Αφηρημένο

Η πρωτεολυτική δραστηριότητα της φουρίνης υπεύθυνο για την επεξεργασία πλήρους μήκους Notch-1 (P300) παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη σηματοδότηση Notch. Το πλάτος και η διάρκεια της δραστικότητας της Notch μπορεί να ρυθμιστεί σε διάφορα σημεία στην οδό, αλλά δεν υπήρξε καμία αναφορά σχετικά με τη ρύθμιση της αλληλεπίδρασης Notch-1-φουρίνη, παρά τη σημασία του. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η αλληλεπίδραση Notch-1-φουρίνη ρυθμίζεται από την κινάση τυροσίνης μη-υποδοχέα, c-Src. c-Src και Notch-1 συνδέονται φυσικώς, και αυτή η συσχέτιση είναι υπεύθυνη για Notch-1 επεξεργασία και την ενεργοποίηση. Βρήκαμε επίσης ότι αυξητικού παράγοντα ΤΟΡ-α, έναν συνδέτη EGFR, και PDGF-ΒΒ, ένας συνδέτης PDGFR, επάγουν την αλληλεπίδραση Notch-1-φουρίνη διαμεσολαβείται από c-Src. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν τρεις νέες και προκλητικές συμπεράσματα: (1) Η σχέση μεταξύ Notch-1 και φουρίνη είναι μια καλά οργανωμένη διαδικασία? (2) Το εξωκυτταρικό ανάπτυξης σήματα παράγοντας ρυθμίζει αυτή την αλληλεπίδραση, η οποία διαμεσολαβείται από c-Src? (3) Υπάρχει cross-talk μεταξύ των υποδοχέων c-Src και Notch μονοπάτια του αυξητικού παράγοντα του πλάσματος. Συν-εντοπισμός του Notch-1 και c-Src επιβεβαιώθηκε σε ιστούς όγκων ξενομοσχεύματος και στους ιστούς των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος. Τα ευρήματά μας έχουν συνέπειες για το μηχανισμό με τον οποίο τα μονοπάτια Notch και παράγοντα ανάπτυξης υποδοχέα-c-Src σηματοδότησης ρυθμίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων καρκινογένεση και τον καρκίνο

Παράθεση:. Ma YC, Shi C, Ζανγκ ΥΝ, Wang LG, Liu H , Jia ΗΤ, et al. (2012) Η κινάσης τυροσίνης c-Src Μεσολαβεί Άμεσα Growth Factor-Induced Notch-1 και φουρίνη Αλληλεπίδραση και Notch-1 ενεργοποίησης σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (3): e33414. doi: 10.1371 /journal.pone.0033414

Επιμέλεια: Laszlo Buday, Ουγγρική Ακαδημία Επιστημών, Ουγγαρία

Ελήφθη: 3 Νοέμβρη 2011? Αποδεκτές: 8 Φλεβάρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 30, Μάρτη 2012

Copyright: © 2012 Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ερευνητικές επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30873033 έως ΥΧΖ) και Major μέλος βασικά προγράμματα έρευνας & Ανάπτυξης (2009CB521800 και 2010CB529400 να ΥΧΖ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. FHS χρησιμεύει τώρα ως συντάκτης για PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος έχει τη χειρότερη πρόγνωση όλων των μεγάλων καρκίνων και παραμένει η τέταρτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε όλο τον κόσμο [1]. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στο γεγονός ότι δεν αποτελεσματικών μεθόδων έγκαιρης διάγνωσης είναι διαθέσιμα σήμερα, καθώς και η έλλειψη αποτελεσματικών θεραπειών. Έχει αναφερθεί ότι το δίκτυο σηματοδότησης Notch συχνά απορυθμισμένη σε ανθρώπινες κακοήθειες συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του παγκρέατος, με up-ρυθμιζόμενη έκφραση των υποδοχέων Notch και τους συνδέτες τους [2]. σηματοδότηση Notch εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση, τα οποία επηρεάζουν την ανάπτυξη και τη λειτουργία πολλών οργάνων.

Notch

γονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες που μπορούν να ενεργοποιηθούν από την αλληλεπίδραση με μια οικογένεια συνδετών [3] . Notch-1 είναι παρούσα στην κυτταρική επιφάνεια ως ετεροδιμερές μόριο (p120 /Ρ200), ενώ η πρόδρομη πρωτεΐνη (P300) πιθανώς δεν φθάσει στην κυτταρική επιφάνεια και διασπάται σε ρ120 και ρ200 στο δίκτυο trans-Golgi (TGN) με Η φουρίνη (διάσπαση S1) [4], [5]. συνδέσεως συμπλοκοποιητού επάγει διαδοχική διάσπαση των υποδοχέων Notch, πρώτη διάσπαση της εξωκυτταρικής περιοχής (ECD) με ADAM (ένα ντισιντεγκρίνης και μεταλλοπρωτεάση) TACE πρωτεϊνάσης (διάσπαση S2) και, στη συνέχεια, της διαμεμβρανικής περιοχής από ένα ένζυμο σύμπλεγμα γ-σεκρετάσης (διάσπαση S3), απελευθερώνοντας το ενδοκυτταρικό τομέα (NICD) [3], [6]. Αυτό το τελευταίο κατόπιν μετατοπίζεται στον πυρήνα, όπου συνδέεται με το δεσμευόμενο με DNA CSL πρωτεΐνη (CBF1 /RBPJ-κ) για να ρυθμίζουν τη μεταγραφή πολλαπλών γονιδίων τελεστή, συμπεριλαμβανομένων των μελών της /οικογένειας HES HEY [7]. Πρόσφατα, η λίμνη κ.ά. κατέδειξε και πάλι μια συσχέτιση μεταξύ της απώλειας της διάσπασης με φουρίνη και την απώλεια του

in vivo

λειτουργία του υποδοχέα Notch, υποστηρίζοντας την ιδέα ότι η διάσπαση S1 είναι ένα

in vivo

μηχανισμός που ελέγχει Notch-1 σηματοδότηση [8]. Έτσι, η πρωτεολυτική δραστικότητα υπεύθυνος για την επεξεργασία p300 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην Notch-1 σηματοδότηση καθώς καθορίζει την δομή του υποδοχέα. Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν η διάσπαση του Notch με φουρίνη είναι μια στοχαστική, ή σφιχτά διαδικασία ρυθμίζουν.

διαλογή αρκετές αναστολείς κινάσης και διαπίστωσε ότι οι αναστολείς κινάσης Src ανέστειλε Notch-1 και δεσμευτική φουρίνη. c-Src είναι μια 60.000 μη-υποδοχέα προϊόν κινάσης τυροσίνης κ του πρωτο-ογκογονιδίου c-Src, και το κυτταρικό ομόλογο του μετασχηματισμού πρωτεΐνης ιού σαρκώματος Rous, ν-Src [10] (Ishizawar και Parsons, 2004). Συσσωρευμένα στοιχεία που εμπλέκει Src ως σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της ογκογένεσης, εισβολή και μετάσταση [9]. c-Src υπερεκφράζεται σε περισσότερο από το 70% των παγκρεατικών κυτταρικές γραμμές καρκινώματος, και της δράσεως της Src κινάσης συχνά αυξημένα [10]. Έτσι, Src και Notch-1 είναι σημαντικές πρωτεΐνες που επηρεάζουν παγκρεατικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, εισβολή και μετάσταση. Στην παρούσα μελέτη, ανιχνεύσαμε άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών. Βρήκαμε επίσης ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των Notch-1 και φουρίνη δεν είναι στοχαστική, αλλά μάλλον καλά οργανωμένη, αφού c-Src συνδέεται με Notch-1 και διεγείρει την αλληλεπίδραση Notch-1 και φουρίνη. Βρήκαμε ότι η σύνδεση του EGFR και PDGFR με συνδέτες τους τόνωσε επίσης την αλληλεπίδραση Notch-1-φουρίνη, δεικνύοντας ότι τα σήματα εξωκυτταρικό αυξητικός παράγοντας μπορεί να ρυθμίζει άμεσα την ενεργοποίηση του Notch-1 στη συσκευή trans-Golgi.

Αποτελέσματα

1. Επιδράσεις των αναστολέων Src επί φουρίνη επαγόμενη Notch-1 διάσπασης

Για να διερευνηθεί ποια κινάση ή οικογένεια κινάσης εμπλέκεται στη ρύθμιση της φουρίνης-επαγόμενη διάσπαση Notch-1, αρκετές αναστολείς κινάσης δοκιμάστηκαν. Πολλαπλασιαζόμενα BxPC-3 και HPAC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ΡΡ2 ή SU6656 και τα εκχυλίσματα ηλεκτροφορήθηκαν και κηλιδώθηκαν για την ανίχνευση του Notch-1. Η Src κινάσης PP2 μειωμένη διάσπαση της πλήρους μήκους Notch-1 περισσότερο από δύο φορές. Μετά από προ-θεραπεία με ΡΡ2 για 20 λεπτά, τα 120 προϊόντα διάσπασης kD του Notch-1 μειώθηκαν και πλήρους μήκους πρωτεΐνη Notch-1 αύξησε (Σχήμα 1Α). Έχουμε παρείχε επίσης ένα ελαφρύτερο έκθεση ενός παρόμοιου κηλίδος Western στην κατώτερη ομάδα του σχήματος 1Α για να δείξει τη μείωση του προϊόντος διασπάσεως 120 kD με μεγαλύτερη σαφήνεια. ΡΡ2-επαγόμενη αναστολή της πλήρους μήκους Notch διάσπασης-1 φάνηκε να είναι δοσοεξαρτώμενη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Src αναστολείς ΡΡ2 και SU6656 επάγει αναστολή της πλήρους μήκους Notch επεξεργασίας-1 με φουρίνη σε HPAC καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα. κύτταρα HPAC αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ του ΡΡ2 ή SU6656 για 60 λεπτά. Κηλίδες Western διεξήχθησαν με αντι-Notch-1 αντίσωμα. Κάτω πάνελ, η μείωση των Notch-1 /ρ120 δείχθηκε σε έναν αναπτήρα έκθεσης από ένα παρόμοιο κηλίδος Western. Notch-1 P300, FL πρωτεΐνες Notch πλήρους μήκους? Notch-1 ρ120, που διασπάται πρωτεΐνες Notch. (Β) Ο συνδέτης EGFR ΤΟΡ-α επάγει πλήρους μήκους διάσπαση Notch-1, η οποία μειώνεται με c-Src αναστολέας ΡΡ2 στα δύο καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα HPAC και BxPC3. Τα κύτταρα ορό starvated για 48 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΜ ΡΡ2 για 60 λεπτά, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 7 ηΜ ΤΟΡ-α για 20 λεπτά. Κηλίδες Western διεξήχθησαν με αντι-Notch-1, φωσφο-c-Src, c-Src και β-ακτίνη αντισώματα. ρ-c-Src, φωσφο-c-Src.

Η

Ενώ είναι αλήθεια ότι ΡΡ2 αναστέλλει εκλεκτικά Src κινασών, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, ΡΡ2 είναι επίσης γνωστό ότι αναστολείς του EGFR. Έχουμε διεξαγάγει πειράματα δόσης-απόκρισης και βρήκαν ότι ΡΡ2 αναστέλλει c-Src με IC50 4 μΜ σε κύτταρα HPAC (Σχήμα S1), αλλά 10 μΜ ΡΡ2 μόνο ανέστειλε δραστικότητα του EGFR κατά 45%, υποδεικνύοντας ΡΡ2 αναστέλλει τη δράση του EGFR με IC50 πάνω από 10 μΜ στο σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας (Σχήμα S2). 10 μΜ ΔΜΠ2 αναστέλλεται δραστηριότητας c-Src κατά 77%, φαίνεται PP2 αναστέλλει Notch-1 διάσπασης κυρίως μέσω c-Src, αλλά όχι μέσω του EGFR, αν και δεν μπορούσε να αποκλείσει τη δυνατότητα όπως η άμεση αναστολή του EGFR συμβάλλει ελαφρώς προς ΔΜΠ2 επαγόμενη κάτω ρύθμιση του Notch-1 διάσπασης. SU6656, η οποία ανήκει σε μια διαφορετική δομική κατηγορία των αναστολέων της κινάσης Src είχαν παρόμοια επίδραση σε Notch-1 διάσπασης όπως ΡΡ2 (Εικόνα 1Α).

Δοκιμάσαμε επίσης αν δραστηριότητας c-Src παράγοντα από την ανάπτυξη που επηρεάζει τετράθυρες 1 ενεργοποίηση. Πολλαπλασιαζόμενα HPAC και τα κύτταρα BxPC-3 απλώθηκαν σε πρότυπο μέσο ανάπτυξης για 24 ώρες και μεταφέρθηκε σε ϋΜΕΜ χωρίς ορό για 48 ώρες για να επιτρέψει να ισορροπήσει υποδοχείς στην κυτταρική επιφάνεια. Αυτά στη συνέχεια σε επεξεργασία για 60 λεπτά με ΡΡ2 πριν από τη διέγερση με 7 nmol /L ΤΟΡ-α. Μετά από 20 λεπτά, τα προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και τα εκχυλίσματα ηλεκτροφορήθηκαν και κηλιδώθηκαν για τον εντοπισμό Notch-1, ρ-c-Src, και β-ακτίνης. Το σχήμα 1Β δείχνει αξιοσημείωτη ενεργοποίηση της c-Src στα κύτταρα ΤΟΡ-α-θεραπεία. Προκατεργασία των κυττάρων με 10 μΜ ΡΡ2 για 60 λεπτά είχε σαν αποτέλεσμα σχεδόν πλήρη αναστολή της φωσφορυλίωσης c-Src σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Εικόνα 1Β). Στα κύτταρα HPAC και BxPC3 εκτίθενται σε ΤΟΡ-α διάσπαση του Notch-1 αυξήθηκε περίπου 2 και 3 φορές, αντίστοιχα, και αυτές οι αυξήσεις ήταν επίσης παρεμποδίζεται από προκατεργασία με ΡΡ2 (Εικόνα 1Β).

2. ΤΟΡ-α αυξάνει CSL σύνδεση προς τον προαγωγό με HES 1

Μετά την διαδοχική διάσπαση από φουρίνη, ΤΑΟΕ και γ-σεκρετάσης, Notch-1 NICD απελευθερώνεται από την μεμβράνη του πλάσματος και μεταφέρεται στον πυρήνα όπου συνδέεται με το δέσμευσης DNA πρωτεΐνης CSL (CBF1 /RBPJ-κ) και επάγει μεταγραφή πολλαπλών γονιδίων τελεστή, συμπεριλαμβανομένης ΗΕδ-1. Για να ελέγξετε αν ο ΤΟΡ-α επάγει δέσμευση της CSL στο Hes-1 υποκινητή πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς CHIP. Πριν ΤΟΡ-α θεραπεία, μια μικρή ποσότητα του CSL ανιχνεύθηκε στην θέση σύνδεσης CSL ΗΕδ-1, και αυτό προοδευτικά αυξήθηκαν μετά ΤΟΡ-α θεραπεία για 30 και 60 λεπτά (Εικόνα 2Α). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό καλύτερη αλλαγές στην CSL δέσμευσης προς τον προαγωγό ΗΕδ-1, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς Q-PCR επί των δειγμάτων μαρκών. CSL σύνδεση με ΗΕδ-1 αυξήθηκαν και πάλι σε 30 λεπτά και 60 λεπτά μετά την αγωγή ΤΟΡ-α (Σχήμα 2Β).

(Α) δοκιμασία CSL CHIP. κύτταρα HPAC αναπτύχθηκαν σε μέσο χωρίς ορό για 48 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 7 ηΜ ΤΟΡ-α για 0, 30, 60 λεπτά. δείγματα χρωματίνης ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα CSL, DNA εκχυλίστηκε και ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ΗΕδ-1 εκκινητές υποκινητή για 35 κύκλους με PCR. Μ, 100 bp DNA σκάλα. (Β) ανάλυση Q-PCR δειγμάτων ϋΝΑ τσιπ δείχνει ότι ΤΟΡ-α-επαγόμενη συνδέσμου CSL-1 με τον υποκινητή ΗΕδ-1, με αποτέλεσμα περίπου 0,5, και 2- φορές αυξήσεις από το 30 λεπτά και, 60 λεπτά χρονικό σημείο , αντίστοιχα. Οι τυπικές αποκλίσεις υποδεικνύονται (n = 3).

Η

Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η υπερέκφραση του NICD αυξάνει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων και εισβολή [11]. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε κάνει colonigenic δοκιμασία και βρέθηκαν ότι η υπερέκφραση του ενεργού μορφής του Notch-1, Notch Εξωκυτταρική κολόβωση (Next), αύξησε σημαντικά τον σχηματισμό αποικίας κυττάρου HPAC (Σχήμα S3).

3. Επιδράσεις των αναστολέων c-Src και αυξητικοί παράγοντες για την αλληλεπίδραση των Notch-1 και φουρίνη

Για να προσδιοριστεί εάν το c-Src επηρεάζει δραστικότητα φουρίνη, μετρήσαμε τα αποτελέσματα του ΡΡ2 και SU6656 στη δραστηριότητα φουρίνη σε κύτταρα BxPC3 και HPAC χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία φθορισμού. ΡΡ2 και SU6656 μειωθεί μόνο δραστηριότητα φουρίνη κατά 30% (τα δεδομένα δεν φαίνονται), τα οποία δεν θα μπορούσαν να εξηγήσουν 2 φορές μείωση της Notch-1 διάσπασης. Ως εκ τούτου, εμείς αιτιολογημένη ότι οι αναστολείς c-Src μπορεί να επηρεάσει την αλληλεπίδραση μεταξύ των Notch-1 και φουρίνη. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα με 10 μΜ ΔΜΠ2 ή SU6656 για 20 λεπτά και στη συνέχεια εκτελούνται οι δοκιμασίες ανοσοκατακρήμνισης για να εξετάσει τη σχέση μεταξύ φουρίνη και Notch-1. ΡΡ2 και SU6656 πράγματι ανέστειλαν σημαντικά φουρίνη Notch-1 σύνδεση (Σχήμα 3Α). Μία ποσοτική πυκνομετρία για Εικόνα 3Α παρέχεται στο Σχήμα S4. Σε συγκέντρωση 10 μΜ, ΔΜ2 και SU6656 μειωμένη φουρίνη-Notch-1 ένωση κατά 53% και 43%, αντίστοιχα (Σχήμα S4).

(Α) Src αναστολέας ΡΡ2 ή SU6656 αναστέλλει Notch-1 και φουρίνη σχέση. κύτταρα HPAC αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS χωρίς στέρηση ορού. Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μΜ ΡΡ2 ή SU6656 για 60 λεπτά. Κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μια πυκνομετρία για το Σχήμα 3Α παρέχεται στο Σχήμα S4. (Β) PDGF-ΒΒ διεγείρει την αλληλεπίδραση φουρίνη και Notch-1. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα HPAC είχαν ορό starvated για 48 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 ng /ml ΡϋΟΡ-ΒΒ επί 20 λεπτά. Κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. (C) SU6656 αναστέλλει PDGF που προκαλείται από φουρίνη-Notch-1 ένωση. Τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα HPAC είχαν ορό starvated για 48 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SU6656 για 60 λεπτά, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 ng /ml PDGF για 20 λεπτά. SS, ασιτία ορού? PDGF, PDGF-BB? FBS, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο, ​​DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS χωρίς ασιτία ορού? Notch-1 ρ120, που διασπάται πρωτεΐνες Notch? Notch-1 P300, πρωτεΐνες Notch FL. (Δ) Το EGFR συνδέτη ΤΟΡ-α επάγει την ενεργοποίηση της Src σε Golgi. RFP-B4GLT1-επιμολυσμένα κύτταρα HPAC ήταν ορό starvated για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 7 ηΜ ΤΟΡ-α. Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-φωσφο-Src (

πράσινο

) αντισωμάτων για να απεικονίσει συν-εντοπισμό της φωσφο-Src (πράσινο) και RFP-TAged TGN B4GALT1 δείκτη.

Bar,

10 μm.

Η

Για να ελέγξετε αν δραστηριότητας Src παράγοντα από την ανάπτυξη που επηρεάζει Notch-1 ενεργοποίηση και την αλληλεπίδραση Notch-1-φουρίνη, BxPC-3 και HPAC κύτταρα στερήθηκαν ορού για 48 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 20 ng /ml ΡϋΟΡ-ΒΒ επί 20 λεπτά. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 3C αποκαλύπτουν σημειώνονται ενεργοποίηση της c-Src στα PDGF-ΒΒ-κατεργασμένα κύτταρα. Σε αυτά τα κύτταρα συν-ανοσοκαταβύθιση των πλήρους μήκους Notch-1 με φουρίνη αυξηθεί περισσότερο από 5 φορές (Σχήμα 3Β). Η κύρια μορφή του Notch-1 που συνδέεται με φουρίνη ήταν πλήρους μήκους (Εικόνα 3Β), σε αντίθεση με την εγκοπή-1 που αλληλεπιδρά με c-Src, οι οποίες ήταν κυρίως ρ120 (Σχήμα 4Α). Η θεραπεία με 7 nmol /L ΤΟΡ-α είχαν παρόμοια επίδραση με PDGF-ΒΒ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) c-Src associatesd με Notch-1 σε κύτταρα BxPC3. Τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντι-c-Src αντισώματα και immunoblotteding (ΙΒ) πραγματοποιήθηκαν με αντι-Notch-1 και αντισώματα αντι-c-Src. Κανονική IgGs κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι. (Β) ΔΜΠ2 αναστέλλει ΤΟΡ-α που προκαλείται από c-Src και Notch-1 ένωση. Ορός-starvated κύτταρα HPAC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ ΡΡ2 για 60 λεπτά, έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 7 nmol /L ΤΟΡ-α για 20 λεπτά. Κανονική IgGs κουνελιού χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες για ΠΕ. Τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε κανονικό μέσο (DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου) χωρίς στέρηση ορού χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Ν, Κανονική μέσο. (Γ) SU6656 αναστέλλει ΤΟΡ-α-επαγόμενη c-Src και Notch-1 σύνδεσης. Notch-1 /ρ300, πρωτεΐνες Notch FL.? Notch-1 /ρ120, που διασπάται πρωτεΐνες Notch. (Δ) Ένωση c-Src με Notch-1 εξαρτάται από την δραστικότητα της κινάσης της. Άγριου τύπου, Y416F, Y527F και συντήκονται με μια ετικέτα ΗΑ επιμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα HeLa. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν στη συνέχεια, ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-Notch-1 αντισώματα, και immunoblottedting (ΙΒ) πραγματοποιήθηκαν με αντι-ΗΑ και-Notch-1 αντι αντισώματα. Κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.

Η

Στη συνέχεια εξέτασαν τα αποτελέσματα των αναστολέων c-Src για την ΡϋΟΡ-ΒΒ-επαγόμενη αύξηση των Notch-1 και φουρίνη δεσμευτική. Προκατεργασία των κυττάρων με 10 μΜ ΡΡ2 ή SU6656 για 60 λεπτά είχε σαν αποτέλεσμα σχεδόν πλήρη αναστολή του PDGF-ΒΒ-επαγόμενη αύξηση των Notch-1 και δεσμευτική φουρίνη (Σχήμα 3C). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι εξωκυτταρικά σήματα του αυξητικού παράγοντα που διαμεσολαβείται από c-Src προκαλέσουν Notch-1 και φουρίνη δεσμευτική και να ενεργοποιήσετε Notch-1.

Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η πλήρους μήκους Notch-1 cleavaged για πρώτη φορά από φουρίνη στην TGN. Όπως αυξητικού παράγοντα ΤΟΡ-α και ΡϋΟΡ-ΒΒ διεγείρει την αλληλεπίδραση των Notch-1-φουρίνη, ρωτήσαμε αν αυξητικό παράγοντα επάγει την ενεργοποίηση c-Src στο TGN. Εμείς επιμολυσμένα κύτταρα HPAC με RFP-TAged B4GALT1 ως TGN δείκτη. Αποδείχθηκε ότι B4GALT1 εντοπίζεται κυρίως στο TGN, και για κάποιο βαθμό, έσω Golgi [12]. B4GALT1-επιμολυσμένα κύτταρα HPAC είχαν ορό starvated για 48 ώρες και 7 ηΜ ΤΟΡ-α προστέθηκε για 30 λεπτά. Για να προσδιορίσετε αν CSRC δραστηριοποιείται στο TGN, κοιτάξαμε συν-εντοπισμό της φωσφο-Src και B4GALT1 χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας. Δείξαμε συνεντόπισης του RFP-TAged B4GALT1 και φωσφο-c-Src immunoreactivty σε ΤΟΡ-α επεξεργασμένα κύτταρα, αλλά όχι στα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 3D). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο TGF-α επάγει θα μπορούσε γρήγορα ενεργοποίηση c-Src στο TGN.

4. c-Src συσχετίζει άμεσα με το Notch-1

Ρωτήσαμε αν c-Src κινάσης επηρεάζει την ενεργοποίηση Notch-1 απ ‘ευθείας, είτε ενεργεί έμμεσα μέσω άλλων τελεστών. BxPC3 κύτταρα λύθηκαν και το κυτταρόλυμα ανοσοκαταβυθίστηκε με αντισώματα αντι-c-Src, και Notch-1 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. Μερικά Notch-1, τόσο πλήρους μήκους Notch-1 /ρ300 και Notch-1 /ρ120, συνδέθηκε με c-Src (Σχήμα 4Α). Μπορούμε επίσης ανοσοκαταβυθίστηκε Notch-1 και βρήκε σημαντικές ποσότητες c-Src στα ανοσοκαθιζήματα Notch-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το c-Src φυσικώς συνδέεται με Notch-1.

Στη συνέχεια ζητήθηκε εάν ανάπτυξης ενεργοποίηση του παράγοντα που διεγείρεται c-Src θα μπορούσε να οδηγήσει σε αυξημένη σύνδεση της c-Src και Notch-1. κύτταρα HPAC στερήθηκαν ορού για 48 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 7 nmol /L ΤΟΡ-α για 30 λεπτά. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ΤΟΡ-α, συν-ανοσοκαταβύθιση των δύο πλήρους μήκους Notch-1 και Notch-1 /ρ120 με c-Src αυξήθηκε περίπου 3 φορές, και ανεστάλη δια προκατεργασίας με ΡΡ2 (Σχήμα 4Β) ή SU6656 (Σχήμα 4C ).

για να καταδειχθεί ότι η δραστικότητα της κινάσης src είναι απαραίτητη για τη σύνδεση του c-src με Notch-1, δημιουργήσαμε κινάση νεκροί και συστατικώς δραστικές μεταλλάξεις src. δραστηριότητα κινάσης απενεργοποιηθεί με μετάλλαξη του τόπου τυροσίνη Y416 σε φαινυλαλανίνη (c-Src-Y416F), ενώ ουσιαστικά δραστική Src Y527F δημιουργήθηκε από τη μετάλλαξή του ανασταλτικού τυροσίνη 527 σε φαινυλαλανίνη. Εμείς υπερεκφράζεται αυτά τα μεταλλάγματα σε κύτταρα HeLa και αξιολογείται η ικανότητα των διαφόρων c-Src κατασκευάσματα να συνδέσει με το Notch-1. Notch-1 συνδέεται με το άγριου τύπου και συστατικές μορφές του c-Src, αλλά η σύνδεση με το νεκρό κινάση μεταλλάκτη μειώθηκε περισσότερο από 3-φορές (Σχήμα 4D). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η δραστικότητα της κινάσης του c-Src απαιτείται για την αποτελεσματική σύνδεση προς Notch-1.

5. Συν-εντοπισμός του c-Src με Notch-1

in vivo

Η

Για να προσδιορίσετε αν c-Src και Notch-1 συν-Localize

in vivo

, πραγματοποιήσαμε ανοσοχρώση . Συνεντόπισης του Notch-1 και c-Src ανοσοαντιδραστικότητα μπορεί να φανεί από το κίτρινο φθορισμό όταν οι εικόνες των Cy3-χρώση αντι-Notch-1 και FITC-χρώση αντι-c-Src ανοσοαντιδραστικότητες συγχωνεύθηκαν (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια εξετάστηκαν για συν-εντοπισμό του ΗΑ-tagged c-Src και ενδογενές Notch-1. Άγριου-τύπου ΗΑ-c-Src εκφράστηκε σε κύτταρα HeLa. Ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού απεκάλυψε συν-εντοπισμό της c-Src-HA και Notch-1 (Σχήμα 5Β), και η έκφραση του FLAG-tagged ΝΕΧΤ σε κύτταρα HeLa αποκάλυψε συν-εντοπισμό της επόμενης-FLAG και c-Src (Σχήμα 5C).

(Α) ενδοκυττάρια αλληλεπίδραση της c-Src και Notch1. c-Src και Notch-1 έγιναν ορατά με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Bar,

10 μm. (Β) συν-εντοπισμό του ΗΑ-tagged c-Src και Notch-1. HPAC κύτταρο μεταμολύνθηκαν με pcDNA3-c-Src-ΗΑ πλασμίδιο, και συν-χρώση με αντι-Notch-1 (

κόκκινο

) και (

πράσινο

) αντισωμάτων αντι-ΗΑ για να απεικονίσει ενδογενή Notch-1 και ΗΑ-tagged c-Src, αντίστοιχα.

Bar,

10 μm. (C) Συν-εντοπισμός του ενδογενούς c-Src και FLAG-tagged Notch εξωκυττάριο αποκοπής (NEXT) τεμάχιο. HPAC κύτταρο μεταμολύνθηκαν με pcDNA3-ΕΠΟΜΕΝΗ-FLAG πλασμίδιο, συν-χρώση με αντι-c-Src (

κόκκινο

) και αντι-FLAG (

πράσινο

) αντισωμάτων για να απεικονίσει ενδογενές c-Src και FLAG-tagged Notch-1 ΕΠΟΜΕΝΗ κομμάτι, αντίστοιχα.

Bar,

10 μm.

Η

6. Οι πρωτεϊνικές περιοχές που εμπλέκονται στην c-Src-Notch-1 σύνδεση

c-Src αποτελείται από SH3, SH2 και πεδία κινάσης των οποίων η ικανότητα να δεσμεύονται διάφορες πρωτεΐνες έχουν χαρακτηριστεί. Εκφράσαμε μια σειρά από c-Src μεταλλάξεις διαγραφής σε HeLa κύτταρα για να προσδιοριστούν οι αναγκαίες για τη σύνδεση με τις περιοχές Notch-1 (Σχήμα 6Α). Σύνδεσης με Notch-1 ήταν μειωμένη, εάν η περιοχή της κινάσης του c-Src διεγράφη (Σχήμα 6Β). Σε αντίθεση, η διαγραφή του τομέα SH3 ή SH2 δεν επηρέασε σημαντικά σύνδεσης με Notch-1 (Σχήμα 6Β). Για να καθοριστεί εάν η περιοχή c-Src KD είναι επαρκής για την αλληλεπίδραση με το Notch-1, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς ανοσοκαθίζησης και κηλίδα Western με μια πρωτεΐνη σύντηξης c-Src KD-ΗΑ στα κυτταρολύματα HeLa. Notch-1 δεσμεύεται ειδικά με c-Src KD αλλά όχι με τον τομέα c-Src SH3, και μόνο ασθενώς με τον τομέα SH2 (Σχήμα 6Β). Ετσι, φαίνεται απαραίτητο και επαρκές για την αλληλεπίδραση c-Src με Notch-1 ο τομέας KD.

Ο τομέας κινάσης του c-Src συνδέεται με Notch-1. (Α) Σχηματική αναπαράσταση της δομής του c-Src κατασκευάσματα διαγραφής. (Β) Ο τομέας KD του c-Src συνδέεται με Notch-1

in vitro

. Οι υποδεικνυόμενες θραύσματα c-Src συντήχθηκαν με μια ετικέτα ΗΑ και μεταμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα HeLa. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν στη συνέχεια, ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ΗΑ αντισωμάτων, και immunoblotteding (ΙΒ) πραγματοποιήθηκαν με αντι-Notch-1 και αντισώματα αντι-ΗΑ. Κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. (C) συνανοσοκαθίζησης της FLAG-tagged Notch-1 NEXT και ΗΑ-tagged c-Src. (Δ) Σχηματική αναπαράσταση της δομής των κατασκευασμάτων εξάλειψης Notch-1. (Ε) Η επανάληψη ανκυρίνης τομέα του Notch-1 δεσμεύεται με c-Src. Οι υποδεικνυόμενες θραύσματα του Notch-1 συνενωμένο με επισήμανση FLAG και μεταμολύνθηκε παροδικά σε κύτταρα HeLa. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν στη συνέχεια, ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα αντι-FLAG, και immunoblotteding (ΙΒ) πραγματοποιήθηκαν με αντι-FLAG και αντι-c-Src αντισώματα. Κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. (F) Notch-1 είναι τυροσίνη-φωσφορυλιωμένη. Notch-1 ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-φωσφο-τυροσίνης Ab 4G10. Λύματα ολόκληρων κυττάρων από HPAC παρασκευάστηκαν, και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-φωσφο-τυροσίνης (4G10), και αντι-Notch-1 αντισώματα, και immunoblotteding (ΙΒ) πραγματοποιήθηκαν με αντι-Notch-1. Κανονική IgG κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. (G) Ανίχνευση τυροσίνης φωσφορυλίωση με αντι-Notch-1 ανοσοκαθιζήματα. Πάνω πίνακας: Λύματα ολόκληρων κυττάρων από HPAC ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-IgG και αντι-Notch-1 αντισώματα. Τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με αντίσωμα αντι-φωσφοτυροσίνης 4G10. Κάτω πάνελ, το ίδιο στύπωμα απογυμνώθηκε και ανιχνεύθηκε με αντι-Notch-1 αντίσωμα. (H) Src αναστολέα SU6656 ή ΔΜΠ2 μειώνει φωσφο-tysosine που σχετίζονται με Notch-1. Λύματα ολόκληρων κυττάρων από HPAC ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-IgG και αντι-φωσφοτυροσίνης αντισώματα 4G10. Τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης με αντι-Notch-1.

Η

Επίσης, συν-επιμολυσμένα FLAG-επισημασμένη Notch-1 επόμενη και ΗΑ-tagged c-Src σε κύτταρα HeLa. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το επόμενο συνδέεται με ΗΑ-tagged c-Src (Σχήμα 6C).

Το εύρημα μας ότι τόσο πλήρους μήκους Notch-1 (P300) και διασπάται Notch-1 (p120) συνεργάτης με C- src έδειξαν ότι η ενδοκυτταρική περιοχή Notch-1 (NICD) έχει μια θέση δέσμευσης c-src. Για τον προσδιορισμό του τομέα (ες) του Notch-1 είναι υπεύθυνη για πρόσδεση c-Src, δημιουργήσαμε διαγραφή κατασκευάσματα της NICD (Σχήμα 6D), και εκτελείται συνανοσοκαθίζηση αναλύσεις με ετικέτα αντι-FLAG και c-Src-ειδικά αντισώματα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επανάληψης ανκυρίνης (ANK) -deletion μεταλλάκτη είχε μια πολύ μειωμένη συγγένεια δέσμευσης για c-Src, υποδηλώνοντας ότι η περιοχή ΑΝΚ του Notch-1 είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση με c-Src (Σχήμα 6Ε). Ως εκ τούτου, Notch-1 και c-Src συνεργάτης μέσω της περιοχής ΑΝΚ του Notch-1 και τον τομέα KD του c-Src.

Για να δοκιμαστεί εάν Notch-1 είναι φωσφορυλιωμένη επί υπολειμμάτων τυροσίνης, ανοσοκαταβυθίσαμε κυτταρολύματα HPAC με αντι-φωσφο-τυροσίνης αντίσωμα 4G10, και ανιχνεύεται Notch-1 με κηλίδωση Western. Μερικά Notch-1 /ρ120 ήταν παρούσα στο ανοσοΐζημα (Σχήμα 6F). Μπορούμε επίσης ανοσοκαταβυθίστηκαν κυτταρικά λύματα HPAC με αντι-Notch-1 αντίσωμα και ανιχνεύεται τυροσίνης φωσφορυλίωση με 4G10 αντίσωμα αντι-φωσφο-τυροσίνης. Τόσο Notch-1 /ρ300 και Notch-1 /ρ120 φωσφορυλιώθηκαν επί τυροσίνης (Σχήμα 6G). Εμείς κατεργασμένα κύτταρα HPAC με 10 μΜ SU6656 ή ΡΡ2 για 30 λεπτά, και ανοσοκαθίζηση του κυτταρολύματος με αντίσωμα αντι-φωσφο-τυροσίνης 4G10, τότε ανιχνεύεται φωσφο-τυροσίνης που σχετίζεται με Notch-1 (Σχήμα 6Η). Βρήκαμε ότι SU6656 ή ΡΡ2 μειώθηκε αισθητά φωσφο-τυροσίνης που σχετίζεται με Notch-1 (Σχήμα 6Η). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Notch-1 δυνητικά φωσφορυλιώνεται από c-Src.

7. Συν-εντοπισμό της c-Src και Notch-1 σε μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του παγκρέατος

Για να δούμε αν συστηματική θεραπεία με ΡΡ2 μπορούσε να επηρεάσει την αλληλεπίδραση των Notch-1-c-Src σε όγκους ξενομοσχεύματος

in vivo

, ιδρύσαμε HPAC ανθρώπινο παγκρεατικό ξενομοσχεύματα καρκίνου σε γυμνούς ποντικούς. Μόλις τα μοσχεύματα HPAC είχε εξελιχθεί σε ψηλαφητών όγκων (200 mg), ΡΡ2 δόθηκε σε 4 mg /kg υποδορίως ενέσεις για συνολικά 8 ενέσεις κάθε δεύτερη μέρα. PP2 θεραπεία μείωσε την ανάπτυξη του όγκου (

P

= 0,0007 έναντι του οχήματος) σε σύγκριση με τους μη επεξεργασμένους μάρτυρες. (Εικόνα 7Α & amp? Β)

(Α) Επίδραση της ΔΜ2 στην αύξηση του όγκου των HPAC καρκίνου του παγκρέατος ξενομοσχεύματα στα πλευρά γυμνών ποντικών. Ένα αντιπροσωπευτικό φωτογραφία του ένα ποντίκι από κάθε ομάδα παρουσιάζεται., Με όγκους που βρίσκονται στα πλευρά τους. (Β) Μειωμένη ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων των HPAC καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια που οφείλεται στη θεραπεία ΡΡ2. Οι όγκοι του όγκου ήταν 200-300 mm

3 κατά την έναρξη της θεραπείας ναρκωτικών. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τους όγκους των όγκων. Η διαφορά μεταξύ των ομάδων DMSO και ΡΡ2 ήταν πολύ σημαντική (

P

& lt? 0,01? N = 10). (Γ) Οι όγκοι αποκόπηκαν και επεξεργασία, και τα πλακίδια χρωματίστηκαν με Η &? Ε. (Δ) Η ανοσοϊστοχημική χρώση σε ξενομοσχεύματα όγκου HPAC. Οι όγκοι αποκόπηκαν και επεξεργασία, και τα πλακίδια χρωματίστηκαν με αντισώματα προς c-Src (κόκκινο), Notch-1 (πράσινο), και ϋΑΡΙ (μπλε). Ο εντοπισμός του c-Src και Notch-1 έγιναν ορατά με ένα ομοεστιακό microscopye. συν-Εντοπισμό εμφανίζονται

κίτρινο

στην επικάλυψη.

Bar,

10 μm. (Ε) Η συχνότητα αναλογία κόκκινο-πράσινο συν-εντοπισμό των DMSO και ΡΡ2-αγωγή καρκινικών ιστών (αριθμοί κυττάρων με κίτρινο χρώμα /αριθμοί των συνολικών κυττάρων με μπλε χρώμα στο Σχ. 7D), μετρήθηκε με το λογισμικό Εικόνα- Pro Plus λογισμικό.

Η

αιματοξυλίνη και ηωσίνη τομές χρώση των όγκων ξενομοσχεύματος παρουσιάζονται στο Σχήμα 7C. Σημειώστε την πυρηνική πύκνωση και οίδημα δει στο ΔΜΠ2 αγωγή όγκων. Η ανοσοχρώση των διαδοχικών τομών αποκάλυψε συν-εντοπισμό της c-Src και Notch-1 ανοσοαντιδραστικότητες στον ιστό ξενομοσχεύματος όγκου (άνω πάνελ, το Σχήμα 7D), υποδηλώνοντας θετική συσχέτιση μεταξύ του c-Src και Notch-1 ενεργοποίηση σε μεμονωμένα κύτταρα του όγκου. Η θεραπεία με ΡΡ2 μείωσε σημαντικά την συν-εντοπισμό των Notch-1 και c-Src (Σχήμα 7D), η συχνότητα των κόκκινο-πράσινο συν-εντοπισμό ήταν πολύ χαμηλότερη από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (6 ± 1,5 έναντι 15,4 ± 4,6%?

P

& lt? 0,01, η = 10?. Σχήμα 7Ε)

Συζήτηση

Αν και διάσπαση του Notch-1 στην περιοχή S1 με φουρίνη είναι απαραίτητη για Notch-1 ενεργοποίηση , ο μηχανισμός που διέπει σύνδεση Notch-1-φουρίνη δεν ήταν σαφές. Στην παρούσα μελέτη αποδείξαμε ότι η ενεργοποίηση Notch-1 ρυθμίζεται από μια κινάση τυροσίνης. Δείξαμε επίσης ότι η c-Src συνδέεται φυσικώς με το Notch-1? c-Src αλληλεπιδρά με Notch-1 μέσω τομέα του KD, και η δραστικότητα κινάσης απαιτείται για την αποτελεσματική σύνδεση των c-Src με Notch-1. Εξωκυτταρική παράγοντες ανάπτυξης φαίνεται να ρυθμίζουν άμεσα Notch-1 διάσπασης στο επίπεδο πρωτεΐνης μέσω c-Src.

Άμεση cross-talk μεταξύ ανάπτυξης υποδοχέα-c-Src και της οδού Notch

Src οικογένεια κινασών (SFKs) είναι μη υποδοχείς κινάσες υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των καρκίνων του παγκρέατος και που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [9]. Η αναστολή αυτών των κινασών έχει δείξει υπόσχεση σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η Notch-1 και c-Src πρωτεΐνες είναι φυσικώς συνδεδεμένα και ότι αυτή η ένωση προκαλεί Notch-1 επεξεργασία και την ενεργοποίηση. Έχει αναφερθεί ότι το Notch-1 σχετίζεται με την κινασών σερίνης /θρεονίνης ΟδΚ3β και CDK8 [13], [14]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Notch-1 ρυθμίζεται επίσης από μια κινάση της τυροσίνης.

Notch-1 είναι δυνητικά ένα καθοδικός τελεστής του EGFR /PDGFR σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

EGFR σηματοδότησης επιπτώσεις πολλές πτυχές του όγκου βιολογία, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, εισβολή, διάδοση, και την απόπτωση [15]. Η ενεργοποίηση του EGFR ενισχύει την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, και την εξάπλωση? αναστέλλει επίσης την απόπτωση. Η πλειονότητα των καρκίνων του παγκρέατος υπερεκφράζουν EGFR, και αυτό έχει συσχετισθεί με προχωρημένη νόσο κατά την παρουσίαση και την μειωμένη μέσος χρόνος επιβίωσης [16]. EGFR παράγει το αποτέλεσμά του επί κακοήθων κυττάρων μέσω αυτοκρινών και παρακρινείς βρόχοι και έχει δειχθεί ότι δεσμεύουν ΤΟΡ-α και EGF. EGFR συνέχεια αυτοφωσφορυλιωμένο και transphosphorylated σχετικά με τα κατάλοιπα τυροσίνης, με αποτέλεσμα σε συνδυασμό με τον προσαρμογέα και τα μόρια σηματοδότησης και οδηγεί στην ενεργοποίηση πολλαπλών ενδοκυτταρικής καταρράκτες σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που αφορούν Src, AKT και ras /MAPK1 /2 [15].

ΡϋΟΡΡ-α και ΡϋΟΡΡ-β είναι δομικά παρόμοιες κινάσες τυροσίνης υποδοχέα που ενεργοποιείται από προερχόμενο από αιμοπετάλια αυξητικό παράγοντα [17]. PDGF επάγει κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση [18] και του μετασχηματισμού [19]. Η ενεργοποίηση του PDGFR σε όγκους μπορεί επίσης να προκύψει μέσω αυτοκρινή ή παρακρινή διέγερση, καθώς οι δύο όγκων και φυσιολογικών κυττάρων στο στρώμα εκκρίνουν PDGF. Υπερ-έκφραση του PDGFR έχει βρεθεί σε καρκίνους του παγκρέατος [20]. Όπως EGFR, PDGFR διέγερση οδηγεί στην ενεργοποίηση της ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, ιδιαίτερα των Src, ΑΚΤ, και ras /MAPK1 /2.

Έχουμε παρατηρήσει προηγουμένως ότι η υπερ-έκφραση της ενδοκυτταρικής περιοχής του Notch-1 (NICD) αυξάνει ανάπτυξη του παγκρέατος των καρκινικών κυττάρων, και να χτυπήσει κάτω Notch-1 αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη [11]. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι η υπερέκφραση του Notch-1 αυξάνει τον σχηματισμό αποικιών HPAC καρκίνου του παγκρέατος κύτταρα. Δείξαμε παραπάνω ότι η ενεργοποίηση του EGFR είτε ή PDGFR διεγείρει Notch-1 ενεργοποίησης, η οποία διαμεσολαβείται από c-Src. Έτσι, Notch-1 ενεργοποίηση παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων και στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που διεγείρονται από την ενεργοποίηση του EGFR ή PDGFR.

Σε προηγούμενη έκθεση βρήκαμε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του Notch-1 μειωμένη κυτταρική εισβολή, ενώ Notch-1 υπερέκφραση με επιμόλυνση cDNA οδήγησε σε αυξημένη εισβολή των καρκινικών κυττάρων [11]. Βρήκαμε επίσης ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του Notch-1 μειωμένη δραστηριότητα και την έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9 (ΜΜΡ-9) και VEGF [21] ΝΡ-κΒ DNA-δεσμευτική. Έτσι, Notch-1 μπορεί να δρα ως κατάντη τελεστή του EGFR /ΡϋΟΡΡ σηματοδότησης πάνω ρύθμιση ΜΜΡ-9 και VEGF έκφραση, και την τόνωση της κυτταρικής εισβολής και της μετάστασης.