντίστροφη) 5′-ΤΑΑ AAC TCC ΤΑΑ CTT CGC GCT ACG-3 ‘? (

Alu

προς τα εμπρός) 5′-GGT TAG GTA TAG TGG ΤΤΤ ΑΤΑ ΤΤΤ GTA ΑΤΤ ΤΤΑ GTA-3, (

Alu

καθετήρα) 6FAM-5′-ΚΔ ACC ΤΤΑ ACC TCC C- 3′-MGBNFQ, (

Alu

αντίστροφη) 5′-ΑΤΤ AAC ΤΑΑ ACT ΑΑΤ CTT ΑΑΑ CTC CTA ACC TCA-3 ‘. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν για την Real Time PCR όργανο Applied Biosystems 7500. Πρότυπες καμπύλες δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας σειριακές αραιώσεις του θετικού μάρτυρα supermethylated DNA για το γονίδιο που ενδιαφέρει και

Alu

επαναλαμβάνεται. μεθυλιωμένα ποσοστιαία αναλογία (PMR) για ένα γονίδιο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας

Alu

επαναλαμβάνεται, όπως αναφοράς ως εξής: (γονίδιο /

Alu αναλογία ποσότητας

φθορισμού για τροποποιημένου DNA δείγματος) /(γονίδιο /

Alu

λόγος για supermethylated DNA) Χ 100%. Ένα θετικό αποτέλεσμα για μεθυλίωση δόθηκε εάν PMR για ένα δεδομένο όγκο ήταν ≥10%.

Αποτελέσματα

Ανάλυση της γονιδιωματικής μεθυλίωσης

Εμείς χώριζε την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μας σε δύο υποσύνολα. Το πρώτο υποσύνολο αποτελούνταν από όλες τις 20 δειγμάτων καρκίνου σε σύγκριση με αναφοράς DNA. Μια λίστα των γονιδίων που ταυτοποιήθηκαν ως υπερμεθυλίωση σημαντικά τις στατιστικές μεθόδους που εκτελούνται για τον καρκίνο σε σχέση με το σύνολο δεδομένων αναφοράς (ΔΜΠ3 & amp? ΔΜΠ4 έναντι αναφοράς DNA) απεικονίζεται στον Πίνακα 1. Είναι ενδιαφέρον, 27 από τις 100 κορυφαίες μεθυλιωμένο γονίδια (ανάλογα με ατομικές φορές καθετήρα μεταβολή) από τον καρκίνο /σύνολο δεδομένων αναφοράς είναι ομοιοακολουθίας ή Τ-box γονίδια (Πίνακας 2), σύμφωνα με την τρέχουσα βιβλιογραφία μοτίβα ανάλυση μεθυλίωσης σε άλλους καρκίνους συμπεριλαμβανομένων αυτών του πνεύμονα, του μαστού, και του παχέος εντέρου [28], [29], [30 ]. Μπορούμε επίσης να βρεθεί & gt? Σήματος 2 φορές σε γονίδια που έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως ως μεθυλιώνονται στον καρκίνο του προστάτη, όπως

CDKN2A

(μέσος όρος 15,8 εμπλουτισμού φορές),

RUNX3

(2,8 φορές), και

PTGS2

(2,9 φορές). Το γονίδιο που δείχνει το μεγαλύτερο βαθμό μεθυλίωσης ήταν

FOXC1

με μια μέση μεταβολή φορές από 60,9 σε σχέση με το DNA αναφοράς. Χρησιμοποιώντας PGS, η οποία περιορίζεται ανάλυση για πολλαπλούς ανιχνευτές που δείχνει τον εμπλουτισμό, ο μεγαλύτερος βαθμός μεθυλίωσης σε ένα χαρακτηρισμένο γονίδιο ήταν

HOXD9

(3,2 φορές αλλαγή σε ολόκληρη 8 ανιχνευτές).

Η

το δεύτερο υποσύνολο των δεδομένων σε σύγκριση με τις δέκα ΔΜΠ3 περιπτώσεις στις περιπτώσεις 10 ΔΜΠ4, το οποίο θα ονομάζεται το σύνολο δεδομένων εξέλιξης. Χρησιμοποιώντας ένα 2-φορές κατά μέσο όρο διαφορά σήματος εμπλουτισμό μεταξύ των δύο προτύπων ως cut-off, ανακαλύψαμε ένα σύνολο 493 ανιχνευτές σειρά που είναι σε θέση να διακρίνουν μεταξύ ΔΜΠ3 και καρκίνους ΔΜΠ4. Στη συνέχεια φιλτράρονται πολλαπλούς ανιχνευτές που αντιπροσωπεύουν το ίδιο γονίδιο και ανιχνευτές που εκπροσωπούν μη χαρακτηρισμένα θέσεις, δίνοντας μια τελική λίστα με τις 223 μεμονωμένα γονίδια. Ένα ειδικό ανιχνευτή που εκπροσωπούν τον τομέα της ΚΓΠ-Gly που περιέχει την οικογένεια πρωτεϊνών σύνδεσης, μέλος 4 (

CLIP4

) έδειξε την μεγαλύτερη διαφορά φορές μεταξύ των δύο προτύπων (6.5). Χρησιμοποιώντας PGS για στατιστική ανάλυση, πρόσθιου ομοιοακολουθίας 1 (

VAX1

) εμφανίζεται η μεγαλύτερη μέση διαφορά φορές (2.7) σε πολλαπλούς ανιχνευτές (6 συνολικά). Μια αντιπροσωπευτική εικόνα των γονιδίων από την ανάλυση PGS δίνεται στον Πίνακα 1. Παρόμοια με το σύνολο δεδομένων του καρκίνου /αναφοράς, 23 από τις 100 κορυφαίες γονίδια ανάλογα με τη μεταβολή καθετήρα φορές από το σύνολο δεδομένων της εξέλιξης είναι γονίδια ομοιοκυτίου (Πίνακας 2).

Εμείς επόμενο επιλέγονται δύο γονίδια από αυτές τις λίστες για περαιτέρω ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό τεχνικών που βασίζονται μεθυλίωσης και έκφρασης. Τα κριτήρια επιλογής περιελάμβαναν την βιολογική λειτουργία του γονιδίου, συμμετοχή σε /συμβολή του καρκίνου του προστάτη, και η στατιστική σημαντικότητα από CpG αποτελέσματα μικροσυστοιχιών

Gene ειδική ανάλυση μεθυλίωσης

Τα γονίδια που επιλέγονται για ανάλυση ήταν:.

BMP7

[μορφογόνο πρωτεΐνη οστών] (χρωμόσωμα # 8ρ21), ένα γονίδιο που ήδη εμπλακεί σε προστάτη εξέλιξη [31], η οποία είχε προηγουμένως αναφερθεί ως μεθυλιωμένο σε ολιγοδενδρογλοίωμα κυτταρική γραμμή και γαστρικών καρκίνων [32] , [33]. Αποφασίσαμε να διερευνήσει περαιτέρω το προφίλ της μεθυλίωσης του, λόγω των θεωρούμενων αρνητική ρύθμιση της στον προστάτη εξέλιξη [31] και παρατηρήθηκε σήμα μεθυλίωσης στο σύνολο δεδομένων του καρκίνου /αναφοράς μας (3,2 φορές εμπλουτισμός), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεθυλίωση του γονιδίου μπορεί να παίζει ρόλο στην εξέλιξη της ΣΕΣΣ.

HOXD3

[Homoebox παράγοντας μεταγραφής] (χρωμόσωμα # 2q31-37), ένα γονίδιο βρέθηκε να μεθυλιωθεί σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και πρωτογενείς όγκους [34], η οποία έδειξε ένα σαφές σχέδιο για την αύξηση μεθυλίωση με το βαθμό του όγκου σε σειρά μας με βάση τη μέση διαφορά εμπλουτισμού (6.4), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεθυλίωση του γονιδίου μπορεί να εμπλέκονται στην εξέλιξη της ασθένειας, καθώς και.

η

Partek γραφική και heatmap οπτικοποίηση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών είναι φαίνεται για τα δύο γονίδια στο σχήμα 1.

(Α)

BMP7

και (Β)

HOXD3

. γραφήματα γραμμής στην άνω πλευρά του κάθε αρχείου καταγραφής show

2 τιμές αναλογία για κάθε ανιχνευτή, με κόκκινο περιπτώσεις που εκπροσωπούν ΔΜΠ4 Α-J και μπλε αντιπροσωπεύουν περιπτώσεις ΔΜΠ3 1-10. Το κατώτερο πάνελ του καθενός είναι ένας χάρτης θερμότητας για κάθε ανιχνευτή σε μεμονωμένες ΔΜΠ4 και ΔΜΠ3 περιπτώσεις. Κόκκινα βέλη αντιστοιχούν σε περιοχές που έχουν επιλεγεί για την ανάλυση EpiTYPER ενώ μαύρα βέλη αντιστοιχούν σε περιοχές που επιλέχθηκαν για την ανάλυση MethyLight.

Η

EpiTYPER ποσοτικοποίηση των CpG μεθυλίωση

Η ανάλυση EpiTYPER περιλαμβάνεται ένα υποσύνολο των περιπτώσεων που έδειξε εμπλουτισμός των ≥3 φορές ή έλλειψη σήματος μεθυλίωσης (≤2 φορές) σχετικά με τις μικροσυστοιχίες. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από την ανάλυση EpiTYPER επιβεβαίωσε τα προφίλ εμπλουτισμού /μεθυλίωσης στο

BMP7

και

HOXD3

που ήταν εμφανές από τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών σε ένα σύνολο τεσσάρων περιπτώσεων μικροσυστοιχιών που επιλέχθηκε για ανάλυση (Σχήματα 2, 3) . Για

BMP7

, μεθυλίωση της περιοχής που προσδιορίζονται από ανάλυση μικροσυστοιχιών μας επιβεβαίωσαν ότι για τα δείγματα Β και 3, υπήρχε ένα σημαντικό επίπεδο μεθυλίωσης σε σύγκριση με εκείνη του DNA αναφοράς (έως και 76% για το CpG δινουκλεοτίδιο 4 δείγμα Β) (σχήματα 2Α, Β). Αυτά τα δείγματα είχαν μέση μεθυλίωση του 43% και 52% (μεθυλιωμένο αναλογία /μη μεθυλιωμένο, δίνεται ως επί τοις εκατό), αντίστοιχα, σε όλες τις 35 CpGs που αναλύθηκαν, ενώ τα δείγματα Ι και 4 έδειξαν μία μέση CpG μεθυλίωση του 14% και 17%, αντίστοιχα.

HOXD3

εμφανίζεται ένα ευδιάκριτο μοτίβο αυξημένης μεθυλίωσης στις περιπτώσεις ΔΜΠ4 σε σύγκριση με τις περιπτώσεις ΔΜΠ3. Η ανάλυση των δειγμάτων νωπών κατεψυγμένων DNA F, Ι, 4, και 8 επιβεβαίωσε διαφορικό πρότυπο μεθυλίωσης από PP3 να ΔΜΠ4, τουλάχιστον όσον αφορά τις τέσσερις περιπτώσεις που αναλύθηκαν (Σχήμα 3Α, Β). περιπτώσεις υψηλού βαθμού F και είχα ένα μέσο μεθυλίωσης του 72% και 43% αντίστοιχα, σε όλες τις 27 CpG δινουκλεοτίδια αναλύονται, ενώ οι χαμηλές δείγματα βαθμού 4 και 8 είχαν αντίστοιχα κατά μέσο όρο μεθυλίωση του 19% και 35%.

(Α) περιπτώσεις ΔΜΠ3 3 και 4 και (Β) περιπτώσεις ΔΜΠ4 Β και λεμφοκυττάρων Ι αναφοράς εμφανίζεται για το καθένα. Χρωματιστά μπάρες αντιπροσωπεύουν το μέσο μεθυλίωσης πάνω από τρεις επαναλήψεις με το πρότυπο μπάρες σφάλματος.

Η

(Α) περιπτώσεις ΔΜΠ3 4 και 8 και (Β) περιπτώσεις ΔΜΠ4 F και Ι Αναφορά λεμφοκυττάρων εμφανίζεται για το καθένα. Χρωματιστά μπάρες αντιπροσωπεύουν το μέσο μεθυλίωσης πάνω από τρεις επαναλήψεις με το πρότυπο μπάρες σφάλματος.

Η

MethyLight Ανάλυση

Για να επαληθεύσετε μοτίβα μεθυλίωσης των γονιδίων αυτών, εμείς τους επικυρώνονται σε μια ανεξάρτητη σειρά τομές παραφίνης περιπτώσεις προστάτη, με συμφωνημένα φυσιολογικό ιστό από τα ίδια δείγματα όπου αυτά είναι διαθέσιμα, καθώς επίσης και αξιολόγησε την κατάσταση μεθυλίωσης τους σε κυτταρικές σειρές προστάτη (DU-145, PC-3, 22RV1, και LNCaP) χρησιμοποιώντας MethyLight.

BMP7

μεθυλίωση επαληθεύτηκε σε συνολικά 4 δείγματα όγκων (δύο PP3, δύο ΔΜΠ4) καθώς και δύο φυσιολογικά δείγματα από ξεχωριστές περιπτώσεις (Σχήμα 4Α).

HOXD3

μεθυλίωση ήταν παρούσα σε ένα σύνολο οκτώ δειγμάτων (δύο PP3, έξι ΔΜΠ4) (Σχήμα 4Β). DU-145 κύτταρα ήταν θετικά για μεθυλίωση των δύο

BMP7

και

HOXD3

. Οι τιμές PMR για DU-145 και θετικές περιπτώσεις δίνονται στον πίνακα 3.

(Α)

BMP7

και (Β)

HOXD3

MethyLight οικόπεδα ενίσχυσης. Το x-άξονας δείχνει τον αριθμό του κύκλου, ενώ ο y-άξονας δείχνει το δέλτα αξία Rn. + Ctrl -. Supermethylated DNA

Η

RT-PCR

επόμενο αντιμετωπίζονται DU-145 κύτταρα με τον παράγοντα απομεθυλίωσης ΕΑΒ και εκτελούνται ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR με τη χρήση μη επεξεργασμένων και τα επεξεργασμένα κύτταρα να εκτιμηθεί η επίδραση της μεθυλίωσης επί της έκφρασης για τα δύο γονίδια.

HOXD3

έκφραση φαίνεται να καταργηθεί εντελώς μη επεξεργασμένα κύτταρα DU-145, ενώ

BMP7

είναι ελάχιστα εκφράζεται. Η θεραπεία με DAC που επάγεται

HOXD3

έκφραση και προκάλεσε αύξηση των

BMP7

επίπεδα του mRNA (Σχήμα 5), υποδεικνύοντας ότι η μεθυλίωση ενέχεται στην μειωμένη έκφραση των δύο

BMP7

και

HOXD3

Η

NTC -. κανένας έλεγχος πρότυπο. -DAC – Χωρίς θεραπεία. + DAC – αγωγή με 5-αζα-2-δεοξυκυτιδίνη

Η

Συζήτηση

Έχουμε χρησιμοποιήσει την ανθρώπινη νησί μικροσυστοιχίες CpG για τον εντοπισμό μεθυλιωμένα γονίδια σε προστάτη στο σύνολό της, καθώς και διαφορικά. μεθυλιωμένο σε χαμηλής ποιότητας, η ΔΜ3 και υψηλής ποιότητας, ΔΜΠ4 ΣΕΣΣ. Ενδιάμεσο Gleason score 7 όγκοι δεν εξετάστηκαν, δεδομένου ότι αποτελούνται από δύο σχέδια 3 και 4, και εμείς επιλέξαμε να περιορίσετε την εστίασή μας σε αυτές τις όγκοι που αποτελούνται εξ ολοκλήρου από Gleason μοτίβο 3 ή Gleason μοτίβο 4, προκειμένου να εμπλουτιστεί πληθυσμούς μοτίβο κυττάρων. Βρήκαμε ότι ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει νησίδες CpG που είναι τόσο ποσοτικά όσο πιο μετουσιωμένο και μετουσιωμένο σε αυξημένη συχνότητα σε όγκους ΔΜΠ4 σε σύγκριση με τους όγκους ΔΜΠ3. Αυτό μπορεί να αντικατοπτρίζει μια συνολική στροφή προς μια μεγαλύτερη κατάσταση της μεθυλίωσης στο υποστηρικτής CpG νησίδες όπως ο όγκος εξελίσσεται προς ένα ανώτερο βαθμό.

Τα περισσότερα γονίδια αποκάλυψε μέσα από συστοιχίες μας έχουν είτε δεν έχει αποδειχθεί ότι είναι μεθυλιωμένα στον προστάτη ή σε άλλους τύπων καρκίνου. Άλλες περιγράφηκε προηγουμένως μεθυλιωμένα γονίδια σε καρκίνο του προστάτη, όπως

CDKN2A

,

PTGS2

, και

RUNX3

, όλα έδειξαν απόδειξη της μεθυλίωσης με βάση φορές αλλαγές και στατιστική σημαντικότητα. Η αυστηρότητα των στατιστικών αναλύσεων που πραγματοποιήσαμε μπορούσε να είχε αποτρέψει τη συμπερίληψη αυτών των γονιδίων μέσα σε κορυφαία γονίδια μας της εξέλιξης ή του συνόλου δεδομένων του καρκίνου /αναφοράς. Ως εκ τούτου, αυτό μπορεί να μην είναι ενδεικτική της έλλειψης μεθυλίωσης, αλλά αντ ‘αυτού μπορεί να εξηγηθεί από ποσοτικά επίπεδα μεθυλίωσης. Είναι πιθανό ότι η μεθυλίωση αυτών των γονιδίων μπορεί να έχει συμβεί σε λιγότερα κύτταρα ή /και σε ένα μικρότερο αριθμό CpG δινουκλεοτιδίων, παράγοντας έτσι ένα λιγότερο ισχυρό σήμα σε οθόνη μας. Εναλλακτικά, η ομαδοποίηση των περιπτώσεων στις στατιστικές αναλύσεις μπορεί να φιλτράρεται αυτά τα γονίδια έξω, δεδομένου ότι μεθυλίωση σε έναν μικρότερο αριθμό δειγμάτων θα δημιουργήσει μια χαμηλότερη μέση και υψηλότερη μεταβλητότητα σε αυτές τις περιπτώσεις. Ήμασταν έκπληκτοι να διαπιστώσουν ότι η καλύτερη χαρακτηρίζεται εκδήλωση μεθυλίωση σε προστάτη, υπερμεθυλίωση του

GSTP1

υποκινητή, δεν συνελήφθη στα αποτελέσματα οθόνη σειρά μας. Είναι πιθανό ότι η μέθοδος που χρησιμοποιείται για την παρασκευή του DNA στόχου σε συνδυασμό με την πλατφόρμα μικροσυστοιχιών είναι υπεύθυνη για την έλλειψη ανίχνευσης

GSTP1

σήμα μεθυλίωσης. Η ανάλυση της αλληλουχίας του

GSTP1

αποκάλυψε ότι η μέθοδος μεθυλιωμένο εμπλουτισμός DNA μας θα παρήγαγε ένα θραύσμα περίπου 1900 bp, η οποία μπορεί να επηρεάσει την ανόπτηση σε ανιχνευτές σημαντικά μικρότερο μήκος (περίπου 45-60 μερές) ή δεν μπορεί να παραμείνει ανέπαφο εξής μεθυλίωσης ευαίσθητη πέψη. Κατά την περαιτέρω διερεύνηση των

GSTP1

μεθυλίωση στα ίδια 20 δείγματα καρκίνου, ωστόσο, θα μπορούσε να ανιχνεύσει μεθυλίωση σε 80% των περιπτώσεων με χρήση MSP (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Έχουμε αναπτύξει μια λίστα γονιδίων συγκρίνοντας το συνολικό σύνολο δεδομένων καρκίνου έναντι αναφοράς, καθώς και το διαχωρισμό προφίλ μεθυλίωσης για ΔΜΠ3 και ΔΜΠ4 Gleason σκορ. Εμείς επιλέξαμε να κάνουμε μια ανάλυση μεθυλίωσης σε βάθος

BMP7

και

HOXD3

, καθώς αυτά είναι νέα στόχους για μεθυλίωση στην ΣΕΣΣ. Αντιπροσωπεύουν ένα υποσύνολο των γονιδίων όπου φίμωση μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη των καρκίνων του προστάτη υψηλής ποιότητας με βάση τα αποτελέσματα συστοιχία μας, αλλά και με βάση τις διαθέσιμες λειτουργικές πληροφορίες από την τρέχουσα βιβλιογραφία. Ως εκ τούτου, αυτά τα γονίδια δεν αντικατοπτρίζουν απαραίτητα τη μεγαλύτερη στατιστική σημαντικότητα ή τη μεγαλύτερη αλλαγή μεθυλίωση φορές είτε δύο σύνολα δεδομένων που παράγονται. Τα γονίδια με τις μεγαλύτερες αλλαγές φορές στα σύνολα δεδομένων,

FOXC1

και

VAX1

, θα απαιτήσει μελλοντική επικύρωση σε μια μεγαλύτερη σειρά των όγκων του προστάτη.

Μορφογενετικές πρωτεΐνες

Bone εκκρίνονται παράγοντες που ελέγχουν την ανάπτυξη και τη συντήρηση των σχηματισμού των οστών και ανήκουν στην υπεροικογένεια πρωτεϊνών ΤΟΡβ σηματοδότησης [35]. Εντός προστάτη έχει αποδειχθεί ότι

BMP7

σημαντικά υποεκφράζεται σε λέιζερ μικροδιατομή καρκινικά κύτταρα, οδηγώντας σε έναν επιθηλιακό προς μεσεγχυματικά μετάβαση [31]. Είναι, ωστόσο, φαίνεται να είναι εκ νέου εκφράζονται σε μεταστατικές εστίες προστάτη του οστού [36]. Η ανακάλυψή μας μεθυλίωσης υποκινητή στο

BMP7

προτείνει ένα πιθανό μηχανισμό μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η αρχική φίμωση, ως θεραπεία των κυτταρικών σειρών DU-145 με DAC αυξήθηκε

BMP7

έκφραση δραματικά. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει μεθυλίωση του

BMP7

σε γαστρικούς καρκίνους και ολιγοδενδρογλοίωμα κυτταρικές γραμμές [32], [33], υποδηλώνοντας ότι η αποσιώπηση του

BMP7

μέσω αυτού του μηχανισμού δεν περιορίζεται σε PCA μόνο. Αξίζει να σημειωθεί ότι,

BMP7

μεθυλίωση δεν ήταν αποκλειστικά για ιστολογικά καρκινικού ιστού, αλλά ήταν επίσης εμφανής σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στην επίδραση σχηματισμός καρκίνου πεδίο όπου μεθυλίωση λαμβάνει χώρα πριν από οποιαδήποτε ιστολογική καρκινικές μεταβολή στα κύτταρα, η οποία έχει αποδειχθεί να συμβεί σε καρκίνο του προστάτη [37]. Εναλλακτικά, αυτή η μεθυλίωση μπορεί να είναι κατά κύριο λόγο σχετίζεται με την ηλικία, καθώς το φαινόμενο αυτό έχει επίσης δειχθεί προηγουμένως σε φυσιολογικό ιστό του προστάτη [38]. Οι μελλοντικές μελέτες που απαιτούνται για την αντιμετώπιση των ζητημάτων αυτών.

HOXD3

, ένα άλλο μυθιστόρημα προστάτη στόχο μεθυλίωση, έδειξαν μια ξεχωριστή μετατόπιση προς υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης από PP3 να ΔΜΠ4 προστάτη κατά την ανάλυση CpG αποτελέσματα σειρά μας. Ο ρόλος που

HOXD3

παίζει στην ογκογένεση ή /και την πρόοδο της ασθένειας δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί, αλλά η ενεργοποίηση του ΤΟΡβ σηματοδότησης έχει δειχθεί σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με

HOXD3

[39]. Εκτροπές σε αυτή την οδό έχουν καλώς τεκμηριωθεί σε PCa και άλλων καρκίνων [40]. Συνεπώς, είναι πιθανό ότι η μεθυλίωση επαγόμενη σίγηση του

HOXD3

είναι διατάραξης ΤΟΡβ σηματοδότηση, και ίσως συμβάλλουν στην ανάπτυξη υψηλής ποιότητας προστάτη.