Αφηρημένο

Η επίδραση της προληπτικής ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV), ο εμβολιασμός για τη μείωση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (CC) επιβάρυνση δεν θα είναι γνωστή εδώ και 30 χρόνια. Ως εκ τούτου, εξακολουθεί να είναι αναγκαίο να βελτιωθούν οι διαδικασίες για τον έλεγχο CC και θεραπεία. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει και να χαρακτηρίσει κυτταρικών στόχων που θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως δυνητικοί δείκτες για τον έλεγχο ή θεραπευτικούς στόχους. Μια στρατηγική πυραμιδική χρησιμοποιήθηκε. Αρχικά η έκφραση των γονιδίων 8638 συγκρίθηκε μεταξύ 43 HPV16-θετική CCS και 12 υγιείς τραχήλου της μήτρας epitheliums χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες. Ένα σύνολο από 997 γονίδια απορυθμισμένη, και 21 γονίδια που παρουσίασαν τη μεγαλύτερη απορρύθμιση επικυρώθηκαν με χρήση qRT-PCR. Τα 6 πιο ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια (

CCNB2, CDC20, PRC1, SYCP2, NUSAP1

,

CDKN3

) ανήκουν στην οδό μίτωση. Είχαν ακόμη διερευνηθεί σε 29 χαμηλού βαθμού τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (CIN 1) και 21 υψηλής ποιότητας CIN (CIN2 /3) να διερευνήσει κατά πόσον θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν CC και CIN2 /3 (CIN2 +) από CIN1 και τους ελέγχους.

CCNB2

,

PRC1

, και

SYCP2

ως επί το πλείστον συνδέονται με την CC και

CDC20

,

NUSAP1

, και

CDKN3

επίσης σχετίζεται με CIN2 /3. Η ευαισθησία και η ειδικότητα του

CDKN3

και

NUSAP1

για την ανίχνευση CIN2 + ήταν περίπου 90%. Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από όλους τους 6 γονίδια δείχθηκαν απορυθμίζεται σε CC με ανοσοϊστοχημεία. Η σύνδεση αυτών των δεικτών με την επιβίωση διερευνήθηκε σε 42 ασθενείς CC παρακολουθήθηκαν για τουλάχιστον 42 μήνες. Μόνο

CDKN3

συσχετίστηκε με κακή επιβίωση και ήταν ανεξάρτητη από κλινικό στάδιο (HR = 5,9, 95% CI = 1,4 – 23,8, p = 0.01).

CDKN3

και

NUSAP1

μπορεί να είναι πιθανοί στόχοι για την ανάπτυξη μεθόδων ελέγχου. Παρ ‘όλα αυτά, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες με μεγαλύτερα δείγματα που απαιτούνται για να καθορίσουν τη βέλτιστη ευαισθησία και ειδικότητα. Η αναστολή της μίτωσης είναι ένας γνωστός στρατηγικής για την καταπολέμηση καρκίνων. Ως εκ τούτου,

CDKN3

μπορεί να είναι όχι μόνο μια προβολή και την επιβίωση δείκτη, αλλά ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος στη CC. Ωστόσο, αν αυτό είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη του όγκου μένει να αποδειχθεί

Παράθεση:. Espinosa AM, Alfaro Α, ρωμαϊκό-Basaure E, Guardado-Estrada Μ, Palma Ι, Serralde C, et al. (2013) Μίτωση είναι μια πηγή Πιθανοί δείκτες για τον προσυμπτωματικό έλεγχο και την επιβίωση και Θεραπευτικό Στόχοι στον Καρκίνο του Τραχήλου της Μήτρας. PLoS ONE 8 (2): e55975. doi: 10.1371 /journal.pone.0055975

Επιμέλεια: Μιχαήλ Scheurer, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13, Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 4 Ιανουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 6η Φεβρουαρίου του 2013

Copyright: © 2013 Espinosa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Συμβούλιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (CONACYT, www.conacyt.mx), να χορηγούν αριθμούς 8135 /A1, 24341 (για JB) και 80.680 (σε SK), και το Εθνικό Πανεπιστήμιο του Μεξικού (www.unam.mx ), χορηγεί αριθμό SDI.PTID.05.2 (σε JB). AME, AA και ΙΜΜ ήταν αποδέκτες υποτροφία από CONACYT. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο ιός των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) είναι ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας για την ανάπτυξη του διηθητικού καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (CC), και HPV βρίσκεται σε σχεδόν 100% των όγκων αυτών [1], [2]. CC αποτελέσματα από την εξέλιξη της preinvasive τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (CIN), η οποία είναι ιστολογικά βαθμολογείται σε ήπια (CIN 1), μέτρια (CIN 2), ή σοβαρή (CIN 3), δυσπλασία. CC εμφανίζεται κυρίως από CIN3 και CIN2, αλλά σπάνια από CIN1? τα εκτιμώμενα ποσοστά εξέλιξης αυτών των βλαβών σε CC είναι 12%, 5% και 1%, αντίστοιχα [3]. Επί του παρόντος, υπάρχουν εμβόλια στην αγορά που εμποδίζουν τη μόλυνση από ογκογόνους τύπους HPV 16 και 18, οι οποίες συνδέονται με 65-70% των ΥΧ παγκοσμίως [4]. Αυτά τα εμβόλια έχουν πολύ υψηλή απόδοση για την πρόληψη της μόλυνσης και της ανάπτυξης υψηλού βαθμού τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (CIN2 /CIN3) [5], [6]. Ωστόσο, εμβολιασμένα οι γυναίκες πρέπει να εξακολουθούν να παρακολουθήσουν προγράμματα για την έγκαιρη ανίχνευση των CC δεδομένου ότι αυτά τα εμβόλια προστατεύουν μόνο έναντι ορισμένων τύπων του ιού, και δεν είναι ακόμη γνωστό πόσο καιρό η προστασία του ανοσοποιητικού συστήματος ενάντια στα ερείπια του ιού στόχος [7], [8]. Σε πολλές χώρες έχουν προληπτικά εμβόλια για τον HPV 16 και 18 έχουν ενσωματωθεί στο εθνικό πρόγραμμα εμβολιασμού, για τα κορίτσια 9-12 ετών [9], [10]. Ωστόσο, επειδή η μέγιστη επίπτωση της CC εμφανίζεται σε γυναίκες 45-50 ετών, η επίδραση αυτών των προγραμμάτων προληπτικού εμβολιασμού για τη μείωση του επιπολασμού του CC δεν θα είναι γνωστή εδώ και 30 χρόνια. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να βελτιωθούν οι διαδικασίες για τον έλεγχο και τη θεραπεία CC. Επειδή κάθε χρόνο 530 000 νέες περιπτώσεις CC και 275 000 θάνατοι CC αναφερθεί σε όλο τον κόσμο, η επίπτωση στο ποσοστό θνησιμότητας είναι περίπου 50% [11], [12].

Για πολλά χρόνια, ο Παπανικολάου (Παπ) δοκιμή ήταν η πιο σημαντική διαδικασία ελέγχου για την έγκαιρη διάγνωση των CC, και μαζική εφαρμογή της στις ανεπτυγμένες χώρες έχει μειωθεί η συχνότητα των CC κατά περισσότερο από 50% τα τελευταία 40 χρόνια [13]. Οι γυναίκες με μη φυσιολογική Χυλός παραπέμπονται για κολποσκόπηση για να επιβεβαιώσει, απορρίψει ή να διευκρινιστεί η διάγνωση με ιστοπαθολογική μελέτη. Ωστόσο, η μέση ευαισθησία της κυτταρολογίας για ανίχνευση CIN αλλοιώσεων είναι 50-60%? αν και η εξειδίκευση είναι πολύ υψηλή, περίπου το 90% [14]. Από HPV είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του CC, διάφορες διαδικασίες για την ανίχνευση του γονιδιώματος του HPV έχουν ενσωματωθεί διαλογής CC. Σε σύγκριση με τη συμβατική κυτταρολογία, HPV DNA δοκιμές έχει υψηλότερη ευαισθησία, αλλά χαμηλότερη ειδικότητα για την ανίχνευση βλαβών CIN2 ή υψηλότερη (CIN2 +). Η υψηλή ευαισθησία και υψηλή αρνητική προγνωστική αξία (NPV) των τεστ DNA HPV για την ανίχνευση CIN2 + βλάβες δείχνουν ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την επέκταση διαστήματα διαλογής. Ωστόσο, η χαμηλή εξειδίκευση των τεστ DNA του HPV θα αυξήσει τον αριθμό των δοκιμών παρακολούθησης και κολποσκόπηση παραπομπές, γεγονός που θα αυξήσει το κόστος της εξέτασης [15]. Ως εκ τούτου, η ανάγκη για την ανάπτυξη νέων μεθόδων για την έγκαιρη ανίχνευση του CC με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα είναι σαφής. Πολλαπλές καρκινικών δεικτών που σχετίζονται με CIN2 + έχουν εντοπιστεί, ιδιαίτερα

CDKN2A

,

TOP2A

, και

MCM2

. Ωστόσο, αυτοί οι δείκτες έχουν δεν προτείνονται για τη διαλογή, αλλά για τη διάγνωση, πρόγνωση, ή την κλινική διαχείριση [11], [16].

διηθητικού καρκίνου του τραχήλου προς το παρόν αντιμετωπίζεται με χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, ή ένας συνδυασμός από αυτές τις θεραπείες, ανάλογα με το κλινικό στάδιο της νόσου. Η επιτυχία αυτών των συμβατικών θεραπειών και την επιβίωση του ασθενούς μειώνεται καθώς η νόσος εξελίσσεται σε πιο προχωρημένα στάδια [17]. Στην πραγματικότητα, το ποσοστό των γυναικών που επιβιώνουν πέντε χρόνια μειώνεται από 93% για το στάδιο ΙΑ έως 15% για το στάδιο IVB (www.cancer.org). Σε αντίθεση με άλλους τύπους καρκίνου, για τα οποία έχουν αναπτυχθεί διάφορες ειδικές μοριακές φάρμακα [18], δεν υπάρχουν ειδικές θεραπείες μοριακού στόχο για CC. Η πλειοψηφία των φαρμάκων κατά συγκεκριμένων στόχων στον καρκίνο κατευθύνονται προς μεταλλαγμένες πρωτεΐνες, ιδιαίτερα πρωτεϊνικών κινασών [19]? Ωστόσο, μερικά φάρμακα στοχεύουν φυσιολογικές πρωτεΐνες που υπερεκφράζονται, όπως HER2 /neu σε καρκίνο του μαστού [20], [21]. Το πρώτο βήμα για την ανάπτυξη μιας ειδικής μοριακής φάρμακο εντοπισμό καθολική μοριακούς στόχους που υπάρχουν σε ασθενείς με CC και απουσιάζει σε υγιείς γυναίκες.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει και να χαρακτηρίσει κυτταρικών στόχων που είναι παρόντες στις περισσότερες υποψήφιες χώρες και απουσιάζει από φυσιολογικό τραχηλικό ιστό που διαφέρουν αρκετά μεταξύ των 2 ομάδων να θεωρηθούν είτε ως δυνητικοί δείκτες για τη διαλογή, με ευαισθησία και ειδικότητα κοντά στο 100%, ή ως εν δυνάμει θεραπευτικοί στόχοι.

Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από τις επιστημονικές επιτροπές δεοντολογίας και του Νοσοκομείου General de Mexico (αριθμός έγκρισης DIC /03/311/04/051) και έγινε σύμφωνα με τις ηθικές αρχές που περιγράφονται στο το 1964 Διακήρυξη του Ελσίνκι. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες πριν από την ένταξή τους στη μελέτη.

Θέματα, δείγματα, και Πειραματική Μελέτη

Τα θέματα μελέτη περιλάμβανε 69 ασθενείς με διηθητικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (CC) διαγνώστηκε σε το Τμήμα Ογκολογίας, 29 ασθενείς με χαμηλού βαθμού CIN (CIN 1), 21 ασθενείς με υψηλού βαθμού CIN (CIN2 και CIN3) και 25 γυναίκες με φυσιολογικό τραχηλικό επιθήλιο αξιολογήθηκαν στο Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας στο Νοσοκομείο General de México στην Πόλη του Μεξικού. Τα δείγματα CC ήταν ένα υποσύνολο επιλέγεται από ένα σύνολο 462 ασθενών με CC που προσλήφθηκαν διαδοχικά από το Νοέμβριο του 2003 έως τον Ιούλιο του 2007, οι οποίες αντιπροσώπευαν περίπου το 80% των ασθενών που διαγνώστηκαν πρόσφατα με CC κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, λόγω των κριτηρίων περιοριστικά ένταξης (καμία προηγούμενη επεξεργασία, την περίπτωση συμβάντος, που γεννήθηκε στο Μεξικό με το μεξικάνικο καταγωγή για 2 γενιές). Τα κριτήρια επιλογής για το CC υποσύνολο βασίστηκαν στη διαθεσιμότητα μιας νέας βιοψίας όγκου για την εκχύλιση του RNA με κύτταρα όγκου περισσότερο από 70% κατά την μορφολογική ανάλυση (βλέπε παρακάτω), ως επί το πλείστον ΦΥΓΩ σταδίων Ι /ΙΙ, και την ιογενή τύπου. Αυτό το υποσύνολο περιλαμβάνονται 47 δείγματα θετικά για HPV16 και 22 δείγματα θετικά για άλλους τύπους ιών, συμπεριλαμβανομένων των HPV18, 31, 33, 45, 51, 58, και 59. Μεταξύ αυτών, 54 δείγματα ήταν από καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, 14 δείγματα ήταν αδενοκαρκινώματα, και 1 δείγμα ήταν μια αδενοχοληδωτό καρκινώματος. Η μέση ηλικία των ασθενών με καρκίνο ήταν 48 έτη (εύρος, 23-78 χρόνια? Πίνακας S1). Όλοι οι ασθενείς έλαβαν πλήρη κλινική αξιολόγηση. Οι όγκοι των ασθενών CC οργανώθηκαν σύμφωνα με την τελευταία διεθνή αναθεωρημένο πρωτόκολλο για γυναικολογικό καρκίνο [22]. Ένα ή δύο βιοψίες, που διεξάγεται υπό εξέταση κολποσκόπηση, ελήφθησαν από όγκους. Μία βιοψία χωρίστηκε σε 2 ίσα μέρη, 1 μέρος σταθεροποιήθηκε σε ρυθμισμένο με φορμόλη για μορφολογική ανάλυση και αφετέρου, μαζί με τη δεύτερη βιοψία, ήταν snap-κατεψυγμένα σε ξηρό πάγο και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι την ανάλυση. Όλοι οι ασθενείς CC παραπέμφθηκαν για τη χειρουργική επέμβαση, ακτινοβολία, χημειοθεραπεία, ή έναν συνδυασμό αυτών των θεραπειών σύμφωνα με τις οδηγίες της Αμερικανικής Εταιρείας Καρκίνου (βλέπε παρακάτω). Τον έλεγχο του τραχήλου της μήτρας δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε υστερεκτομή λόγω myomatosis στη Γυναικολογία Υπηρεσία του Νοσοκομείου General de Mexico. Είχαν προηγουμένως διαγνωστεί με φυσιολογικό τράχηλο από κυτταρολογίας και κολποσκόπηση. Αμέσως μετά τη λήψη ενός τραχήλου θραύσμα από το χειρουργείο, οι exocervical και ενδοτραχηλικά epitheliums αποκόπηκαν κάτω από στερεοσκοπικό μικροσκόπιο για να αποφευχθούν τα στρωματικά κύτταρα. Οι ιστοί στη συνέχεια καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Για την ανίχνευση του HPV και πληκτρολόγηση, ένα απόξεσης από το ενδοτράχηλου και εξωτράχηλος συλλέχθηκε με κυτταρική ψήκτρα από τους ασθενείς και τους ελέγχους, τα κύτταρα αιωρούνται σε ένα φιαλίδιο με ρυθμιστικό εκχύλισης, και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -20 ° C μέχρι την ανάλυση. Ανάλυση της παγκόσμιας γονιδιακής έκφρασης (8638 γονίδια) διεξήχθη σε RNAs που εξάγονται από 43 φρέσκο ​​βιοψίες όγκων θετικών για HPV16 και από 12 δείγματα φυσιολογικού επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας χρησιμοποιώντας το HG-Focus μικροσυστοιχίας. Παγκόσμια γονιδιακή έκφραση ελέγχθηκε σε 24 δείγματα, συμπεριλαμβανομένων 19 ΥΧ και 5 του τραχήλου της μήτρας ελέγχους επιθηλίου, με μια δεύτερη υψηλής μικροσυστοιχιών απόδοσης (HG-ST1.0). Τα 23 γονίδια που παρουσίασαν τη μεγαλύτερη απορρύθμιση επικυρώθηκαν από πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR) σε 44 CC και 25 ελέγχου δείγματα HPV16-θετική. Τα 6 πιο διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (

CCNB2

,

CDC20

,

PRC1

,

SYCP2

,

NUSAP1

, και

CDKN3

) περαιτέρω διερευνηθεί σε 29 χαμηλού βαθμού τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας (CIN 1) και 21 υψηλής ποιότητας CIN (CIN2 /3) να διερευνήσει κατά πόσον θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν CC και CIN2 /3 (CIN2 +) από CIN1 και τους ελέγχους. Ανοσοϊστοχημεία (IH) πραγματοποιήθηκε για 10 επιλεγμένες πρωτεΐνες σε 26 δείγματα CC και 10 δείγματα ελέγχου. Η σύνδεση των 9 δεικτών με την επιβίωση διερευνήθηκε με ανάλυση επιβίωσης των 42 ασθενών με HPV 16-θετικοί CC που παρακολουθήθηκαν για τουλάχιστον 42 μήνες.

DNA και RNA Απομόνωση

DNA καθαρίστηκε από τραχηλικά επιχρίσματα και μερικά δείγματα βιοψίας με τη χρήση της PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen, Grand Island ΝΥ) και διατηρήθηκαν στους -20 ° C μέχρι την ανάλυση. Ολικό RNA απομονώθηκε από το ήμισυ του διαιρούμενο βιοψίας χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ποιότητα του RNA επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης, όπως αποδεικνύεται από την παρουσία του ανέπαφου ριβοσωματικού RNA, με το συγκρότημα 28S δύο φορές τόσο έντονη όσο το συγκρότημα 18s.

Ανίχνευση και HPV Typing

ανίχνευση HPV έγινε με PCR χρησιμοποιώντας καθολική εκκινητών που βρίσκεται στο HPV

L1

γονίδιο

MY09

/

MY11

,

GP5

+ /

6 +

, και

L1C1

όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23] – [25]. Η

HBB

γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την αξιολόγηση της ποιότητας του DNA. Οι τύποι HPV ταυτοποιήθηκαν με αλληλούχιση των ενισχυμένων ζωνών σε θετικά δείγματα χρησιμοποιώντας μια μέθοδο φθορίζοντος κύκλου-αλληλουχίας (BigDye Terminator Ready Kit Αντίδρασης, Applied Biosystems, Foster City, CA). Η ανάλυση ακολουθίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα γενετικό αναλυτή ΑΒΙ PRISM 3130xl (Applied Biosystems). Κάθε ακολουθία από τις HPV θετικά δείγματα αναλύθηκε με το εργαλείο ομοιότητα αλληλουχίας FASTA [26]. Το μέσο ποσοστό ταυτότητα αυτών των ακολουθιών με τους τύπους HPV ήταν 98,7% (εύρος 91-100%).

γονιδιακής έκφρασης και Ανάλυση Δεδομένων

Το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των 43 ΥΧ θετικές για HPV16 και 12 υγιή έλεγχο του τραχήλου της μήτρας epitheliums εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο γονίδιο Focus (HG Focus) ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχιών (ΜΑ) (Affymetrix, Santa Clara, CA). Αυτή η σειρά περιέχει 8794 σύνολα ανιχνευτή που αντιστοιχεί στο 8638 χαρακτηρίζεται ανθρώπινα γονίδια στη βάση δεδομένων Gene αναφοράς. Σύνολο παρασκεύασμα RNA (10 μg), επισημασμένα σύνθεση cRNA, υβριδισμός, σάρωση, και η ανάλυση της εικόνας διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Affymetrix GeneChip Expression εγχειρίδιο Δοκιμασία). Για να εκτιμηθεί η ποιότητα των πειραμάτων, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες παράμετροι: αυξημένη έκφραση του εξωγενούς ελέγχων πολυ-Α (Lys & lt? Phe & lt? Thr & lt? Dap), η παρουσία του ολίγο B2 χρησιμοποιείται για να κάνει ευθυγραμμίσεις πλέγμα, φόντο με ένα αποδεκτό εύρος από 20 έως 100, ίση θορύβου σε ολόκληρη όλα τα δείγματα, το ποσοστό της παρούσης καλεί μεγαλύτερη από 50%, μία αναλογία 3 ‘/5’ ενός ιδιοσυστατικού γονιδίου (GAPDH ή β-ακτίνης) μικρότερο από 3, και αυξημένη έκφραση των ελέγχων υβριδισμού (BioB & lt ? Bioc & lt? BioD & lt? CRE). Μόνο αυτές οι μητροπολιτικές περιοχές με τη βέλτιστη ποιοτικούς ελέγχους αναλύθηκαν. Επιπλέον, ορισμένα δείγματα διεξήχθησαν εις διπλούν για να αξιολογηθεί η δυνατότητα αναπαραγωγής του πειράματος, η οποία ήταν υψηλότερη από 99%.

τιμών έντασης ΜΑ ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Robust πολλαπλών μικροπλακετών Μέτρια (RMA) με τη χρήση του λογισμικού FlexArray [27]. Οι κανονικοποιημένες τιμές έντασης αναφέρονται ως μονάδες της έντασης (UI). Γονιδίων που εκφράζονται διαφορετικά μεταξύ τους όγκους και τους ελέγχους εντοπίστηκαν με τη χρήση της ανάλυσης αλγόριθμο Σημασία των μικροσυστοιχιών (SAM έκδοση 3.0, https://www.stat.stanford.edu/~tibs/SAM) χρησιμοποιώντας τις τιμές cut-off μιας φορές μεταβολής ( FC) της ≥1.5, ένα γενικό ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) του 1%, και ένα τοπικό FDR του & lt? 10% [28]. Χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση και ανάλυση κύριο συστατικό (PCA) πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού dChip (έκδοση 1.6, www.dCHIP.org) και R γλώσσα στην πλατφόρμα της Java, αντίστοιχα.

Επικύρωση της Παγκόσμιας Gene Expression από ένα δεύτερο υψηλής απόδοσης μικροσυστοιχιών (HG-ST1.0)

το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των 24 δειγμάτων που διερευνώνται με την HG-Focus μικροσυστοιχιών, συμπεριλαμβανομένων 19 ΥΧ και 5 του τραχήλου της μήτρας ελέγχους επιθηλίου, εξετάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας το ανθρώπινο γονίδιο 1.0 ST ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχιών ( Affymetrix, Santa Clara, CA). Αυτή η σειρά περιέχει 33.297 σετ ανιχνευτών που αντιστοιχούν σε περίπου 20.741 γονίδια της βάσης δεδομένων αναφοράς ανθρώπινο γονίδιο, ανάλογα με το πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα Συνέλευση Μαρ 2006 NCBI 36 /hg18, διαθέσιμα σε https://genome.ucsc.edu/. Σύνολο παρασκεύασμα RNA (300 ng), επισημασμένα σύνθεση του DNA, υβριδοποίηση, σάρωση, και η ανάλυση της εικόνας διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Affymetrix GeneChip Expression εγχειρίδιο Δοκιμασία). Για να εκτιμηθεί η ποιότητα των πειραμάτων, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες παράμετροι: έκφραση των εξωγενών ελέγχων πολυ-Α, η παρουσία ολίγο B2 χρησιμοποιείται για να κάνει ευθυγραμμίσεις πλέγμα, και η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) τιμές πάνω από 0,8. Μόνο εκείνα τα μικροσυστοιχίες με τη βέλτιστη ποιοτικούς ελέγχους αναλύθηκαν. Μικροσυστοιχίες ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο RMA στην κονσόλα έκφραση Affymetrix. Οι κανονικοποιημένες τιμές έντασης αναφέρονται ως μονάδες της έντασης (UI). Οι κανονικοποιημένες εντάσεις (log

2 τιμές) από τα 8.370 γονίδια που εξετάστηκαν στις δύο μικροσυστοιχίες (HG ST1 και HG Focus) συγκρίθηκαν, και το επίπεδο της συσχέτισης εκτιμήθηκε με συντελεστή συσχέτισης κατά Pearson.

Επικύρωση της Global Gene Expression με πραγματικού χρόνου ποσοτική ρετρομεταγραφή PCR (qRT-PCR)

η αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της υψηλής χωρητικότητας cDNA Αρχείο σετ (Applied Biosystems) σε ένα συνολικό όγκο 20 μL. Το μίγμα περιλάμβανε 2 μg του RNA, 2 μί ρυθμιστικό 10 × RT, 0.8 μί 100 mM dNTPs, 2 μί 10 χ RT Random Primers, 1 μι MultiScribe ™ ανάστροφης μεταγραφάσης (5 υ /μΙ) και 1 μΙ αναστολέα RNase (2 U /μL). Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 37 ° C επί 120 λεπτά, και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -20 ° C. Ένα σύνολο των 23 γονιδίων που χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της γονιδιακής έκφρασης σε 44 HPV16-θετική CC και 25 υγιείς τραχήλου δείγματα ελέγχου επιθηλίου με qRT-PCR για τη χρήση ανιχνευτών TaqMan. Τα γονίδια που περιλαμβάνονται είναι

CCNB2, CDC2, CDC20, CDKN2A, CDKN3, CKS2, MCM2, MKI67, NUSAP1, PCNA, PRC1, RFC4, RRM2, SMC4, SYCP2, TOP2A, Tyms, ZWINT, CFD, EDN3, NDN, SLC18A2 ,

και

WISP2

.

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. ανιχνεύσεις TaqMan γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν (Πίνακας S2? Applied Biosystems). Επτά γονίδια επίσης διερευνηθεί σε 22 CC θετικά για άλλα ιοί HPV (

CCNB2

,

CDC20

,

CDKN3

,

PRC1

,

SYCP2

,

NUSAP1

,

Tyms

), και το πρώτο 6 από αυτά, μαζί με το

CDKN2A

,

PCNA

,

MKI67

γονίδια, περαιτέρω διερευνηθεί σε 29 CINS χαμηλού βαθμού και 21 CINS υψηλής ποιότητας. Τα πειράματα έγιναν εις διπλούν σε ένα τελικό όγκο 20 μί, συμπεριλαμβανομένων 200 ng προτύπου cDNA, 10 μL 2 χ TaqMan καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 μί 20 χ TaqMan γονιδιακής έκφρασης Δοκιμασία, και 7 μί RNase-free νερό. Το πρόγραμμα ποδηλασίας διεξήχθη σε έναν ρότορα-Gene (Corbett Research, Sydney, Αυστραλία), το οποίο ορίζεται ως εξής: ένα αρχικό στάδιο ενεργοποίησης της PCR σε 50 ° C για 2 λεπτά ακολουθούμενο από 95 ° C για 10 λεπτά, στη συνέχεια 40 κύκλους που τήκεται στους 95 ° C για 15 s και ανασύνδεσης /επέκτασης στους 60 ° C για 1 λεπτό. Η διάμεση τιμή των τυπικών αποκλίσεων Ct εις διπλούν κυμαινόταν 0,09 – 0,24 (μέσος όρος = 0,16) μεταξύ των 23 γονιδίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι διαφορές μεταξύ των δύο αναλύσεων ήταν πολύ μικρό [29]. Μέτρηση της έκφρασης του γονιδίου βασίστηκε σε σχετική τυπική καμπύλες κατασκευάζονται από μια 10-πλάσια σειριακά αραιωμένου πισίνα του CC ή φυσιολογικό τραχηλικό cDNAs επιθηλίου κυμαίνεται από 500 έως 0,05 ng. Η πρώτη καμπύλη χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των τιμών των απορυθμίζεται γονιδίων και η δεύτερη καμπύλη οι τιμές του ρυθμίζεται προς τα κάτω γονιδίων. Καμπύλες για κάθε γονίδιο δοκιμάστηκαν σε τρία διαφορετικά πειράματα έτρεξαν εις διπλούν και οι μέσοι όροι των coeficients συσχέτισης (r) ήταν υψηλότερα από 0,98. Η έκφραση των γονιδίων στόχων κανονικοποιήθηκε σε κάθε δείγμα όγκου και ελέγχου με την ένταση της εσωτερικής αναφοράς (

GADPH

) χρησιμοποιώντας μία προηγουμένως περιγραφείσα μέθοδο [30]. Οι κανονικοποιημένες τιμές έντασης μετρήθηκαν σε ng /μL. Μια δοκιμή κανονικότητα (Shapiro-Wilk) διεξήχθη σε δοκιμή για μια κανονική κατανομή των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης. Η έκφραση πολλαπλή μεταβολή υπολογίστηκε διαιρώντας τη μέση κανονικοποιημένη ένταση των δειγμάτων όγκου από το διάμεσο κανονικοποιημένη ένταση των δειγμάτων ελέγχου. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ των διάμεσοι των όγκων και των ελέγχων υπολογίστηκε με το Mann-Whitney (MW) μη-παραμετρικό τεστ. Οι συσχετίσεις μεταξύ των αποτελεσμάτων ΜΑ και τα δεδομένα qRT-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση log

2 αξίες και μετριέται χρησιμοποιώντας συντελεστή συσχέτισης του Pearson.

Η ανοσοϊστοχημεία

Η έκφραση της πρωτεΐνης των 10 γονιδίων προσδιορίστηκε σε 26 CC και 10 δείγματα ελέγχου με IH. Δύο μικροσυστοιχίες σπιτικό ιστού (TMA) χτίστηκαν, ένα που περιέχει 14 HPV16-θετική CCS και 5 ελέγχων και το άλλο 12 CC θετικό για άλλους HPVs και 5 μάρτυρες. NUSAP1 είχε διερευνηθεί μόνο σε δείγματα του πρώτου TMA. Κυλινδρικά δείγματα από αντιπροσωπευτικές περιοχές των ενσωματωμένα σε παραφίνη τμήματα ιστού, που προηγουμένως επιλέγονται από Η &? Ε χρώση διαφανειών, ελήφθησαν με διάτρηση-βιοψία βελόνα (διάμετρος 2 mm), μεταφέρθηκαν σε μπλοκ παραφίνης παραλήπτη σε καθορισμένες θέσεις συστοιχία και πρόσφατα ενσωματωμένο σε παραφίνη. Όλες οι ιστοί μπλοκ συμφωνημένα ασθενών ελήφθησαν από το Τμήμα Παθολογίας του νοσοκομείου. Διαδοχικές τομές (πάχους 4 μm) της TMA κόπηκαν και το 10ο slide βάφτηκε με Η &? Ε για να επιβεβαιωθεί η ιστοπαθολογική διάγνωση. Οι τομές εμβαπτίζονται σε ξυλόλιο προς απομάκρυνση παραφίνης και έπειτα επανυδατώνεται με διαβαθμισμένη αλκοόλη (100%, 95%, 90%, 80% και 70% ν /ν σε νερό). Επιτόπου ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των διαφανειών, και την εισαγωγή τους σε Target Ανάκτηση Solution, pH 6,0 (Dako, Carpinteria, CA) στους 121 ° C για 5 λεπτά σε μια χύτρα ταχύτητας. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση των αντικειμενοφόρων πλακών με 1% υπεροξείδιο υδρογόνου σε PBS για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, ένας μη ειδικός αποκλειστής υποβάθρου προστέθηκε και επωάστηκε για 10 λεπτά. Πρωτογενή αντισώματα κατά του PCNA (SC-53407)? p16 για CDKN2A (SC-71804)? SCP-2 για SYCP2 (SC-20048), PRC1 (SC-56345)? κυκλίνη Β2 για CCNB2 (SC-81241)? CDKN3 (sc-475)? και CDC2 για Ρ34 (SC-70822), ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Τα αντισώματα έναντι CDC20 (κατ. 34 – 1900), Ki-67 για MKI67 (cat. M7187) και NUSAP1 (cat. H00051203-B01) ελήφθησαν από την Invitrogen, Dako (Glostrup, Denmark), και Nova Biological (Littleton, CO ), αντίστοιχα. Η αραίωση που χρησιμοποιείται για όλα τα αντισώματα ήταν 1:100, εκτός από CDC2, (1:50) και NUSAP1 (1:250), και το αραιωτικό του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε ήταν από την Dako. Ένα συνολικό όγκο 300 μL προστέθηκαν σε κάθε τμήμα, και τα πλακίδια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C σε ένα υγρό θάλαμο. σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος ανιχνεύθηκαν με τη μέθοδο της υπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτίνης, χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη-tetrahydrocloride ως χρωμογόνο υπόστρωμα (Cat KO679 LSAB + Sys /HRP?. Dako-Cytomation Carpinteria, CA), και οι τομές επιχρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν. Τα αντισώματα για SYCP2, PRC1, CCNB2, CDKN3, CDC2, και CDC20 ελέγχθηκαν σε ιστούς που είναι γνωστό ότι εκφράζουν αυτά τα αντιγόνα. SYCP2 ελέγχθηκε σε νεογνό όρχεις? PRC1, CDC2, και CCNB2 ελέγχθηκαν σε καρκίνο του παχέος εντέρου? και CDKN3 δοκιμάστηκε σε βιοψίες καρκίνου του πνεύμονα. Όλοι οι ιστοί λήφθηκαν από τα αρχεία του Τμήματος Παθολογίας. Το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων υπολογίστηκε από την ανάλυση των 10 διαδοχικά πεδία υψηλής ισχύος των νεοπλασματικών κυττάρων. Το κυτταρικό εντοπισμό της ανοσοαντίδρασης προσδιορίστηκε, και η ένταση της ανοσοαντίδρασης βαθμολογήθηκε από 0 έως 4, όπου 0 δεν έδειξαν χρώση. Ανοσολογική αντίδραση σήματα βρέθηκαν σπάνια στο στρώμα με όλα τα αντισώματα και δεν βαθμολογήθηκαν για την ανάλυση. Ανοσοχρωματίστηκε διαφάνειες αναλύθηκαν και σκόραρε από 2 παθολόγους, οι οποίοι δεν γνώριζαν τα αποτελέσματα. Σπάνιες περιπτώσεις με ασύμφωνα βαθμολογίες επαναξιολογηθούν και πέτυχα βασίζεται στη συναίνεση γνώμη.

Ανάλυση Επιβίωσης Καρκινοπαθών

Σύμφωνα με σταδιοποίηση των ασθενών ΦΥΓΩ με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας έλαβαν εξατομικευμένη θεραπεία βασίζεται στις κατευθυντήριες γραμμές θεραπείας για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας της American Cancer Society (Βλέπε πίνακα 1). Μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας, κάθε ασθενής αξιολογήθηκε κλινικώς κάθε 3 ή 6 μήνες από έναν έμπειρο ογκολόγο. Κλινικά δεδομένα της μελέτης παρακολούθησης ελήφθη από τους ασθενείς ιατρικό ιστορικό. Επίσης, ένας κοινωνικός λειτουργός που εκτελούνται τηλεφωνήματα και επισκέψεις κατ ‘οίκον στους ασθενείς κάθε 6 μήνες κατά τη διάρκεια της μελέτης. Οι ασθενείς που καταγράφεται ως ζωντανός στη μελέτη είχαν επιτυχία παρακολουθήθηκαν για τουλάχιστον 42 μήνες μετά τη θεραπεία. Λογοκρίθηκε και από νεκρούς ασθενείς παρακολουθήθηκαν για τον αριθμό των μηνών που αναφέρονται στον πίνακα 1. Οι περιπτώσεις που χαρακτηρίζονται ως λογοκριμένο αναφέρεται σε εκείνους τους ασθενείς που χάθηκαν με τη μελέτη κατά την περίοδο παρακολούθησης ή απεβίωσε από αιτίες εκτός από τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Οι ασθενείς θεωρήθηκαν χάνεται όταν δεν παρέστη σε ιατρικά ραντεβού για τον έλεγχο της νόσου, δεν βρέθηκαν σε κατ ‘οίκον επισκέψεις ή δεν απαντήσει τηλεφωνήματα. Σε αυτή την ομάδα, οι ασθενείς καταγράφονται ως αποθανών ήταν μόνο οι γυναίκες που έχασαν τη ζωή τους από τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας πρωτοπαθούς όγκου ως κύρια αιτία. Η αιτία του θανάτου του όλοι εκτός από έναν ασθενή ο οποίος πέθανε κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης μέχρι και επιβεβαιώθηκε από τον ιατρικό φάκελο και το πιστοποιητικό θανάτου. Μόνο 42 από 44 ασθενείς με HPV16-θετικά CC διερευνηθεί με qRT-PCR περιελήφθησαν στην συνέχεια μελέτης. Τέσσερις περιπτώσεις θεωρήθηκαν σωστά λογοκρισία και οκτώ θάνατοι καταγράφηκαν. Η μέση μετά από περίοδο των 42 ασθενών ήταν 50,5 μήνες. Η συσχέτιση της έκφρασης ΦΥΓΩ και το γονίδιο (

PRC1, CCNB2, CDC20, CDKN3, NUSAP1, SYCP-2, CDKN2A, PCNA, MKI67

) με την επιβίωση διερευνήθηκε με ανάλυση επιβίωσης. Με το σύνολο του δείγματος, 500 σύνολα εκπαίδευσης, της 21ης ​​δείγματα δημιουργήθηκαν τυχαία για κάθε γονίδιο διερευνηθούν. Για την κατηγοριοποίηση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης ποσοτικοποιείται με qRT-PCR, ανάλυση ROC πραγματοποιήθηκε σε κάθε σύνολο εκπαίδευσης. Η ανάλυση αυτή έγινε για να καθορίσει cut-off για την έκφραση του γονιδίου που αντιπροσωπεύεται αυτές τις τιμές με την υψηλότερη ευαισθησία και ειδικότητα για τη διαφοροποίηση μεταξύ νεκρών και ασθενείς που επιβίωσαν. Το σύνολο του δείγματος στη συνέχεια αναλύθηκε με το μέσο όρο της αποκοπής, υπολογίζεται από τις τιμές των 500 σύνολα κατάρτισης. Δείγματα με τιμές γονιδιακής έκφρασης πάνω από το cut-off τέθηκαν σε 1 και εκείνων με τιμές κάτω από το cut-off τέθηκαν σε 0. Το σωρευτικό συνολικό χρόνο επιβίωσης υπολογίστηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και αναλύθηκαν από την δοκιμασία log-rank. ΦΥΓΩ στάσης και η έκφραση του γονιδίου συμπεριλήφθηκαν ως συμπαράγοντες σε ένα μοντέλο αναλογικών κινδύνων Cox.

Η

Γονιδιακή Οντολογία Ανάλυση Ταξινόμησης

Η βάση δεδομένων για το σχολιασμό, Οπτικοποίηση, και Ολοκληρωμένη Discovery (David) λειτουργική εργαλείο σχολιασμού (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [31], [32] και η ανάλυση Ingenuity Pathway (ΜΠΒ? Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) χρησιμοποιήθηκαν για την ταξινόμηση των απορυθμισμένη γονίδια. Γονίδια ταξινομήθηκαν χρησιμοποιώντας λειτουργική ομαδοποίηση σχολιασμού εξέταση των γονιδίων οντολογίας βιολογικές διαδικασίες. Ταξινόμηση αυστηρότητα ορίστηκε στο μέσο και ανώτατο επίπεδο.

Gene σχολιασμού και Ανάλυση Δεδομένων

Η φυσική θέση των γονιδίων χαρτογραφήθηκε σύμφωνα με το πρόγραμμα περιήγησης UCSC γονιδίωμα Συνέλευση Μάρτιο 2006 NCBI 36 /hg18, που διατίθεται σε https://genome.ucsc.edu/. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση Access 2010 (Microsoft Inc.). Τα ακατέργαστα δεδομένα MA είναι MIAME συμβατό και έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME (GEO, https://www.ncbi.nih.gov/geo/) με τον αριθμό πρόσβασης GSE39001. χειριστή του δέκτη ανάλυση χαρακτηριστικών (ROC) καμπύλη έγινε και χρησιμοποιήθηκε δείκτης Youden [33] για να επιλέξετε τα καλύτερα σημεία αποκοπής για τη διάκριση των όγκων από τους ελέγχους και CIN2 + από CIN1- χρησιμοποιώντας τις τιμές έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων που λαμβάνονται από qRT-PCR. Για κάθε δείκτη, την ευαισθησία, την ειδικότητα, θετική προγνωστική αξία (PPV) και αρνητική προγνωστική αξία (NPV) υπολογίστηκαν σύμφωνα με τους τύπους που περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Όλες οι δοκιμασίες ήταν 2 όψεων, και ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση Sigma Stat και SPSS ver. 17 λογισμικό.

Αποτελέσματα

Ανάλυση Έκφρασης των 8.638 γονίδια σε καρκίνο του τραχήλου

Η ποσότητα του mRNA που μεταγράφεται από 8.638 γονίδια συγκρίθηκε μεταξύ των δειγμάτων 43 CC θετικά για HPV 16 και 12 της κανονικής του τραχήλου της μήτρας επιθηλιακά δείγματα χρησιμοποιώντας το μικροσυστοιχιών HG-Focus. Ένα σύνολο από 997 γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των καρκινικών και ελέγχου ομάδες? 600 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω και 397 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω (Πίνακας S3). Σχεδόν το ήμισυ των απορυθμίζεται και ρυθμίζεται προς τα κάτω γονίδια είχαν FCS σε εύρος 1.5-2.0, και ο αριθμός των γονιδίων σε αμφότερες τις ομάδες μειώθηκαν γραμμικά (r = -0,8, ρ = 0,002) ως τιμή FC αύξηση (σχήμα 1). Η ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA? Δεδομένα δεν φαίνονται) και το μη-εποπτεύονται ιεραρχική συσταδοποίηση (πάνελ Α στο Σχήμα 2) πραγματοποιείται με όλες τις τιμές έκφρασης γονιδίου 997 διαχωρίζονται σαφώς τα δείγματα καρκίνου από την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο, η έκφραση πολλών γονιδίων δεν ήταν εντελώς ομοιόμορφη μεταξύ των δειγμάτων του καρκίνου, ειδικά στην ομάδα των προς τα πάνω ρυθμισμένη γονίδια (σήματα φαίνεται στο κόκκινο στο σχήμα 2Α). Πολλά από αυτά τα γονίδια υπερεκφράζονται σε ορισμένους όγκους και προς τα κάτω σε άλλους όγκους. Αυτό ήταν σε αντίθεση με την ομοιομορφία των σημάτων έκφρασης στα δείγματα ομάδα ελέγχου. Γονίδια που πρόκειται να δοκιμαστεί ως δείκτες για τη διαλογή ή ως δυνητικοί θεραπευτικοί στόχοι επιλέχθηκαν σύμφωνα με την κατάταξη Δ-βαθμολογία (ένα τροποποιημένο t-test, που χρησιμοποιείται στην SAM), FC ή αν είχαν χρησιμοποιηθεί προηγουμένως ως δείκτες για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Από τα 997 γονίδια που σχετίζονται με τα δείγματα καρκίνου, 163 έχουν προηγουμένως αναφερθεί ως δείκτες για διαφορετικούς τύπους καρκίνου (ΙΡΑ, Ingenuity Systems), συμπεριλαμβανομένων των

MCM2

,

TOP2A

, και

CDKN2A

, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί ως δείκτες για τη διάγνωση του καρκίνου του τραχήλου [35]. Τα 997 γονίδια που αναφέρονται στη μείωση κατά Δ-βαθμολογία (Πίνακας S3). Επελέγησαν συνολικά 23 γονίδια (18 ρυθμίζεται προς τα πάνω και 5 ρυθμίζεται προς τα κάτω) για την επικύρωση από qRT-PCR (που σημειώνονται με έντονους χαρακτήρες στον πίνακα S3 και στον πίνακα 2? κύκλους χρωματισμένο με μπλε και πορτοκαλί στο Σχήμα 1). Όλα τα μειωτικά γονίδια (

CFD

,

NDN

,

WISP2

,

σκοπό αυτό3

, και

SLC18A2

) και 10 από το 18 ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια (

PRC1

,

CKS2

,

Tyms

,

RFC4

,

RRM2

,

NUSAP1

,

MCM2

,

CCNB2

,

SMC4

, και

CDC2

) επιλέχθηκαν με βάση την κατάταξή Δ-score. Επτά από τα υπόλοιπα ρυθμίζεται αυξητικά γονίδια είναι στον κατάλογο των 50 καλύτερων κατετάγη γονίδια, 2 εκ των οποίων είναι γονίδια που έχουν προηγουμένως προταθεί ως δείκτες σε CC (

CDKN2A

και

TOP2A

), 4 (

CDC20

,

CDKN3

,

ZWINT

, και

SYCP2

) επιλέχθηκαν με βάση την αξία FC, και

PCNA

(Πίνακας S3), μαζί με το

MKI67

, το οποίο κατατάσσεται στην 139η θέση, συμπεριλήφθηκαν επειδή αυτοί οι δείκτες είναι συνήθως χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. ένα. ένα. σι. ντο. σι.