Αφηρημένο

Η ιστολογική υποδιαίρεση της ταξινόμησης των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), έχει αυξανόμενη θεραπευτική επίδραση. Σε προχωρημένα στάδια του καρκίνου δείγματα ιστών συνήθως bioptically συλλέγονται. Αυτά τα μικρά δείγματα είναι εξαιρετική αξία καθώς οι μοριακές αναλύσεις αποκτούν σημασία για στοχευμένες θεραπείες. Ως εκ τούτου, μελέτησε τη σκοπιμότητα, διαγνωστική ακρίβεια, οικονομική και προγνωστικές επιπτώσεις ενός ιστού φειδωλοί ταυτόχρονη δοκιμασία πολλαπλών αντισωμάτων για την υποδιαίρεση των NSCLC. 265 ασθενείς με ΜΜΚΠ ιστού πολλαπλών συστοιχιών (TMA) κατασκευάστηκαν για να προσομοιώσουν δείγματα βιοψίας. TMAs βάφτηκαν με ταυτόχρονη δίχρωμη δοκιμασία πολλαπλών αντισωμάτων που αποτελείται από TTF1, βιμεντίνη, p63 και νευροενδοκρινείς δείκτες (CD56, χρωμογρανίνη Α, συναπτοφυσίνη). Η κατάταξη αυτή βασίζεται κυρίως στην τρέχουσα πρόταση της IASLC με ένα ιεραρχικό δέντρο αποφάσεων για την υποδιαίρεση σε αδενοκαρκίνωμα (ΛΑΚ), πλακώδες καρκίνωμα (SCC), μεγάλο καρκίνωμα νευροενδοκρινικά (αυτήν των άτυπων) και NSCLC δεν ορίζεται διαφορετικά. Διερεύνηση της ετερογένειας των όγκων έδειξε μια ρητή χαμηλότερη διακύμανση για ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις σε σύγκριση με τα συμβατικά κατάταξης. Επιπλέον, η ανάλυση επιβίωσης των συνδυασμένων ανοσοϊστοχημική κατάταξης μας αποκάλυψε διακριτό διαχωρισμό της καμπύλης επιβίωσης της κάθε εταιρείας. Αυτό ήταν στατιστικά σημαντική για θεραπευτικά σημαντικές υποομάδες (p = 0.045). Όπως μορφολογικών και μοριακών δοκιμών του καρκίνου αναδύεται, δοκιμασία μας multi-αντίσωμα σε συνδυασμό με την τυποποιημένη ταξινόμηση παρέχει ακριβείς και αξιόπιστες διαχωρισμό των ιστομορφολογικά διαγνώσεις. Επιπλέον, επιτρέπει κλινικά σχετική υποκατηγοριών των NSCLC, συμπεριλαμβανομένων αυτήν των άτυπων. δοκιμασία πολυ-αντισώματος μας μπορεί συνεπώς να είναι ιδιαίτερη αξία, ιδιαίτερα στην διάγνωση μικρές βιοψίες. Παρέχει μακρύτερα σημαντικές προγνωστικές πληροφορίες με θεραπευτικές συνέπειες. Ένταξη των ανοσοϊστοχημική υποκατηγοριών συμπεριλαμβανομένης της διερεύνησης των νευροενδοκρινών διαφοροποίηση σε τυπική ιστοπαθολογική ταξινόμηση των NSCLC πρέπει, ως εκ τούτου, να θεωρηθεί

Παράθεση:. Kayser G, Csanadi Α, Otto C, Plönes Τ, Bittermann Ν, Rawluk J, et al . (2013) Η ταυτόχρονη Multi-αντισώματος χρώσης σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Ενισχύει διαγνωστική ακρίβεια Ειδικά σε μικρά δείγματα ιστού. PLoS ONE 8 (2): e56333. doi: 10.1371 /journal.pone.0056333

Επιμέλεια: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 του Αυγούστου του 2012? Αποδεκτές: 8, Γενάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Kayser et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη έχει υποστηριχθεί οικονομικά από την Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB 850. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα παρουσιάζει την υψηλότερη συνολική θνησιμότητα από κακοήθη νόσο σε ανθρώπους σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Παρά τεράστια πρόοδος στη σύγχρονη ιατρική, τα ποσοστά θανάτου στον καρκίνο του πνεύμονα είναι ακόμη σε μια σταθερή κατάσταση που αντικατοπτρίζει την επείγουσα ανάγκη ισχυρών στοχευμένων χημειοθεραπευτικών παραγόντων στη θεραπεία αυτής της ευρέως διαδεδομένη ασθένεια. Μεταξύ του διαχωρισμού των μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), τα τελευταία μπορούν να ταξινομηθούν περαιτέρω σύμφωνα με μορφολογική εμφάνιση του σε τρεις μεγάλες ομάδες: αδενοκαρκινώματα (LAC), καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (SCC) και μεγάλα καρκινώματα (LCC). Δίπλα διαφορετική μορφολογία πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει βιολογικές διαφορές μεταξύ των ιστολογικών NSCLC υποτύπους. Αυτά περιλαμβάνουν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης του m-RNA και ανοσοϊστοχημικά ανιχνεύσιμο πρωτεΐνες όπως θυμιδυλική συνθετάση (TS). TS, που εμπλέκονται στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης DNA, είναι ένας από τους κύριους στόχους της πεμετρεξίδη και σημαντικά υψηλότερο εκφράζονται σε SCC σε σύγκριση με ΛΑΚ και LCC. Scagliotti et al. θα μπορούσε να δείξει ότι οι ασθενείς που πάσχουν από ΛΑΚ και να επωφεληθούν LCC από πλατίνα χημειοθεραπεία βασισμένη σε συνδυασμό με πεμετρεξίδη. Σε αντίθεση, SCC ασθενείς επωφελούνται από ένα συνδυασμό πλατίνη με γεμσιταβίνη [3]. Βασίζονται κυρίως σε αυτή τη μελέτη, οι συστάσεις για την ακριβή τυποποίηση της NSCLC εισήχθησαν σε εθνικές κατευθυντήριες γραμμές καρκίνου του πνεύμονα [4] – [6]. Το δίλημμα για Παθολόγοι σε αυτή τη ρύθμιση αυτή, από τη μία πλευρά, η σημερινή κατάταξη που εισήγαγε το 2004. Σύμφωνα με την ΠΟΥ, υποδιαίρεση της ταξινόμησης των NSCLC πρέπει να γίνει κυρίως με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η & amp? Ε) λεκέδες. Λόγω της συχνά εκτεταμένη ετερογένεια του όγκου, τα δείγματα εκτομή απαιτούνται για μια οριστική διάγνωση, πάρα πολύ [2]. Από την άλλη πλευρά, αυτές οι κατευθυντήριες γραμμές θεραπείας υπερισχύουν για ασθενείς σε προχωρημένο UICC-φάσεις ΙΙΙΒ και IV [3]. Από αυτούς τους ασθενείς, συνήθως, μόνο μικρά δείγματα όγκων που συγκεντρώθηκαν, συνήθως, με βιοψία, μεσοθωρακοσκόπηση ή ακόμα και αναρρόφηση με λεπτή βελόνα. Έτσι, ο παθολόγος θα πρέπει να στηρίξει την διαγνωστική την απόφασή του /της σχετικά με πρόσθετες ανοσοϊστοχημικές ειδικές λεκέδες. Μεταξύ άλλων, ιδιαίτερα μεταγραφικού παράγοντα του θυρεοειδούς 1 (TTF1) και πλακωδών βλαστικών p63 κυτταρικό δείκτη συνιστώνται στην πρώτη γραμμή [7] – [9]. Από το υλικό όγκου από μικρές βιοψίες είναι πολύ σπάνιο, τεχνικές φειδωλοί ιστού πρέπει να αναπτυχθούν για να αντιμετωπίσουν μικρότερο διαγνωστικό υλικό για ένα μεγαλύτερο αριθμό των διαγνωστικών ερευνών. Επιπλέον, καθώς η ποσότητα που απαιτείται μοριακών έρευνες για στοχευμένη θεραπεία αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς, πρέπει επίσης να ληφθούν οικονομικά ζητήματα υπόψη κατά την εισαγωγή νέων τεχνικών. Με βάση κυρίως από δημοσιευθεί σύνολα δείκτη, Sterlacci [10] και Yamagita [11] πρόσφατα δημοσιευθεί διπλό πρωτόκολλα χρώσης και ένα εμπορικά διαθέσιμο αντίσωμα κοκτέιλ, αντίστοιχα. Παρ ‘όλα αυτά, δίπλα ΛΑΚ και SCC, καρκίνωμα νευροενδοκρινικά μεγάλων κυττάρων (αυτήν των άτυπων) αντιπροσωπεύει ένα άλλο subentity του NSCLC με θεραπευτικές συνέπειες. Σε πρόσφατες μελέτες, έχει γίνει όλο και περισσότερο προφανές ότι αυτήν των άτυπων είναι βιολογικά στενά συνδεδεμένα με SCLC [12], [13]. Ως εκ τούτου, προτείνεται να διαχειριστεί αυτήν των άτυπων ασθενείς χημειοθεραπευτικούς συνδυασμούς σε αναλογία με SCLC [14]. Στο πλαίσιο της στρατηγικής της διάγνωσης NSCLC και υποκατηγοριών, θα πρέπει με αυτά τα μέσα να συμπεριληφθούν αυτήν των άτυπων. Μετά τα ανωτέρω ερευνήσαμε όφελος του νεοαποκτηθέντα ταυτόχρονη δοκιμασία πολλαπλών αντισωμάτων χρώση σε ένα μεγάλο και καλά χαρακτηρισμένο ομάδα των ασθενών με NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

η μελέτη έχει εγκριθεί από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Φράιμπουργκ (EK 10/12). Σε συμφωνία με αυτή την απόφαση της επιτροπής δεοντολογίας όλα τα ασθενή στοιχεία που αφορούν χρησιμοποιήθηκαν μόνο σε μια ψευδώνυμα τρόπο. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με αυτή τη μελέτη δεν επηρέασε τη θεραπεία του ασθενούς. Το υλικό παραφίνης είχε αρχειοθετηθεί τουλάχιστον 3 χρόνια μετά την αρχική διάγνωση. Λόγω αυτών των προϋποθέσεων, με απόφαση της επιτροπής δεοντολογίας, καμία γραπτή συγκατάθεση του κάθε ασθενούς έπρεπε να ληφθούν.

Ασθενείς και TMA κατασκευή

265 ασθενείς, που λειτουργούν στις μεταξύ 1ης Ιανουαρίου

st 1990 και στις 31 Δεκεμβρίου

ου 2007 στο Τμήμα Χειρουργικής θώρακος, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Φράιμπουργκ, επιλέχθηκαν από τη βάση δεδομένων του Ινστιτούτου Παθολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Φράιμπουργκ. Εκτός από πρωτογενείς NSCLC, τα κριτήρια συμπερίληψης ήταν πρόσβαση σε επαρκή όγκο και μη νεοπλαστικά πνευμονικού ιστού. Η επιλογή των ασθενών πραγματοποιήθηκε τυφλό να αποφευχθούν οι προκαταλήψεις που προκύπτει από το στάδιο του όγκου και /ή ιστολογική υπότυπο. δείγματα Λειτουργία μονιμοποιήθηκαν σε 4% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 έως 48 ώρες. Αποφέροντας συνολικά διαδικασία και εμβάπτιση σε παραφίνη ακολούθησε πρωτόκολλα ρουτίνας. Όλα τα μπλοκ παραφίνης που φέρει όγκο ανασύρθηκαν από το αρχείο. Κατά τη νέα H & amp? Ε τμημάτων όλοι οι όγκοι αναταξινομήθηκαν ανεξάρτητα από τρεις έμπειρους παθολόγο (GK, AC, MW), σύμφωνα με την τρέχουσα ταξινόμηση του ΠΟΥ [2]. Δεν ανοσοϊστοχημική χρώση αποτελέσματα είχαν ληφθεί υπόψη για αυτή την ανακατάταξη. 5 ασύμφωνα και δύσκολες περιπτώσεις, πάλι, να αναθεωρηθεί και να συζητηθούν από κοινού. Με την παρουσία των κριτηρίων της ΠΟΥ, συναίνεση ορίστηκε για περαιτέρω αναλύσεις. ΤΝΜ-φάσεις ήταν ομοιόμορφα επανεκτιμηθεί μετά την τρέχουσα ταξινόμηση UICC (7

η έκδοση) [15]. Για την εξάλειψη των προκαταλήψεων, ιστολογικές αναταξινόμηση και αναβίωση UICC όλων των περιπτώσεων πραγματοποιήθηκαν πριν από ανοσοϊστοχημικές διαδικασίες και την αξιολόγηση τους. Από όλους τους ασθενείς, τα δεδομένα κλινικο-παθολογική συμπεριλαμβανομένων συνήθειες καπνίσματος και η συνολική επιβίωση ήταν διαθέσιμα (πίνακας 1).

Η

Tissue πολλαπλών συστοιχιών (TMA) κατασκευάστηκαν με τη λήψη τριών πυρήνες κάθε όγκου τυχαία από τρία διαφορετικές απομακρυσμένες περιοχές. Διάμετρο πυρήνα ήταν 2 mm. Σε Η &? Ε χρώση τμημάτων του TMAs όλοι οι πυρήνες αξιολογήθηκαν για την παρουσία του αδενικού διακριτά πρότυπα ή πλακώδες ανάπτυξη η οποία ταξινομείται ως αυτοί LAC ή SCC, αντίστοιχα. TMA πυρήνες λείπει ειδικά σχέδια ανάπτυξης διαγνώστηκαν ως NSCLC δεν ορίζεται διαφορετικά (NOS).

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Δύο μικρόμετρο παχύ τμήματα του TMAs ήταν τοποθετημένα σε επικαλυμμένο γυαλί διαφάνειες (Superfrost συν) , αποκηρωμένα και επανυδατωθεί σε μια σειρά φθίνουσα αλκοόλ. Για ανάκτηση αντιγόνου, τα πλακίδια επωάστηκαν σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.1) για 2 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα χύτρα ταχύτητας. Ο χρόνος επώασης για το πρώτο πρωτογενή αντισώματα, βιμεντίνη (κλώνος VIM3B4) και TTF1 (κλώνος 8G7G3 /1), ήταν 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η επώαση με το πρώτο δευτερεύον βιοτινυλιωμένο αντίσωμα που ακολουθήθηκε για 15 λεπτά. Η ενεργοποίηση και η οπτικοποίηση πραγματοποιήθηκαν με αλκαλικό φωσφατάσης σε συνδυασμό στρεπταβιδίνης (ΑΡ /Στρεπταβιδίνης? Σύστημα ϋΑΚΟ Ρεάλ ανίχνευσης ΑΡ /RED, κωδικό K5005). Το δεύτερο μέρος του λεκέ multi-αντισώματος αποτελούνταν από ένα πρωτογενές αντίσωμα που κατευθύνεται εναντίον ρ63 (κλώνος 4A4) και ένα κοκτέιλ νευροενδοκρινείς αντίσωμα που στοχεύει Χρωμογρανίνης Α (κλώνος DAK-Α3), Synaptophysin (κλώνος SY38) και CD56 (κλώνος 1B6). Ο χρόνος επώασης για αυτά τα αντισώματα ήταν 30 λεπτά. Ένα πολυμερές δεξτράνης συζευγμένα με υπεροξειδάση ραδικιού συζευγμένων μορίων αντισώματος εφαρμόστηκε και χρώση διεξήχθη με επώαση με 3’3′-διαμινο-βενζιδίνη (ϋΑΒ? ΫΑΚΟ οραματίζονται FLEX +, κωδικός 8012). Τέλος, τα πλακίδια αντίθετα με αιματοξιλίνη. Η διαδικασία χρώσης εκτελέστηκε σε μία Autostainer ϋΑΚΟ για όλες τις διαφάνειες (λεπτομερής βήμα-βήμα πρωτόκολλο Έγγραφο S1).

Αξιολόγηση της πολυ-αντίσωμα δοκιμασία

σύνοψη με τον ιστολογικό τύπο αύξησης μια συνδυασμένη διάγνωση ιστολογική-IHC για κάθε πυρήνα έγινε σε αντιστοιχία με τις προτεινόμενες κατευθυντήριες γραμμές IASLC [9]: Δια του παρόντος, σαφείς αδενικό πρότυπα ανάπτυξης που ορίζονται ΛΑΚ ανεξάρτητα από την έκφραση των δεικτών IHC. Το ίδιο ορίστηκε για SCC, αν ceratinization ή /και μεσοκυττάρια γέφυρες ήταν παρόντες. Σε όγκους χωρίς καθορισμένη μορφολογική H & amp? E-διάγνωση, αξιολόγηση της έκφρασης IHC-δείκτης ακολούθησε αυτό ιεραρχική αλγόριθμο: 1) έκφραση TTF1: θετική ΛΑΚ, αρνητική: 2) έκφραση p63: θετική SCC, αρνητικό: 3) έκφραση των δεικτών νευροενδοκρινείς: αυτήν των άτυπων , αρνητική: NSCLC NOS (σχήμα 1). Vimentin υπηρέτησε ως αναπληρωματικός δείκτης για την αξιολόγηση της αρχιτεκτονικής στρωματικά καθώς και κατάσταση στερέωση του ιστού από την ευρωστία της στην χρώση ποιότητας. Κάθε δείκτης αξιολογήθηκε ανεξάρτητα, ενώ μόνο διακριτές ειδικών πυρηνικών (TTF1 και p63) ή κυτταροπλασματική (βιμεντίνης, χρωμογρανίνης Α και Synaptophysin) και μεμβρανώδη (CD56) με τουλάχιστον μέτρια έως ισχυρή ένταση στο υπερβαίνον πλειονότητα των κυττάρων όγκου θεωρήθηκαν θετικά για διαγνωστικούς σκοπούς.

η

Για την τελική αξιολόγηση του όγκου, η συναίνεση διάγνωση που συνδυάζει και τις τρεις πυρήνες TMA έγινε. Σε συμφωνία με την τρέχουσα WHO-ταξινόμηση [15], εάν οι πυρήνες TMA δεν έγιναν ομόφωνα διαγνωστεί ο καρκίνος είχε χαρακτηριστεί ως ΛΑΚ για το συνδυασμό της ΛΑΚ και NSCLC NOS, και ως SCC για το συνδυασμό των SCC και NSCLC NOS. Ο συνδυασμός των ΛΑΚ ή SCC με αυτήν των άτυπων ήταν ομαδοποιούνται σε αυτήν των άτυπων. Αν και οι δύο, LAC και SCC, διαγνώστηκαν σε διαφορετικές πυρήνες TMA του ασθενούς αυτά ταξινομούνται ως αναμιγνύεται LAC /SCC. Όπως ερμηνεία αυτού του προφίλ έκφρασης IHC δεν ορίζεται σαφώς στην πρόταση IASLC και μόνο 5 ασθενείς ομαδοποιήθηκαν σε αυτό, οι περιπτώσεις αυτές αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις επιβίωσης.

Στατιστικά

Η συσχέτιση μεταξύ των διαφορετικών αντισωμάτων ήταν αξιολογήθηκαν με υπολογισμό του συντελεστή συσχέτισης b Kendall-tau. Διαγνωστική αξιοπιστία των διαφορετικών αντισωμάτων για IHC αλγόριθμο ταξινόμησης των NSCLC κρίθηκε από (AUC) υπολογισμοί δέκτη-λειτουργικό χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη και η περιοχή κάτω από την καμπύλη. Inter-core διαφορές, καθώς και διαγνωστικών συμφωνία μεταξύ H & amp? E-ταξινόμηση των δειγμάτων εκτομή και οριστική κατάταξη στη συνδυασμένη μορφολογική-IHC αναλύθηκαν με υπολογισμό των κάπα του Cohen και V του Cramer, αντίστοιχα. ανάλυση επιβίωσης διεξήχθη σύμφωνα με Kaplan-Meier. τεστ log-rank υπηρέτησε για την αξιολόγηση στατιστικής σημαντικότητας. χρόνο παρακολούθησης εκτιμήθηκε έως 120 μήνες. Όπως δημοσιεύθηκε και διεθνώς αποδεκτή [16] – [19] 15 ασθενείς που απεβίωσαν εντός 30 ημερών από την επέμβαση είχαν εξαιρεθεί από την επιβίωση αναλύσεις για τον αποκλεισμό προκατάληψη που προκύπτουν από περιεγχειρητική θνητότητα σε αυτήν την μακροχρόνια μελέτη παρακολούθησης. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS 17 σουίτα λογισμικού. Στατιστικό επίπεδο σημαντικότητας α ορίστηκε σε 5% για όλες τις δοκιμές.

Αποτελέσματα

Δεν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αντισωμάτων που παρατηρήθηκαν

Για να εκτιμήσουν τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των διαφορετικών αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται , ένα σύνολο δοκιμής 10 NSCLC και μη νεοπλαστικά ανιχνευτές πνευμονικό ιστό χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πολλαπλής αντισώματος. Διαδοχικές τομές αυτού του συνόλου δοκιμών χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας μόνο ένα από τα αντισώματα που περιλαμβάνονται στο πρωτόκολλο πολλαπλών αντίσωμα χρώση. Επανεξέταση αυτά τα τμήματα, σε όλα τα δείγματα θα μπορούσαν να ανιχνευθούν διαφορές στα πρότυπα χρώσης μεταξύ κάθε μονού αντισώματος και το πρωτόκολλο πολλαπλών αντίσωμα (σχήμα 2). Για να αξιολογηθεί η πιθανή διασταυρούμενη αντίδραση του δεύτερου συστήματος ανίχνευσης (DAB-based) με το πρώτο που εφαρμόζεται πρωτογενές αντίσωμα (βιμεντίνης και TTF1), που βάφονται το σύνολο ελέγχου παραλείποντας το δεύτερο πρωτεύον κοκτέιλ αντισωμάτων (p63, CD56, Χρωμογρανίνης Α και Synaptophysin). Τα τμήματα αυτά αποκάλυψαν μόνο το κόκκινο χρώση χρωμογόνου για βιμεντίνη και TTF1, χωρίς διασταυρούμενη αντίδραση με τον καφέ σύστημα DAB βασίζεται ανίχνευσης παρατηρήθηκε (σχήμα S1.). Επιπλέον, σε αναλύσεις συμπεριλαμβανομένων όλη την κοόρτη δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουν οποιαδήποτε θετική στατιστική συσχέτιση μεταξύ αυτών των αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται για κάθε μέθοδο ανίχνευσης χρωμογόνου, i. μι. TTF1 και βιμεντίνης για AP /στρεπταβιδίνης και p63 και η νευροενδοκρινείς κοκτέιλ για DAB. Αντιθέτως, p63 και έκφραση δεικτών νευροενδοκρινικών έδειξε μία σημαντική αρνητική συσχέτιση (ρ & lt? 0,001? Συντελεστής συσχέτισης -0.300? Kendall-tau-b). Σημαντική αρνητική συσχέτιση θα μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί για TTF1 και p63 (p & lt? 0.001? Συντελεστής συσχέτισης -0,262? Kendal-tau-b). Καμία άλλη θετική ή αρνητική συσχέτιση μεταξύ αντισώματος ανιχνεύθηκαν. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν, επίσης, ότι χρώσης και την αξιολόγηση του κάθε αντισώματος δεν επηρεάζεται από το δυναμικό χρώση υποβάθρου ή χρωμογόνο διασταυρούμενες αντιδράσεις. Παρ ‘όλα αυτά, τα πυρηνικά και /ή κυτταροπλασματικών διπλή θετικότητα αντανακλώντας ειδική χρώση για τα δύο αντιγόνα, i. μι. TTF1 σε συνδυασμό με την p63 και βιμεντίνης σε συνδυασμό με δείκτες νευροενδοκρινών, αντίστοιχα, εξακολουθούν να διακρίνονται σαφώς (σχήμα S2).

Κανονική πνευμονικού ιστού (Α), ΛΑΚ (Β), SCC (C) και αυτήν των άτυπων (D) χρωματίζονται με τη συνδυασμένη δοκιμασία πολλαπλών αντισώματος (επάνω) και για κάθε ενιαίο περιλαμβάνονται αντίσωμα. Κόκκινο πυρήνες – TTF1? κόκκινο κυτταρόπλασμα – vimentin? καφέ πυρήνες – ρ63? καφέ κυτταρόπλασμα – νευροενδοκρινείς δείκτες. Κάτω από το bi-χρώμα IHC δοκιμασία αντίστοιχων δοκιμασιών μοναδικό αντίσωμα εμφανίζονται στην ίδια περιοχή του όγκου. Σύγκριση κάθε απλή χρώση του αντισώματος και της ανάλυσης πολλαπλών αντισωμάτων bi-χρώμα δείχνει αναλογική συγκεκριμένες θετικότητα στα ίδια κύτταρα και δεν αποκαλύπτει οποιαδήποτε μη ειδική χρώση υποβάθρου ή χρωμογόνο διασταυρούμενη αντιδραστικότητα.

Η

TTF1 και p63 είναι χρήσιμοι δείκτες για την αξιολόγηση της διαφοροποίησης γενιάς

Η τρέχουσα ταξινόμηση WHO προτείνει H & amp? Ε ταξινόμηση των δειγμάτων εκτομή ως ο χρυσός κανόνας του καρκίνου του πνεύμονα [2]. Αναφορικά με αυτό, θα μπορούσαμε να παρατηρήσουμε μια ευαισθησία και εξειδίκευση του TTF1 για την αναγνώριση των LAC σε μία περιοχή μεταξύ των τριών πυρήνων ΤΜΑ από 80,4% έως 84,6% και 70,6% έως 76,9%, αντίστοιχα. Αξιολογώντας ρ63 ως ένας δείκτης για πλακώδη διαφοροποίηση, η ευαισθησία υπολογίστηκε από 62,1% έως 66,7%, ενώ η ειδικότητα κυμάνθηκε μεταξύ 84,0% και 90,8%. Τα στοιχεία αυτά είναι συγκρίσιμα με την τρέχουσα βιβλιογραφία στην οποία αυτές οι δύο δείκτες συνιστάται να χρησιμοποιείται σε μικρές βιοψίες για την έρευνα της γενεαλογίας διαφοροποίηση [8], [9]. Αυτό αντικατοπτρίζεται και στην ξεκάθαρη αναλογίες περίεργο (Εικόνα S3) και τις ROC-AUC αναλύσεις (σχήμα S4? Πίνακα S1). Τόσο, TTF1 και p63 έδειξε πολύ σημαντικά αποτελέσματα για την ταξινόμηση των ΛΑΚ και SCC, αντίστοιχα (p & lt? 0.001? Πίνακα S1). Όπως ήταν αναμενόμενο, οι τιμές AUC ήταν υψηλότερη σε IHC αλγόριθμο ταξινόμησης σε σύγκριση με το H & amp? Ε ταξινόμηση των δειγμάτων εκτομή (πίνακας S1). Στο πλαίσιο αυτό, παρατηρείται επίσης μια σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του TTF1 και p63 (συνολικά: p & lt? 0.001? Συντελεστής συσχέτισης -0,262? Kendall-tau-b)

Η ενδονεοπλασματική ετερογένεια είναι λιγότερο σημαντικό σε δείκτες IHC. σε σύγκριση με πρότυπα ανάπτυξης μορφολογικές

Ως ετερογένεια της μορφολογίας των όγκων είναι γνωστό ότι είναι υψηλά σε NSCLC συμπεριλάβαμε τρεις ΤΜΑ πυρήνες του κάθε όγκου. Αυτοί οι πυρήνες ελήφθησαν τυχαία αφορούν περιοχή του όγκου να αποκλείσει μορφολογικά προκατάληψη. Όπως δημοσιεύθηκε και διεθνώς αποδεκτό, η ανάλυση της κάθε πυρήνα TMA μπορεί να θεωρηθεί συγκρίσιμο με την ανάλυση των βιοψιών όγκου σε συνήθη διαγνωστική παθολογία [20], [21]. Όσον αφορά τις διαγνωστικές πορείες σε ιστοπαθολογική, ταξινομήσαμε πρώτα κάθε πυρήνα ΤΜΑ σε μια ρουτίνα Η &? Ε λεκέ. Για την αξιολόγηση της κάπα ενδοογκική /δια-core ετερογένεια του Cohen υπολογίστηκε για την H & amp? Ε ταξινόμηση καθώς και για τη συνδυασμένη μορφολογική IHC-αλγόριθμος ταξινόμησης. Συνολικά, Κάππα-τιμές που παρατηρούνται μπορεί να ερμηνευθεί ως σε συμφωνία με καλή συσχέτιση για όλα τα αλγορίθμων ταξινόμησης. Αλλά αποτελέσματα που ελήφθησαν για τη συνδυασμένη ταξινόμηση IHC ήταν πάντα τουλάχιστον τόσο καλή όσο για την H & amp? Ε δια-core παραλλαγή (πίνακας 2). Επί του παρόντος, οι IHC αλγόριθμοι συνιστάται αποκλειστικά για βιοψίες που στερούνται ειδικά σχέδια ανάπτυξης και ως εκ τούτου κατατάσσονται ως NSCLC NOS. Σχετικά με τη σύσταση αυτή, οι τιμές κάπα ξεχωριστά υπολογίζεται για τις περιπτώσεις εκείνες κατά τις οποίες τουλάχιστον ένας πυρήνας ΤΜΑ είχε χαρακτηριστεί ως NSCLC ΝΟΣ κατόπιν H & amp? Ε μορφολογία. Μέσα σε αυτές τις περιπτώσεις, κάππα-τιμές για το H & amp? Ε κατάταξης έδειξαν μόνο φτωχή συσχέτιση ενώ IHC κατάταξης έφτασε αξίες της καλής μεταξύ πυρήνα συσχέτισης (πίνακας 2). Ανάλυση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης σε συνδυασμό με ιστολογικές πρότυπα ανάπτυξης για την ταξινόμηση των NSCLC, ως εκ τούτου, παρουσιάζει λιγότερο εντός του όγκου μεταβλητότητα από ό, τι κατάταξη των NSCLC με βάση την H & amp?. Ε μορφολογία, και μόνο

Η

Πρόσθετες IHC αναλύσεις αυξήσει διαγνωστική ακρίβεια σε σύγκριση με τα συμβατικά H & amp? Ε ταξινόμηση

κατά την H & amp? Ε μορφολογία των πυρήνων TMA μεταξύ 130 και 142 πυρήνες του καθενός από τα τρία βασικά σύνολα TMA δεν θα μπορούσε να χαρακτηριστεί κατά διαφορετικά πρότυπα ανάπτυξης. Αυτά χαρακτηρίζονται ως NSCLC NOS. Συνδυάζοντας τις τρεις πυρήνες σε συναίνεση διάγνωση 48 (18,1%) ταξινομήθηκαν ως NSCLC NOS, 14 εκ των οποίων εκφράζονται οι δείκτες νευροενδοκρινών και επομένως διαγνωστεί ως αυτήν των άτυπων. Σε αντίθεση με Η &? Ε ταξινόμηση, χρησιμοποιώντας συνδυασμένη IHC αλγόριθμο μόνο 13 όγκων (4,9%) εξέφρασε ούτε TTF1 ούτε ρ63 ούτε νευροενδοκρινείς δείκτες και επομένως ταξινομούνται ως NSCLC NOS (πίνακας 3). Για να ορίσετε διαγνωστική συμφωνία του κάθε πυρήνα TMA με ιστολογική αναταξινόμηση του δείγματος εκτομή V του Cramer υπολογίστηκε για κάθε πυρήνα που ταξινομούνται από την H & amp? Ε και τη δοκιμασία πολλαπλών αντισωμάτων. Αν και θα μπορούσαμε να επαληθεύσει μια υψηλή στατιστική σημαντικότητα για τη συσχέτιση των συμβατικών διάγνωση του δείγματος εκτομή με Η &? Ε διάγνωση, καθώς και η ταξινόμηση IHC, αντίστοιχα, συνολικά συμμόρφωση ήταν πάντοτε υψηλότερη με την προσθήκη των πληροφοριών της δοκιμασίας μας multi-αντίσωμα (Πίνακας 3) . Αυτό δεν είναι μόνο αντανακλάται σε υψηλότερο ποσοστό ταξινομείται ορθώς περιπτώσεις, αλλά και σε μια υψηλότερη τιμή για V του Cramer (πίνακας 3).

Η

Ένταξη των δεικτών νευροενδοκρινείς στη ρουτίνα πίνακα IHC παρέχει σαφή ορισμό αυτήν των άτυπων

η έκφραση των δεικτών νευροενδοκρινείς θεωρήθηκε εάν τουλάχιστον ένας πυρήνας TMA εξέφρασε ειδική χρώση. Σύγκριση της παρουσία και απουσία έκφρασης του neurendocrine δείκτη δεν έχουν αντίκτυπο στην επιβίωση του ασθενούς αναλύοντας όλη την ομάδα (p = 0,208). Αυτό ίσχυε επίσης σε αναλύσεις επιβίωσης για LAC (p = 0,690) και SCC (p = 0,207). Από την άλλη πλευρά, τη διερεύνηση εκείνων NSCLC ούτε με διακεκριμένες adenoid ή πλακώδες μορφολογικά χαρακτηριστικά ούτε εκφράζουν TTF1 ή ρ63, έτσι να ταξινομηθεί ως NSCLC NOS, έκφραση δεικτών νευροενδοκρινικών πράγματι αποκάλυψε μια διακριτή διαχωρισμό των λαμβανόμενων καμπυλών επιβίωσης με στατιστική τάση (ρ = 0.095? σχήμα S5). Στις μορφολογική αξιολόγηση, όλες αυτές τις περιπτώσεις αυτήν των άτυπων επιπρόσθετα έδειξε πρότυπα ανάπτυξης νευροενδοκρινείς. Με τη χρήση των συνδυασμένων IHC αυτήν των άτυπων ταξινόμηση μπορεί, επομένως, να διαγνωστεί σε ένα εκλεπτυσμένο και τυποποιημένο τρόπο.

Η συνδυασμένη μορφολογική και πολυ-αντισώματος ταξινόμηση ενισχύει την κλινική σημασία των NSCLC υποκατηγοριών

διαφορετική βιολογική συμπεριφορά των κακοήθων νόσων συνήθως αντανακλάται σε διαφορετικά αποτελέσματα σε μακροπρόθεσμη παρακολούθηση. Για να εκτιμηθεί εάν υπάρχει μια καλύτερη διαστρωμάτωση, χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό ιστολογική και ταξινόμηση IHC, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις επιβίωσης για τις δύο ταξινομήσεις, i. μι. συμβατικά H & amp? Ε μορφολογία των δειγμάτων εκτομή και συνδυασμένη αλγόριθμο ταξινόμησης μορφολογία-IHC. Συμβατικά, Η &? Βασίζεται Ε ταξινόμηση των κοόρτης μας οδήγησε σε κοντά στις παράλληλες καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier (p = 0.904? Σχήμα 3). Από την άλλη πλευρά, μορφολογία-IHC ταξινόμηση δίνει ένα σαφέστερο διαχωρισμό των καμπυλών επιβίωσης κάθε οντότητας με στατιστική τάση (ρ = 0,088, σχήμα 3). Συνδυάζοντας ΛΑΚ και NSCLC NOS σύμφωνα με θεραπευτικό αποτέλεσμα σε «μη-πλακώδες καρκίνωμα» και συγκρίνοντας αυτές με SCC και αυτήν των άτυπων συνολική επιβίωση ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των ομάδων ασθενών (p = 0,045, σχήμα 3).

NSCLC υποτύπους ήταν διαγνωστεί από την H & amp? Ε σε δείγματα εκτομή (Α) και σε συνδυασμό αλγόριθμο ταξινόμησης IHC (Β). Πρόσθετη ταξινόμηση IHC χωρίζει ξεχωριστή ιστολογική οντότητες προτείνοντας διαφορετική βιολογική συμπεριφορά. Η ομαδοποίηση των διαφόρων οντοτήτων σύμφωνα με θεραπευτικές συνέπειες (C και D), δεν διαπιστώθηκαν διαφορές στην επιβίωση είναι εμφανείς με συμβατικές Η &? Ε ταξινόμηση των δειγμάτων εκτομή (C), ενώ το συνδυασμένο ταξινόμηση IHC διαχωρίζει σημαντικά τις διαφορετικές καμπύλες επιβίωσης (ρ = 0.045? D) .

Η

Bi-χρώματος δοκιμασία πολλαπλών αντισωμάτων εξοικονομεί ιστού και οικονομικών πόρων

Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται εδώ για να χαρακτηρίσει ανοσοϊστοχημικά NSCLC αποτελείται από μια ταυτόχρονη λεκέ με 6 διαφορετικά αντισώματα. Έτσι, η ποσότητα του ιστού που απαιτείται για τον χαρακτηρισμό NSCLC βιοψίες περιλαμβάνει μόνο 16,7% σε σύγκριση με εκείνη που απαιτείται για 6 προσδιορισμούς αντίσωμα μονής. Κατά συνέπεια, μόνο το 1/6

ου γυαλί sildes και καλυπτρίδες χρειάζονται. Δεδομένου ότι το πρωτόκολλο χρησιμοποιεί μίγματα αντισώματος TTF1 και βιμεντίνης, καθώς και ρ63 σε συνδυασμό με τη νευροενδοκρινική κοκτέιλ, 1/3

rd χρώσης και αντιδραστήρια αποκλεισμού χρειάζονται. Το ίδιο ισχύει και για φιαλίδια ανίχνευση χρωμογόνου. Στο ίδρυμα μας, οι δαπάνες για αντιδραστήρια που υπολογίζονται σε 3,30 € συν επιπλέον 0,20 € για το γυάλινο πλακίδιο ανά IHC λεκέ. Σε απόλυτους αριθμούς ανά περίπτωση, αυτό έχει ως αποτέλεσμα το συνολικό ποσό των 6,80 € για την δοκιμασία μας multi-αντισώματος σε σύγκριση με 21,80 € για 6 μόνο πρωτόκολλα αντισωμάτων. Έτσι, η χρήση της δοκιμασίας μας multi-αντισώματος εξοικονομεί έως και 68,8% των δαπανών για αντιδραστήρια εργαστηρίου.

Λόγω της διαδικασίας doublestaining Ωστόσο, το συνολικό χρόνο που απαιτείται για να ολοκληρωθεί το πρωτόκολλο διαρκεί περίπου 4 ώρες, σε σύγκριση με 1,5 έως 2 ώρες για την ενιαία λεκέδες αντισώματος. Αλλά, όπως το πρωτόκολλο μπορεί εύκολα να καθοριστεί με αυτοματοποιημένες μηχανές ανοσοϊστοχημική χρώση, καμία αρνητική επίδραση στο φόρτο εργασίας των εργαστηριακών τεχνικών συμβαίνει. Αντιθέτως, χρώση αυτοματοποίηση είναι παρατεταμένη και οι τεχνικοί μπορούν να επιτύχουν πιο πολύπλοκες και χρονοβόρες εργασίες κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας. Επιπλέον, ο χρόνος για τη διαλογή διαφάνεια είναι εντελώς παραλειφθεί.

Για την διάγνωση παθολόγος πρέπει να αξιολογηθεί μόνο μία διαφάνεια. Δια του παρόντος, όλα τα πρότυπα χρώσης IHC μπορεί να αξιολογηθεί σε παράλληλες και ακόμη πιο σημαντικό στα ίδια κύτταρα. Μικροσκοπική διαφάνειες δεν χρειάζεται να αλλάξει και διαγνωστικές περιοχές δεν πρέπει να μετεγκατασταθεί. Ως διαγνωστικοί φορές αξιολόγησης στην διαγνωστική παθολογία είναι πολύ μεταβλητή, η ποσότητα του χρόνου που εξοικονομείται με τη χρήση δοκιμασία μας multi-αντισώματος μπορεί να εκτιμηθεί μόνο. Σύμφωνα με τις εμπειρίες μας η δοκιμασία πολλαπλών αντίσωμα εξοικονομεί περίπου τα δύο τρίτα του χρόνου που απαιτείται για την αξιολόγηση των αντίστοιχων 6 μονά λεκέδες αντίσωμα.

Συζήτηση

Παγκοσμίως, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου μεταξύ όλων των κακοήθων νόσων [1], [22]. Αν και υπήρξαν εξελίξεις στη σύγχρονη θεραπεία του καρκίνου, τα ποσοστά θνησιμότητας των ασθενών με NSCLC δεν έχουν αλλάξει σημαντικά κατά τις τελευταίες δεκαετίες [1], [2], [22]. Με την ανάπτυξη της έρευνας στην εξατομικευμένη διαχείριση του καρκίνου, αρκετές βιοδείκτες αποδοθεί μια προγνωστική αξία για συγκεκριμένους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [23] – [27]. Scagliotti et al. περιγράφεται όφελος της γεμσιταβίνης σε λευκόχρυσο με βάση το χημειοθεραπευτικό καθεστώς για τους ασθενείς που πάσχουν από προχωρημένο NSCLC αν ιστολογία έδειξε μια κυρίαρχη πλακώδη διαφοροποίηση. Επιπλέον, οι ασθενείς των οποίων η ιστολογική εξέταση έδειξε μια κυρίαρχη διαφοροποίηση ΛΑΚ είχαν μεγαλύτερο όφελος αν δοθεί πεμετρεξίδης [3]. Ως εκ τούτου, οι συστάσεις για χημειοθεραπευτική καθεστώτα βασίζονται πλέον σε ιστολογική διαφοροποίηση του NSCLC και έχουν εφαρμοστεί σε αρκετές εθνικές κατευθυντήριες γραμμές θεραπείας NSCLC [4] – [6]. Στην τρέχουσα ταξινόμηση του ΠΟΥ, η ιστολογική πληκτρολόγηση του καρκίνου του πνεύμονα είναι 1) βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στο πρότυπο H & amp? E χρώση και 2) απαιτεί ιστοπαθολογική εξέταση των δειγμάτων εκτομή, ιδιαίτερα λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι σχεδόν το 50% των καρκίνων του πνεύμονα παρουσιάζουν περισσότερες από μία σημαντική ιστολογική υπότυπο [2]. Από την άλλη πλευρά, το έργο της Scagliotti βασίζεται σε μια σειρά ασθενών με NSCLC διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο UICC φάσεις ΙΙΙΒ και IV. Εδώ, ιστολογικές πληκτρολόγηση πρέπει να γίνεται σε μικρά δείγματα ιστού, όπως επί το πλείστον εκτομή δείγματα δεν είναι διαθέσιμα σε αυτούς τους ασθενείς. Ως εκ τούτου, οι δείκτες IHC και συλλέκτες έχουν προταθεί από διάφορους συγγραφείς για υποτύπου του NSCLC [8], [28], [29]. Μεταξύ αυτών, TTF1 για την ανίχνευση των αδενικό και p63 για πλακώδη διαφοροποίηση φαίνεται να είναι οι πιο αξιόπιστες δείκτες για την υποδιαίρεση των NSCLC [8], [9]. Για τους λόγους αυτούς, επιλέξαμε TTF1 και p63 ως δείκτες για τη διαφοροποίηση γενεαλογίας στον NSCLC, και καθιέρωσε ένα διαγνωστικό διαδρομή που συνδυάζει τα συμβατικά πρότυπα μορφολογίας και της έκφρασης IHC κατ ‘αναλογία με την πρόταση της [9] IASLC. Τον τελευταίο καιρό, η κολοβωμένη πρωτεΐνη p63 DeltaNp63 (p40) έχει περιγραφεί να έχουν μια υψηλότερη ειδικότητα για πλακώδη διαφοροποίηση σε σύγκριση με την πρωτεΐνη πλήρους μήκους [xpath ΣΦΑΛΜΑ:. Άγνωστη μεταβλητή «START2»], [31]. Αλλά και οι δύο αντιγόνα, πλήρους μήκους ρ63 και DeltaNp63, έχουν την ίδια ευαισθησία για το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [30], [31]. Δεδομένου ότι η έκφραση του p63 είναι διαγνωστικά αξιολογείται μετά TTF1 (Σχήμα 2), μπορεί να υποτεθεί ότι και τα δύο αντισώματα θα δώσει τα ίδια αποτελέσματα ταξινόμησης στον προσδιορισμό μας πολυ-αντισώματος. Για να συμπεριλάβετε αυτήν των άτυπων, επεκτείναμε πάνελ αντισώματος μας όχι μόνο με βιμεντίνη, το οποίο μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης για sarcomatoid καρκίνωμα [8], αλλά και με δείκτες neurendocrine (CD56, Synaptophysin, Χρωμογρανίνης Α). Θετικότητα από ένα ή περισσότερα από αυτά τα γονίδια είναι απαραίτητη για τη διάγνωση του νευροενδοκρινούς διαφοροποίησης [2]. Για να διαθέσετε το πεπερασμένο των ιστών του βιοπτικό υλικό, εφαρμόσαμε με επιτυχία μια δοκιμασία bi-χρώμα πολλαπλών αντισωμάτων χρώσης που επιτρέπει όχι μόνο την ταυτόχρονη χρώση των 6 αντισωμάτων για το ίδιο τμήμα του ιστού, αλλά και πραγματική ταυτόχρονη αξιολόγηση. Για να αποδειχθεί ότι δεν υπάρχουν παρεμβολές μεταξύ των αντισωμάτων, έχουν διάφορα πειράματα έχουν γίνει επικύρωση: Ένα σύνολο δοκιμής βάφτηκε με δοκιμασία μας πολυ-αντισώματος και έχουν σειριακές τομές έχουν χρωματίζονται με κάθε αντίσωμα, ξεχωριστά. Εδώ, δεν διαπιστώθηκαν διαφορές στα πρότυπα χρώσης ή χρωμογόνο αντιδράσεις υποβάθρου μπορούν να παρατηρηθούν (εικόνα 2, εικόνα S1). Για να διερευνηθεί η πιθανή διασταυρούμενη χρώση από το δεύτερο σύστημα ανίχνευσης DAB που βασίζεται η δοκιμασία εκτελέστηκε για το σύνολο της δοκιμής ενώ παραλείποντας τα δευτερόλεπτα πρωτογενή αντισώματα (ρ63, χρωμογρανίνης Α, Synaptophysin, CD56). Εάν είχαν υπάρχουσες ελεύθερες ή /και προσβάσιμες θέσεις σύνδεσης των πρώτων αντισωμάτων, αυτά θα είναι ορατή σε καφέ χρώμα. Επανεξέταση των βάφονται διαφάνειες, αυτά τα πειράματα αποδεικνύουν ότι όλες οι θέσεις σύνδεσης των πρώτων πρωτογενή αντισώματα (βιμεντίνης, TTF1) μπλοκάρεται από το σύστημα ανίχνευσης AEC-based καθώς δεν καφέ χρώση DAB ήταν ορατό (εικόνα S1). Ούτε θα μπορούσαμε να διαφωτίσει οποιαδήποτε θετική στατιστική συσχέτιση μεταξύ των αντισωμάτων που οπτικοποιούνται με την ίδια μέθοδο ανίχνευσης χρωμογόνου. Αν υπήρχε χρώση φόντο, είτε πυρηνική ή κυτταροπλασματική των αντίστοιχων δεικτών που οδηγούν σε ψευδείς ερμηνεία, αυτό θα αντανακλάται στο θετικό στατιστικούς συσχετισμούς. Αντίθετα, διαπιστώσαμε στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση της ρ63 με μαρκαδόρους νευροενδοκρινική, καθώς και με TTF1. Πρόσφατα, Sterlacci et al ιδρύθηκε διπλό λεκέδες που αποτελείται από TTF1 /CK7, p63 /CK5 /6 και TTF1 /CK5 /6 για την ταξινόμηση των NSCLC και αποκάλυψε αποτελέσματα παρόμοια με τα δικά μας [10]. Yanagita et al. έχουν δημοσιεύσει ένα εμπορικά διαθέσιμο προσδιορισμό πολυ-αντισώματος που περιέχει 4 αντισώματα, TTF1, ναψίνης Α, p63 και CK5 /6 [11]. Αυτά που είχαν καθοριστεί προηγουμένως κοκτέιλ αντισωμάτων να αποδειχθεί χρήσιμη, αλλά χρησιμεύουν μόνο για να διακρίνει ΛΑΚ από την SCC. Η δυνατότητα να ερευνήσει για αυτήν των άτυπων δεν λαμβάνεται υπόψη. Ωστόσο, ειδικά αυτή η οντότητα της αυτήν των άτυπων απαντάται όχι μόνο infavourable πρόγνωση, αλλά χημειοθεραπευτικών καθεστώτα παρόμοια με αυτά που χρησιμοποιούνται σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα πρέπει να θεωρηθεί [14]. Στην τρέχουσα βιβλιογραφία, αυτήν των άτυπων είναι μόνο να διαγνωστεί εάν NSCLC δείχνουν πρότυπα ανάπτυξης νευροενδοκρινικού σε συνδυασμό με την έκφραση τουλάχιστον ενός από τα CD56 δεικτών νευροενδοκρινική, χρωμογρανίνη Α ή συναπτοφυσίνη [2].