Αφηρημένο

Τα μακροφάγα είναι κύτταρα με πολλές σημαντικές λειτουργίες και στις δύο έμφυτη και προσαρμοστική ανοσοποιητικό απαντήσεις και έχει αποδειχθεί ότι παίζουν ένα σύνθετο ρόλο στη την εξέλιξη του όγκου δεδομένου ότι τρέφουν τόσο του όγκου πρόληψη (M1 μακροφάγα) και του όγκου προώθηση (M2 μακροφάγα) δραστηριότητες. Σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους, έχουν διεισδύοντα μακροφάγα έχουν συσχετιστεί με κακή πρόγνωση ασθενούς, και ως εκ τούτου προτείνεται να είναι κυρίως ενός φαινοτύπου Μ2. Ωστόσο, και άλλοι έχουν δείξει προηγουμένως ότι η αυξημένη πυκνότητα των μακροφάγων σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) αντί συσχετίζεται με μια βελτιωμένη πρόγνωση. Είναι ένα ενδιαφέρον ερώτημα αν οι διαφορετικοί ρόλοι από μακροφάγα σε διάφορους καρκίνους θα μπορούσε να εξηγηθεί από τις διακυμάνσεις στην ισορροπία μεταξύ Μ1 και Μ2 χαρακτηριστικά μακροφάγων, οδηγείται από όγκο ή όργανο-ειδικούς παράγοντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου των μεμονωμένων καρκίνων. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε ένα

in vitro σύστημα

κυτταρικής καλλιέργειας των μακροφάγων διαφοροποίησης να συγκρίνει τις διαφορές και τις ομοιότητες στον φαινότυπο (μορφολογία, αντιγόνο-παρουσίαση, η μετανάστευση, ενδοκυττάρωση, και την έκφραση κυτοκίνης και χημειοκίνης γονίδια) μεταξύ M1 /​​M2 και ενεργοποιείται όγκου μακροφάγα (ΤΑΜ), που θα μπορούσε να εξηγήσει το θετικό ρόλο των μακροφάγων στο CRC. Βρήκαμε που εκκρίνονται από τα κύτταρα παράγοντες CRC που προκαλείται ΤΑΜ ενός «μικτού» φαινότυπος Μ1 /Μ2, το οποίο με τη σειρά του θα μπορούσε να συμβάλει σε μια «καλή φλεγμονώδη αντίδραση». Αυτό υποδηλώνει ότι η εκ νέου εκπαίδευση των μακροφάγων μπορεί να επιτρέψει σημαντικές θεραπευτικές εξελίξεις στη θεραπεία του καρκίνου του ανθρώπινου

Παράθεση:. Edin S, Wikberg ML, Rutegård J, Oldenborg PA, Palmqvist Ε (2013) φαινοτυπική στρέβλωση των μακροφάγα

In Vitro από

Έκκριση Παράγοντες από τα κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (9): e74982. doi: 10.1371 /journal.pone.0074982

Επιμέλεια: Antonio Moschetta, Πανεπιστήμιο του Μπάρι & amp? Consorzio Mario Negri Sud, Ιταλία

Ελήφθη: 12 Μαρτίου, 2013? Αποδεκτές: 13 Αυγούστου 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Edin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τη σουηδική Εταιρεία Καρκίνου (www.cancerfonden.se) (Grant δεν CAN 2011/839, Palmqvist.)? Σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας (Grant δεν B03488901, Palmqvist.) (Www.vr.se)? Έρευνα αιχμής Επιχορήγηση από το Νομαρχιακό Συμβούλιο του Västerbotten, Σουηδία (Grant δεν VLL-132981, Palmqvist.)? Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο στη Βόρεια Σουηδία (Grant δεν AMP 10-655, Εντίν.) (Www.cancerforskningsfonden.se)? και Tore Ίδρυμα Nilssons (Edin) (www.torenilssonsstiftelse.nu). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το μικροπεριβάλλον του όγκου παίζει αρκετά πολύπλοκο και σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του όγκου [1]. Κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, μία κύρια έμφαση στην έρευνα για τον καρκίνο έχει σχετικά με τη σημασία της φλεγμονώδους μικροπεριβάλλον του όγκου, η οποία στη συνέχεια οδήγησε στην ένταξη της φλεγμονής προάγουν όγκο και το ανοσοποιητικό φοροδιαφυγής, όπως οι αναδυόμενες χαρακτηριστικά του καρκίνου [2]. Μια αυξημένη κατανόηση του ανοσοποιητικού contexture – δηλαδή τη θέση, την πυκνότητα και λειτουργικό προσανατολισμό των κυττάρων του ανοσοποιητικού, και πώς αυτό επηρεάζει την εξέλιξη του όγκου θα μπορούσε να παράσχει σημαντικά εργαλεία για την πρόβλεψη της πρόγνωσης των ασθενών, καθώς και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών [3]

Οι εργασίες για φλεγμονή στον ανθρώπινο καρκίνο είχε ως αποτέλεσμα την ταυτοποίηση των συστατικών του ανοσοποιητικού συστήματος που μπορεί να είναι επωφελής και επιβλαβής για πρόγνωση του ασθενούς. Ένα τέτοιο συστατικό είναι τα μακροφάγα του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Τα μακροφάγα αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά πλαστικό κύτταρα που μπορεί να εμφανίσει τόσο του όγκου πρόληψη (M1 μακροφάγα) και τις λειτουργίες προώθηση όγκου (M2 μακροφάγα) που επισκοπείται στο [4], [5]. Εν συντομία, τα κλασικά ενεργοποιημένα μακροφάγα Μ1 υποστηρίζουν την προσαρμοστική ανοσολογική απάντηση και στοχεύουν μολυσματικών παραγόντων και κατεστραμμένα ή αλλοιωμένα κύτταρα. Χαρακτηρίζονται από μια αυξημένη έκφραση των μορίων που παρουσιάζουν το αντιγόνο (π.χ. MHC κατηγορίας II), συν-διεγερτικών υποδοχέων επί λεμφοκυττάρων (π.χ. CD86 και CD40), καθώς και ένας αριθμός προ-φλεγμονωδών κυτοκινών (π.χ. IL6, IL12, IL23 και TNFα), και φέρεται να έχει μικροβιοκτόνο και αντικαρκινική δράση. Εναλλακτικά οι ενεργοποιημένα μακροφάγα Μ2 που ασχολούνται με την επούλωση των πληγών και στην συντηρήσεις ομοιόστασης ιστού και housecleaning και εκφράζουν υψηλά επίπεδα των υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (π.χ. μαννόζη υποδοχέα (MR) και υποδοχέων σαρωτής (π.χ. CD163). Ωστόσο, πολλές από τις λειτουργίες του Μ2 μακροφάγων μπορεί στην πραγματικότητα να είναι προ-ογκογόνο δεδομένου ότι διεγείρουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την αναδιαμόρφωση των ιστών, την αγγειογένεση και την ανάπτυξη ενός ανοσοκατασταλτικού περιβάλλοντος με έκκριση ανοσο-κατασταλτικής κυτοκίνες (π.χ. IL10 και ΤΟΡβ), η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί από έναν αυξανόμενο όγκο να εισβάλει τη γύρω ιστός και να εξαπλωθεί σε απομακρυσμένα όργανα [6]. Μ1 και Μ2 μακροφάγα έχουν διακριτά προφίλ χημειοκίνης, που οδηγεί στην επιλεκτική πρόσληψη των ανοσοκυττάρων, π.χ. διαφορετικά υποσύνολα των Τ-λεμφοκυττάρων. Ενώ M1 μακροφάγα εκφράζουν κυρίως CXCL9 και CXCL10 που προσλαμβάνουν λεμφοκύτταρα Τ βοηθός τύπου 1 (Th1) και κυτταροτοξικά (το) υποσύνολα, M2 μακροφάγα αντί προσλαμβάνουν κυρίως λεμφοκύτταρα ενός ρυθμιστικού φαινότυπο (Treg) και Τ βοηθητικού τύπου (Th2) υποσύνολα με έκκριση του χημειοκινών CCL17, CCL22 και CCL24 [4], [5 ], [7]. Τα μακροφάγα μπορούν επίσης να διαφοροποιηθούν σε διάφορες M2-όπως λειτουργικά κράτη, τα οποία έχουν αποδεικνύεται τόσο

in vitro

και

in vivo

, αναθεωρούνται στο [4]. Στην πραγματικότητα, οι μεταβολές των μακροφάγων με διάφορα χαρακτηριστικά M1 ή M2 φαίνεται να είναι ατελείωτες. Μ1 και Μ2 φαινότυποι των μακροφάγων πρέπει να εκλαμβάνεται ως ακραίες λειτουργικές καταστάσεις σε ένα φάσμα των μακροφάγων phentoypes [8]. Ωστόσο, η ταξινόμηση Μ1 και Μ2 μπορούν ακόμα να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό της κύριας φαινότυπο και τις λειτουργίες των διαφορετικών πληθυσμών μακροφάγων. Το μακροφάγων φαινότυπος ελέγχεται από τα γεγονότα στο μικροπεριβάλλον του όγκου στον οποίο βρίσκεται. Παραδείγματα μακροφάγων πόλωσης γεγονότα είναι έκκριση μεσολαβητών που προέρχονται από όγκους, υποξική ή νεκρωτικές παραγόντων και βλάβη των ιστών [9]. Η φαινότυπος μακροφάγων επηρεάζεται επίσης από άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού και των συστατικών του στρώματος.

σε ανθρώπινους καρκίνους, διήθηση μακροφάγων έχει συχνά συσχετιστεί με χειρότερη πρόγνωση και, συνεπώς, τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους έχουν προταθεί να είναι κυρίως ενός φαινοτύπου Μ2 [10] – [12]. Ωστόσο, αυτό δεν συμβαίνει σε όλες τις μορφές καρκίνου. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι ένας μεγάλος αριθμός των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους συσχετίζονται με μία βελτιωμένη πρόγνωση [13] – [17]. Έχουμε περαιτέρω μελέτησαν την κατανομή των Μ1 και Μ2 φαινότυποι των μακροφάγων στο CRC. Βρήκαμε ότι ο αριθμός των Μ1 και Μ2 μακροφάγα υψηλή συσχέτιση. Οι ασθενείς που έχουν υψηλούς αριθμούς που διηθούν Μ1 μακροφάγων, είχε επίσης υψηλό αριθμό των διηθητικών μακροφάγων Μ2, και μια σημαντικά καλύτερη πρόγνωση [18]. Λαμβάνοντας υπόψη την υψηλή πλαστικότητα των μακροφάγων, μια πιθανή εξήγηση για την μικτό πληθυσμό Μ1 και Μ2 μακροφάγων φαίνεται στο CRC μπορεί να είναι είτε ότι καρκινικά εκκρίνονται παράγοντες CRC έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιήσουν ή να διατηρήσουν Μ1 χαρακτηριστικά μακροφάγων, ή ότι δεν οδηγούν M2 μακροφάγων διαφοροποίηση στον ίδιο βαθμό όπως και σε άλλους καρκίνους, όπου διήθηση μακροφάγων είναι σαφώς επιζήμια για την πρόγνωση των ασθενών.

Εδώ έχουμε χρησιμοποιήσει ένα

in vitro σύστημα

κυτταρικής καλλιέργειας για να συγκρίνουν την φαινότυπο (και λειτουργίες) του ενεργοποιημένα μακροφάγα όγκου (ΤΑΜ) σε CRC με εκείνη των καθιερωμένων Μ1 και Μ2 φαινότυποι των μακροφάγων να πάρετε μια καλύτερη κατανόηση του τρόπου με τον φαινότυπο μακροφάγων επηρεάζεται από τον όγκο που εκκρίνονται παράγοντες και πώς αυτό μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα του ασθενούς. Βρήκαμε που εκκρίνονται από τα κύτταρα παράγοντες CRC δεν προκάλεσε μια πλήρη M1 ή M2 απάντηση των μακροφάγων, αλλά αντ ‘αυτού ΤΑΜ ενός «μικτού» φαινότυπος M1 /​​M2. Επιπλέον, ακόμη και αν Μ1 και Μ2 μακροφάγα βρέθηκαν να ξαναγίνει εύκολα edjucated προς την αντίθετη κατεύθυνση, που εκκρίνεται από τα κύτταρα παράγοντες CRC δεν ήταν σε θέση να παραποιήσει ήδη παρούσα μακροφάγων Μ1 προς M2 μακροφάγα, αλλά αντ ‘αυτού φάνηκε να ενισχύσει το φαινότυπο Μ1. Μαζί, αυτό θα μπορούσε να συμβάλει στη δημιουργία μιας «καλής φλεγμονώδη αντίδραση», όπου οι ογκο-κατασταλτικά λειτουργίες των μακροφάγων κυριαρχούν.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Ανθρώπινα μονοκύτταρα που λαμβάνονται από φλεγμονώδεις πλακούντες των ανώνυμων υγιείς δότες αίματος που είχαν δώσει ενημερωμένη συγκατάθεση τους εγγράφως (σύμφωνα με τις τοπικές κατευθυντήριες γραμμές στο κέντρο αίματος, Πανεπιστήμιο της Umea Νοσοκομείο). Σύμφωνα με την τοπική επιτροπή δεοντολογίας στην έρευνα (Περιφερειακό Ηθικά Διοικητικό Συμβούλιο κριτική στη Umeå, Σουηδία) την έγκριση ηθική δεν είναι υποχρεωμένη να μελετήσει λευκοκύτταρα απομονώνονται από φλεγμονώδεις πλακούντες που προέρχονται από ανώνυμο αιμοδότες (DNR 2012-327-31M).

τηλέφωνα Culture

Οι κυτταρικές σειρές CRC RKO, SW480 και Caco2 (ATCC) αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) σε 37 ° C με 5% διοξείδιο του άνθρακα. Προσαρμοσμένα μέσα από τις κυτταρικές σειρές CRC παρασκευάστηκε με έκπλυση των κυττάρων σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), μετά το οποίο τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περίπου 90% συρροή σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS και αντιβιοτικά για 48 ώρες. Ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 rpm για 30 λεπτά και αποθηκεύονται στο -80 ° C καταψύκτη μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) καθαρίστηκαν από αίμα δότη φλεγμονώδεις πλακούντες με καταβύθιση δεξτράνης και Fiqoll-Paque φυγοκέντρηση κλίσης. Μονοκύτταρα καθαρίστηκαν περαιτέρω από τα PBMCs είτε κατά 1,5 ώρες προσκόλλησης που ακολουθήθηκε από 2 πλύσεις σε θερμό PBS συμπληρωμένο με 5% FBS, ή με μαγνητικό-ενεργοποιούμενο κυτταρικό διαχωρισμό (MACS) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Miltenyi Biotec) οδηγώντας σε ένα πληθυσμό των μονοκυττάρων με καθαρότητα περίπου 95%. Καθαρισμένα μονοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI με 10% FBS και αντιβιοτικά συμπληρωμένο με 20 ng /ml M-CSF, με το μέσο που ανταλλάσσονται κάθε δεύτερη μέρα. Την ημέρα 6, τα μονοκύτταρα διεγέρθηκαν περαιτέρω για 40 ώρες με την προσθήκη 100 ng /ml LPS και 20 ng /ml ΙΡΝγ (για Μ1 μακροφάγα), ή 20 ng /ml IL-4 ή IL10 (για M2 μακροφάγα). Για ενεργοποιείται όγκου υποσύνολα μακροφάγων, μονοκυττάρων ήταν την ημέρα 6 επωάζονται σε όγκο ρυθμισμένο μέσο συμπληρωμένο με 20 ng /ml M-CSF για 40 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε περαιτέρω αναλύσεις. Οι διαφοροποιημένοι φαινότυποι μακροφάγων αξιολογήθηκαν για κάθε φλεγμονώδη πλακούντα με αναλύσεις κυτταρομετρίας ροής της έκφρασης των Μ1 και Μ2 τυπικών δεικτών. κυτταρικό θάνατο (απόπτωση /νέκρωση) ελέγχθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη V /PI χρώση (Abcam), όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. EtOH προστέθηκαν σε συγκέντρωση 5% για 30 λεπτά ως θετικός έλεγχος για τον κυτταρικό θάνατο.

για μορφολογική έρευνα 8 × 10

6 καθαρίστηκε μονοπύρηνα κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 6 φρεατίων, καθαρίζεται περαιτέρω με προσκόλληση, και διαφοροποιούνται σε διαφορετικές μακροφάγων πληθυσμούς, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ζωντανή φωτογραφία τραβήχτηκε με μια DeltaPix Invenio 3S τοποθετημένα σε ένα μικροσκόπιο Leitz ΒϊανειΊ.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

έκφραση δείκτη επιφανείας αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής (BD FACS Calibur κυτταρομετρητή ροής) με χρήση R-φυκοερυθρίνη (R-ΡΕ) μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι CD14 (κλώνος Μ5Ε2, BD Pharmingen) και CD1a (κλώνος HI149, Immunotools)? Ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι CD86 (κλώνος FUN-1, BD Pharmingen), HLA-DR (κλώνος MEM12, Abcam) και CD40 (κλώνος 5C3, Βϋ Pharmingen)? Αλλοφυκοκυανίνη (APC), συζευγμένης με μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι Μαννόζης υποδοχέα (MR) (κλώνος 15-2, Biolegend) και CD163 (κλώνος 215927, R & amp? D Systems). Μάρτυρες ισοτύπων συμπεριλήφθηκαν σε όλα τα πειράματα. Πριν από χρώση, υποδοχείς Fc δεσμεύτηκαν με 5% ανθρώπινη TruStain FCX ​​™ (Biolegend). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό CellQuest Pro (Tree Star) μετά gating στον πληθυσμό μακροφάγων στο SSC παράθυρο FSC /.

Ενδοκυττάρωση

FITC-δεξτράνης (Sigma-Aldrich) εσωτερικοποίηση χρησιμοποιήθηκε για να παρακολουθεί ενδοκύτωση από μακροφάγα πληθυσμούς. Τα μονοκύτταρα υποβλήθηκαν σε καθαρισμό MACS και διαφοροποιημένων για 6 ημέρες σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS και 20 ng /ml M-CSF. Την ημέρα 6, τα μακροφάγα συλλέχθηκαν και οι αριθμοί των κυττάρων ρυθμίστηκαν σε 5 × 10

5 κύτταρα σε 1 ml μέσου RPMI και εμβολιάστηκαν σε μια 24 φρεατίων πλάκα. Τα μακροφάγα περαιτέρω διαφοροποιούνται σε διαφορετικούς υποτύπους των μακροφάγων, όπως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από 40 ώρες διέγερσης, τα κύτταρα προ-επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με 20 μg /ml FITC-δεξτράνης για 90 λεπτά στους 37 ° C ή στους 4 ° C για την ανίχνευση δέσμευσης κυτταρικής επιφάνειας. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές χρησιμοποιώντας 1 ml PBS με 5% FBS και μέσες εντάσεις φθορισμού (ΝΧΙ) προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής.

Κυττάρων Η μετανάστευση

πειράματα θαλάμου Boyden πραγματοποιήθηκαν για να αναλυθεί το πώς η μετανάστευση των διαφοροποιημένων μακροφάγων είχε επηρεαστεί από ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα CRC. 75 000 μακροφάγα διαφορετικών φαινοτύπων, όπως υποδεικνύεται, τοποθετήθηκαν σε ένα 24-φρεατίων ενθέτου κυτταρικής καλλιέργειας (μέγεθος πόρων 8 μm? BD Biosciences) σε 500 μΐ RPMI μέσο καλλιέργειας με 10% FBS και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 3 ώρες. Στη συνέχεια, ένθετα καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε ρυθμισμένο μέσο από RKO, SW480 ή Caco2 CRC κύτταρα ή RPMI μέσο κυτταρικής καλλιέργειας που περιέχει 10% FBS και επωάστηκαν για 24 ώρες. Μετά πλύση σε PBS, τα ένθετα τοποθετήθηκαν σε παγωμένη μεθανόλη για 1 λεπτό και πλύθηκαν πάλι σε PBS. Τα κύτταρα προσκολλώνται στο εσωτερικό του ενθέτου ξύνεται με μια μπατονέτα, και τα κύτταρα στην εξωτερική βάφτηκαν με 0.5% Coomassie blue. Μετά πλύσεις σε PBS, το φίλτρο αποκόπηκε και τα κύτταρα μετρήθηκαν σε τρία τυχαία επιλεγμένα πεδία και εμφανίζονται ως μέσος αριθμός κυττάρων που μεταναστεύουν /πεδίο.

κυτοκίνης και χημειοκίνης PCR Array

Η έκφραση του γονιδίου προφίλ των διαφορετικών πληθυσμών μακροφάγων μελετήθηκαν με τις κυτοκίνες & amp? Χημειοκινών PCR Array (PAH-150A, SABiosciences) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Εν συντομία, ολικό RNA απομονώθηκε από διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων χρησιμοποιώντας το κιτ NucleoSpin® RNA II (Macherey-Nagel). 1 μg του ολικού RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση και cDNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας RT

2 κιτ First Strand. Για κάθε ανάλυση, τα δείγματα cDNA αναμίχθηκαν με RT

2 qPCR κύριο μείγμα και διανέμονται σε όλη τη συστοιχία PCR πλάκες 96-φρεατίων και ανακυκλώνεται με πραγματικού χρόνου PCR (ΑΒΙ 7900HT, Applied Biosystems). στοιχεία ενίσχυσης (fold-αλλαγές στην C

t τιμές όλων των γονιδίων) αναλύθηκε με λογισμικό SABiosciences.

Στατιστικά

Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών εκτιμήθηκε με τη χρήση 2-tailed φοιτητές του

t

τεστ. Ένα

σ

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα σχήματα δείχνουν κατά μέσο όρο 3 ανεξάρτητων πειραμάτων, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση (SD).

Αποτελέσματα

Για να πάρετε μια καλύτερη κατανόηση για το πώς ο όγκος ως τέτοια επηρεάζει το φαινότυπο και τη λειτουργία των μακροφάγων στην CRC, έχουμε χρησιμοποιήσει ένα

in vitro κυττάρων

πολιτισμό μοντέλο για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων των διαφοροποιημένων μακροφάγων περιφερικού αίματος και κυτταρικές σειρές CRC. Σε μια

in vitro

ρύθμιση, η κλασική ενεργοποιημένου φαινοτύπου των μακροφάγων Μ1 μπορεί να επιτευχθεί με την έκθεση σε συνδέτες TLR όπως LPS και την Th1 κυτοκίνη ΙΡΝγ τυπικό. Εναλλακτικά ενεργοποιημένα μακροφάγα Μ2 διαφοροποιούνται σε μικροπεριβάλλοντα πλούσια σε Th2 τυπικά κυτοκίνες (π.χ. IL-4 και IL13) και μερικές φορές αναφέρεται ως επούλωσης πληγών μακροφάγα. Σε απάντηση του ανοσοποιητικού-κατασταλτική κυτοκίνες (π.χ. IL10) μακροφάγα υιοθετήσει μια M2-όπως το ανοσοποιητικό ρυθμιστικές φαινότυπο [4], [8].

Επαλήθευση των Μ1 και Μ2 μακροφάγων πληθυσμοί

Τα καθαρισμένα μονοκύτταρα διαφοροποιήθηκαν σε προσκολλημένα μακροφάγα με διέγερση με την κυτοκίνη M-CSF για 1 εβδομάδα και περαιτέρω διαφοροποιούνται με την προσθήκη LPS και ΙΡΝγ (για Μ1) και IL4 ή IL10 (για M2 μακροφάγα). Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Α, Μ1 μακροφάγων, γενικά, εμφανίζεται μια πιο στρογγυλή μορφολογία ενώ M2 μακροφάγα ήταν πιο επίμηκες. Τα μακροφάγα οδηγείται σε παρουσία και μόνο M-CSF έδειξε επίσης μια επιμήκη μορφολογία περισσότερο μοιάζει με το φαινότυπο Μ2, παρότι λιγότερο έντονη ότι ότι για τους διαφορετικούς πληθυσμούς του Μ2 μακροφάγων. Κοιτώντας σε περισσότερες λεπτομέρειες για τη μορφολογία, IL-4 διεγείρεται M2 μακροφάγα έδειξε την πιο έντονη επιμήκυνση, με ιδιαίτερα μεγάλες προεξοχές (Εικόνα 1Α). IL10 διεγερμένα μακροφάγα ήταν περισσότερο παρόμοια με το M-CSF μακροφάγα, με την εξαίρεση ότι είναι ελαφρώς πιο προσκολλημένα. Για να αποκλειστεί ότι οι μορφολογικές διαφορές παρατηρείται μεταξύ Μ1 και Μ2 μακροφάγα δεν οφείλονταν σε αυξημένη απόπτωση ή νέκρωση, αναλύσαμε την δέσμευση αννεξίνης V σε φωσφατιδυλοσερίνη κυτταρικής επιφάνειας και, καθώς προπιδίου ιώδιο (ΡΙ) πρόσληψη, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, οι διαφορετικοί φαινότυποι των μακροφάγων περιέχονται εύλογα χαμηλά επίπεδα των αποπτωτικών και νεκρωτικών κυττάρων, αντίστοιχα. Κατά την εξέταση της έκφρασης των Μ1 ή Μ2 τυπικών δεικτών με κυτταρομετρία ροής, M1 μακροφάγα έδειξαν να εκφράζουν υψηλά επίπεδα επιφάνειας κυττάρων της MHC τάξης II υποδοχέα HLA-DR, καθώς και συν-διεγερτικών υποδοχέων Τ κυττάρων, CD86 και CD40, αλλά χαμηλότερα επίπεδα των τυπικών δεικτών Μ2, CD163 και MR (Σχήμα 1 C). M2 μακροφάγα αντί εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του CD163 και MR, ενώ δείχνουν χαμηλή έκφραση των δεικτών Μ1 (Σχήμα 1 C). Οι δύο πληθυσμοί μπορούσαν Μ2 περαιτέρω να διακριθεί από το ότι η IL-4 μακροφάγα έδειξαν υψηλότερη έκφραση του MR, ενώ IL10 διεγερμένα μακροφάγα εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα CD163 (Σχήμα 1 C). Επιπλέον, όλα τα μακροφάγα υπότυποι βρέθηκαν να εκφράζουν συνήθως την μονοκυττάρων /μακροφάγων CD14 δείκτη (Εικόνα 1 C). CD1a, ο δείκτης για τα δενδριτικά κύτταρα μονοκυτταρικής προέλευσης, δεν εκφράστηκε είτε των πληθυσμών μακροφάγων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Μορφολογική αξιολόγηση των φαινοτύπων μακροφάγων. (Β) Η απόπτωση και νέκρωση των πληθυσμών μακροφάγων αξιολογήθηκε με χρώση με Annexin V και ΡΙ, αντίστοιχα, που ακολουθείται από κυτταρομετρία ροής. Παρίσταται τοις εκατό νεκρωτικών αποπτωτικών κυττάρων /(μέση ± SD) από τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Γ) έκφραση των εξωκυτταρικών δεικτών για μακροφάγων πληθυσμούς όπως αξιολογείται με ανοσοχρώση και κυτταρομετρία ροής. Σχετική μέση flourescense ένταση (MFI) ± SD από τρία ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται, όπου κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε έναντι των αντίστοιχων ισοτυπικό έλεγχο της. Οι σχετικές στατιστικά σημαντικές διαφορές υποδεικνύονται με * (p & lt? 0.05), ** (p & lt? 0,01), ή *** (p & lt? 0.001), μη σημαντικές

σ

τιμές υποδεικνύονται από ns

η μετανάστευση των Μ1 και Μ2 μακροφάγα

Για να μελετήσει κατά πόσον όγκου εκκρίνονται παράγοντες που κατά κάποιο τρόπο προσλαμβάνουν κατά προτίμηση μακροφάγα ενός συγκεκριμένου φαινοτύπου, κοιτάξαμε τη μεταναστευτική ικανότητα των Μ1 και Μ2 μακροφάγων σε ένα

in vitro

δοκιμασία κυτταρικής μετανάστευσης. Βρήκαμε ότι M1 μακροφάγα είχαν πολύ χαμηλά μεταναστευτικά ικανότητα προς έλεγχο μέσου RPMI, ενώ M-CSF διεγείρονται και Μ2 μακροφάγα μετανάστευσαν περισσότερο προς μέσο μόνο (Σχήμα 2). Κατά την έγκριση της διαφορετικούς υποπληθυσμούς των μακροφάγων να μεταναστεύουν προς ρυθμισμένα μέσα από κυτταρικές σειρές CRC RKO ή SW480, βρήκαμε ότι προνομιακά IL4 διεγείρονται M2 μακροφάγα έδειξαν αυξημένη μετανάστευση προς όγκο ρυθμισμένα μέσα, υποδηλώνοντας ότι όγκου εκκρίνεται παράγοντες προσλαμβάνουν κατά προτίμηση μακροφάγα ενός φαινοτύπου επούλωσης τραύματος (Σχήμα 2).

η μετανάστευση των μακροφάγων φαινοτύπων αξιολογήθηκε με πειράματα θαλάμου Boyden, όπου αφέθηκαν τα μακροφάγα να μεταναστεύσουν προς ρυθμισμένα μέσα από κυτταρικές σειρές RKO ή SW480 CRC, ή μέσο καλλιέργειας ελέγχου (RPMI + 10% FBS) . Οι μέσοι αριθμοί κυττάρων που μεταναστεύουν (n) ± SD δείχνεται. Οι σχετικές στατιστικά σημαντικές διαφορές υποδεικνύονται με * (p & lt? 0,05), μη σημαντικές

σ

τιμές υποδεικνύονται από ns

Η

Ο φαινότυπος των όγκων ενεργοποιημένα μακροφάγα (ΤΑΜ)

Η μορφολογία και την επιφάνεια των κυττάρων του φαινοτύπου ΤΑΜ διαφοροποιούνται με την παρουσία ρυθμισμένων μέσων από RKO, SW480 ή κυτταρικές γραμμές Caco2 CRC αναλύθηκε στο σχήμα 3Α και Β, αντίστοιχα. ΤΑΜ ήταν επίμηκες, έτσι η μορφολογία περισσότερο έμοιαζε με εκείνη του Μ2 πληθυσμών μακροφάγων (Συγκρίνετε Εικόνες 3Α και 1Α). Κατά την εξέταση της έκφρασης των ειδικών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας Μ1 και Μ2, ΤΑΜ βρέθηκαν επίσης να μοιράζονται περισσότερες ομοιότητες με M2 μακροφάγα (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, ο φαινότυπος ΤΑΜ δεν ήταν τόσο έντονη όπως εκείνη για τα μακροφάγα Μ2, δεδομένου ότι η υψηλή έκφραση είτε MR (όπως στην IL4 διεγερμένα Μ2 μακροφάγα) ή CD163 (όπως στην IL10 διεγερμένα M2 μακροφάγα) δεν θεωρήθηκε γενικά. Η εξαίρεση ήταν τα μακροφάγα ενεργοποιούνται από ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα SW480, η οποία εμφανίζεται μια υψηλή έκφραση του MR παρόμοια με εκείνη της IL-4 μακροφάγα Μ2 (Σχήμα 3Β). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα SW480 μπορεί να παραποιήσει τα μακροφάγα προς ένα έντονο φαινότυπο M2, ενώ RKO ή κύτταρα Caco2 δεν προκαλεί σημαντικές αλλαγές στο M-CSF μακροφάγα, τουλάχιστον όχι αλλαγές που εντοπίστηκαν εδώ.

( Α) Η μορφολογική αξιολόγηση των μακροφάγων που διεγείρονται με ρυθμισμένα μέσα (CM) από κυτταρικές γραμμές Caco2 RKO, SW480 ή. (Β) Έκφραση εξωκυτταρικών δεικτών αξιολογήθηκε με ανοσοχρώση και κυτταρομετρία ροής σε μακροφάγα του Μ1 και Μ2 υποτύπου ή σε μακροφάγα διεγερμένα με ρυθμισμένα μέσα (CM) από κυτταρικές γραμμές CRC. Σχετική μέση flourescense ένταση (MFI) ± SD από τρία ή περισσότερα ανεξάρτητα πειράματα φαίνεται, όπου κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε έναντι των αντίστοιχων ελέγχου ισοτύπου της και με το M-CSF διεγείρεται δείγμα ελέγχου καθορίζεται ως 1.

Η

ενδοκύττωση Χωρητικότητα του Μ1 /Μ2 μακροφάγων πληθυσμοί και ΤΑΜ

Η λειτουργία ενδοκυτταρικής των διαφόρων υποσυνόλων του Μ1 και Μ2 μακροφάγα, καθώς και ΤΑΜ, ερευνήθηκε επίσης σε μας

in vitro

σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας . Τα κύτταρα διαφοροποιούνται εντός των διαφορετικών φαινοτύπων μακροφάγων, και παρακολουθούνται για την ικανότητά τους να endocytose επισημανθεί δια φθορισμού δεξτράνη. M1 μακροφάγα φάνηκαν να έχουν χαμηλότερη ενδοκυτταρική ικανότητα σε σύγκριση με το Μ2 μακροφάγα, περίπου 20% για Μ1 σε σύγκριση με 50-100% για M2 μακροφάγα, με IL10 διεγερμένα μακροφάγα Μ2 εμφανίζει την υψηλότερη ικανότητα ενδοκυτταρικής (Σχήμα 4). Για να διερευνήσουν πώς όγκου εκκρίνεται παράγοντες επηρεάζουν μακροφάγων ενδοκύττωση, συγκρίναμε ότι του Μ1, Μ2 και ΤΑΜ (Σχήμα 4). Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι ενδοκυττάρωση του FITC-δεξτράνης των ΤΑΜ περισσότερο έμοιαζε ότι από Μ2 μακροφάγων.

Ενδοκυττάρωση με Μ1 και Μ2 μακροφάγα, ή μακροφάγα διεγερμένα με ρυθμισμένα μέσα (CM) από κυτταρικές γραμμές RKO, SW480 ή Caco2 CRC έγινε αξιολογήθηκε μετρώντας εσωτερικοποίηση του FITC-δεξτράνης με κυτταρομετρία ροής. Παρίσταται ποσοστιαία σχετική ενδοκύττωση (μέση ± SD) με ενδοκυττάρωση με IL10 διεγερμένα μακροφάγα Μ2 οριστεί ως 100%. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές υποδεικνύονται με * (p & lt? 0,05) ή ** (p & lt? 0,01). Όλες οι άλλες διαφορές ελέγχθηκαν, αλλά βρέθηκε μη σημαντική (δεν φαίνεται στο σχήμα).

Η

μακροφάγων πλαστικότητα

Τα μακροφάγα είναι γνωστό ότι είναι πλαστικό κύτταρα, υιοθετώντας διάφορα σχήματα ανάλογα με παράγοντες στην περιβάλλον στο οποίο βρίσκονται. Κατά την ανάλυση πλαστικότητα μας

in vitro

σύστημα καλλιέργειας κυττάρων, τα μακροφάγα Μ1 και Μ2 πράγματι διαπιστώθηκε ότι είναι πολύ πλαστικό στη φύση, δεδομένου ότι διαφοροποιημένα μακροφάγα M1 θα μπορούσε να οδηγείται προς ένα φαινότυπο Μ2, και το αντίστροφο, όπως αξιολογήθηκε με μορφολογική έρευνα και την έκφραση του Μ1 και Μ2-τυπικών δεικτών των μακροφάγων (Σχήμα 5). Η μορφολογία του Μ1 μακροφάγων που έλαβαν Μ2 ερεθίσματα φάνηκε να στραφούν σε ένα πιο επίμηκες Μ2 εμφάνιση (Σχήμα 5Α), έστω και αν δεν είναι τελείως. Από την άλλη πλευρά M2 μακροφάγα φάνηκε να υιοθετούν πιο γρήγορα το γύρο μορφολογία του Μ1 μακροφάγων όταν υποβάλλεται στις απέναντι ερεθίσματα (Σχήμα 5Α). Κατά την ανάλυση της έκφρασης των Μ1 και Μ2 δείκτες, μια μετατόπιση μεταξύ των φαινοτύπων ήταν επίσης εμφανής, δεδομένου ότι M1 τυπικό δείκτες βρέθηκαν να είναι κάτω-ρυθμίζονται από Μ2-ερεθίσματα και αντίστροφα (Σχήμα 5Β). Προτείνεται στη βιβλιογραφία ότι οι ΤΑΜ ασύμμετρη από όγκου που εκκρίνονται παράγοντες προς ένα φαινότυπο M2 [10] – [12]. Ωστόσο, αυτό δεν αντικατοπτρίζεται σαφώς σε μας

in vitro

σύστημα καλλιέργειας κυττάρων, δεδομένου ότι μια διακριτή πληθυσμός Μ2 δεν ήταν γενικά επάγεται από εκκριμένο παράγοντες από κύτταρα CRC. Λόγω της πλαστικής συμπεριφοράς που επέδειξαν οι μακροφάγων πληθυσμούς, επιδιώξαμε να ερευνήσει αν διαφοροποιηθούν τα μακροφάγα M1 θα μπορούσε να επηρεαστεί από τον όγκο που εκκρίνονται παράγοντες. Ωστόσο, μέσα από κύτταρα CRC δεν ήταν σε θέση να παραποιήσει ήδη διαφοροποιηθεί μακροφάγων Μ1 προς ένα φαινότυπο Μ2. Αντ ‘αυτού, προσαρμοσμένα μέσα από κύτταρα CRC αύξησαν την έκφραση του CD86 δείκτη Μ1, ενώ η μείωση αυτή του Μ2 CD163 δείκτη, και με τον τρόπο αυτό φαίνεται να ενισχύουν το φαινότυπο Μ1 (Σχήμα 5C). IL4 ή IL10 διεγερμένα μακροφάγα Μ2 δεν επηρεάστηκαν από εκκριμένο παράγοντες από κύτταρα CRC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό υποδηλώνει ότι όγκος εκκρίνονται παράγοντες από μόνη της δεν είναι σε θέση να μετατοπίσει ένα καθιερωμένο φαινότυπο μακροφάγων Μ1 προς μια φαινότυπο Μ2 σε CRC.

Η μορφολογία και η έκφραση των εξωκυτταρικών δεικτών αξιολογήθηκε σε μακροφάγα διακριτών Μ1 ή Μ2 υποτύπους πριν και μετά διέγερση προς το απέναντι φαινότυπο ή διέγερση από ρυθμισμένα μέσα (CM) από RKO, SW480 ή κυτταρικές σειρές Caco2 CRC. (Α) Η μορφολογική αξιολόγηση της φαινοτύπων μακροφάγων. (Β) Έκφραση εξωκυτταρικών δεικτών για μακροφάγων πληθυσμούς όπως αξιολογείται με ανοσοχρώση και κυτταρομετρία ροής. (Γ) τη διαφοροποίηση των Μ1 μακροφάγων με διέγερση με ρυθμισμένα μέσα (CM) από κυτταρικές γραμμές CRC. Σχετική μέση flourescense ένταση (MFI) ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων φαίνεται, όπου κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε έναντι των αντίστοιχων ελέγχου ισοτύπου του και με την Μ1 ή Μ2 (IL10) διεγερμένα δείγμα μακροφάγων οριστεί ως 100%. Οι σχετικές στατιστικά σημαντικές διαφορές υποδεικνύονται με * (p & lt? 0,05), μη σημαντικές

σ

τιμές υποδεικνύονται από ns

Η

κυτταροκινών Έκφραση από Μ1 και Μ2 μακροφάγα και TAM πληθυσμοί

είναι προφανές ότι η απλοποιημένη ξεχωριστή ορισμό των Μ1 και Μ2 μακροφάγα δεν εφαρμόζεται σε όλα τα μακροφάγα σε μια

in vivo

ρύθμιση. Ωστόσο, για να αναλύσει τις διαφορές που προκαλούνται μόνο από τον όγκο που εκκρίνονται παράγοντες, μπορούμε και πάλι χρησιμοποιηθούν μας

in vitro

σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας για να εξετάσει πιθανές διαφορές και τις ομοιότητες μεταξύ των προτύπων έκφρασης κυτταροκινών και χημειοκινών των Μ1 και Μ2 μακροφάγα, ή πληθυσμούς ΤΑΜ. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε ένα array έκφραση που βασίζεται σε PCR κυτοκίνης και χημειοκίνης γονίδιο (τα αποτελέσματα παρουσιάζονται αναλυτικά στον πίνακα S1). Επιλεγμένα γονίδια ενδιαφέροντος παρουσιάζονται στο Σχήμα 6. Όπως αναμενόταν, Μ1 μακροφάγων βρέθηκαν να εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, IL1, IL6, IL12, IL23 και TNFa, οι οποίες δεν εκφράζονται από τα μακροφάγα Μ2 (Σχήμα 6Α) . Οι ανοσορυθμιστική κυτοκίνες IL10 και ΤΟΡβ εκφράστηκαν κυρίως από Μ2 μακροφάγα, ιδιαίτερα Μ2-σαν ανοσο-ρυθμιστικές μακροφάγα IL10 προερχόμενο (Σχήμα 6Α). Όταν κοιτάζετε το πρότυπο κυτοκινών και έκφραση των χημειοκινών στην ΤΑΜ ήταν σαφές ότι κάθε κυτταρική σειρά CRC που προκαλείται από ένα μεμονωμένο πρότυπο έκφρασης. Κατά τη σύγκριση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης του Μ1 και Μ2 μακροφάγα με εκείνη των διαφόρων ΤΑΜ, ΤΑΜ βρέθηκαν να εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα προ-φλεγμονωδών κυτοκινών από τα μακροφάγα Μ2, παρόλο που στις περισσότερες περιπτώσεις ήταν πολύ χαμηλότερη από ό, τι για τα μακροφάγα Μ1. Μια εξαίρεση ήταν TNFα, η οποία βρέθηκε να εκφράζεται με ΤΑΜ σε παρόμοια επίπεδα όπως και για M1 μακροφάγα. Το ανοσοποιητικό-ρυθμιστική χημειοκινών IL10 και ΤΟΡβ2 εκφράστηκαν επίσης από τη διαφορετική ΤΑΜ, σε ορισμένες περιπτώσεις, σε ακόμη μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι τα μακροφάγα Μ2. Επιδιώξαμε να διερευνήσει τις διαφορές στην απόκριση που επάγεται από χημειοτακτική Μ1 ή Μ2 μακροφάγα και ΤΑΜ να κατανοήσουμε πώς ο όγκος σε CRC επηρεάζει την προκαλούμενη από μακροφάγα πρόσληψη άλλων ανοσοκυττάρων (Σχήμα 6Β). Κατά την εξέταση των παραγόντων που θα προσλαμβάνει κατά προτίμηση λεμφοκύτταρα του Th1 τύπου (π.χ. CXCL9 και CXCL10), ΤΑΜ διεγείρεται από ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα RKO ή Caco2 βρέθηκαν να εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα από ό, τι M2 μακροφάγα, αλλά εξακολουθεί να είναι πολύ χαμηλές ποσότητες σε σύγκριση με την έκφραση του αυτοί οι παράγοντες από M1 μακροφάγα. Ο χημειοτακτικός παράγοντας για τα ουδετερόφιλα CXCL2 [19] εκκρίθηκε από ΤΑΜ διεγείρονται από ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα SW480. Αυτό υποδηλώνει ότι, αν και τα αποτελέσματα ήταν μέτρια, ορισμένα χαρακτηριστικά του M1 μακροφάγα μπορεί να βρεθεί επίσης στο ΤΑΜ. Κατά την εξέταση των παραγόντων που προσλαμβάνουν τα λεμφοκύτταρα του Treg και Th2 τύπου (π.χ. CCL17, CCL18, CCL22 και CCL24), που εκφράζονται κυρίως από τον πληθυσμό Μ2, αυτά βρέθηκαν να μην εκφράζεται από ΤΑΜ, με την εξαίρεση των CCL24 στην ΤΑΜ διεγείρονται από ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα SW480. Αυτό υποδηλώνει ότι δεν είναι όλα τα χαρακτηριστικά Μ2 βρίσκονται στο ΤΑΜ. Τέλος, εξετάσαμε γονίδια τα οποία ήταν περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε ΤΑΜ σε γενικές γραμμές, σε σύγκριση με εκείνη στο Μ1 ή Μ2 μακροφάγα. Το μονοκύτταρο προσέλκυση χημειοτακτικός παράγοντας CCL2 βρέθηκε ότι εκφράζεται υψηλά σε όλους τους πληθυσμούς ΤΑΜ. Επίσης συμπληρώνουν πρωτεΐνη C5 βρέθηκε ότι εκφράζεται υψηλά σε ΤΑΜ ειδικότερα. Μαζί, αυτό υποδηλώνουν ότι όγκου εκκρίνεται παράγοντες προκαλεί ΤΑΜ ενός «μικτού» φαινότυπος, με κάποια χαρακτηριστικά που είναι TAM συγκεκριμένα και ορισμένα χαρακτηριστικά, τα οποία μπορεί να είναι παρόμοια ή διαφορετική από εκείνη στην M1 ή M2 μακροφάγα.

Η γονιδιακή έκφραση ήταν μελετηθεί σε Μ1 και Μ2 μακροφάγα, ή μακροφάγα διεγερμένα με ρυθμισμένα μέσα (CM) από κυτταρικές γραμμές Caco2 CRC RKO, SW480 ή χρησιμοποιώντας μια κυτοκίνη & amp? Array χημειοκινών PCR. (Α) Εκφραση των προ-φλεγμονωδών και αντι-φλεγμονώδεις κυτοκίνες. (Β) Έκφραση χημειοτακτικών παραγόντων. Αναγραφόμενη φορές την έκφραση του γονιδίου, με IL-4 διεγείρεται M2 μακροφάγα οριστεί ως 1.

Η

Συζήτηση

Σε μια προηγούμενη μελέτη, όπου αναλύσαμε Μ1 και Μ2 διανομή των μακροφάγων σε ασθενή ομάδα του CRC βρήκαμε ότι μια αυξημένη διείσδυση των μακροφάγων ενός φαινοτύπου Μ1 θα μπορούσε να συσχετιστεί με μια βελτιωμένη επιβίωση σε ασθενείς με CRC [18]. Ωστόσο, η διείσδυση του Μ1 μακροφάγων βρέθηκε να συνοδεύεται επίσης από διείσδυση του Μ2 μακροφάγων. Τα καρκινικά κύτταρα είναι γνωστό ότι παράγουν παράγοντες που επηρεάζουν τον φαινότυπο των μακροφάγων και έτσι την απόκριση μακροφάγων προς τον όγκο, προτείνεται να ευνοούν εισβολή και μετάσταση όγκου [12], [20]. Πιθανές εξηγήσεις για το θετικό ρόλο των μακροφάγων δει στην πρόγνωση σε CRC, θα μπορούσε να είναι είτε ότι CRC συντηρεί κάπως συνεχιζόμενη ανταπόκριση των μακροφάγων Μ1, ή λιγότερο αποτελεσματικά παραποιήσει την απόκριση μακροφάγων προς μια απάντηση Μ2 από ό, τι άλλες μορφές καρκίνου, όπου η διείσδυση των μακροφάγων είναι ένα κακό προγνωστικό δείκτη