Αφηρημένο

Η σχέση μεταξύ γ υποδοχέα που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος (

PPARG

) έκφρασης και επιγενετικές αλλαγές που συμβαίνουν στην παθογένεση του παχέος-καρκίνος είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Ερευνήσαμε κατά πόσο

PPARG

είναι επιγενετικώς ρυθμίζεται με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) εξέλιξη.

PPARG

έκφραση αξιολογήθηκε σε ιστούς CRC και σε συνδυασμό φυσιολογικό βλεννογόνο από κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία και σχετίζονται με κλινικοπαθολογικών παραμέτρων και την επιβίωση των ασθενών.

PPARG

μεθυλίωση προαγωγού αναλύθηκε με μεθυλίωση-ειδική-PCR και όξινο θειώδες αλληλούχιση.

PPARG

έκφρασης και μεθυλίωση του υποκινητή παρομοίως εξέτασε επίσης το CRC που προέρχονται κυτταρικές σειρές. Χρωματίνης ανοσοκαθίζηση σε βασικές συνθήκες και μετά τη θεραπεία επιγενετικές διεξήχθη παράλληλα με τα πειράματα να χτυπήσει τα κάτω των υποθετικών ρυθμιστικών παραγόντων. Η γονιδιακή έκφραση παρακολουθήθηκε με ανοσοκηλίδωση και λειτουργικές δοκιμασίες του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διεισδυτικότητα. Η μεθυλίωση σε μια συγκεκριμένη περιοχή του υποκινητή συσχετίζεται έντονα με

PPARG

έλλειψη έκφρασης σε 30% της πρωτογενούς CRCs και με κακή πρόγνωση των ασθενών. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το ίδιο μοτίβο μεθυλίωσης βρίσκεται στο

PPARG

-αρνητικοί κυτταρικές σειρές CRC. Επιγενετικές θεραπεία με 5′-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης μπορεί να επανέλθει αυτή την κατάσταση και, σε συνδυασμό με την τριχοστατίνη Α, δραματικά εκ νέου ενεργοποιεί τη μεταγραφή του γονιδίου και η δραστικότητα του υποδοχέα. Μεταγραφική σίγηση οφείλεται στην πρόσληψη MeCP2, HDAC1 και ΕΖΗ2 που προσδίδουν κατασταλτικά χρωματίνης υπογραφές καθορισμό αυξημένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της εισβολής δυνατότητες, τα χαρακτηριστικά που μπορεί πειραματικά να επανέλθει. Τα ευρήματά μας παρέχουν ένα μυθιστόρημα μηχανιστική εικόνα επιγενετική αποσιώπηση των

PPARG

στο CRC που μπορεί να έχουν σημασία ως προγνωστικός δείκτης της εξέλιξης του όγκου

Παράθεση:. Pancione M, L Sabatino, Fucci Α, Carafa V, Nebbioso Α, Forte Ν, et al. (2010) Επιγενετική κατασιγάσει του πολλαπλασιαστή περοξυσώματος Receptor γ είναι μια βιοδεικτών για καρκίνο του παχέος εντέρου εξέλιξη και έκβαση των επιβλαβών ασθενών. PLoS ONE 5 (12): e14229. doi: 10.1371 /journal.pone.0014229

Επιμέλεια: Chun-Ming Wong, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 10 του Ιουλίου του 2010? Αποδεκτές: 9 Νοέμ, 2010? Δημοσιεύθηκε: 3 Δεκ, 2010

Copyright: © 2010 Pancione et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) για VC και L.A .; του έργου της ΕΕ στο LA Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχείς (PPARs) είναι μεταγραφικοί παράγοντες εξαρτώμενοι από συνδετήρα που ανήκει στον υποδοχέα πυρηνικής ορμόνης υπεροικογένεια [1]. Τρεις διαφορετικές ισομορφές PPAR, α, β και γ έχουν απομονωθεί μέχρι σήμερα, το καθένα με ένα διακριτό πρότυπο έκφρασης ιστού και την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με διαφορετικές κατηγορίες ενώσεων. Συγκεκριμένα, η ισομορφή ΡΡΑΚγ εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα φυσιολογικών διεργασιών [2]: ενσωματώνει τον έλεγχο της ενέργειας, των λιπιδίων και της ομοιόστασης της γλυκόζης και παίζει κεντρικό ρόλο στην αδιπογένεσης, φλεγμονώδη απόκριση και τη διαφοροποίηση πολλών επιθηλιακών κυττάρων [3]. Σταθερά, διακυμάνσεις

έχουν έκφραση ή γονίδιο PPARG

μεταλλάξεις έχουν συσχετιστεί με ογκογένεση [4] – [6]. Ωστόσο, έχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα έχουν αναφερθεί μέχρι στιγμής, ανεβάζοντας το ερώτημα κατά πόσον PPARγ διευκολύνει ή να καταστέλλει ογκογένεση [7], [8]. Πρόσφατα, έχουμε δείξει ότι οι σποραδικές παχέος εντέρου (CRCs) παρουσιάζουν μειωμένα επίπεδα έκφρασης του PPARγ είναι σημαντικά συνδέεται με χειρότερη πρόγνωση των ασθενών? στον ίδιο τύπο των όγκων,

PPARG

έχει δειχθεί ότι είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας [9], [10], υποδηλώνοντας τη δυνατότητα να στοχεύσει αυτό το γονίδιο με φάρμακα σε κλινικές εφαρμογές [10]. Οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν

PPARG

ρύθμιση της έκφρασης στην εξέλιξη της CRC είναι ακόμη άγνωστες [9].

Καθίσταται ολοένα και πιο σαφές ότι, εκτός από γενετικές αλλοιώσεις, επιγενετικές τροποποιήσεις συμβάλλουν στην ογκογένεση [11] . Επιγενετικής ρύθμισης περιλαμβάνει κληρονομικές τροποποιήσεις που δεν αλλάζουν τις ακολουθίες DNA, αλλά παρέχουν «έξτρα» στρώματα ελέγχου για τη ρύθμιση της οργάνωσης της χρωματίνης και της γονιδιακής έκφρασης [12]. Η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA σε CpG πλούσιων σε αλληλουχίες, επίσης γνωστή ως «νησίδες CpG», που βρίσκεται στις περιοχές προαγωγού περίπου τα μισά από τα γνωστά γονίδια, οδηγεί σε επιγενετικές σίγηση της γονιδιακής έκφρασης [11], [12]. Στο CRC, η εκτεταμένη μεθυλίωση DNA έχει ανιχνευθεί σε πολλά τόπους, ειδικά στις περιοχές προαγωγού των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (TSG), ένα χαρακτηριστικό μιας υποομάδας των όγκων που παρουσιάζουν τη λεγόμενη «CpG φαινότυπος νησί methylator» (CIMP) [13] . Άλλες επιγενετικές εκδηλώσεων, όπως κατασταλτικές τροποποιήσεις των ιστονών, συνεργάζονται για τη δημιουργία σταθερών γονιδιακή αποσιώπηση. Ένα «κωδικός ιστόνης» έχει προταθεί για να παρέχει μια υπογραφή σε συγκεκριμένα υπολείμματα αμινοξέων που συσχετίζεται με ενεργή ή καταπιεσμένη έκφραση γονιδίου [11], [12]. Η σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και οι τροποποιήσεις των ιστονών φαίνεται να διαμεσολαβείται από πρωτεΐνες δέσμευσης μεθυλο CpG DNA, ένα μέλος της οποίας MeCP2 παίζει σημαντικό ρόλο για τη δημιουργία αυτής της αλληλεπίδρασης [14]. DNA μεθυλιωμένο περιοχές, συνήθως εμπλουτισμένο σε τροποποιημένο ιστόνες, να δημιουργήσει ένα πιο σφικτά συσκευασμένα χρωματίνη όπου η πρόσβαση των συγκεκριμένων παραγόντων μεταγραφής στο συγγενές θέσεις δέσμευσης τους είναι σε μεγάλο βαθμό μειωμένη [12]. Πώς μεθυλίωσης του DNA και ο τρόπος διεξαγωγής των τροποποιήσεων ιστονών σε περιοχές προαγωγού ειδικών γονιδίων σχετίζονται με την έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου, ειδικότερα σε σποραδικές CRC, μένει να διευκρινιστεί [15]. Στην έκθεση αυτή, αναλύσαμε εκατόν πενήντα δύο πρωτοβάθμια CRCs και σε συνδυασμό φυσιολογικό βλεννογόνο, προκειμένου να συσχετιστούν

PPARG

παραλλαγές έκφραση διαμεσολαβείται από επιγενετικές γεγονότα με την εξέλιξη του όγκου και της επιβίωσης των ασθενών. Έχουμε επεκταθεί η ανάλυση στο CRC κυτταρικές σειρές που προέρχονται ως ένα σύστημα για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν

PPARG

αποσιώπηση λόγω επιγενετικών μεταβολών.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review της Fatebenefratelli Νοσοκομείου στο Μπενεβέντο. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση για τη συλλογή των δειγμάτων και η επακόλουθη ανάλυση.

δείγματα όγκων

Εκατόν πενήντα δύο ασθενείς που διαγιγνώσκονται πρωτογενή σποραδικές CRC και χειρουργικά αντιμετωπίζεται στο Τμήμα Χειρουργικής, Fatebenefratelli Hospital, Μπενεβέντο, Ιταλία, μεταξύ 1999-2004, διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Πενήντα-δύο περιπτώσεις που περιλαμβάνουν τόσο υγρό άζωτο snap-κατεψυγμένα δείγματα, που λαμβάνονται αμέσως μετά τη χειρουργική εκτομή, και μπλοκ παραφίνης. Κάθε δείγμα συνδυάζεται με την παρακείμενη προφανώς κανονική βλεννογόνο (σε απόσταση 20 cm από την μάζα του όγκου) απομακρύνονται κατά τη διάρκεια της ίδιας χειρουργικής επέμβασης. Κανένας από τους ασθενείς είχαν οικογενειακό ιστορικό εντερικών δυσλειτουργίας ή CRC, είχαν λάβει χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία πριν από την εκτομή ούτε είχαν λάβει μη στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα σε τακτική βάση. Οι συμβατικές θεραπείες μετεγχειρητική δόθηκαν σε όλους τους ασθενείς, ανάλογα με τη σοβαρότητα της νόσου. Οι κλινικο-παθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών διερευνήθηκαν αναφερθεί (Πίνακας 1). Η παρακολούθηση ήταν διαθέσιμες για όλους τους ασθενείς, με μέση μετεγχειρητική διάρκεια των 59,5 ± 26,5 μήνες. Συνολικό μήκος της επιβίωσης υπολογίσθηκε αρχίζοντας από την πρώτη χειρουργική επέμβαση. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν προοπτικά μέχρι το θάνατο ή την πιο πρόσφατη ιατρική εξέταση τους.

Η

Οι κυτταρικές σειρές και 5′-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη και Τριχοστατίνη Μια θεραπεία

Δώδεκα CRC προέρχονται κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη και ελήφθησαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν όπως προτείνεται. Για DNA απομεθυλίωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ή 5 μΜ 5′-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (ΑΖΑ) για 72 hs ή 300 ηΜ Τριχοστατίνη Α (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) για 24 hs, μόνα τους ή σε συνδυασμό. Μετά τις αγωγές, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για DNA, RNA ή εκχύλιση πρωτεϊνών.

εκχύλιση του DNA, όξινου θειώδους επεξεργασία, την ανάλυση μεθυλίωσης και αλληλούχιση

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από κατεψυγμένα ιστούς ή από τομές παραφίνης δειγμάτων χρησιμοποιώντας μια τυποποιημένη διαδικασία [6], ή το κιτ FFPE ιστούς (56404, Qiagen, Hilden, Germany), αντίστοιχα. Ένα μg εκάστου δείγματος ΟΝΑ διθειώδες τροποποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (59104, Qiagen, Hilden, Germany). Τόσο καθολικά μη μεθυλιωμένη (59.665) και CpGenome καθολικά μεθυλιωμένο DNA (59655, Qiagen, Hilden, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε αντίδραση ως μη μεθυλιωμένο ή μεθυλιωμένο ελέγχου, αντίστοιχα. Η αναζήτηση για το περιεχόμενο CpG στο

PPARG

προαγωγού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού Methprimer σύμφωνα με τον ορισμό CpG νησίδα. PCR εναρκτήρες για μεθυλίωσης ειδική PCR (MS-PCR) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό v1 Methyl Primer Express. Τόσο μη μεθυλιωμένη (U) και μεθυλιωμένα (Μ) συγκεκριμένα σύνολα εκκινητών σχεδιάστηκαν με βάση τη θετική κλώνο του με όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA που καλύπτει τα νησιά CpG εντός του

PPARG

περιοχή προαγωγού. Αντιδράσεις MS-PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ MS-PCR (59305, Qiagen, Hilden, Germany) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα προϊόντα PCR φορτώθηκαν μη μετουσιωτικές πηκτές αγαρόζης 3%, χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο, και έγινε ορατό κάτω από μια συσκευή υπεριώδους. Οι αλληλουχίες εκκινητών που αναφέρονται (Πίνακας S1). Όξινου θειώδους αλληλουχίας (BS) αυτομάτως διεξάγεται επί του προϊόντος ενίσχυσης PCR που λαμβάνεται με τη χρήση ενός εκκινητή που δεν περιέχουν CpG θέσεις μέσα στις αλληλουχίες τους και έχουν σχεδιαστεί για όξινου θειώδους τροποποιημένο DNA (Applied Biosystems, Applera, Foster City, USA).

chip και δοκιμασία MeDIP

δοκιμασίες chip και την ενίσχυση Q-PCR (Biorad, Hercules, USA) διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [16]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν περιγράφονται (Πίνακας S1). δοκιμασία MeDIP διεξήχθη, όπως συνιστάται από τον προμηθευτή (Diagenode, Λιέγη, Βέλγιο). Αντισώματα εγείρονται έναντι: AcH3K9, H3K4me3, HDAC1 και MeCP2 (Abcam, Cambridge, UK), H3K27me3, (Millipore, Billerica, USA), RNA ροΙ II και P-RNA ροΙ II (Covance, Dallas, USA), ZAC και καθαρισμένη IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες chip.

κηλίδος Western και ανοσοϊστοχημική ανάλυση

ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης από ιστούς όγκου και γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο που ελήφθησαν κατά χειρουργική επέμβαση και CRC κυτταρικές σειρές, όπως έχει ήδη αναφερθεί [6], [9]. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση σχετικά με όγκους και μακρινό μη νεοπλαστικά βλεννογόνου διεξήχθη όπως περιγράφεται [9]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: αντι-ΡΡΑΚγ (Ε-8), αντι-ZAC (Η-253), αντι-ERK 1/2 (ΜΚ1) και αντι-ρ-ΕΚΚ (Ε-4) (Santa Cruz Biotechnology, Σάντα Cruz, USA)? αντι-Ε-καδερίνης (610.405) (BD Transduction Laboratories, Lexington, USA)? αντι-MeCP2 (ab55538), αντι-HDAC1 (ab19845) (Abcam, Cambridge, UK)? αντι-ΕΖΗ2 (4905) (Cell Signaling, Boston, USA)? αντι-β-ακτίνης (A5441) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

ΜΤΤ και την απόπτωση δοκιμασίες

Τα κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε 24 ή 96 φρεατίων πλάκες και η ΜΤΤ δοκιμασία (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή σε 0, 24, 48, 72 και 96 hs μετά την επίτευξη συρροής, όπως υποδεικνύεται. Οι καμπύλες ανάπτυξης στήθηκαν λαμβάνοντας υπόψη τα μέσα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Για να αναλυθεί χημειο-ευαισθησία προς ΡΡΑΚγ αγωνιστές κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ τρογλιταζόνη (TZD). δοκιμασία απόπτωση διεξήχθη με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FCA) χρησιμοποιώντας χρώση ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ). Εν συντομία, μετά από επώαση με ΤΖϋ, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε 70% παγωμένης αιθανόλης /PBS και φυλάχθηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα αιωρούμενα κύτταρα μετά πλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν σε ένα διάλυμα ΡΙ για 15 λεπτά. στους 37 ° C και αμέσως αναλύθηκαν με ροή σάρωσης FAC κυτταρομετρητή (Becton Dichinson, San Jose, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες

Για τον προσδιορισμό επούλωση της πληγής, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες και αναπτύχθηκαν σε συρροή 60-mm. Μετά από 6 hs πείνας καιρό ορού, μια πληγή έγινε χρησιμοποιώντας ένα άκρο μικροπιπέτας να ξύνεται τα κύτταρα. Η κυτταρική κινητικότητα μελετήθηκε μετά από 24 και 48 hs, μετά τα κύτταρα από διαφορετικά πεδία μικροσκοπίου. Τέλος, η αντίστοιχη περιοχή του τραύματος σε κάθε χρονικό σημείο ήταν ψηφιοποιημένο και ποσοτικά με τη χρήση Metamorph Imaging λογισμικού συστήματος στην έκδοση 6.0 για τα Microsoft Windows. Ένα μέσο ποσοστό κλεισίματος τραύματος υπολογίσθηκε από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Για τον προσδιορισμό της ικανότητας εισβολής ένας προσδιορισμός transwell διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ένθετο κυτταρικής καλλιέργειας 24 φρεατίων, πόρων 8 μm (3097, Falcon-Becton Dickinson, USA). Μετά την ενυδάτωση του matrigel στο άνω διαμέρισμα, τα κύτταρα σπάρθηκαν και επωάζεται. Είκοσι τέσσερις και σαράντα οκτώ hs αργότερα τα κύτταρα της άνω επιφάνειας του φίλτρου απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα? εκείνοι κάτω μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με 0,2% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν. Η ποσοτικοποίηση λήφθηκε μετρώντας τουλάχιστον 10 χαμηλότερα πεδία ισχύος από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

εκχύλιση RNA και ημιποσοτική ανάστροφης μεταγραφής-ΡΟΡ

Ολικό RNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές και ιστούς με ΤπζοΙ με μικρές τροποποιήσεις (Invitrogen Carlsbad, USA). Η αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR) έγινε χρησιμοποιώντας Super-script II (Invitrogen, Carlsbad, USA) και ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για

PPARG

. Οι συνθήκες RT-PCR και οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν έχουν αναφερθεί προηγουμένως [5]. Σε όλες τις αντιδράσεις PCR,

GAPDH

υπηρέτησε ως εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση. Τα ενισχυμένα προϊόντα έτρεξαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2% και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο.

Πλασμίδια και επιμολύνσεις

Το PPRE-ΤΚ πλασμίδιο οδηγείται ανταποκριτή λουσιφεράσης, ο pcDNA3 που φέρει το αγρίου τύπου

PPARG

cDNA και οι συνθήκες διαμολύνσεως έχουν ήδη περιγραφεί [6]. Για προσδιορισμούς γονίδιο επαναδραστηριοποίηση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΑΖΑ και TSA μόνα τους ή σε συνδυασμό και παροδικά επιμολυσμένα με το πλασμίδιο αναφοράς. Μετά από 12 hs, 1 μΜ ΤΖϋ ή το όχημα μόνο του προστέθηκαν στο μέσο. Όταν ενδείκνυται, GW9662, ένας εκλεκτικός ανταγωνιστής PPARγ, χρησιμοποιήθηκε.

siRNA

Ένας φορέας ρετροϊού PSM2C (κλώνος ID VH2-203345) που φέρει το DNA μικρή φουρκέτα (shRNA, αριθμός καταλόγου RHS1764- 9494331) για στόχευση ΡΡΑΚγ mRNA χρησιμοποιήθηκε. ΗΤ29 κύτταρα διαμολύνθηκαν σταθερά με τον φορέα shRNA-ΡΡΑΚγ και των θετικών κλώνων που επιλέγονται με τη χρήση 1 μΜ πουρομυκίνη. Ένας φορέας που φέρει μη ειδική Τα siRNAs ή ένα άδειο φορέα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Το siRNA σχεδιαστεί για τη στόχευση του ανθρώπου MeCP2 mRNA (κωδικός: HS-MECP2-7HP SI02664893, Qiagen, Hilden, Γερμανία) παρασχέθηκε ευγενώς από τον καθηγητή Chiariotti. κύτταρα HCT116 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και παροδικά επιμολυσμένα με το MeCP2 siRNA ή μη-ειδική oligos, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, USA). Να φιμώσουν ΕΖΗ2, ένα φορέα ρετροϊού PSM2C μεταφέρουν ένα ΕΖΗ2-shRNA (κωδικός: RHS1764-9100483, CN: V2HS-63033) κωδικοποιημένα χρησιμοποιήθηκαν Τα siRNAs ή ένα άδειο φορέα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, USA). Και στις δύο περιπτώσεις, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση κηλίδας western 56 hs αργότερα.

Η απώλεια ετεροζυγωτίας,

BRAF

και

KRAS

μεταλλάξεων και αστάθεια μικροδορυφορικού ανάλυση

η απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) εκτιμήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως, χρησιμοποιώντας τους δείκτες μικροδορυφορικού D31259 και D3S3701, που πλαισιώνουν

PPARG

[6]. Αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI) έγινε όπως αναφέρθηκε [17].

MLH1

μεθυλίωση υποστηρικτής αξιολογήθηκε επίσης σε μερικά αντιπροσωπευτικά δείγματα όγκων [18].

BRAF

και

KRAS

μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 600 στο εξώνιο 15 και κωδικόνια 12/13 στο εξόνιο 2, αντίστοιχα, αξιολογήθηκαν με PCR /αλληλουχίας και Real-Time PCR με τη χρήση εκκινητών που περιγράφηκε προηγουμένως [18 ].

η στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το SPSS (έκδοση 15.0) για τα Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). Σύνδεσης μεταξύ

PPARG

μεθυλίωση προαγωγού, άλλοι δείκτες και κλινικο-παθολογικών παραμέτρων εκτιμήθηκε με τη χρήση της χ

2 δοκιμή ή τις δοκιμές κατάταξης Spearman, όπως υποδεικνύεται. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της επιβίωσης? διαφορές επιβίωσης αναλύθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD, και οι μέσες τιμές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student ή Mann-Whitney test. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν ένας

P

≤0.05 ελήφθη.

Αποτελέσματα

PPARG

μεθυλίωση προαγωγού σε CRCs συσχετίζεται με τη γονιδιακή έκφραση και συνδέεται με αποτέλεσμα οι ασθενείς »

για να αξιολογηθεί ο ρόλος που

PPARG

παίζει στην παχέος ογκογένεση

in vivo

, αναλύσαμε 152 πρωτοβάθμια σποραδικές CRCs και συμφωνημένα παρακείμενο μη-νεοπλασματικές βλεννογόνο για

PPARG

έκφρασης (Σχήμα 1, πλαίσιο Α). Περίπου το 60% των όγκων έδειξε

PPARG

υπερ-έκφραση και 5% των περιπτώσεων δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ιστών του όγκου και της αντιστοιχισμένης φυσιολογικού βλεννογόνου. Σε αντίθεση, το 35% των όγκων έδειξε χαμηλότερα επίπεδα ΡΡΑΚγ από την κανονική βλεννογόνο και μια στατιστικά σημαντική συσχέτιση με απομακρυσμένες μεταστάσεις και την επιβίωση μειώνεται ασθενών, σύμφωνα με προηγούμενα δεδομένα μας (Εικόνα 1, πίνακες Β και C) [9]. Έχουμε ήδη αναφερθεί ότι μειώνεται

PPARG

έκφραση σε σποραδικές CRCs δεν σχετίζεται με την ΑΕ [6]. Έτσι, για να καθοριστεί αν

PPARG

μειωμένη έκφραση συσχετίζεται με μεθυλίωση του DNA, εξετάσαμε το σύνολο της περιοχής του υποκινητή. Επιθεώρηση του ανθρώπινου

PPARG

υποκινητή έδειξε ότι η περιοχή πυρήνα από -474 έως +600 σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής, είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένο σε «CpG νησίδες» που θα μπορούσε να είναι ο στόχος της μεθυλίωσης του DNA (Σχήμα 1 , πάνελ D). Μια συντομότερη CpG πλούσιων οδού DNA που βρίσκεται ανοδικά (από -793 -580 να) έχει βρεθεί σταθερά μεθυλιωμένα σε μία μελέτη αξιολόγησης της επιγενετικό παράγοντα κινδύνου που σχετίζεται με την πρώιμη έναρξη των ενήλικων μεταβολικού συνδρόμου (Σχήμα 1, πλαίσιο D) [19]. Για να διερευνηθεί εάν αυτές οι δύο περιοχές είναι διαφορικά μεθυλιωμένα στην πρωτοβάθμια CRCs και αντιστοιχισμένο φυσιολογικό βλεννογόνο, εκτελέσαμε MS-PCR σε τέσσερα τμήματα προαγωγό (Μ1 έως Μ4 ξεκινώντας από το πιο κατάντη) (Σχήμα 1, πλαίσιο D). Τμήματα Μ4 (από 746 -616 να) και M1 (από -123 να +49) ήσαν πάντοτε μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα σε φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα και δεν συσχετίστηκαν με

PPARG

επίπεδα έκφρασης (Σχήμα 1, πλαίσιο Ε ). M2 (από -235 έως -151) ήταν μεταβλητά μεθυλιωμένα και, τέλος, Μ3 (από -359 έως -260) μεθυλιώθηκε σε περίπου 30% των όγκων σε σύγκριση με το 8% του ζευγαρωμένα κανονικής βλεννογόνων (n = 80) και συσχετίζεται με μείωση /απώλεια

PPARG

έκφρασης (Σχήμα 1, πίνακα Ε και Πίνακας 1). Μια πιο προσεκτική εξέταση του τμήματος Μ3 προσδιορίζονται 9 θέσεις CpG, η κατάσταση μεθυλίωσης των οποίων αναλύθηκε με όξινο θειώδες αλληλουχίας (Σχήμα 1, πλαίσιο F). Το επίπεδο νησιά μεθυλίωση CpG ήταν σημαντικά υψηλότερη σε

PPARG

-αρνητικοί από

PPARG

-θετικό όγκους και σε συνδυασμό φυσιολογικό βλεννογόνο (Σχήμα 1, πίνακα Ζ). Συνέπεια, η μεθυλίωση περιοχή M3 σχετίζεται με την ηλικία του ασθενούς, βαθιά εισβολή, Γ και Δ στάδια Δούκα, ενώ καμία συσχέτιση ανιχνεύθηκε με τη θέση του όγκου (εγγύς ή άπω του παχέος εντέρου) και το φύλο (Σχήμα 1, πίνακα H και Πίνακας 1).

PPARG

μεθυλίωση παρατηρήθηκε συχνότερα σε μια υποομάδα των μικροδορυφόρων υψηλής (MSI-H) σε σχέση με μικροδορυφορικού σταθερή (MSS) όγκους. Επιπλέον, οι περιπτώσεις αυτές δεν είχαν σχέση με το

KRAS

ή

BRAF

μεταλλάξεις (Εικόνα S1). Όλα μαζί αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

PPARG

μεθυλίωση προαγωγού, ειδικά στην περιοχή του Μ3, είναι συσχετίστηκε σημαντικά με την εξέλιξη του όγκου και κακή έκβαση των ασθενών (Σχήμα 1, πίνακας Ι).

(Α) Πενήντα μα ολικής πρωτεΐνης εκχυλισμάτων από ιστούς όγκου (Τ) και συμφωνημένα μη νεοπλαστικά βλεννογόνου (Ν) αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Στον πίνακα είναι μόνο μερικά αντιπροσωπευτικά δείγματα (από 1 έως 8) που φαίνονται. Το ιστόγραμμα αναφέρει την ποσοτικοποίηση σε β-ακτίνη, που χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) Συσχέτιση του

PPARG

επίπεδα έκφρασης απουσία = M0 ή παρουσία = M1 απομακρυσμένων μεταστάσεων. ανάλυση επιβίωσης (C) Kaplan Meier που σχετίζονται με

PPARG

επίπεδα έκφρασης. Η

P

τιμή αναφέρεται σε κάθε γράφημα. (Δ) Σχηματική δομή του

PPARG

υποκινητή και ταυτοποίηση των CpG εμπλουτισμένου περιοχές που περιλαμβάνει την θέση έναρξης μεταγραφής του ανθρώπινου γονιδίου. Τα MS-PCR αναλύθηκαν περιοχές (Μ1-Μ4) και οι θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται απεικονίζονται ως ορθογώνια. (Ε) Αντιπροσωπευτική MS-PCRs δείχνουν μια συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης της περιοχής Μ3 και μειωμένη

PPARG

έκφραση σε ιστούς όγκων έναντι συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο, C + υποδεικνύει μεθυλιωμένη (Μ) και μη μεθυλιωμένη (U) μάρτυρες. (F) Η ακολουθία νουκλεοτιδίων Μ3 έχει αναφερθεί? τα νησιά CpG τόνισε. Τα χρωματογραφήματα δείξει ποια δινουκλεοτίδιο CpG είναι μεθυλιωμένο σε ορισμένα αντιπροσωπευτικά δείγματα μετά την BS. Μαύρο ή άσπρο κύκλοι δείχνουν τα μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα κυτοσίνες, αντίστοιχα. επίπεδα (G) Μεθυλίωση ανιχνεύεται από BS σε όγκο και δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Η περιοχή μεθυλίωση M3 σχετίζεται με όγκο »στάδιο (Duke από Α έως Δ) (Η) και των ασθενών επιβίωση (Ι). Η

P

τιμή αναφέρεται σε κάθε γράφημα.

Η

PPARG

αποσιώπηση σε κυτταρικές σειρές CRC συσχετίζεται με τη μεθυλίωση υποστηρικτής

Για τη διερεύνηση της μοριακής μηχανισμού (ες) που διέπουν τη σχέση αυτή, επιδιώξαμε να χρησιμοποιήσετε ένα

in vitro

σύστημα καλλιέργειας κυττάρων. Θα προβληθεί μια σειρά από ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC (Πίνακας S2) για

PPARG

επίπεδα έκφρασης και συσχετίζονται αυτά τα πιθανά γεγονότα αποσιώπηση. έκφραση ΡΡΑΚγ ερευνήθηκε στο επίπεδο του mRNA και της πρωτεΐνης με RT-PCR και ανάλυση κηλίδος western, αντίστοιχα (Εικόνα 2, πλαίσιο Α). ΡΡΑΚγ mRNA αντικατοπτρίζεται επιπέδων πρωτεΐνης με ένα ευρύ φάσμα των παραλλαγών από τα υψηλότερα στην ΗΤ29 στο χαμηλότερο σε κύτταρα HCT116. Οι διαφορές ανιχνεύονται αποδόθηκαν σε μεταβολές μεταγραφή? μια μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης που δεν σχετίζονται με τα επίπεδα mRNA παρατηρήθηκε μόνο σε κύτταρα Caco-2, πιθανόν να οφείλεται σε μετα-μεταφραστική μηχανισμός (ες). Μεταξύ αυτών των κυτταρικών σειρών, επιλέξαμε ΗΤ29 και HCT116 για περαιτέρω έρευνες. Δεν ανιχνεύει την απώλεια της ετεροζυγωτίας στο

PPARG

θέση στις δύο κυτταρικές σειρές. Παρομοίως, δεν είχαμε τη συσχέτιση των διαφόρων

PPARG

επίπεδα που παρατηρήθηκαν σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που προκαλούνται από μια δραστική ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ /ΕΚΚ) οδού (Εικόνα S2) [6], [20]. Για να διερευνηθεί αν

PPARG

έκφραση συσχετίζεται με μεθυλίωση προαγωγού στις κυτταρικές γραμμές CRC, εκτελέσαμε MS-PCR (σχήμα 2, πλαίσιο Β). Τα τμήματα Μ4 και Μ1 ήταν σταθερά μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα σε όλες τις κυτταρικές σειρές, ανεξάρτητα της έκφρασης ΡΡΑΚγ. Το τμήμα Μ2 μεθυλιώθηκε σε 5 από 8 κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων HCT116. Είναι ενδιαφέρον ότι, το τμήμα M3 μεθυλιώθηκε μόνο σε HCT116 από τις οκτώ κυτταρικές σειρές CRC αναλύθηκαν (Εικόνα 2, πλαίσιο Β). Με την εξέταση τεσσάρων επιπλέον κυτταρικές γραμμές CRC, βρήκαμε ότι επίσης RKO κύτταρα ήταν αρνητικά για

PPARG

έκφραση, λόγω παρεκκλίνοντα μεθυλιωμένη περιοχή Μ3 (Πίνακας S2 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). δοκιμασίες MeDIP επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσματα: το

PPARG

υποκινητή DNA (-368 έως -166) ήταν τρεις φορές πιο μετουσιωμένο σε HCT116 από ό, τι στα κύτταρα ΗΤ29, υποδεικνύοντας μια πιο σφικτά συσκευασμένα δομής της χρωματίνης (Εικόνα S2). Το 90% των θέσεων CpG που περιέχονται στο τμήμα Μ3 μεθυλιώθηκαν σε HCT116, ενώ μόνο λίγοι ή καθόλου μεθυλιώθηκαν σε άλλες κυτταρικές γραμμές όπως αξιολογήθηκαν από διθειώδες αλληλουχίας (Σχήμα 2, πάνελ C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η μεθυλίωση προαγωγός θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στη φίμωση

PPARG

έκφραση στις κυτταρικές σειρές CRC αναλύεται.

(Α)

PPARG

επίπεδα mRNA και η πρωτεΐνη ανιχνεύεται με RT ανάλυση κηλίδας Western -PCR διαφήμιση σε ένα πάνελ οκτώ κυτταρικές σειρές CRC.

GAPDH

και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι, αντίστοιχα. (Β) τα αποτελέσματα MS-PCR που λαμβάνονται στις περιοχές υποκινητή Μ1-Μ4 αναλύονται? Μ, μετουσιωμένες? U, μη μεθυλιωμένες? C + δείχνει μετουσιωμένο και μη μεθυλιωμένα ελέγχους. Η κατάσταση μεθυλίωσης όλων των κυτταρικών σειρών που αναλύθηκαν CRC συνοψίζεται, με HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα απεικονίζεται στην γκρι. (Γ) δινουκλεοτίδια CpG μεθυλίωση εκτιμήθηκε με BS. Τα αποτελέσματα ορισμένων αντιπροσωπευτικών κυτταρικών σειρών που αναφέρθηκαν. Τα μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα δινουκλεοτίδια CpG απεικονίζεται ως μαύρο ή άσπρο κύκλους, αντίστοιχα. (Δ) Η φαρμακολογική απομεθυλίωση επάγεται

PPARG

έκφραση σε HCT116 ενώ καμία σημαντική διαφορά βρέθηκε σε κύτταρα ΗΤ29 χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 1 και 5 μΜ AZA για 72 hs, MS-PCR διεξήχθη στις Μ2 και Μ3 περιοχές, πριν και μετά τη θεραπεία, **

P

& lt?. 0.01

Η

PPARG

έκφραση επαναδραστηριοποιηθεί με την φαρμακολογική απομεθυλίωση

Για να επαληθεύσετε εάν

PPARG

έκφραση μπορεί να επαναδραστηριοποιηθεί με την φαρμακολογική απομεθυλίωση, που αντιμετωπίζονται κύτταρα HCT116 με AZA , ένας πολύ γνωστός αναστολέας της μεθυλίωσης του DNA. ανάλυση RT-PCR από HCT116 εκτέθηκαν σε 1 και 5 μΜ ΑΖΑ έδειξε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση του mRNA PPARγ ενώ δεν παρουσίασαν σημαντικές μεταβολές στα κύτταρα ΗΤ29, όπως αναμενόταν (Σχήμα 2, πάνελ D). MS-PCR πραγματοποιήθηκε σε περιοχή Μ3, που μεθυλιώνεται μόνο σε κύτταρα HCT116, έδειξε απώλεια της μεθυλίωσης μετά τη θεραπεία? η περιοχή Μ2, ότι σε βασικές συνθήκες είναι μεθυλιωμένη στις δύο κυτταρικές σειρές, πήρε απομεθυλιώνεται μετά την αγωγή (Σχήμα 2, πάνελ D). Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η εκτεταμένη μεθυλίωση υποστηρικτής συνδέεται με μειωμένη

PPARG

έκφραση σε κυτταρικές σειρές CRC.

Συνεταιριστική επίδραση της AZA και TSA για

PPARG

εκ νέου ενεργοποίηση

αυτή συγκεκριμένες περιοχές του

PPARG

υποστηρικτής είναι διαφορικά μετουσιωμένο επισημαίνει ότι επιγενετικές μηχανισμό (ες) που εμπλέκονται στην απορυθμισμένη έκφραση του σε κύτταρα CRC. Για να επαληθευτεί αυτή η υπόθεση, έχουμε κατεργάζεται HCT116 με AZA, μόνη ή σε συνδυασμό με TSA, ενός γνωστού αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης (HDACi). ΗΤ29 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος.

PPARG

έκφραση συνεργικά προκαλείται από τη συνδυασμένη θεραπεία με ΑΖΑ και TSA σε κύτταρα HCT116 ενώ δεν επηρεάστηκε σε κύτταρα ΗΤ29, όταν τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό (Σχήμα S3). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι χρωματίνη που σχετίζονται ένζυμα ιστόνης μπορεί να συνεισφέρει στη γονιδιακή σίγηση. Για να καθοριστεί αν η εκ νέου ενεργοποιημένο PPARγ συμπεριφέρεται ως

καλόπιστους

λειτουργικό παράγοντα της μεταγραφής, που αντιμετωπίζονται κύτταρα HCT116 με AZA ή TSA μόνα τους ή σε συνδυασμό, και στη συνέχεια επιμολύνονται με ένα γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης PPRE-οδηγείται. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε σε κυτταρικά εκχυλίσματα αυξήθηκε κατά AZA και /ή θεραπεία TSA και, εντυπωσιακά, ακόμα περισσότερο κατά την προσθήκη τρογλιταζόνης, ενός συγκεκριμένου συνδέτη ΡΡΑΚγ (Σχήμα S3). Για να αποδειχθεί ότι η αύξηση της δραστικότητας λουσιφεράσης ήταν πραγματικά εξαρτάται από τον υποδοχέα και ενεργοποιείται εκ νέου εκθέσαμε τα μορφομετατραπέντα κύτταρα στον ανταγωνιστή ΡΡΑΚγ, GW9662. Μια σημαντική μείωση της δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς παρατηρήθηκε λόγω της ικανότητάς GW9662 να παρεμβαίνει μη αναστρέψιμα με την ικανότητα μετενεργοποιητική της ώριμης πρωτεΐνης (Εικόνα S3). Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η μεθυλίωση του DNA υποστηρικτής και ιστόνης τροποποιήσεις που ενδέχεται να συνεργαστούν για να ρυθμίζουν προς τα κάτω

PPARG

έκφρασης, γεγονός που υποδηλώνει ότι επιγενετικές θεραπείες αποκαταστήσουν τη μεταγραφή του γονιδίου και τη δραστηριότητα.

Ειδικές κατασταλτική χρωματίνης τα σήματα και μεθυλίωσης του DNA που σχετίζονται με

PPARG

μεταγραφή

να παρέχει γνώσεις σχετικά με το μηχανισμό (ες) με την οποία η μεθυλίωση του DNA και των ιστονών τροποποιήσεις επηρεάζουν

PPARG

έκφρασης, ποσοτικούς προσδιορισμούς ChIP διεξήχθησαν ερευνά το τμήμα υποκινητή που εκτείνεται -368 έως -166 στα κύτταρα HCT116. Σε συμφωνία με τα δεδομένα MeDIP, HDAC1 ήταν στενά συνδεδεμένη στο

PPARG

προαγωγό, ενώ το RNA-πολυμεράσης II (RNAPol-ΙΙ) και φωσφορυλιωμένη μορφή του (P-RNAPol-ΙΙ) ήταν μόλις και μετά βίας υπάρχουν σε μη επεξεργασμένα κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3, πάνελ Α). Κατά την έκθεση σε AZA και TSA σε συνδυασμό, HDAC1 ήταν αξιοσημείωτα εξαντληθεί μαζί με μειωμένη μεθυλίωση του DNA (Σχήμα S2), ενώ RNAPol-ΙΙ και Ρ-RNAPol-ΙΙ ενισχύεται σε μεγάλο βαθμό, υποδεικνύοντας μεταγραφή ανάκτηση (Σχήμα 3, πλαίσιο Α). Κατά συνέπεια, τριμεθυλιωμένη H3K4 και ακετυλιωμένα H3K9, που είναι ιστόνης τροποποιήσεις που συνήθως συνδέονται με μεταγραφική δραστικότητα, ήταν σχεδόν μειωθεί σε ακατέργαστα κύτταρα HCT116 και αύξησε σημαντικά με TSA, AZA ή συνδυασμός τους (σχήμα 3, πλαίσιο Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τριμεθυλιωμένη H3K9, έναν δείκτη της σιγήσει χρωματίνης, εμπλουτίστηκε στο

PPARG

υποκινητή και σταδιακά εξαντλούνται μετά από επιγενετικές θεραπείες, ενώ τριμεθυλιωμένη H3K27 μειώθηκε σημαντικά μόνο από το AZA /TSA συνδυασμένη θεραπεία (Σχήμα 3, πάνελ ΝΤΟ). Αυτή η ανάλυση δείχνει ότι μεθυλίωσης του DNA συνδέεται στενά με καταπιεστικά σημάδια της χρωματίνης στο

PPARG

υποστηρικτής να βλάψουν την έκφραση γονιδίων σε κύτταρα CRC.

(Α) Ποσοτική ανάλυση τσιπ κύτταρα HCT116 διεξήχθη πριν και μετά την κατεργασία με AZA και TSA μόνα τους ή σε συνδυασμό. Εγγενής χρωματίνη επωάστηκε με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. Το ανοσοκαταβυθισμένο DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε αντιδράσεις qPCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για την

PPARG

περιοχή προαγωγού *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01. (Β) δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω κατά ακετυλιωμένο H3K9 και τριμεθυλιωμένη H3K4 *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 ή (Γ) τριμεθυλιωμένη H3K9 και H3K27 *

P

& lt? 0,05. Τα χρονικά σημεία για συν-θεραπείες ήταν 72 hs για 5 μΜ AZA και 24 hs 300 nM TSA, μόνα τους ή σε συνδυασμό? CC υποδεικνύει μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Τα αποτελέσματα είναι οι μέσες τιμές ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εκτελέστηκαν εις διπλούν.

Η

siRNA μεσολαβεί knock-down του MeCP2 και ΕΖΗ2 διασώσεις

PPARG

έκφραση σε καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου

Ο σύνδεσμος μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και οι τροποποιήσεις των ιστονών φαίνεται να διαμεσολαβείται από μια ομάδα πρωτεϊνών με δραστικότητα δέσμευσης μεθύλιο DNA που περιλαμβάνει πρωτεΐνη μεθυλο CpG πρόσδεσης 2 (MeCP2) [14]. Αυτές οι πρωτεΐνες εντοπίζονται σε περιοχές μετουσιωμένο υποκινητή και προσλαμβάνουν πρωτεϊνικά σύμπλοκα που περιέχουν HDACs, ειδικά HDAC1 και μεθυλτρανσφεράσες ιστόνης (HMTs). Enhancer του Zeste 2 (ΕΖΗ2) είναι ένα μέλος της Polycomb καταστολέα συγκρότημα 2 (PRC2) με δραστικότητα μεθυλ-τρανσφεράσης ιστόνης σε ειδικές θέσεις H3K27 [21]. Τόσο MeCP2 και ΕΖΗ2 έχουν αναφερθεί ότι εμπλέκονται σε

PPARg

καταστολή σε αστεροειδή κύτταρα ποντικού που υφίστανται στο ήπαρ ινωδογενέσεως [22].