Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αγγειογένεση θεωρείται ως σήμα κατατεθέν στην ανάπτυξη καρκίνου, και αντι-αγγειογενετική θεραπεία σήμερα χρησιμοποιείται σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς. Τα microRNAs (Mirs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης, ενδογενή, μονόκλωνου RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων. Σε αυτή τη μελέτη με στόχο να εντοπίσει σημαντικά μεταβληθεί Mirs που σχετίζονται με την αγγειογένεση σε NSCLC.

Μέθοδοι

Από μια μεγάλη ομάδα 335 ασθενών με NSCLC, δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες από 10 ασθενείς με μια σύντομη ασθένεια συγκεκριμένο επιβίωσης (DSS), 10 με ένα μακρύ DSS και 10 φυσιολογικούς μάρτυρες αναλύθηκαν. Οι Mirs ήταν ποσοτικά με υβριδισμό μικροσυστοιχιών και επιλεγμένα Mirs επικυρώθηκαν από πραγματικό χρόνο qPCR. Οι επιπτώσεις των διαφόρων οδών, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης, αξιολογήθηκαν από τον Gene Σετ Ανάλυση εμπλουτισμού (GSEA) που προέρχεται από πρωτεΐνη ανάλυση μέσω εξελικτική σχέση (PANTHER). Ένα από τα πιο ενδιαφέροντα υποψήφιο δείκτες, miR-155, επικυρώθηκε από

in situ υβριδισμού

(ISH) στο σύνολο κοόρτης (n = 335) και αναλύσεις συσχέτισης με αρκετές γνωστές αγγειογενετική δείκτες έγιναν.

Αποτελέσματα

128 Mirs ήταν σημαντικά πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται? κανονικά έναντι μακρά DSS (n = 68) και /ή την κανονική έναντι μικρής DSS (n = 63) και /ή μακράς έναντι μικρής DSS (n = 37). Η ανάλυση δείχνει μονοπάτι Mirs που σχετίζονται με αγγειογένεση να συμμετέχουν σε NSCLC. Υπήρξαν ισχυρές σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της υβριδισμό συστοιχίας και επικύρωση των δεδομένων qPCR. Η ριζική αλλαγή που σχετίζονται με αγγειογένεση Mirs υψηλού ενδιαφέροντος ήταν miR-21, miR-106a, miR-126, το miR-155, miR-182, miR-210 και miR-424. miR-155 συσχετίζεται σημαντικά με αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 2 (FGF2) στη συνολική ομάδα (r = 0,17, P = 0,002), αν και πιο σημαντικό στην υποομάδα με κομβικό μετάσταση (r = 0,34, P & lt? 0.001).

Συμπεράσματα

Πολλά Mirs σχετίζονται με την αγγειογένεση μεταβληθεί σημαντικά σε NSCLC. Περαιτέρω μελέτες για την κατανόηση των βιολογικών λειτουργιών τους και να διερευνήσουν κλινική σημασία τους είναι δικαιολογημένη

Παράθεση:. Donnem Τ, Fenton CG, Lonvik Κ, Berg Τ, Eklo K, Andersen S, et al. (2012) microRNA υπογραφές σε Tumor ιστού σχετίζονται με την αγγειογένεση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (1): e29671. doi: 10.1371 /journal.pone.0029671

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 30 του Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: 2 του Δεκέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 25 Ιανουαρίου 2012

Copyright: © 2012 Donnem et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε αποκλειστικά από τη Βόρεια Νορβηγία Περιφερειακή Αρχή Υγείας (Helse Nord RHF), η οποία είναι υπεύθυνη για τα δημόσια νοσοκομεία στη βόρεια Νορβηγία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η υπ ‘αριθμόν ένα αιτία που σχετίζονται με θνησιμότητα από καρκίνο στους άνδρες και τις γυναίκες, και περίπου το 80% είναι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [1]. Παρά τις αναδυόμενες βελτιώσεις στην έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία λεπτομέρειες, η συνολική επιβίωση 5 ετών είναι σε πενιχρό 15%. ΤΝΜ (όγκος, Κόμβοι, μετάσταση) στάδιο έχει θεωρηθεί το πιο σημαντικό προγνωστικό μεταβλητή ως πρώιμο στάδιο της νόσου είναι απαραίτητη προϋπόθεση για πλήρη χειρουργική εκτομή είναι αναγκαία για πιθανή θεραπεία. Τρόποι θεραπείας και τις παρενέργειες από τις νέες θεραπευτικές επιλογές έχουν στενή σχέση με διαφορετικές ιστολογικές οντότητες του NSCLC [2] – [4]. Ωστόσο, στοχευμένες θεραπείες στρέφεται κατά συγκεκριμένων κυτταρικών αλλοιώσεων απαιτούν ακριβή υπο-ταξινόμηση των NSCLC που είναι σε μεγάλο βαθμό πέρα ​​από τη σημερινή στάσης και τη ρουτίνα διάγνωσης ιστοπαθολογικές τεχνικές [5].

Τα microRNAs (Mirs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης, ενδογενή, λανθάνον RNAs single που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση [6] – [9]. Με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, Mirs έχει μεγάλο αντίκτυπο σε μια ευρεία ποικιλία των οδών, συμπεριλαμβανομένων των διαφόρων οδών που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου. Αρκετές μελέτες έχουν διερευνήσει την απελευθέρωση των διαφόρων Mirs στον NSCLC και τις πιθανές λειτουργίες ογκογόνο και ογκοκατασταλτικό τους, καθώς και προγνωστικούς επιπτώσεις τους [10] – [20].

Μερικές Mirs φαίνεται να εμπλέκονται στην αγγειογένεση [21] – [24]. Η αγγειογένεση είναι μια διαδικασία σχηματισμού νέων αιμοφόρων αγγείων από προϋπάρχοντα αυτά, και παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου [25]. Οι αναστολείς της αγγειογένεσης που χρησιμοποιούνται στην θεραπεία NSCLC. Το μονοκλωνικό αντίσωμα μπεβασιζουμάμπη σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία είναι εγκεκριμένο από τον FDA ως θεραπευτική επιλογή σε μεταστατικό μη-πλακώδες NSCLC ασθενείς, και πολλοί αναστολείς της τυροσινικής κινάσης αντιαγγειογενετικοί υπόσχεται [3], [26].

Τα πρώτα στοιχεία δείχνει Mirs στη ρύθμιση της αγγειογένεσης προήλθε από Dicer knockout ποντικών. Dicer είναι ένα κρίσιμο ένζυμο στην σύνθεση miR. Οι ποντικοί Dicer ελλειμματικές πέθανε νωρίς κατά την ανάπτυξη, λόγω της λέπτυνση των αγγειακών τοιχωμάτων και σοβαρή αποδιοργάνωση του δικτύου των αιμοφόρων αγγείων [27]. Εκτός αυτού, μια άλλη μελέτη ποντικών έδειξαν ότι ένα υποσύνολο των Mirs μεταβληθεί κατά τη διάρκεια της αγγειογενετική διακόπτη έγινε αντίθετα ρυθμιζόμενη ως απάντηση στην αντι-αγγειογενετική θεραπεία [23].

Σε ένα μεγάλο μη επιλεγμένα NSCLC ομάδα έχουμε ήδη μελετήσει την προγνωστική επίπτωση της διάφορους βασικούς αγγειογόνους αυξητικούς παράγοντες και υποδοχείς όπως επίσης και ο προγνωστικός ρόλος του miR-155 και miR-126 από

in situ υβριδισμού

[28] – [38]. Στο παρόν, δεν αξιολόγησε τα προφίλ έκφρασης του miR στον NSCLC χρησιμοποιώντας ιστό από επιλεγμένους ασθενείς από αυτή την ομάδα. Έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει ενδιαφέροντα σχετίζονται με την αγγειογένεση υποψήφιοι miR για περαιτέρω το δυναμικό μεγάλης κλίμακας και σε βάθος μελέτες.

Αποτελέσματα

Ασθενείς

Δημογραφικά, κλινικά και ιστοπαθολογικά μεταβλητές σε οι ομάδες ασθενών (μακρύ DSS, σύντομη DSS και έλεγχοι) φαίνονται στον πίνακα 1. Η μέση DSS ήταν 8.0 (εύρος 06.05 – 09.09) μηνών και 160,5 (εύρος 60,5 έως 184,3) μήνες στην ομάδα χαμηλής και υψηλής DSS, αντίστοιχα. Υπήρχαν τέσσερις αδενοκαρκινώματα και έξι καρκινώματα πλακωδών κυττάρων σε κάθε ομάδα.

Η

Micro έκφραση RNA ανάλυση

Από 281 Mirs, το Σχήμα 1 δείχνει τον αριθμό και την κατανομή των 128 διαφορικά εκφρασμένων Mirs σημαντική σε διάφορες συγκρίσεις στη μελέτη (P & lt? 0,1 προσαρμοσμένο για ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη, FDR). Το αντίστοιχο -up και κάτω-ρυθμίζονται οι (-1,1) Mirs παρουσιάζονται στον Πίνακα S1. miR-182 ήταν η μόνη miR μεταβληθεί σε όλους τους τρεις συνδυασμούς? κανονική έναντι μικρής DSS, κανονική σχέση με μακρά DSS και μικρή σε σχέση με μακρά DSS. Μια ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) (Εικόνα 2Α) σε ολόκληρο το σύνολο του δείγματος των τιμών έκφρασης αποκάλυψε ότι η βασική αρχή συνιστώσα της διακύμανσης χωρίζει φυσιολογικά δείγματα από τα δείγματα NSCLC. Για να τονίσει τη διαφορά μεταξύ των ομάδων των δειγμάτων όγκου NSCLC μερική ελαχίστων τετραγώνων (PLS) μοντέλο γέφυρα χρησιμοποιήθηκε για να εξαγάγετε ένα υποχώρο όπου οι διαφορές της ομάδας είναι περισσότερο εμφανής από ό, τι στο PCA (Εικόνα 2Β). Ο Πίνακας 2 παρουσιάζει τις δέκα Mirs με την υψηλότερη φορές αλλαγή κατηγοριοποιήθηκαν σε ομάδες μακράς επιβίωσης έναντι των φυσιολογικών ελέγχου και μικρή επιβίωση σε σχέση με την κανονική ελέγχου. Ο Πίνακας 3 δείχνει τις Mirs με την υψηλότερη αλλαγή φορές σε σύντομο σε σχέση με μακρύ ομάδες επιβίωσης

Το διάγραμμα Venn δείχνει τον αριθμό όλων των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs σε διάφορες συγκρίσεις:. Ιστών από ασθενείς με NSCLC με μικρή επιβίωση έναντι των ιστών από ασθενείς με NSCLC με μακρά επιβίωση, ιστός από φυσιολογικό πνεύμονα έναντι ιστό από ασθενείς με NSCLC με μακρά επιβίωση και ιστό από φυσιολογικό πνεύμονα έναντι ιστό από ασθενείς με NSCLC με σύντομη επιβίωση. Από 281 Mirs αξιολογήθηκαν, ο αριθμός των διαφορικών εξέφρασε Mirs με FDR προσαρμοστεί P & lt?. 0.1 (σύνολο n = 128) της κάθε σύγκρισης ενδείκνυται

Η

(Α) Δύο διαστάσεων PCA της Mirs, που προέρχεται από 20 ασθενείς με NSCLC και 10 δείγματα ιστού από φυσιολογικά πνευμονικό ιστό, που δείχνει τον διαχωρισμό των δύο δειγμάτων ομάδες. (Β) Το οικόπεδο απεικονίζει τα συστατικά 1 και 2 του PLS μοντέλο που χρησιμοποιείται ο χρόνος επιβίωσης ως κριτήρια βαθμολόγησης. Η ανάλυση διαχωρίζει σαφώς τις ομάδες δείγμα ιστού για μικρές και μεγάλες επιβίωση των ασθενών με NSCLC. Όλα τα δείγματα είναι χρώμα που κωδικοποιείται σύμφωνα με την ομάδα: Μαύρο: Κανονική δείγματα ασθενών? πράσινο: Τα δείγματα από ασθενείς με μικρή επιβίωση? κόκκινο:. Τα δείγματα από ασθενείς με μακρά επιβίωση

Η

Η

Διαδρομή ανάλυση

Ο Πίνακας 4 δείχνει τα αποτελέσματα από το GSEA. Το σύνολο γονιδίων που συνδέονται με 31 Mirs σχετίζονται με την αγγειογένεση αποκάλυψε την υψηλότερη γονίδιο που ονομαστική βαθμολογίας εμπλουτισμού (NES = -1,17, ονομαστική τιμή p 0,28, FDR 0). Το Σχήμα 3 δείχνει το χάρτη θερμότητα που αντιπροσωπεύουν 31miRs συνδέεται με την αγγειογενετική σετ γονίδιο.

Η διαφορά στην έκφραση miR μεταξύ δείγματα όγκων από ασθενείς με NSCLC με μακρά (L) και βραχέα (S) επιβίωση δείχνεται. Οι τιμές έκφραση του miR εμφανίζεται σε ένα φάσμα, όπου ρυθμίζεται προς τα κάτω είναι μπλε και up-ρύθμιση είναι κόκκινο.

Η

επικύρωση PCR

οικόπεδα διασποράς σύγκριση υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών και τα στοιχεία qPCR από οι 28 επιλέγονται Mirs φαίνεται στο Σχήμα 4. Το συμπεριλαμβανόμενο Mirs, και τα δεδομένα από όλες τις τρεις συνδυασμούς (τόσο υβριδισμό και qPCR) που παρατίθενται στον πίνακα S2. Υπήρχαν ισχυρές και σημαντική συσχέτιση μεταξύ του υβριδισμού και δεδομένων qPCR: Σύντομη έναντι κανονικών r = 0,81, Ρ & lt? 0,001? μακρά σχέση με την κανονική r = 0,85, P & lt? 0.001? μικρή σε σχέση με μακρά r = 0,85, P & lt?. 0.001

Σύγκριση μεταξύ της υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών (dLMR, η διαφορά στο μέσο όρο επίπεδα έκφρασης μεταξύ των ομάδων του δείγματος, η κλίμακα log2) και qPCR (ddCP, η διαφορά στο μέσο όρο επίπεδα έκφρασης μεταξύ των ομάδων του δείγματος, κλίμακα log2) τα δεδομένα, ο συντελεστής συσχέτισης = r (Pearson): (Α) χαμηλή σε σχέση με την κανονική r = 0,81, P & lt? 0.001? (Β) υψηλή σε σχέση με την κανονική r = 0,85, P & lt? 0.001? (C) υψηλά έναντι χαμηλών r = 0,85, P & lt? 0.001. Στο κόκκινο? miR-150.

Η

ανάλυση συσχέτισης μεταξύ αγγειογενετική δείκτες και miR-155

Έχουμε ήδη δημοσιευθεί σχετικά με την προγνωστική επίδραση του miR-155 σε μεγάλες (335 ασθενείς) μας NSCLC πληθυσμού [ ,,,0],37]. Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ miR-155 και πολλά γνωστά αγγειογενετική δείκτες. Οι ίδιες τιμές αποκοπής όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί χρησιμοποιήθηκαν για FGF2 και miR-155 [33], [37]. Σχήμα S1 δείχνει

in situ υβριδισμού

ανάλυση (ISH) του NSCLC αντιπροσωπεύουν ισχυρά και ασθενή εντάσεις για κύτταρο όγκου miR-155 έκφρασης, καθώς και αρνητικοί και θετικοί έλεγχοι. Ο Πίνακας 5 δείχνει τη συσχέτιση μεταξύ αγγειογενετική δεικτών [αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα – Α (VEGF-A), προερχόμενος από αιμοπετάλια παράγοντας – B (PDGF-Β), ο HIF-1α και αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών 2 (FGF2)] και miR-155. miR-155 συσχετίζεται σημαντικά με FGF2 στη συνολική ομάδα (r = 0,17, P = 0,002), αν και πιο σημαντικό στην υποομάδα με κομβικό μετάσταση (r = 0,34, P & lt? 0.001). Οι crosstabs στον Πίνακα 6 και Πίνακα 7 δείχνουν τη συσχέτιση και την κατανομή των υψηλών και χαμηλών έκφραση των FGF2 και miR-155.

Η

Η

Συζήτηση

Για τις γνώσεις μας , αυτή είναι η πρώτη NSCLC miR έκφραση προφίλ μελέτη που δείχνει μια σειρά γονιδίων που συνδέονται με Mirs αγγειογένεση που σχετίζονται με την υψηλότερη επίπτωση στην ανάλυση μονοπάτι. Συνεπής με προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες παρατηρούμε σημαντικές διαφορές στα προφίλ miR μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών ιστών και μεταξύ των δειγμάτων από ασθενείς με κακή σχέση με ένα ευνοϊκό DSS. Αρκετές από αυτές τις σημαντικές αλλαγμένη Mirs σχετίζονται με την αγγειογένεση και είναι ενδιαφέρον υποψήφιο δείκτες για περαιτέρω αξιολόγηση. Με την επικύρωση ενός από αυτούς τους δείκτες, miR-155, σε μία ομάδα από 335 ασθενείς με ΜΜΚΠ, θα βρούμε αυτό το miR για πρώτη φορά να σχετίζεται σημαντικά με το γνωστό αγγειογενετική FGF2 δείκτη.

Οι κυριότερες αδυναμίες της η μελέτη στην έρευνα για νέες υποψήφιες δείκτες είναι η σχετικά ανομοιογενής πληθυσμός της μελέτης και ο χαμηλός αριθμός των ασθενών που συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. Πολλά από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στο παρόν είναι επομένως οριακά μόνο σημαντική (ή μερικά μόνο δείχνει μια τάση) και περαιτέρω επικύρωση σε ένα μεγαλύτερο σύνολο NSCLC, όπως γίνεται για το miR-155, αποτελεί προϋπόθεση για την πιο σταθερή συμπεράσματα. Αυτό είναι ιδιαίτερα η περίπτωση όταν συγκρίνονται σημαντικές διαφορές μεταξύ των ιστών του όγκου (μακρά έναντι μικρής επιβίωσης) ως εκεί, σε γενικές γραμμές, είναι μεγαλύτερες διαφορές μεταξύ ιστών όγκου και φυσιολογικών ελέγχων. Οι φορές οι αλλαγές είναι κατά μέσο όρο υψηλότερες και οι τιμές p ισχυρότερη στον Πίνακα 2 (ιστού του όγκου σε σχέση με την κανονική τους ελέγχους) σε σύγκριση με τον Πίνακα 3 (μακρύ έναντι μικρής επιβίωσης). Από κλινική άποψη, τουλάχιστον όταν πρόκειται για Mirs ως πιθανοί προγνωστικοί ή προγνωστική δείκτες, Mirs με αλλοιωμένη έκφραση μεταξύ βραχυπρόθεσμων έναντι των μακροπρόθεσμων ομάδα επιβίωσης παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Ως εκ τούτου, έχουμε διερευνήσει τη βιβλιογραφία σχετικά με τέσσερις Mirs που σχετίζονται με την αγγειογένεση από τον Πίνακα 3 (miR-106a, miR-155, miR-182 και miR-424) και να επικυρώνονται miR-155 σε ένα μεγάλο σύνολο των ασθενών με NSCLC. Επιπλέον θέλαμε να αναδείξει τις πιθανές επιπτώσεις της miR-21, miR-126 και miR-210 από τον Πίνακα 2, καθώς υπάρχουν πειστικές αναφορές δείχνουν αυτά τα Mirs να έχει πιθανές επιπτώσεις στην αγγειογένεση. Εκτός αυτού, έχουμε δείξει στο παρελθόν miR-126 να έχουν προγνωστική επίπτωση στον NSCLC ομάδα μας [38].

Ενίσχυση αποτελέσματα μας είναι ισχυρές και σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των δεδομένων υβριδοποίησης μικροσυστοιχιών και τα ίδια Mirs επικυρωθεί από qPCR. Περαιτέρω, τα αλλοιωμένα εκφράσεις miR σε όγκο έναντι κανονικού ιστού είναι σε μεγάλο βαθμό συμφωνεί με προγενέστερα δημοσιευθείσες μελέτες NSCLC miR [15] – [17], [20] και όπως συζητήθηκε στο ακόλουθο εκεί συνεχώς νέα λογοτεχνία προστίθεται, υποστηρίζοντας υποψήφιος μας Mirs να εμπλέκονται στην αγγειογένεση.

Λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει την επίδραση των οδών που σχετίζονται με τους στόχους του γονιδίου miR σε NSCLC. Η ερμηνεία αυτών των αναλύσεων δεν είναι ευθεία εμπρός και τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τα οποία στοχεύουν τα γονίδια που συνδέονται με τις Mirs και τα οποία Mirs συνδέονται με τις διαφορετικές οδούς υψηλά. Επιπλέον Mirs είναι συχνά πολυλειτουργικό και το ίδιο miR μπορούν να στοχεύουν ποικίλα γονίδια σε διαφορετικά μονοπάτια, και ένα γονίδιο μπορεί να αποτελούν αντικείμενο πολλών Mirs. Αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική, ο GSEA κυμαινόταν αγγειογένεση ως το πιο σημαντικό μονοπάτι σε δείγματα NSCLC μας. Υπάρχουν αρκετές νέες αναφορές που συνδέουν ειδικές Mirs σε αγγειογένεση που υποστηρίζουν τα ευρήματα μας [23], [24], [39] – [42]. Εκτός αυτού, Raponi et al. έχουν δείξει ότι η οδός που σχετίζονται με αγγειογένεση αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGF) είχαν σημαντική γονίδιο εμπλουτισμό σε πλακώδη NSCLC [17].

Σε μια ολοκληρωμένη μελέτη ποντικού, Olson et al. προσδιορίζονται συγκεκριμένες miR υπογραφές έκφραση που σχετίζεται με τα βήματα στην ογκογένεση και διαφορετικά χαρακτηριστικά του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης [23]. Ανασταλτική της αγγειογένεσης Mirs υπογραφή αξιολογήθηκαν από τεχνική qPCR και ορίζονται ως τα Mirs μεταβάλλονται σημαντικά σε κανονικά έναντι πρωτογενείς όγκους sunitinib επεξεργασμένο με & gt? 1,3 φορές αλλαγή [23]. Το sunitinib είναι ένας αναστολέας τυροσινικής κινάσης στόχευσης αγγειακού ενδοθηλιακού υποδοχέα παράγοντα ανάπτυξης (VEGFR), προερχόμενο από αιμοπετάλια αυξητικού παράγοντα (PDGFR) και c-Kit. Σύμφωνα με qPCR αποτελέσματα επικύρωσης μας, τα δεδομένα PCR σε γενικές γραμμές δείχνουν συχνά αυξημένο φορές αλλαγή σε σύγκριση με τα δεδομένα υβριδισμού. Πολλά από τα Mirs που σχετίζονται με αγγειογένεση παρατηρείται με Olson και τους συνεργάτες του, επίσης, μεταβάλλονται σημαντικά σε υλικό μας [23]. Ανάμεσα στα πιο ενδιαφέροντα Mirs σχετίζονται με την αγγειογένεση μεταβληθεί σημαντικά και στις δύο μελέτες βρίσκουμε miR-126, το miR-155 και miR-21 και miR-424.

miR-126 έχει πρόσφατα αναθεωρηθεί ως σημαντικός παίκτης στην αγγειογένεση [43] και Wang et al. έδειξαν σε ένα μοντέλο ποντικού που ενισχύει τις προ-αγγειογόνος δράσεις του VEGF και FGF με καταστολή της έκφρασης του απλώθηκε-1, μία ενδοκυτταρική αναστολέας της αγγειογόνου σηματοδότηση [44]. miR-126 έχει επίσης βρίσκεται μέσα στην περιοχή παράγοντα όπως επιδερμικού αυξητικού 7 (EGFL7) γονίδιο. EGFL7 μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση με την προώθηση σηματοδότησης VEGF και αγγειακή ακεραιότητα [45]. Επιπλέον, έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η έκφραση miR-126 συνδέεται σημαντικά με VEGF-A σε NSCLC [38]. Περαιτέρω, παρατηρήσαμε ότι η προγνωστική επίδραση του miR-126 σχετίζεται με ιστολογική υποτύπους και κομβικών κατάστασης. Επιπλέον, η έκφραση και οι ρόλοι του miR-126 μπορεί να είναι διαφορετική σε διάφορες κακοήθειες [23].

miR-155 είναι ένα από τα πιο Mirs εμπλέκονται με συνέπεια σε νεοπλασματική νόσο [46], αλλά με τις γνώσεις μας, δεν έχουν σχέση με την αγγειογένεση πριν από τη μελέτη από Olson και τους συνεργάτες του [23]. Έχει αναφερθεί ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε διάφορες μελέτες ανθρώπινο NSCLC [15], [17], [20], και ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ένα μοντέλο ποντικού κατά τη χρήση του sunitinib αναστολέα αγγειογενετική [23]. Σε δεδομένα συστοιχία μας, miR-155 έτεινε να μεταβάλλεται σημαντικά μεταξύ των ομάδων βραχείας και μακράς επιβίωσης (Πίνακας 3) και ήταν σημαντικά υπερ-εκφράζεται σε όγκο έναντι φυσιολογικό ιστό στο σύνολο επικύρωσης qPCR. Έχουμε αναφέρει την προγνωστική επίδραση του miR-155 να συνδέεται με την ιστολογική υποτύπους και κομβικά κατάσταση, αλλά δεν συνδέουν αυτά τα αποτελέσματα να αγγειογενετική δείκτες [37]. Με βάση τα νέα αυτά δεδομένα θα εξεταστεί τώρα αν το miR-155 συσχετίζεται με γνωστό αγγειογενετική /υποξικής παραμέτρους όπως VEGF-A, PDGF-Β, HIF-1α και FGF2. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε, για πρώτη φορά, miR-155 να συνδέεται σημαντικά με FGF2 με την υψηλότερη επίπτωση στην υποομάδα N + NSCLC. Αν και FGF2 έχει πολλές λειτουργίες, είναι ένας σημαντικός παίκτης στην αγγειογένεση. Στην πραγματικότητα, miR-155 επίσης έτειναν να συσχετίζονται με VEGF-A στην υποομάδα N +. miR-155 ήταν ένα από τα πρώτα Mirs να σχετίζεται με την ανάπτυξη NSCLC και περαιτέρω μελέτες θα είναι σημαντική, προκειμένου να διερευνήσει τις δυνατότητες αγγειογενετική λειτουργία του.

Σε αυτή τη μελέτη, miR-21 είναι σημαντικά up-ρυθμίζονται σε όγκο έναντι φυσιολογικό ιστό (Πίνακας 2), υποστηρίζοντας προηγούμενες εκθέσεις NSCLC [15], [17], [20] και της παρατηρούμενης κάτω ρύθμιση μετά αντι-αγγειογενετική θεραπεία [23]. miR-21 έχει επίσης βρεθεί να είναι άκρως εκφρασμένη σε ενδοθηλιακά κύτταρα [24]. Σε μια πρόσφατη μελέτη από τους Liu et al., MiR-21 υπερεκφράζεται με επιμόλυνση προ-miR-21 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη και την αγγειογένεση των όγκων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κοτόπουλο χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη [47]. Βρήκαν ότι η υπερέκφραση του miR-21 σε κύτταρα DU145 αύξησε την έκφραση του HIF-1α και VEGF, και επαγόμενη αγγειογένεση όγκου. Καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι το miR-21 επάγει την αγγειογένεση των όγκων μέσω της στόχευσης PTEN, που οδηγεί στην ενεργοποίηση της ΑΚΤ και οδών σηματοδότησης ERK1 /2, και ενισχύοντας έτσι HIF-1α και της έκφρασης του VEGF. Οι ίδιες πορείες που περιγράφονται ως σημαντικά στην ανάπτυξη NSCLC, καθώς και [48], και περαιτέρω μελέτες για την αντιμετώπιση αυτής της σχέσης με το miR-21 στον καρκίνο του πνεύμονα θα ήταν ενδιαφέρον.

Η μελέτη Olson δείχνει miR-424 είναι που εμπλέκονται στην αγγειογένεση καθώς αυτό miR ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω μετά την επεξεργασία με sunitinib [23]. Επιπλέον, Ghosh et al. έχουν μελετήσει αυτό το miR και περιγράφεται ότι η υποξία που προκαλείται από την έκφραση του miR-424 σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ρυθμίζει HIF-α ισομορφές και προάγει την αγγειογένεση [49]. Περαιτέρω προτείνουν miR-424 για να παίξει ένα σημαντικό φυσιολογικό ρόλο στην μετα-ισχαιμική αγγειογένεση. Σε αντίθεση, Nakshima et al. ανέφεραν τα κάτω ρύθμιση του miR-424 να συνεισφέρουν στην ανώμαλη αγγειογένεση μέσω ΜΕΚ1 και κυκλίνης Ε1 σε γεροντική αιμαγγείωμα, επιδεικνύοντας τις δυνατότητες του ιστού και το στάδιο συγκεκριμένες επιπτώσεις της ίδιας miR [50]. Στη μελέτη μας, miR-424 δεν μετεβλήθη κατά τη σύγκριση του όγκου με φυσιολογικό ιστό, αλλά ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε ιστό από ασθενείς με κακή πρόγνωση σε σύγκριση με ιστό από ασθενείς με ευνοϊκή πρόγνωση (Πίνακας 3). Υπάρχει σε γνώση μας καμία δημοσιευμένη μελέτη η οποία έχει διερευνηθεί η προγνωστική επίδραση του miR-424 στον καρκίνο. Ωστόσο, δεδομένου ότι υπάρχει μια σημαντική miR-424 πάνω ρύθμιση στην κακή προγνωστική ομάδα θα ήταν ενδιαφέρον να αξιολογηθεί περαιτέρω το δείκτη σε μια μεγάλης κλίμακας μελέτη NSCLC.

Μια άλλη σημαντική up-ρυθμιζόμενη δείκτη στο υλικό μας είναι miR-210 (Πίνακας 2), το οποίο προηγουμένως έχει σχέση με την αγγειογένεση [41], [51], [52]. miR-210 πάνω ρύθμιση πιστεύεται ότι είναι ένα κρίσιμο στοιχείο των ενδοθηλιακών κυττάρων απόκρισης στην υποξία και επομένως δυνητικά σημαντικό στην αγγειογένεση των όγκων. Αυτό το miR έχει πρόσφατα αναθεωρηθεί από Devlin et al. [51], συμπεραίνοντας ότι miR-210 είναι μια ισχυρή στόχος του παράγοντα υποξία και ότι η υπερέκφραση του έχει ανιχνευθεί σε μία ποικιλία καρδιαγγειακών παθήσεων και συμπαγών όγκων. Σε κυτταρικές σειρές NSCLC, miR-210 έχει αναφερθεί ότι μεσολαβεί μιτοχονδριακή αλλοιώσεις που συνδέονται με την διαμόρφωση του HIF-1 δραστηριότητα [52]. Ωστόσο, ένα μεγάλο μέρος της λειτουργικής και προγνωστική επίδραση του miR-210 σε NSCLC παραμένει άλυτο.

miR-182 περιλαμβάνεται στην οδό αγγειογένεση στον GSEA, εν μέρει επειδή υπόστρωμα υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών 2 (FRS2) είναι ένα από τα γονίδια στόχους της. FRS2 είναι ένας κύριος ρυθμιστής του μονοπατιού παράγοντα ανάπτυξης ινοβλαστών που έχουμε και άλλοι έχουν δείξει ότι είναι σημαντικές στην εξέλιξη NSCLC, ενδεχομένως διεγείροντας την αγγειογένεση [33], [53]. Είναι ενδιαφέρον ότι, miR-182 ήταν το μόνο miR μεταβάλλονται σημαντικά σε όλους τους τρεις συνδυασμούς, όπως φαίνεται στο διάγραμμα Venn (Σχήμα 1). up-ρύθμιση του σε όγκο (τόσο φτωχή και ευνοϊκές προγνωστική ομάδα, Πίνακας 2), σε σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό, είναι συνεπής με την προηγούμενη μελέτη από Raponi et al. [17]. Επιπλέον, miR-182 είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε σύντομο Σ.Α.Τ. έναντι των ασθενών μακράς DSS (Πίνακας 3). Ωστόσο, Barchack et al. παρατηρήθηκε υψηλότερη έκφραση του miR-182 σε πρωτογενείς όγκους σε σχέση με τις μεταστατικούς όγκους του πνεύμονα, υποδεικνύοντας ότι το miR-182 έκφρασης μπορεί να φθάσει στο ανώτατο σημείο το πρώιμο στάδιο NSCLC.

Παρατηρούμε την ίδια τάση για miR-106a, το οποίο έχει φαίνεται να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα κατά την υποξία σε καρκίνο του μαστού και του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές [40]. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, miR-106a ήταν ρυθμισμένη σε NSCLC [16], [17], [20]. Παρατηρούμε επίσης έκφραση του να αυξηθεί σημαντικά σε όγκους έναντι των φυσιολογικών ελέγχων (Πίνακας 2). Όσο για miR-182, miR-106a αυξήθηκε περαιτέρω σε ιστό από ασθενείς με μια σύντομη επιβίωση και όχι μακρά επιβίωση (Πίνακας 3).

Όπως ήταν αναμενόμενο, πολλοί Mirs είναι γνωστό ότι σχετίζονται με την αγγειογένεση είχαν δεν μεταβάλλονται σημαντικά στη μελέτη μας. Cluster miR-17-92 (miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a, miR-19a, miR-19b, miR-20a και miR92-1), ας-7, αφήστε-7F, ΜΙΚ 27β, miR-15b, miR-16, miR-92a, miR-99a, miR-130a, miR-214, miR-221, miR-222 και miR-296, καθώς και μερικά από τα Mirs παρουσιάζονται στο χάρτη θερμότητας ( Σχήμα 3), δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά ή εμφάνισαν μόνο μικρές μεταβολές φορές [24], [39], [41], [42]. Αυτή η έλλειψη σημαντικών αλλαγών μπορεί να οφείλεται σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα, καθώς υπάρχουν λίγοι ασθενείς σε κάθε ομάδα. Επιπλέον, όπως πολλοί Mirs φαίνεται να είναι ιστός και το στάδιο συγκεκριμένες, ορισμένες από αυτές τις Mirs μπορεί εναλλακτικά να ασκήσει επίδραση περιορίζεται σε υποομάδες εκτομή NSCLC ή μπορεί να είναι σημαντική σε άλλες κακοήθειες.

Οι αναστολείς της αγγειογένεσης σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία εγκατεστημένος ως θεραπεία NSCLC, αλλά μια περαιτέρω γνώσεων σχετικά με τη βιολογία, μηχανισμοί δράστες και προγνωστική και προβλεπτική δείκτες είναι δικαιολογημένη. Mirs είναι σταθερές και δυνητικά μετρήσιμη στο χαρτί και στον ορό. Αρκετές Mirs συνδέονται με την αγγειογένεση και η μελέτη αυτή υποστηρίζει την υπόθεση ότι ένας αριθμός Mirs που σχετίζονται με αγγειογένεση είναι δυνητικά σημαντικά στην εξέλιξη της NSCLC. Προτείνουμε miR-21, miR-106a, miR-126, το miR-155, miR-182, miR-210 και miR-424 να είναι από τις πιο ενδιαφέρουσες υποψηφίων. Από Mirs συχνά στάδιο και ειδικά των ιστών, οι μεγάλης κλίμακας μελέτες δικαιολογείται να διερευνήσει περαιτέρω προγνωστική και προβλεπτική επιπτώσεις τους. Εκτός από το ίδιο miR έχει συχνά πολλαπλά γονίδια-στόχους και διαφορετικές λειτουργίες. Ως εκ τούτου, λειτουργικές μελέτες είναι ιδιαίτερα απαραίτητη για να αποκτήσουν καλύτερη εικόνα για βιολογικές τους λειτουργίες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη έχει εγκριθεί από το Εθνικό Συμβούλιο Ελέγχου Δεδομένων, Η περιφερειακή Επιτροπή για την Έρευνα Ηθικής και Βιοτράπεζα Συλλογή Διοικητικού ιστών. θεωρήθηκε πληροφοριών και η επακόλουθη γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς ή πλησιέστερων συγγενών, αλλά αυτό ήταν μια αναδρομική μελέτη με περισσότερους από τους μισούς ασθενείς θανόντος, κάποιοι περισσότερο από δέκα χρόνια, η Περιφερειακή Επιτροπή για την Έρευνα Ηθικής παραιτηθεί ρητά την ανάγκη για συναίνεση.

ασθενείς και δείγματα ιστών

από μια προηγουμένως καλά περιγραφείσες μεγάλο NSCLC κοόρτης [30], είκοσι μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και (FFPE) δείγματα καρκινικού ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη ελήφθησαν από ασθενείς με διάγνωση σταδίου Ι -IIIA στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Βόρειας Νορβηγίας (UNN) και Nordland Κεντρικό Νοσοκομείο (NLCH). Αυτά ήταν δέκα ασθενείς με μια σύντομη ασθένεια, ειδικά επιβίωσης (DSS) (NSCLC_01 – NSCLC_10), και δέκα ασθενείς με χρόνια DSS (NSCLC_11 – NSCLC_20). Επιπλέον, τα δείγματα από την κανονική τοποθεσίες πνευμονικό ιστό σε δέκα ασθενείς με ΜΜΚΠ (NSCLC_01, NSCLC_02, NSCLC_06, NSCLC_11, NSCLC_12, NSCLC_13, NSCLC_15, NSCLC_16, NSCLC_18 και NSCLC_19) συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη (NORM_01 – NORM_10). Τέσσερις πυρήνες του δείγματος, το καθένα 0,6 mm σε διάμετρο, από βιώσιμες περιοχές όγκου από κάθε όγκο και φυσιολογικό δείγμα λήφθηκαν και συνενώθηκαν πριν από την απομόνωση του RNA, ώστε να ληφθεί ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα του κάθε ασθενούς. Μεγάλες και μικρές ομάδες DSS στρωματοποιήθηκαν, προκειμένου να πάρει την ίση κατανομή των φύλων και την ιστολογική εξέταση. Τα δείγματα όγκων ήταν αποθηκευμένα στα Τμήματα Παθολογίας UNN και NLCH, οργάνωσαν σύμφωνα με την ταξινόμηση ΤΝΜ Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου (UICC), και ιστολογικά υποτύπου σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας [54], [55]. Όλο το υλικό ασθενής εξετάστηκε από δύο ανεξάρτητους και εκπαιδευμένο παθολόγους (SAS και KAS). Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την επέμβαση. Πλήρη στοιχεία των ασθενών λήφθηκε από ιατρικά αρχεία, συμπεριλαμβανομένων των δεδομένων των δημογραφικών, κλινικών, τη θεραπεία και την έκβαση.

απομόνωση RNA

Το RNA απομονώθηκε από τα συλλεχθέντα δείγματα πυρήνα, χρησιμοποιώντας την ανακτήσει όλα ™ Σύνολο νουκλεϊκών οξέων Απομόνωση Kit για FFPE ιστούς (Ambion, Austin, ΤΧ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, με κάποιες μικρές προσαρμογές. θεραπεία Ξυλόλιο αυξήθηκε από 3 λεπτά έως 8 λεπτά, και η θεραπεία της πρωτεάσης αυξήθηκε από 3 ώρες έως περίπου 20 ώρες. την ποιότητα και την ποσότητα του RNA εκτιμήθηκε με τη χρήση του NanoDrop 1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) και την περαιτέρω επαλήθευση από Agilent 2100 προφίλ Bioanalyzer.

διαδικασίες μικροσυστοιχιών

Το συνολικό RNA (700 ng ) από το δείγμα αναφοράς και σημάνθηκε με Hy3 ™ και την ετικέτα φθορισμού hY5 ™ χρησιμοποιώντας το miRCURY

Tm LNA Array κιτ επισήμανσης ισχύος (Exiqon, Vedbaek, Denmark) ακολουθώντας τη διαδικασία που περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Η Hy3 ™ -επισημασμένο δείγματα και hY5 ™ σημασμένα RNA δείγματος αναφοράς (που περιέχει μια ίση ποσότητα του όλων των ειδών RNA που περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη) αναμείχθηκαν κατά ζεύγη και υβριδίστηκαν με τον miCURY

Tm LNA Array έκδοση 5

ης γενιάς (Exiqon, Δανία), η οποία περιέχει ανιχνευτές σύλληψης που στοχεύουν όλα τα ανθρώπινα miRNAs είναι νηολογημένα στην έκδοση miRBASE 14.0 στο Ινστιτούτο Sanger. Ο υβριδισμός διεξήχθη σύμφωνα με το εγχειρίδιο συστοιχία miRCURY ™ LNA χρησιμοποιώντας ένα σταθμό υβριδοποίησης Tecan HS4800 (Tecan, Αυστρία). Μετά τον υβριδισμό οι αντικειμενοφόρες μικροσυστοιχιών σαρώθηκαν και αποθηκεύθηκαν σε ένα ελεύθερο περιβάλλον όζοντος (επίπεδο όζοντος κάτω του 2,0 ppb), προκειμένου να αποφευχθεί το δυναμικό λεύκανση των φθορίζουσες χρωστικές. Τα πλακίδια μικροσυστοιχιών Array miCURY ™ LNA σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας την Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies Inc., USA) και η ανάλυση εικόνας διεξήχθη με τη χρήση του λογισμικού ImaGene 8.0 (BioDiscovery Inc., USA). Οι ποσοτικοί σήματα διόρθωση υποβάθρου με offset αξίας 10 και ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την παγκόσμια Lowess (Τοπικά Weighted Scatterplot Smoothing) αλγόριθμο παλινδρόμησης [56].

υποβολή Βάση δεδομένων του

δεδομένων μικροσυστοιχιών

Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών προετοιμάστηκαν σύμφωνα με τις ελάχιστες πληροφορίες για ένα πείραμα μικροσυστοιχιών (MIAME) συστάσεις [57] και έχει κατατεθεί στη βάση δεδομένων GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Ο αριθμός προσχώρηση GEO για την πλατφόρμα είναι GSE27705 και η μελέτη μπορεί να θεαθεί στο:. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27705

Ποσοτικοποίηση ώριμων miRNAs με πραγματικό χρόνο qPCR

Ένα ή περισσότερα από τα ακόλουθα κριτήρια χρησιμοποιήθηκαν κατά την επιλογή Mirs για την επικύρωση PCR? σημαντική P-αξίας, υψηλής αλλαγή φορές και /ή Mirs σχετίζονται με την αγγειογένεση. Πέντε δείγματα από κάθε ομάδα με επαρκή όγκο miR απομένει μετά την ανάλυση της σειράς χρησιμοποιήθηκαν στην επικύρωση PCR. Από τις 41 δοκιμάστηκαν Mirs, 28 Mirs ανιχνεύθηκαν σε 7 ή περισσότερα δείγματα και αναλύθηκαν. Η σταθερότητα των miRNAs ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα ελέγχθηκε με Exicon χρησιμοποιώντας το λογισμικό Normfinder. miR-423-5p ήταν ένα από τα συνιστώμενα miRNAs αναφοράς μαζί με το miR-150, miR-423-5p και miR-300. miR-300 αποκλείστηκε λόγω των πολύ χαμηλών επιπέδων εντοπίζονται. Περαιτέρω Normfinder βρέθηκε μεγάλη διακύμανση στην ΜΙΚ 150, ωστόσο miR-423-5p βρέθηκε να είναι η πιο σταθερή miRNA στην ρυθμίσετε τα δεδομένα και, κατά συνέπεια, χρησιμοποιείται ως σημείο αναφοράς. Όλα τα πειράματα σε πραγματικό χρόνο qPCR έγιναν από Exiqon, Vedbaek, στη Δανία. 10 ng RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε 10 μΐ αντιδράσεων χρησιμοποιώντας την miRCURY LNA ™ καθολική RT miR PCR, πολυαδενυλίωσης και κίτ σύνθεσης cDNA (Exiqon)? Κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία εις τριπλούν. cDNA αραιώθηκε 100 × και 4 ul χρησιμοποιήθηκε σε 10 υΐ αντιδράσεις PCR σύμφωνα με το πρωτόκολλο για miRCURY LNA ™ καθολική RT PCR miR? κάθε miR αναλύθηκε μια φορά από qPCR εις τριπλούν cDNA. Η ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε ένα LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Roche) σε 384 φρεατίων. LinRegPCR (έκδοση 11.5) λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης qPCR. Η μέση απόδοση της ενίσχυσης χρησιμοποιήθηκε για να διορθώσετε τις τιμές Πρώτες Cp.

Διαδρομή ανάλυση

Οι επιπτώσεις των διαφόρων οδών αξιολογήθηκαν από Γονιδιακή Ρύθμιση Ανάλυσης εμπλουτισμού (GSEA) που προέρχεται από πρωτεΐνη ανάλυση μέσω εξελικτική σχέση (ΠΑΝΘΉΡ). Το σύστημα ταξινόμησης PANTHER είναι ένα μοναδικό πόρο που ταξινομεί τα γονίδια από τα καθήκοντά τους, χρησιμοποιώντας δημοσιευμένες επιστημονικές πειραματικές αποδείξεις και εξελικτικές σχέσεις για να προβλέψει τη λειτουργία ακόμη και εν απουσία της άμεσης πειραματική απόδειξη. Το σύνολο γονίδιο ελήφθη από τη βάση δεδομένων MirDB (https://www.mirdb.org) (https://rnajournal.cshlp.org/content/14/6/1012.full), ο οποίος έχει συντάξει λίστες γονιδίων από μονοπάτια επιμέλεια στην η βάση δεδομένων PANTHER.

Μια πλήρης λίστα είναι διαθέσιμη στο https://mirdb.org/cgi-bin/pathway.cgi. miRNA σχολιασμού βασίζεται σε miRBase έκδοση 13 (https://www.mirbase.org/). ανάλυση GSEA διεξήχθη με τη χρήση της γλώσσας στατιστικών R (www.r-project.org) και το πακέτο GSEA για διαθέσιμες R σε https://www.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp.

Δεδομένα