Αφηρημένο

Η ανώμαλη ενεργοποίηση της β-κατενίνης /Tcf-4 σηματοδότηση έχει ενοχοποιηθεί για την ανθρώπινη καρκινογένεση, συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε τις επιδράσεις του από TCF 4 knockdown με β-κατενίνης knockdown στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, και τηςχημειοευαισθησίας σε SW480 και HCT116 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα χρησιμοποιώντας φορέα αδενοϊού μεσολάβηση μικρή φουρκέτα RNA (shRNA). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, σε σύγκριση με την β-κατενίνης knockdown, από TCF 4 knockdown πιο αποτελεσματικά το σχηματισμό ανέστειλαν αποικία, απόπτωση, και αυξημένη 5-FU και οξαλιπλατίνας κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Ερευνήσαμε περαιτέρω οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στα διάφορα αποτελεσματικότητες που παρατηρήθηκαν με β-κατενίνης και η TCF-4 knockdown σε καρκινικά κύτταρα κόλου. FOXO4 είναι ένα μέλος της υποοικογένειας των FOXO θηλαστικών μεταγραφικών παραγόντων forkhead και παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, και την επιδιόρθωση του DNA. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το επίπεδο πρωτεΐνης FOXO4 δεν άλλαξε μετά από θεραπεία με δύο β-κατενίνης και η TCF-4 shRNA. Ωστόσο, β-κατενίνης shRNA βρέθηκε να αυξάνει τη συσσώρευση των φωσφορυλιωμένων FOXO4 S193 και να μειώσει την έκφραση των γονιδίων στόχων FOXO p27kip1 και MnSOD, ενώ από TCF 4 shRNA έδειξε το αντίθετο αποτέλεσμα. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση με β-κατενίνης knockdown, από TCF 4 knockdown δείχνει καλύτερη αποτελεσματικότητα για την αναστολή του πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης του ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα, τα οποία μπορεί να σχετίζονται με αυξημένη FOXO4 μεταγραφική δραστικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι από TCF 4 είναι ένας ελκυστικός δυνητικός θεραπευτικός στόχος για τον ορθοκολικό καρκίνο θεραπεία

Παράθεση:. Xie J, Xiang ϋ-Β, Wang Η, Zhao C, Chen J, Xiong F, et al. (2012) Αναστολή της Tcf-4 επάγει την απόπτωση και ενισχύει χημειοευαισθησία καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 7 (9): e45617. doi: 10.1371 /journal.pone.0045617

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Πανεπιστήμιο Vanderbilt Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3η Απριλίου, 2012? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 24 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Xie et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30700978). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η κανονική μονοπάτι σηματοδότησης Wnt παίζει κεντρικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, από εμβρυϊκή ανάπτυξη σε ομοιόσταση ενήλικο ιστό [1]. Η δραστηριότητα αυτού του μονοπατιού σηματοδότησης καθορίζεται από την ποσότητα της β-κατενίνης που υπάρχουν στο κυτταρόπλασμα. Σε περίπτωση απουσίας του σηματοδότηση Wnt, κυτταροπλασματικής β-κατενίνης κανονικά διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα μέσω της συνεχούς ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση του β-κατενίνης, η οποία ρυθμίζεται από ένα συγκρότημα αποτελούμενο από καταστροφή αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC), συνθάση γλυκογόνου κινάσης 3β (GSK-3β), /αγωγίνης, κινάση καζεΐνης 1α (CK1α), και άλλες πρωτεΐνες που μεσολαβούν αυτές τις βιοχημικές αντιδράσεις. Η δέσμευση του Wnt πρωτεΐνες στην επιφάνεια του κυττάρου σύμπλοκο υποδοχέα Fz /LRP διευκολύνει την φωσφορυλίωση της κυτταροπλασματικής ουράς του LDL υποδοχέα που σχετίζονται με πρωτεΐνη (LRP) κυτταροπλασματική ουρά από GSK-3β [2]. Αυτό προκαλεί την αλληλεπίδραση του συμπλόκου Fz /LRP με Dishevelled (Dsh) και Axin, η οποία οδηγεί στην απενεργοποίηση του συμπλόκου καταστροφή, με αποτέλεσμα τη συσσώρευση του μη-φωσφορυλιωμένη β-κατενίνη στο κυτταρόπλασμα. Το συσσωρευμένο β-κατενίνης στη συνέχεια μετατοπίζεται στον πυρήνα και συνδέεται προς παράγοντες μεταγραφής Tcf /Lef να ρυθμίζουν προς τα κάτω γονίδια στόχους, όπως c-Myc και Κυκλίνη D1 [3] – [5].

Η παρεκκλίνουσα Wnt /β κατενίνης σηματοδότηση έχει αναφερθεί να συνεισφέρει σε διάφορες ανθρώπινες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος (CRC) [6], [7]. Το γονίδιο APC ή GSK-3β θέση φωσφορυλίωσης εντός του εξωνίου 3 του

β-κατενίνης

γονίδιο (

CTNNB1

) μεταλλάσσεται σε πολλά καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων CRC, με αποτέλεσμα το ενεργοποιημένο μεταγραφική δραστηριότητα του β-κατενίνης /Tcf σηματοδότηση [8]. Επιπλέον, πυρηνική μετατόπιση του β-κατενίνης σε CRC συνδέεται σημαντικά με την εξέλιξη του όγκου και κακή επιβίωση [9], [10]. Ως εκ τούτου, ο έλεγχος της β-κατενίνης ή /και τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης κατάντη στόχου της αντιπροσωπεύει έναν ιδανικό στόχο για θεραπευτικές του καρκίνου και χημειοπροφύλαξη [11], [12], [13] .Van de Wetering

κ.ά.

. ανέφεραν ότι knockdown του β-κατενίνης με μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (siRNAs) ή knockdown του TCF-4 με κυρίαρχο αρνητικό TCF-4 (dnTCF) ανέστειλαν αποτελεσματικά την δραστικότητα του TOPFlash TCF-reporter και επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και διακοπή της ανάπτυξης σε LS174T κόλου καρκινικά κύτταρα [14], [15]. Ωστόσο, Tang

et al.

Ανέφεραν ότι knockdown του TCF-4 με siRNAs αυξημένη ανάπτυξη κυττάρου σε DLD-1 καρκίνος παχέος εντέρου κύτταρα [16]. Αυτές οι αποκλίσεις δείχνουν ότι οι διάφορες κυτταρικές σειρές μπορεί να αντιδρούν διαφορετικά στην TCF-4 νοκ ντάουν.

FOXO4 είναι ένα μέλος της υπο-οικογένειας των παραγόντων των θηλαστικών μεταγραφής FOXO forkhead [17] που είναι σημαντικό σε μια ποικιλία μεθόδων, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού , διαφοροποίηση, την απόπτωση, την επιδιόρθωση του DNA, και η προστασία από το στρες [18]. Αποτελεί στόχο κατάντη ΑΚΤ και φωσφορυλιώνεται σε τρεις εξαιρετικά διατηρημένες σερίνης και θρεονίνης (Thr-28, Ser-193, και Ser-258) κατά την ενεργοποίηση ΡΚΒ /ΑΚΤ. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η β-κατενίνη δεσμεύεται με τον παράγοντα μεταγραφής FOXO, η οποία διαδραματίζει ογκοκατασταλτικό ρόλο σε μία ποικιλία καρκίνων. β-κατενίνης συνδέεται με FOXO και ενισχύει την μεταγραφική δραστηριότητα [19]. Επιπλέον, πρωτεϊνική κινάση cGMP εξαρτώμενη (PKG) αναστέλλει σηματοδότηση TCF σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με το φράξιμο έκφραση β-κατενίνης και την ενεργοποίηση FOXO4 [20]. Ως εκ τούτου, η β-κατενίνης φαίνεται να εξυπηρετεί διττό αποτέλεσμα εξισορροπώντας θετικό (μέσω τρισεκατομμυρίων κυβικών-4) και αρνητικό (μέσω FOXO4) ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης.

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι η προς τα κάτω παράγοντας μεταγραφής από TCF 4 είναι μια πιο ελπιδοφόρα θεραπευτικός στόχος από β-κατενίνης για τη θεραπεία της CRC. Στόχος μας ήταν να συγκρίνει τα αποτελέσματα της Tcf-4 νοκ ντάουν και β-κατενίνης νοκ ντάουν στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, και χημειοευαισθησία στο SW480 (μεταλλαγμένο

APC

, άγριου τύπου

CTNNB1

) και HCT116 (μεταλλαγμένο

CTNNB1

, άγριου τύπου

APC

) καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας σύντομο RNA φουρκέτας (shRNA). Δείχνουμε ότι σε σύγκριση με την β-κατενίνης knockdown, από TCF 4 knockdown αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, επάγει κυτταρική απόπτωση, και ενισχύει την χημειοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση του FOXO4 μεταγραφικής δραστικότητας.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και Αντιδραστήρια

SW480 και κύτταρα HCT116 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και διατηρήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 100 U /ml πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης υπό τυπικές συνθήκες καλλιέργειας. Η οξαλιπλατίνη, 5-φθοριοουρακίλη (5-FU), και μεθυλο θειαζολυλο τετραζολίου (ΜΤΤ) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Το πλασμίδιο pDC316-EGFP-U6 παρέχεται από φορέα γονιδιακής Technology Company Limited (VGTC, Πεκίνο, Κίνα) και το πλασμίδιο pBHGloxΔE1, 3Cre παρέχεται από Microbix Biosystems, Inc. (Microbix, Τορόντο, Καναδάς).

ανασυνδυασμένο αδενοϊό Φορείς

Με βάση τις αλληλουχίες cDNA (

β-κατενίνης

GenBank με αρ.

NM_001098209,

Tcf-4

GenBank με κανένα. NM_030756), ένα ειδικό ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων με μια σύντομη φουρκέτα και αρνητικής ακολουθίας ελέγχου σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν, και στη συνέχεια εισάγονται σε μία μικρή μεταφοράς πλασμιδίου pDC316-EGFP-U6 στις θέσεις ενζύμου περιορισμού BamH Ι και Hind III. Ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάστηκαν με τους ακόλουθους εκκινητές [21]:

Προώθηση της β-κατενίνης shRNA αστάρι

«- GATCCCGTGGGTGGTATAGAGGCTCTTCAAGAGAGAGCCTCTATACCACCCACTTTTTGGAAA-3 ‘, αντίστροφη β-κατενίνης shRNA αστάρι:. 5’-AGCTTTTCCAAAAAGTGGGTGGTATAGAGGCTCTCTCTTGAAGAGCCTCTATACCACCCACGG-3 «?

Προώθηση Tcf-4 shRNA Primer

5′-GATCCCCGGAGCGACAGCTTCATATGTTCAAGAGACATATGAAGCTGTCGCTCCTTTTTGGAAA-3 ‘, αντίστροφη Tcf-4 shRNA αστάρι:

5′-AGCTTTTCCAAAAAGGAGCGACAGCTTCATATGTCTCTTGAACATATGAAGCTGTCGCTCCGGG-3?

Έλεγχος shRNA:. κατεύθυνση προς τα εμπρός

5′-GATCCCCCAGTAACTGAATAGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCTATTCAGTTACTGTTTTTGGAAA-3 ‘, αντίστροφη κατεύθυνση. 5’-AGCTTTTCCAAAAACAGTAACTGAATAGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCTATTCAGTTACTGGGG-3 ‘. Ο έλεγχος shRNA δεν έχει ομολογία με οποιεσδήποτε σχετικές ανθρώπινα γονίδια. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA. Τα προκύπτοντα πλασμίδια μεταφοράς συν-επιμολύνθηκαν με το πλασμίδιο αδενοϊού διάσωση pBHGloxΔE1, 3Cre σε 293 κύτταρα να αποκτήσουν ανασυνδυασμένο αδενοϊό. Ανασυνδυασμένος αδενοϊός αποδοτικότητα ανιχνεύθηκε με την εξέταση της κυτταροπαθολογικής επίδρασης και έκφραση EGFP στα κύτταρα. Οι τίτλοι αδενοϊού μετρήθηκαν μετά ενίσχυση και καθαρισμό χρησιμοποιώντας TCID50 δοκιμασίες.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

κύτταρα SW480 μολύνθηκαν με ανασυνδυασμένους αδενοϊούς για 90 λεπτά, και μετά από 24 ώρες, αυτοί σπάρθηκαν στα 300 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Μετά την επώαση, το μέσο αλλάχθηκε και οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 10 ημέρες υπό τις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες σε 100% αιθανόλη και στη συνέχεια μετρήθηκαν. Κλώνοι τουλάχιστον 50 κύτταρα μετρήθηκαν ως μία αποικία.

Δοκιμασίες κυτοτοξικότητας

SW480 κύτταρα μολύνθηκαν με τους ανασυνδυασμένους αδενοϊούς για 90 λεπτά, και μετά από 24 ώρες, αυτά τοποθετήθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες στα 4000 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά 24 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της 5-FU ή οξαλιπλατίνη για 72 ώρες. Στη συνέχεια, 20 μλ ΜΤΤ (5 g /L) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για επιπλέον 4 ώρες. Τα μέσα καλλιέργειας στη συνέχεια απορρίφθηκε, προστέθηκαν 0,15 mL διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO), και οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 10 λεπτά με δόνηση. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός (μοντέλο 550, Bio-Rad, USA).

Προσδιορισμός απόπτωσης

SW480 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε έξι φρεατίων σε πυκνότητα 0,5 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα σε 70% συρροή μολύνθηκαν με αδενοϊούς για 90 λεπτά και στη συνέχεια πλένονται για να απομακρυνθούν τα αδενοϊούς. Μετά από μία επιπλέον καλλιέργεια 24 ώρες, το αποπτωτικό δείκτη εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας αννεξίνη-V-FITC κιτ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22].

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και ολικές πρωτεΐνες εκχυλίζονται με ρυθμιστικό RIPA που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης. στύπωμα Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, δείγματα ίσα πρωτεΐνη (50 μg) σε κάθε δείγμα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση 10 ή 12% επί πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες. Μετά τον αποκλεισμό με 5% άπαχο γάλα σε σκόνη, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντισώματα σε β-κατενίνης (1:5,000), από TCF 4 (1:1,000), c-myc (1:2000), κυκλίνη D1 (1: 2000), FOXO4 (1:1000), FOXO4 S193 (1:500), p27kip1 (1:2000), MnSOD (1:2000), κασπάση-3 (1:500), και β-ακτίνη (1:3000) . Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (1:2000) (Pierce, Rockford, IL, USA). Οι πρωτείνες ανιχνεύθηκαν με σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Pierce), και η εκπομπή φωτός συνελήφθη σε φιλμ Kodak Χ-Χ.

Επιμόλυνση και Reporter Gene Assay

Για μετρήσεις β-κατενίνης /χρησιμοποιήθηκαν? από TCF 4 μεταγραφική δραστικότητα, ένα ζεύγος λουσιφεράσης πλασμιδίων ανταποκριτή (Upstate Biotechnology TOPflash /FOPflash). Το γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης πλασμιδίου pRL-ΤΚ (Promega) συν-επιμολύνθηκε για την κανονικοποίηση για αποδοτικότητα διαμόλυνσης. Παροδική διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Fugene 6 (Roche, Indianapolis, ΙΝ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με τους ανασυνδυασμένους αδενοϊούς για 90 λεπτά, και μετά από 24 ώρες, ήταν στη συνέχεια συν-επιμολύνθηκαν με ανταποκριτή TOPflash λουσιφεράσης (ή μεταλλαγμένο φορέα flash FOP ελέγχου) και ρΡΙ_-ΤΚ. Μετά επιπλέον επώαση 24 ωρών, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για μέτρηση δραστικότητας λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης (Promega). Τρεις επαναληπτικές πειράματα.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (S.D.). Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών προσδιορίστηκε με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) με τη χρήση του λογισμικού SPSS v12.0 (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Η τιμή του

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

1. Εξόντωση από TCF 4 ή β-κατενίνης με αδενοϊό-μεσολαβούμενη μεταγωγή του shRNA

Για να knockdown την έκφραση από TCF 4 ή β-κατενίνης, αδενοϊικοί φορείς δημιουργήθηκαν για να εκφράσουν ένα shRNA στόχευσης από TCF 4 ή β- κατενίνης. ανάλυση κηλίδας Western απεκάλυψε μία δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης από TCF 4 ή β-κατενίνης στις 48 ώρες μετά τη μόλυνση με τους αντίστοιχους φορείς αδενοϊών σε SW480 και HCT116 κύτταρα, ενώ δεν υπάρχει αλλαγή στην έκφραση της πρωτεΐνης παρατηρήθηκε μετά από μόλυνση με έναν αδενοϊό που περιέχουν κωδικοποιημένα shRNA (Εικ. 1).

SW480 και κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) αδενοϊού που φέρουν shRNA. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε 48 ώρες μετά τη μόλυνση. Ανάλυση κηλίδας Western των προϊόντων λύσης κυττάρου για την έκφραση πρωτεΐνης του β-κατενίνης (α) και η TCF-4 (β).

Η

2. TCF-4 Νοκ ντάουν Καταστέλλει σηματοδότηση Wnt

HCT116 κυτταρικές σειρές

SW480 και έχουν μόνιμα ενεργή β-κατενίνης /TCF-4 μεταγραφική δραστηριότητα. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα πλασμίδιο TCF ανταποκριτή, TOPflash, η οποία αποτελείται από τρία TCF θέσεις ανοδικά ενός ελάχιστου υποκινητή tk και λουσιφεράσης ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης, ή το πλασμίδιο ελέγχου, FOPflash, το οποίο είναι πανομοιότυπο με TOPflash εκτός του ότι περιέχει μεταλλαγμένο δέσμευσης ανενεργές θέσεις πρόσδεσης TCF. Σχήμα 2α έδειξαν ότι και οι δύο β-κατενίνης shRNA και η TCF-4 shRNA κατέστειλε σημαντικά την ενδογενή β-κατενίνης /από TCF 4 μεταγραφική δραστικότητα σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA σε δύο γραμμές SW480 και κυτταρικές HCT116.

SW480 και HCT116 κύτταρα ήταν αγωγή με αδενοϊούς (50 MOI) που μεταφέρουν shRNA. a, Στις 24 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με γονίδια αναφοράς που φιλοξενούν sites από TCF 4 πρόσδεσης (TOPflash) ή μία μεταλλαγμένη θέση πρόσδεσης από TCF (FOPflash), αντίστοιχα, μαζί με ρΡΙ_-ΤΚ. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, κανονικοποιημένες έναντι τιμές για την αντίστοιχη δραστηριότητα ρΡΙ_-ΤΚ. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο ± s.d. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *

P

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου shRNA. Β, σε 48 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η έκφραση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με κηλίδα western.

Η

Κυκλίνη D1

και

c-Myc

είναι γνωστές β-κατενίνης /Tcf-4 γονίδια-στόχους, και ως εκ τούτου, ερευνήσαμε επίσης την πρωτεΐνη έκφραση της κυκλίνης D1 και c-Myc με κηλίδα western. Το σχήμα 2b δείχνει ότι β-κατενίνης shRNA ή από TCF 4 θεραπεία shRNA οδήγησε σε σημαντική μείωση της κυκλίνης D1 και πρωτεΐνη c-Myc και στα δύο κύτταρα SW480 και HCT116.

3. TCF-4 Νοκ ντάουν Βελτιώνει FOXO4 Δραστηριότητα

Για να αναλύσουμε το επίπεδο πρωτεΐνης και ενεργοποίηση της πρωτεΐνης FOXO4, SW480 και HCT116 κύτταρα αναπτύχθηκαν για 48 ώρες μετά τη μόλυνση με αδενοϊούς, και το επίπεδο της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε από την κηλίδα western. Το επίπεδο πρωτεΐνης του FOXO4 δεν άλλαξε σημαντικά μετά την αγωγή με β-κατενίνης shRNA ή από TCF 4 shRNA (Εικ. 3). Ωστόσο, το επίπεδο της πρωτεΐνης της φωσφορυλιωμένης FOXO4 S193 αυξήθηκε αξιοσημείωτα μετά από αγωγή με β-κατενίνης shRNA, και μειωμένη μετά την επεξεργασία με TCF-4 shRNA (Εικ. 3). Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων στόχων FOXO p27kip1 και MnSOD ήταν σημαντικά μειωμένη μετά την επεξεργασία με β-κατενίνης shRNA και αυξημένη μετά την αγωγή με TCF-4 shRNA (Εικ. 3).

SW480 και κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με αδενοϊούς ( 50 MOI) που μεταφέρουν shRNA. Τα δείγματα συλλέχθηκαν σε 48 ώρες μετά τη μόλυνση. Το επίπεδο της πρωτεΐνης του FOXO4, φωσφορυλιωμένη FOXO4 S193, p27kip1, και MnSOD προσδιορίστηκε με κηλίδα western.

Η

4. Από TCF 4 Knockdown αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και επάγει την κυτταρική απόπτωση σε κύτταρα ορθοκολικού καρκίνου

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση της από TCF 4 knockdown επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση σε SW480 και κύτταρα HCT116. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4α, από TCF 4 knockdown προκάλεσε σημαντικά ισχυρότερη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με τη β-κατενίνη knockdown τόσο SW480 και κύτταρα HCT116 (ρ & lt? 0,05, ρ & lt? 0,01, αντίστοιχα). Για να διερευνηθεί αν από TCF 4 shRNA μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης που σχετίζονται με την απόπτωση, επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4β, τόσο β-κατενίνης shRNA και η TCF-4 shRNA προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στον αριθμό αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα και τον έλεγχο shRNA αγωγή ομάδες (ρ & lt? 0,01), και η TCF-4 shRNA προκάλεσε μεγαλύτερο αριθμό αποπτωτικών κυττάρων από β-κατενίνης shRNA (ρ & lt? 0,01). Η προ-αποπτωτικών ενζύμων κασπάσης-3 ενεργοποιείται σε ένα σημείο σύγκλισης μεταξύ των ενδογενών και εξωγενών οδών επαγωγής απόπτωσης [23]. Επομένως, εξετάσαμε κασπάσης-3 διάσπαση ως δείκτη της απόπτωσης. Σε συμφωνία με την κυτταρομετρία ροής ευρήματα, από TCF 4 shRNA προκάλεσε μια μεγαλύτερη αύξηση σε κασπάσης-3 σε σύγκριση με τη διάσπαση της β-κατενίνης shRNA (Εικ. 4γ).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αδενοϊούς (50 ΜΟΙ) που φέρει shRNA για 24 h. α, Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. β, Cell απόπτωση καθορίστηκε χρησιμοποιώντας χρώση Annexin-V-FITC. C, η έκφραση των αποπτωτικών ενζύμων κασπάσης-3 προσδιορίστηκε με κηλίδα western. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± s.d. τριών ή περισσότερων ανεξάρτητων προσδιορισμών. *

P

& lt? 0,01 έναντι του ελέγχου shRNA?

#

P

& lt? 0,05 έναντι της β-κατενίνης shRNA?

##

P

& lt?. 0,01 έναντι της β-κατενίνης shRNA

Η

5. Από TCF 4 Knockdown Βελτιώνει χημειοευαισθησία σε ορθοκολικό Τα καρκινικά κύτταρα

SW480 και κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τις ανασυνδυαστικών αδενοϊών που φέρουν την αντίστοιχη shRNA και μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-FU ή οξαλιπλατίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, β-κατενίνης θεραπεία shRNA αυξημένη 5-FU και οξαλιπλατίνας διαμεσολαβούμενη κυτταροτοξικότητα. Επιπλέον, από TCF 4 θεραπεία shRNA είχε ως αποτέλεσμα μια πιο σημαντική αύξηση της κυτταροτοξικότητας σε σύγκριση με την β-κατενίνης θεραπεία shRNA σε κάθε σημείο συγκέντρωσης της 5-FU και οξαλιπλατίνη (ρ & lt? 0,01).

Τα κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊούς (50 MOI) που μεταφέρουν shRNA? 48 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-FU ή οξαλιπλατίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό ΜΤΤ. γραφικές παραστάσεις Bar αντιπροσωπεύουν τις μέσες τιμές προσδιορισμών εις τριπλούν ± SD

Η

Συζήτηση

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι μία από τις κακοήθων όγκων πιο κοινά ενηλίκων που συμβαίνουν σε όλο τον κόσμο από την άποψη τόσο νοσηρότητας και θνησιμότητας . Παρά τις βελτιώσεις στην ιατρική θεραπεία, τα αποτελέσματα της θεραπείας για τοπικά προχωρημένη και μεταστατική νόσο παραμένει απογοητευτική, με τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών μικρότερη από 10% σε ασθενείς με μετάσταση. Η παρεκκλίνουσα σηματοδότηση WNT μονοπάτι είναι ένα πρώιμο συμβάν εξέλιξης στο 90% των CRC. Εμφανίζεται μέσω μεταλλάξεων κυρίως του

APC

(έως 80%) και λιγότερο συχνά από

β-κατενίνης

(περίπου 10%) ή AXIN2 [24]. Μεταλλάξεις στο

APC /β-κατενίνης

γονιδίων, η οποία οδηγεί σε ανώμαλη ενεργοποίηση της β-κατενίνης /από TCF 4 οδού, είναι κοινά σε CRC, υποδηλώνοντας ότι στοχευμένη αναστολή αυτής της οδού θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός προσέγγιση για τον έλεγχο CRC. Εμείς και άλλοι έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι φυσικές ενώσεις και μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ) αναστέλλουν την /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt [22], [25], [26], [27], [28]. Ωστόσο, δεν υπάρχει σήμερα εκλεκτικός αναστολέας προς αυτήν την οδό διαθέσιμο ως θεραπευτικό παράγοντα. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι shRNA μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση του β-κατενίνης αναστέλλει σημαντικά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και επάγει κυτταρική απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [29], [30], [31].

Στην παρούσα μελέτη, εστιάσαμε συγκεκριμένα στη σύγκριση των αποτελεσματικοτήτων των β-κατενίνης knockdown και η TCF-4 knockdown σε καρκινικά κύτταρα κόλου, και διερευνήθηκαν οι πιθανές μοριακών μηχανισμών που ευθύνονται για αυτές τις επιδράσεις. Έχουμε δείξει ότι από TCF 4 knockdown επάγει μία σημαντικά ισχυρότερη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, επαγωγή της απόπτωσης, και την ενίσχυση της χημειοευαισθησίας σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με τα κύτταρα της β-κατενίνης knockdown.

Η ενεργοποιημένη β-κατενίνης /Tcf-4 σηματοδότηση από συσσώρευση β-κατενίνης στον πυρήνα έχει ενοχοποιηθεί σε ανθρώπινες καρκινογένεση, συμπεριλαμβανομένων CRC. Αυτή η συσσώρευση μπορεί να προκύψει από τη μετάλλαξη είτε της ογκοκατασταλτικό γονίδιο

APC

ή

β-κατενίνης

ίδια. Τουλάχιστον το 60% των σποραδικών CRC περιπτώσεων να περιέχει μία μετάλλαξη APC, και σχεδόν οι μισοί από αυτούς παρουσιάζουν ανωμαλίες στα δύο αλληλόμορφα APC [32], [33], [34]. Στην παρούσα μελέτη, διεξήχθη μια λεπτομερή μηχανιστική μελέτη για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της αναστολής της β-κατενίνης /Tcf-4 σηματοδότηση σε ανθρώπινα CRC χρησιμοποιώντας την ανθρώπινη κυτταρική σειρά CRC SW480, που φιλοξενεί μεταλλαγμένο APC και άγριου τύπου β-κατενίνης, και ο HCT116 κυτταρική γραμμή, που φιλοξενεί μεταλλαγμένη β-κατενίνης και άγριου τύπου APC. Αρχικά κατασκευάστηκε αδενοϊικοί φορείς που φέρουν την ανθρώπινη β-κατενίνης ή από TCF 4 shRNA, προκειμένου να knockdown την έκφραση της β-κατενίνης ή από TCF 4. ανάλυση κηλίδας Western απεκάλυψε μία δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην Tcf-4 ή έκφραση πρωτεΐνης β-κατενίνης σε SW480 και κύτταρα HCT116 στις 48 ώρες μετά τη μόλυνση με τους αντίστοιχους φορείς αδενοϊού. Επιπλέον, τόσο β-κατενίνης shRNA και η TCF-4 shRNA αξιοσημείωτα κατέστειλε β-κατενίνης /από TCF 4 μεταγραφικής δραστηριότητας καθώς επίσης και την έκφραση δύο γνωστών γονιδίων στόχων, Κυκλίνη D1 και c-Myc, και SW480 και κύτταρα HCT116. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι δύο β-κατενίνης νοκ ντάουν και η TCF-4 νοκ ντάουν να καταστείλει την Tcf-4 δραστικότητα β-κατενίνης /

in vitro

.

Ο συντονισμός μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η οδός β-κατενίνης /Tcf-4 είναι ένα σημαντικό μονοπάτι σηματοδότησης που αδειάζουν το υπόλοιπο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα. Στη μελέτη μας, β-κατενίνης knockdown ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επαγωγή απόπτωσης τόσο SW480 και κύτταρα HCT116. Σε σύγκριση με β-κατενίνης knockdown, από TCF 4 knockdown προκάλεσε σημαντικά μεγαλύτερη αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης. Επιπλέον, βρήκαμε ότι από TCF 4 knockdown ενίσχυσε σημαντικά την χημειοευαισθησία των δύο κυττάρων SW480 και HCT116 σε 5-FU και οξαλιπλατίνη.

Ερευνήσαμε περαιτέρω οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στις απόκλιση αποτελεσματικότητες των β-κατενίνης knockdown και Tcf- 4 νοκ ντάουν στην SW480 και HCT116 κύτταρα. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι το επίπεδο πρωτεΐνης FOXO4 δεν άλλαξε μετά από θεραπεία με δύο β-κατενίνης και η TCF-4 shRNA. Ωστόσο, η β-κατενίνης shRNA βρέθηκε να αυξάνει τη συσσώρευση φωσφορυλιωμένης FOXO4 S193 και να μειώσει την έκφραση των γονιδίων στόχων FOXO p27kip1 και MnSOD, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενη έκθεση που δείχνει ότι η β-κατενίνης ειδικό siRNA αναστέλλει τη δράση δημοσιογράφος TCF και FOXO- εξαρτώμενη σηματοδότηση σε καρκίνο του παχέος εντέρου LS174 κύτταρα [19]. Σε αντίθεση, από TCF 4 shRNA έδειξε το αντίθετο ρυθμιστικό ρόλο σε β-κατενίνης επί FOXO4. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η β-κατενίνης shRNA επαγόμενη μειορύθμιση FOXO4 εξαρτώμενη σηματοδότηση είναι ανεξάρτητη από TCF επί 4.

παράγοντες FOXO διαδραματίζουν σημαντικούς ρόλους στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, και το οξειδωτικό στρες [17]. [18]. Οι λειτουργίες τους ρυθμίζονται από πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων των AKT. Σε περίπτωση απουσίας της ενεργοποίησης ΑΚΤ, FOXO4 βρίσκεται στον πυρήνα, όπου λειτουργεί ως παράγοντας μεταγραφής [35]. Κατά την ενεργοποίηση ΑΚΤ, FOXO4 φωσφορυλιώνεται επί τρεις ιδιαίτερα διατηρημένες σερίνης και θρεονίνης (Ser-193, Thr-28, και Ser-258) που ακολουθείται από την αδρανοποίηση και την πυρηνική αποκλεισμού [36]. Essers et al. [19] έδειξε ότι υπήρχε λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ β-κατενίνης και FOXO σε οξειδωτικό στρες σηματοδότηση, και β-κατενίνη-ειδικό shRNA μειωμένη TCF και FOXO μεταγραφική δραστικότητα σε καρκινικά κύτταρα LS174T κόλου, που εκφράζουν μία μεταλλαγμένη μορφή της β-κατενίνης. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι οι παράγοντες FOXO λειτουργήσουν ως καταστολείς όγκων σε μία ποικιλία καρκίνων. Tang et al. [37] διαπίστωσε επίσης ότι FOXO4 ανέστειλε την έκφραση του HIF-1α και VEGF σε καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η υπερέκφραση του άγριου τύπου FOXO4 οδήγησε σε αύξηση της doxorubicin κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου, η οποία επιδεινώνεται περαιτέρω από υπερέκφραση ενός μεταλλαγμένου FOXO4 εντοπισμένη αποκλειστικά στον πυρήνα [38].

Ως εκ τούτου, υποθέτουμε ότι η προς τα πάνω ρύθμιση της δραστικότητας FOXO4 είναι υπεύθυνη για την μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα του από TCF 4 επιδράσεις shRNA σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου σε σύγκριση με την β-κατενίνης shRNA. Από τη μία πλευρά, από TCF 4 και FOXO4 μπορούν να ανταγωνίζονται για β-κατενίνης [19]. Όταν Tcf σηματοδότηση αναστέλλεται, β-κατενίνης συνδέεται άμεσα με FOXO4 και ενισχύει FOXO4 μεταγραφική δραστηριότητα. Από την άλλη πλευρά, TCF4 knockdown μπορεί ρυθμίζουν προς τα κάτω ορισμένα μονοπάτια σηματοδότησης, όπως Akt. Μια πρόσφατη έκθεση δείχνει ότι μια σημαντική μείωση των επιπέδων ΑΚΤ2 και φωσφορυλίωση της Akt ανιχνεύθηκε μετά από νοκ ντάουν της Tcf-4 χρησιμοποιώντας Tcf-4 siRNA σε κύτταρα γλοιώματος [39]. Ως εκ τούτου, η απενεργοποίηση της Akt από TCF την-4 αποτελέσματα shRNA σε αποφωσφορυλίωση FOXO4, η οποία, κατά συνέπεια, ενεργοποιεί FOXO-εξαρτώμενη σηματοδότησης.

Εν κατακλείδι, έχουμε δείξει ότι στοχευμένη αναστολή της β-κατενίνης /Tcf-4 σηματοδότηση αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμός, επάγει την απόπτωση, και ενισχύει χημειοευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Επιπλέον, σε σύγκριση με β-κατενίνης knockdown, από TCF 4 knockdown έδειξαν μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα για την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης CRC και προκαλεί απόπτωση, η οποία μπορεί να σχετίζεται με την αύξηση της FOXO4 μεταγραφική δραστικότητα. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι από TCF 4 μπορεί να είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία CRC. Οι μελλοντικές μελέτες για να επιβεβαιωθούν τα ευρήματα και να εξακριβώσει τη χρησιμότητα της στόχευσης τρισεκατομμυρίων κυβικών μέτρων-4.