Αφηρημένο

Ιστορικό

Η χρόνια έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία του δέρματος οδηγεί σε ελαττώματα επιδερμική διαφοροποίηση σε ανθρώπους που μπορεί να είναι σε μεγάλο βαθμό αποκατασταθεί με φαρμακολογικές δόσεις νικοτινικού οξέος. Το νικοτινικό οξύ έχει ταυτοποιηθεί ως ένα πρόσδεμα για τις ανθρώπινου G-πρωτεΐνη υποδοχέων συζευγμένων GPR109A και GPR109B που σηματοδοτούν μέσω G

i-διαμεσολαβούμενη αναστολή αδενυλικής κυκλάσης. Εξετάσαμε την έκφραση, κυτταρική κατανομή, και τη λειτουργικότητα των GPR109A /Β στο ανθρώπινο δέρμα και τα παράγωγα του δέρματος επιδερμικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

Το νικοτινικό οξύ αυξάνει την επιδερμική διαφοροποίηση σε φωτοβλαφθέν ανθρώπινο δέρμα όπως κρίνεται από την τερματικό δείκτες διαφοροποίησης κασπάση 14 και filaggrin. Και τα δύο γονίδια GPR109A και GPR109B μεταγράφεται στο ανθρώπινο δέρμα και σε επιδερμικά κερατινοκύτταρα, αλλά η έκφραση σε δερματικούς ινοβλάστες είναι κάτω από τα όρια ανίχνευσης. μεταγραφές υποδοχέα είναι πολύ υπερ-εκφράζεται σε καρκίνους πλακώδους κυττάρου. πρωτεΐνη υποδοχέα σε φυσιολογικό δέρμα είναι διακεκριμένος από το βασικό μέσω κοκκώδους στιβάδες της επιδερμίδας, με κυτταρική εντόπιση περισσότερο διασποράς στη βασική στοιβάδα, αλλά κατά κύριο λόγο εντοπισμένο στην μεμβράνη πλάσματος σε πιο διαφοροποιημένα επιδερμικά στρώματα. Σε φυσιολογικό ανθρώπινο πρωτεύον και αθανατοποιημένα κερατινοκύτταρα, υποδοχείς νικοτινικό οξύ δείχνουν εντοπισμό μεμβράνης πλάσματος και λειτουργικά G

i-διαμεσολαβούμενη σηματοδότηση. Σε αντίθεση, σε ένα πλακώδες καρκίνωμα κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται, πρωτεΐνη υποδοχέα δείχνει ένα πιο διάχυτο κυτταρικό εντοπισμό και οι υποδοχείς είναι σχεδόν μη λειτουργικά.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών δικαιολογούν μελλοντικές γενετικές και φαρμακολογικές μελέτες παρέμβασης για να καθορίσουν το δυνατόν συγκεκριμένο ρόλο (ες) των υποδοχέων νικοτινικό οξύ σε ανθρώπινο ομοιόσταση του δέρματος

Παράθεση:. Bermudez Υ, Benavente CA, Meyer RG, Coyle WR, Jacobson ΜΚ, Jacobson EL (2011) νικοτινικό οξύ Υποδοχέων Ανωμαλίες στον ανθρώπινο καρκίνο του δέρματος: Συνέπειες για ένα ρόλο στην επιδερμική διαφοροποίηση. PLoS ONE 6 (5): e20487. doi: 10.1371 /journal.pone.0020487

Επιμέλεια: Christophe Egles, Université de Technologie de Compiègne, Γαλλία

Ελήφθη: 9 Μαρτίου, 2011? Αποδεκτές: 27 Απριλίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 31 Μαΐου, 2011

Copyright: © 2011 Bermudez et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί CA43894, CA106677, CA78447, CA027502, ES06694 και HD048837. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. MKJ και ELJ είναι διευθυντές σε NiadynePharma, Inc., του οποίου χρηματοδοτείται η έρευνα διαχείριση σύμφωνα με τις πολιτικές του Πανεπιστημίου της Αριζόνα σύγκρουσης συμφερόντων.

Εισαγωγή

το δέρμα λειτουργεί ως ένα μεταβολικά ενεργό βιολογικό φράγμα προστασίας ενάντια στις εξωτερικές περιβαλλοντικές προσβολές. Η διατήρηση του φραγμού του δέρματος είναι κρίσιμη καθώς πολλές δερματολογικές παθήσεις που χαρακτηρίζονται από ακεραιότητα ελαττωματικά φράγμα με αποτέλεσμα μια μειωμένη προστατευτική ικανότητα του δέρματος. σχηματισμός φράγματος του δέρματος χαρακτηρίζεται από μια διαδικασία ομοιόστασης όπου διαιρούμενων κυττάρων στη βασική στιβάδα μεταναστεύουν συνεχώς προς την επιφάνεια του δέρματος και υφίστανται τελική διαφοροποίηση και τελικά προγραμματισμένη κυτταρικό θάνατο για να σχηματίσουν την κεράτινη στιβάδα αποτελούμενη από τερματικά διαφοροποιημένων κερατινοκυττάρων και άλλες ουσίες που σχηματίζουν το φράγμα [ ,,,0],1]. Ωστόσο, επιδερμική πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση πρέπει να εξισορροπείται προσεκτικά αφού ανεπαρκή αποτελέσματα πολλαπλασιασμού σε μια λέπτυνση της επιδερμικής στοιβάδας του δέρματος και την απώλεια της προστασίας φραγμό, ενώ αυξημένο πολλαπλασιασμό χωρίς συντεταγμένη αυξημένη διαφοροποίηση οδηγεί σε διαταραχές όπως η ψωρίαση και καρκίνους του δέρματος. [1]

Μια σημαντική περιβαλλοντική απειλή με αποτέλεσμα σε πολλές αλλαγές στη δομή του δέρματος και τη λειτουργία είναι η έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία από τον ήλιο [2]. Χρόνιες ηλιακή έκθεση στο φως μπορεί τελικά να οδηγήσει σε επιδερμική υπερπλασία με μειωμένη διαφοροποίηση με αποτέλεσμα την ακτινική κεράτωση (AK) βλάβες και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC) του δέρματος. Το κύριο χαρακτηριστικό του ιστολογική SCC είναι η υποκατάσταση της κανονικής ωρίμανσης επιδερμικών κερατινοκυττάρων με πτωχά διαφοροποιημένα άτυπα πλακώδη κύτταρα [3]. Mudgil et al. έδειξαν σε επιδερμικά ισοδύναμα δέρματος που μετασχηματίζεται, πτωχά διαφοροποιημένα κερατινοκύτταρα μπορεί να οδηγηθεί να διαφοροποιηθούν με την παρουσία επαρκούς αριθμού των φυσιολογικών κερατινοκυττάρων [4]. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι οι θεραπείες που θα μπορούσε να προωθήσει την επιδερμική διαφοροποίηση σε φωτοβλαφθέν δέρμα έχουν τη δυνατότητα να αποκατασταθεί η ισορροπία του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης που απαιτούνται για τη διατήρηση της ομοιόστασης του δέρματος και ως εκ τούτου θα μπορούσε να εξουδετερώσει την ανάπτυξη των βλαβών AK και SCC.

Ένα από τα φαρμακολογικές επιδράσεις του νικοτινικού οξέος σε βλάβες από φωτεινή δέρμα είναι η προώθηση της επιδερμικής διαφοροποίησης [5], αυξάνοντας την πιθανότητα ότι ένας υποδοχέας νικοτινικό οξύ μπορούν να συμμετέχουν. Η GPR109A υποδοχέας ονομάζεται (ΗΜ74Α σε ανθρώπους και PUMA-G σε ποντίκια), που δόθηκε πρόσφατα την ονομασία HGNC του NIACR1, ανακαλύφθηκε το πολύ διαφοροποιημένα λιποκύτταρα, σπλήνα, και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού [6], [7], [8]. GPR109A ζευγάρια να G πρωτεΐνες της G

i οικογένεια, μία ανασταλτική πρωτεΐνη G, εν κατά την πρόσδεση σήματα τη μείωση της αδενοσίνης 3 ‘, 5’-κυκλικής μονοφωσφορικής (cAMP) παραγωγή μέσω της αναστολής της αδενυλικής κυκλάσης σε μία τοξίνη κοκκύτη συνδέτη ευαίσθητου τρόπο [6], [7], [8]. GPR109A είναι ένα μέλος της υποοικογένειας των G-πρωτεΐνη υποδοχέων που συνδέονται (GPCR) που αποτελείται από GPR109A και GPR81 τόσο από τα οποία βρίσκονται σε ανθρώπους και τρωκτικά. GPR109B (επίσης ονομάζεται ΗΜ74) είναι ένα άλλο μέλος αυτής της οικογένειας υποδοχέα που δεσμεύει αν και με χαμηλή συγγένεια προς το νικοτινικό οξύ και είναι παρούσα μόνο σε ανθρώπους. Το νικοτινικό οξύ ενεργοποιεί τόσο GPR109A και GPR109B με ΕΚ

50 τιμές των 0.1 μΜ και 100 μΜ, αντίστοιχα [9]. Ενώ θεωρείται απίθανο ότι το νικοτινικό οξύ είναι ο ενδογενής συνδέτης των υποδοχέων αυτών, φαρμακολογικές δόσεις νικοτινικού οξέος που δρουν μέσω GPR109A μεσολαβούν σε αμφότερες τις επιθυμητές αντι-λιπολυτική δράση καθώς επίσης ανεπιθύμητα δερματικές επιδράσεις αγγειοδιαστολή που σχετίζονται με τη θεραπεία με νικοτινικό οξύ από το στόμα [6], [7 ], [8], [10], [11]. Επειδή οξύ επαγόμενη από προστανοειδή σχηματισμός νικοτινικό υπεύθυνη για ερυθρότητα του δέρματος έχει προταθεί να γίνεται σε δερματικά δενδριτικά κύτταρα Langerhans, η έκφραση του GPR109A στο δέρμα έχει μελετηθεί σε αυτό το πλαίσιο [10], [12], [13], [14] ? Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τις λειτουργίες των υποδοχέων νικοτινικού οξέος σε άλλες πτυχές της βιολογίας του δέρματος. Εδώ εξετάζουμε την έκφραση, κυτταρική κατανομή, και η λειτουργικότητα των GPR109A και GPR109B στο δέρμα και τα παράγωγα κύτταρα του δέρματος. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι πλακωδών κυττάρων καρκίνοι έχουν ανώμαλη έκφραση GPR109A /B, κυτταρική κατανομή και λειτουργία, υποδεικνύοντας ότι αυτοί οι υποδοχείς που εμπλέκονται στην ομοιόσταση του δέρματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Κανονικά ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (ΝΗΕΚ, Lonza, Switzerland) ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε EpiLife (GIBCO /Invitrogen) που περιέχει ανθρώπινο συμπλήρωμα ανάπτυξης κερατινοκυττάρων για λιγότερο από 10 διπλασιασμούς πληθυσμού. Φυσιολογικών ανθρώπινων διπλοειδών ινοβλαστών, CF3, (διπλασιασμούς πληθυσμού μικρότερη από 30, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, ΟΚ), η καθιερωμένη κυτταρική σειρά αθανατοποιημένων ανθρώπινων επιδερμικών κερατινοκυττάρων, HaCaT, και Ras-μετασχηματισμένα HaCaT, δώρα από τον Dr. Norbert Fusenig ( Γερμανικά Cancer Research Center, Heidelberg, Germany) [15], η κυτταρική σειρά ανθρώπινου επιδερμοειδούς καρκινώματος, Α-431 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), και ο πλακωδών κυττάρων γραμμή καρκινώματος, SCC-25 (ATCC ) έχουν συνήθως καλλιεργούνται σε Τροποποιημένο κατά Dulbecco Μέσο Eagle (DMEM, Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Hyclone /Fisher Scientific). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C.

Αντίστροφη Μεταγραφάση αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA από τον λιπώδη ιστό, πλακούντα , πνεύμονα και δέρμα αγοράστηκαν από την Stratagene (Cedar Creek, ΤΧ) και 1 μg εκάστου RNA χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει συνθέσεις cDNA με χρήση του κιτ TaqMan Reverse Transcription από την Applied Biosystems (Foster City, CA). PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές για GPR109A και GPR109B: GPR109A – προς τα εμπρός – 5 ‘CACCACACAGACACACACCTCCTTGCTGG 3’, GPR109B – προς τα εμπρός – 5 ‘CACCATACAGACACACGCCACTTTGCTGG 3’, και ο αντίστροφος εκκινητής για τα δύο γονίδια – 5 ‘CAGTGACATTACTCGATGCAACAGCCCAAC 3’ συντίθεται από το Ολοκληρωμένο DNA Technologies (IDT, Coralville, ΙΑ). Θερμικές συνθήκες ποδηλασίας είχαν ως εξής: ενεργοποίηση της DNA πολυμεράσης στους 94 ° C για 1 min, ακολουθούμενο από 25 κύκλους ενίσχυσης στους 94 ° C για 1 λεπτό και 62 ° C και 68 ° C για 1 λεπτό κάθε φορά

Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

Ολικό RNA από καλλιεργημένα κύτταρα παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα καθαρισμού Kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κατεψυγμένα επιτευχθεί ανθρώπινη φυσιολογική βιοψίες δέρματος, ΑΚ, και κλώνοι ενός κυττάρου που λαμβάνεται από το έργο με τίτλο «Χημειοπρόληψη του δέρματος Πρόγραμμα Καρκίνου του έργου Αρχείο δείγματα για επιπλέον αναλύσεις, επανεξετάζονται από το Πανεπιστήμιο της Αριζόνα IRB (Tucson, AZ), Αριθμός έργου 08-0201-04 . Η μελέτη από την οποία ελήφθησαν τα δείγματα διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι Αρχές. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Ολικό RNA από δείγματα ιστού του δέρματος παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τη RNeasy ινώδους ιστού Mini Kit (Qiagen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με χρήση του κιτ TaqMan Reverse Transcription (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας τυχαία εξαμερή και 1 μg ολικού RNA. Για TaqMan που βασίζεται προφίλ έκφρασης qRT-PCR, 25 ng από κάθε cDNA συμπεριλαμβανομένου ολικού RNA από δείγματα πλακώδες καρκίνωμα (Asterand, Detroit, ΜΙ) προστέθηκε στο iTaq Supermix (BioRad, Hercules, CA), μαζί με τους ανιχνευτές TaqMan MGB σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA). qRT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Ανιχνευτές σχεδιαστεί για την ανίχνευση ειδικά του ανθρώπου GPR109A (TaqMan Gene Expression Assay Hs02341584_s1) και GPR109B (TaqMan Gene Expression Assay Hs02341102_s1) μεταγραφές αγοράστηκαν από την Applied Biosystems. έλεγχος φθορισμού σε πραγματικό χρόνο πραγματοποιήθηκε με το ΑΒΙ Prism 7000 (Applied Biosystems). Σε ανθρώπινους ιστούς του δέρματος, αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) και την έκφραση του γονιδίου β-ακτίνης άλλαξε με το βαθμό κακοήθειας, συγκριτικά με 18s rRNA, η οποία παρέμεινε σταθερή. Σε καλλιεργημένα κύτταρα, GAPDH και έκφραση β-ακτίνης παρέμεινε σταθερή σε σύγκριση με 18s rRNA? Ως εκ τούτου, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των διαφόρων μεταγραφών προσδιορίσθηκαν με σύγκριση έναντι των γονιδίων οικοκυρική, 18s rRNA για τους ιστούς και GAPDH για καλλιεργημένα κύτταρα. Όλες οι μετρήσεις έκφρασης διεξήχθησαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα δημιουργούνται δείγματα cDNA. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Σχετική έκφραση του γονιδίου υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Οι μεταβολές στην έκφραση γονιδίου θεωρήθηκαν σημαντικές σε 1,5 φορές αλλαγή και p ≤ 0,05.

Αντίσωμα Παραγωγή και καθαρισμός

Για την ανάλυση της ανθρώπινης GPR109A και GPR109B, ένα προσαρμοσμένο, εμπορικό αντίσωμα παρήχθη σε κουνέλια χρησιμοποιώντας ένα συνθετικό πεπτίδιο (RHHLQDHFLEIDKKNC) για να δημιουργήσει αντιορούς αναγνωρίζει το Ν-άκρο της GPR109A και GPR109B (Sigma-Genosys, Woodlands, ΤΧ). συντήρησης και αντισώματος ζωική παραγωγή έγιναν από την Sigma-Genosys σύμφωνα με το πρωτόκολλο ελεγχθεί και εγκριθεί από το Θεσμικό ζώων Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Sigma-Genosys (IACUC), OPRR Διασφάλισης A4182-01? USDA Αριθμός Εγγραφής 93-R-283. Οι αντιοροί ήταν καθαρισμένο με συγγένεια χρησιμοποιώντας Kit Aminolink του Pierce σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Rockford, IL). Τα αντισώματα επικυρώθηκαν αποδεικνύοντας ότι εκχυλίσματα από κύτταρα HeLa, τα οποία δεν εκφράζουν τον υποδοχέα, δεν έδειξε θετικές ανοσοστυπώματα αλλά εκχυλίσματα από κύτταρα HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) επιμολυσμένα με τον υποδοχέα νικοτινικού οξέος είχε εμφανίζουν θετικές ζώνες σε η αναμενόμενη θέση μετανάστευσης. Επιπλέον, CF3 κύτταρα που δεν δείχνουν έκφραση υποδοχέα με qRT-PCR επίσης δεν έδειξαν θετικά ανοσοστυπώματα. Επίσης, όλα ανοσοστυπώματος αναλύσεις περιελάμβαναν ελέγχου που έδειξε ότι το πεπτίδιο έναντι του οποίου τα αντισώματα παράχθηκαν ανταγωνίστηκε έξω το σήμα.

αναλύσεις ανοσοαποτύπωσης

SDS-PAGE και στύπωμα Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],18]. Τα προσκολλημένα κυτταρικοί πληθυσμοί υποβλήθηκαν σε λύση σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (150 mM χλωριούχο νάτριο, 50 mM φθοριούχο νάτριο, 50 mM φωσφορικό κάλιο, 40 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 500 μL Triton Χ-100, 100 μL SDS, 200 μL 1 Μ Tris-HCI ρΗ 7.4 σε νερό και 1 δισκίο πλήρους μίνι κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ) για 30 λεπτά στους 4 ° C. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 rpm για 30 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρολυμάτων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Protein Assay το BCA ™ Kit (Pierce, Rockford, IL) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Είκοσι μικρογραμμάρια πρωτεΐνης προστέθηκαν σε 4 × ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (250 mM Tris ρΗ 6,8, 8% SDS, 20% γλυκερόλη, 0,012% βρωμοφαινόλη μπλε, 4% β-μερκαπτοαιθανόλη), θερμαίνεται στους 95 ° C για 5 λεπτά, ηλεκτροφορήθηκαν σε 12.5 % γέλες SDS-πολυακρυλαμιδίου, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Amersham, Piscataway, NJ). Όλες οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 5% άπαχο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) συν 0,1% Tween-20 (10 mM ΤΒδ-Τ, ρΗ 7,4) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε πρωτογενές αντίσωμα ή σε πρωτογενείς αντίσωμα συν 1.000 μοριακή περίσσεια πεπτιδίου (που χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει το αντίσωμα) σε σχέση με το αντίσωμα, επωάστηκαν σε 5% γάλα χωρίς λιπαρά ΤΒδ-Τ 24 ώρες πριν από την χρήση. Οι μεμβράνες επωάστηκαν και αναπτύχθηκε σε Immobilon ™ Western χημειοφωταύγειας HRP Substrate (Millipore, Billerica, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την αρχική κηλίδωση, οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι για β-ακτίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για να εξασφαλίσει ακόμη φόρτωση. Οι κηλίδες σαρώθηκαν και αναλύθηκαν με το λογισμικό ImageJ εκδοχή 1.39u (ΝΙΗ, Bethesda, MD). Οι τιμές που αναφέρονται για τις πρωτεΐνες-στόχους κανονικοποιήθηκαν προς τις αντίστοιχες β-ακτίνης επίπεδα Οι κηλίδες »σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η ανοσοκυτταροχημεία (ICC)

CF3, ΝΗΕΚ, HaCaT, Ras-μετασχηματισμένα HaCaT, Α-431, και SCC-25 κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων. Για στερέωση, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές με TBS, επωάζονται σε 4% φορμαλδεΰδη σε TBS για 30 λεπτά, και ξεπλένονται δύο φορές με TBS. Να επισημαίνουν τους υποδοχείς GPR109A /B, ενδογενής μπλοκάρισμα βιοτίνη διεξήχθη χρησιμοποιώντας NeutrAvidin Protein ™ σύνδεσης βιοτίνης (Pierce) επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αμέσως μετά, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 3% αλβουμίνη βόειου ορού διαλύθηκε σε TBS (BSA-TBS) ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού για 1 ώρα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (1:10). Για τα πειράματα πεπτιδίου ανταγωνισμού, περιελήφθη μία περίσσεια 1000 φορές του πεπτιδίου. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές για 5 λεπτά το καθένα με TBS. Το στάδιο δέσμευσης επαναλήφθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν σε 1:25 βιοτίνη-SP-συζευγμένο IgG AffiniPure κατσίκας αντι-κουνελιού (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΡΑ) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα πλακίδια πλύθηκαν με TBS και επωάστηκαν σε 1:25 στρεπταβιδίνης Quantum Dot 605 Συζεύγματα (Millipore) για 45 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από διεξοδική πλύσεις με TBS, καλυπτρίδες στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης που περιέχει 90% γλυκερίνη και 10% TBS. Οι ανοσοχρωματίστηκε πλακίδια τοποθετήθηκαν στους 4 ° C και οπτικοποιούνται την επόμενη ημέρα κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του GPR109A /Β διεξήχθη σε εγκλεισμένο σε παραφίνη τομές από φυσιολογικά ανθρώπινο βιοψίες δέρματος. Αρχειακού υλικού από μια μελέτη που διεξήχθη σύμφωνα με την Διακήρυξη του Ελσίνκι Αρχές επανεξετάζονται από ακε κριτική Ethical Review Board, Austin, TX. Όλα τα θέματα διαβάσει και υπέγραψε IRB-εγκεκριμένη Έντυπο συγκατάθεσης. Όλοι οι συμμετέχοντες, εκείνοι που διαχειρίζονται τα παρεμβάσεις, και εκείνοι την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων δεν γνώριζαν την εκχώρηση της ομάδας. ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και ενυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη σειρά του αλκοόλ, οι τομές βυθίστηκαν σε κιτρικό οξύ σε ένα λουτρό νερού στους 87 ° C για 20 λεπτά για την ενίσχυση της ανάκτησης αντιγόνου. Τα τμήματα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε TBS και αποκλείστηκε σε 3% BSA-TBS για 20 λεπτά. Αμέσως μετά τον αποκλεισμό, οι τομές επωάστηκαν σε πρωτογενές αντίσωμα σε 3% BSA-TBS (1:10) για μία νύχτα σε 4 ° C. Για τα πειράματα πεπτιδίου ανταγωνισμού, περιελήφθη μία περίσσεια 1000 φορές του πεπτιδίου. Την επόμενη ημέρα, οι τομές πλύθηκαν σε TBS, μπλοκάρει και πάλι, και επωάστηκαν σε 1:25 βιοτίνη-SP-συζευγμένο IgG AffiniPure κατσίκας αντι-κουνελιού (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΡΑ) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Οι τομές ξεπλύθηκαν με TBS και επωάστηκαν σε 1:25 στρεπταβιδίνης Quantum Dot 605 Συζεύγματα (Millipore) για 45 λεπτά στους 37 ° C. Μετά από διεξοδική πλύσεις με TBS, καλυπτρίδες στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης που περιέχει 90% γλυκερίνη και 10% TBS. Για τα πειράματα πεπτιδίου ανταγωνισμού, οι τομές πλύθηκαν σε TBS και επωάστηκαν σε 1:1000 FITC κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) για 1 h σε RT.

IHC ανάλυση της κασπάσης 14 και φιλαγγρίνη εμπλέκονται ανάλογες διαδικασίες χρησιμοποιώντας αντισώματος SC5628 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) για κασπάσης 14 και 3137-500 (Abcam, Cambridge, ΜΑ) για filaggrin. Ποσοτικοποίηση της χρώσης αντισώματος διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [5].

cAMP Δοκιμασία

ΝΗΕΚ, HaCaT, Ras-μετασχηματισμένα HaCaT, A-431, SCC-25, και τα κύτταρα CF3 σπάρθηκαν σε μια πυκνότητα 25.000 κύτταρα σε δίσκους καλλιέργειας 35 mm. Δύο ημέρες αργότερα, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο καλλιέργειας που περιέχει 100 ± ng /mL τοξίνη του κοκκύτη (επωάζονται όλη τη νύχτα), ± 10 μΜ φορσκολίνη παρουσία ή απουσία του νικοτινικού οξέος σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για 1 ώρα πριν την δοκιμή. Εκτός από τις μελέτες απόκρισης δόσης, η τελική συγκέντρωση του νικοτινικού οξέος που χρησιμοποιήθηκε ήταν 100 μΜ. Μέτρηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP πραγματοποιήθηκε με χρήση κυκλικού ΑΜΡ Complete Kit ΕΙΑ (υποδείγματα Δοκιμασία, Ann Arbor, ΜΙ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με ανεξάρτητες κυτταρικές καλλιέργειες. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Αποτελέσματα

Το νικοτινικό οξύ προάγει την επιδερμική διαφοροποίηση σε φωτοβλαφθέν ανθρώπινο δέρμα

Η χρόνια έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία οδηγεί σε εξασθενημένη επιδερμική διαφοροποίηση και την αύξηση της επιδερμικός πολλαπλασιασμός που μπορεί να οδηγήσει σε βλάβες ακτινικής κεράτωσης και πλακωδών κυττάρων καρκίνων του δέρματος [19]. Έχουμε προηγουμένως στο συμπέρασμα ότι μυριστυλ νικοτινικό (ΜΝ), ένα προφάρμακο που παραδίδει το νικοτινικό οξύ στο δέρμα, προωθεί επιδερμική διαφοροποίηση μαζί με τις σχετικές λειτουργία ενισχυμένη φραγμού δέρματος σε χρονίως φωτοβλαφθέν δέρμα όπως κρίνεται από τις μεταβολές στα επιδερμικά και το πάχος της κεράτινης στοιβάδας, μειωμένα ποσοστά απώλειας διεπιδερμικής νερό και αυξήσεις σε ελάχιστη δόση που προκαλεί ερύθημα [5]. Για την εξέταση των επιδράσεων MN στη διαφοροποίηση αμεσότερα, δύο δείκτες επιδερμική διαφοροποίηση, κασπάσης 14 και φιλαγγρίνη [20] αξιολογήθηκαν σε άτομα με φωτογήρανσης του δέρματος σε μία ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο κλινική δοκιμή [5]. Σύκο. 1Α παρουσιάζει ένα παράδειγμα των δειγμάτων βιοψίας βάφονται κατά την έναρξη και μετά από 12 εβδομάδες τοπική εφαρμογή ενός σκευάσματος που περιέχει 5% ΜΝ και Σχ. 1Β δείχνει την ποσοτικοποίηση της κασπάσης 14 και filaggrin σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με εικονικό φάρμακο ή ΜΝ σκευάσματα. Η παρουσία του ΜΝ ως αποτέλεσμα μια αύξηση σε σχέση με το εικονικό φάρμακο κατά 30% για την κασπάση 14 και 20% για φιλαγγρίνη. Το σκεύασμα placebo υποκατεστημένο μυριστυλ μυριστικό για MN, αποκλείοντας κάθε επιδράσεις του μυριστυλική αλκοόλη που δημιουργείται ως νικοτινικό οξύ απελευθερώνεται από το προφάρμακο.

συστοιχίες ιστών του δείγματα βιοψίας δέρματος από μια κλινική μελέτη των επιπτώσεων μυριστυλο νικοτινικού (MN) σε ανθρώπινα υποκείμενα με βλάβες από φωτεινή δέρμα [5] βάφτηκαν για τις τερματικές δείκτες διαφοροποίησης κασπάση 14 και φιλαγγρίνη. Πίνακας Α: Ένα παράδειγμα ενός δείγματος βιοψίας στην αρχή της μελέτης και 12 εβδομάδες θεραπείας ΜΝ χρωματίστηκαν με Η &? Ε, και ανοσοχρώση για κασπάσης 14 ή φιλαγγρίνη. Πίνακας Β: Ποσοτικοποίηση της χρώσης για την εικονικού φαρμάκου (n = 27) και ΜΝ αγωγή (n = 31) ομάδες για κασπάσης 14 και φιλαγγρίνη. Students t-test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση με εικονικό φάρμακο και ΜΝ αντιμετωπίζονται οι ομάδες και σ τιμές που εμφανίζονται.

Η

Τα γονίδια των υποδοχέων οξύ Το νικοτινικό εκφράζεται σε κανονικό ανθρώπινο δέρμα

Η προώθηση της επιδερμικής διαφοροποίησης από νικοτινικό οξύ μας οδήγησε στο να χαρακτηρίσει τους υποδοχείς νικοτινικού οξέος στο ανθρώπινο δέρμα ως υποτιθέμενο στόχο νικοτινικό οξύ. Γονίδια που κωδικοποιούν τόσο υψηλή συγγένεια (GPR109A) και χαμηλής συγγένειας έχουν (GPR109B) μορφές του υποδοχέα νικοτινικού οξέος έχουν περιγραφεί προηγουμένως και η έκφραση αυτών των γονιδίων έχει αναφερθεί στο δέρμα [6], [12], [21], αλλά πολύ ελάχιστο χαρακτηρισμός έχει αναφερθεί. PCR ανάλυση απεκάλυψε έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τους υποδοχείς νικοτινικού οξέος στο λιπώδη ιστό, πλακούντα, και των πνευμόνων (Εικ. 2Α), ιστών δειχθεί προηγουμένως να εκφράζουν και τις δύο μορφές του υποδοχέα [6], [7], [8], [10], [12 ]. Σύκο. 2Α δείχνει επίσης ότι οι μεταγραφές για τις δύο μορφές υψηλής και χαμηλής συγγένειας του υποδοχέα ανιχνεύθηκαν εύκολα στο ανθρώπινο δέρμα και τα κύτταρα HaCaT. Πολύ λίγα σήμα ανιχνεύτηκε σε CF3 ινοβλάστες δερματικής δέρματος (το φωτεινό σήμα μερική δείχνεται για GPR109A πιθανόν αντιπροσωπεύει μόλυνση από τη λωρίδα HaCaT καθώς δεν παρατηρήθηκε σε πειράματα επανάληψης). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης σε ανθρώπινο δέρμα που εξετάστηκαν από qRT-PCR δείχνουν ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί την μορφή υψηλής συγγένειας του υποδοχέα εκφράζεται σε περίπου 2,2 φορές υψηλότερο επίπεδο από ό, τι με τη μορφή χαμηλής συνάφειας (Εικ. 2Β).

Πίνακας Α: RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ολικό RNA από τον λιπώδη ιστό, πλακούντα, πνεύμονα, και τους ιστούς και τα κύτταρα του δέρματος χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για GPR109A (άνω σειρά) και GPR109B (κάτω σειρά), όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Πίνακας Β: qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ολικό RNA από έξι διαφορετικούς φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς δέρματος με τη χρήση ειδικών για GPR109A (σκούρο γκρι στήλη) και GPR109B ανιχνευτές (ανοιχτό γκρι στήλη) υποδοχείς, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Students t-test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση GPR109A να GPR109B, * p ≤ 0,05. Πίνακας C: αναλύσεις qRT-PCR διεξήχθησαν επί ολικού RNA από ιστούς δέκα καρκίνωμα πλακωδών ανθρώπινη χρήση ανιχνευτών ειδικών για GPR109A (σκούρο γκρι στήλες) και GPR109B (ανοιχτό γκρι στήλες) υποδοχείς. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SEM. Students t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει με το φυσιολογικό ανθρώπινο δέρμα, * p ≤ 0,05.

Η

γονίδια υποδοχέων οξύ Το νικοτινικό Οι υπερ-εκφράζεται σε πλακωδών κυττάρων του δέρματος καρκίνων

Η έκφραση και των δύο GPR109A και GPR109B σε σχέση με εκείνη του φυσιολογικού δέρματος εξετάσθηκε σε πλακώδη καρκίνους κυττάρων (SCC) σε διαφορετικά στάδια της εξέλιξης (Σχ. 2C). δείγματα σταδίου Ι SCC δείχνουν μια μικρή αύξηση στην έκφραση του mRNA της GPR109A, ενώ η έκφραση GPR109B mRNA δεν είναι σημαντικά αυξημένα. Σε όγκους IIB στάδιο II και, η έκφραση mRNA GPR109A είναι αυξημένη περίπου 3-φορές, ενώ η έκφραση GPR109B παραμένει πάλι παρόμοια με εκείνη του φυσιολογικού δέρματος. Στο στάδιο III και μη σταδιοποιημένο όγκους βαθμολογούνται ως «επεμβατική SCC», και τα δύο προφίλ έκφρασης υποδοχέα αυξημένα έως και 16 φορές σε σχέση με το φυσιολογικό ανθρώπινο ιστό του δέρματος. Σε γενικές γραμμές, η αυξημένη έκφραση των γονιδίων GPR109 αυξάνει με το στάδιο της εξέλιξης του καρκίνου.

γονίδια υποδοχέων οξύ Το νικοτινικό μεταγράφονται και μεταφράζονται σε κυτταρικές γραμμές δέρματος

Διάφορες κυτταρικές σειρές δέρματος εξετάστηκαν με qRT- PCR για την έκφραση του γονιδίου GPR109A /Β και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν σε σχέση με φυσιολογικά πρωτογενή ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (ΝΗΕΚ). Απαθανάτισε επιδερμικά κερατινοκύτταρα (κύτταρα HaCaT), ογκογόνα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (Ras-μετασχηματισμένα HaCaT), μία επιδερμοειδούς αιδοίου καρκίνωμα κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται αναφερθεί στο παρελθόν να περιέχουν υποδοχείς νικοτινικό οξύ (Α-431), και μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά πλακώδους καρκινώματος (SCC- 25) εκφράζουν mRNA για τους δύο υποδοχείς (Εικ. 3Α). Υπερ-έκφραση σε σχέση με ΝΗΕΚ παρατηρείται μέχρι και 40 φορές σε καρκινικά κύτταρα του δέρματος σε σύγκριση με ΝΗΕΚ (Εικ. 3Α). Αντίθετα, η έκφραση των υποδοχέων νικοτινικού οξέος σε χόριο που προέρχεται φυσιολογικά ανθρώπινα διπλοειδείς ινοβλάστες (CF3) είναι μη ανιχνεύσιμο

Πίνακας Α:. QRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ολικό RNA από φυσιολογικό ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (ΝΗΕΚ), αθανατοποιημένα ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (HaCaT), αθανατοποιημένων Ras-μετασχηματισμένα ανθρώπινα επιδερμικά κερατινοκύτταρα (Ras-μετασχηματισμένα HaCaT), κύτταρα ανθρώπινου επιδερμοειδούς καρκινώματος (Α-431), πλακωδών κυττάρων καρκίνωμα (SCC-25), και ανθρώπινους διπλοειδείς ινοβλάστες (CF3), χρησιμοποιώντας ανιχνευτές ειδικά για GPR109A (σκούρο γκρι στήλες) και GPR109B (ανοιχτό γκρι στήλες) υποδοχείς. Students t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει με ΝΗΕΚ, * p ≤ 0,05. Πλαίσια Β και Γ: Πρωτεΐνη Έκφραση GPR109A και GPR109B σε ανθρώπινα κύτταρα δέρματος. Κυτταρικά εκχυλίσματα από ΝΗΕΚ (λωρίδα 1), HaCaT (λωρίδα 2), Ras-μετασχηματισμένα HaCaT (λωρίδα 3), το Α-431 (λωρίδα 4), και SCC-25 (λωρίδα 5) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και Western αναλύσεις ανοσοκηλίδος χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον GPR109A /Β προ-επωάστηκαν με την απουσία (πίνακας Β) ή παρουσία (πίνακας C) 1000-φορές περίσσεια του πεπτιδίου έναντι του οποίου το αντίσωμα δημιουργήθηκε σε σχέση με καθαρισμένο αντίσωμα. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για αναλύσεις ανοσοστυπώματος Western. Μία κηλίδα εκπρόσωπος δείχνεται από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι σχετικές πυκνότητες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ. Γραφική παράσταση δείχνει τις μέσες πυκνομετρική μονάδες των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Students t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει με ΝΗΕΚ, * p ≤ 0,05.

Η

Για να καθοριστεί εάν οι μεταγραφές υποδοχέα νικοτινικό οξύ μεταφραστεί, εξετάσαμε εκχυλίσματα κυττάρων για την πρωτεΐνη GPR109A /Β χρησιμοποιώντας ένα αντι-πεπτίδιο αντίσωμα ανεπτυγμένες και χαρακτηρίζεται από το εργαστήριο μας (βλέπε Υλικά & amp? Μέθοδοι). Αυτό το αντίσωμα στοχεύει μια αλληλουχία πλησίον του Ν-άκρου κοινά για τις δύο υποδοχείς και δεν κάνει διάκριση μεταξύ της υψηλά ομόλογες GPR109A και πρωτεΐνες GPR109B. κηλίδα Western αναλύσεις δείχνουν ότι το νικοτινικό οξύ πρωτεΐνη υποδοχέα ανιχνεύθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν στο αναμενόμενο μέγεθος για τους δύο υποδοχείς νικοτινικό οξύ (~42 kDa) (Σχ. 3Β). Το πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για να δημιουργηθεί το αντίσωμα ανταγωνίστηκε αποτελεσματικά το σήμα αντίσωμα, αποδεικνύοντας την επιλεκτικότητα του αντισώματος (Σχ. 3C). Η ποσότητα της πρωτεΐνης σε σχέση με την β-ακτίνης είναι υψηλότερος στα αθανατοποιημένα, μετασχηματίζεται, και κακοήθεις κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν σε σχέση με ΝΗΕΚ.

υποδοχείς νικοτινικό οξύ στο ανθρώπινο δέρμα είναι παρούσες στην επιδερμίδα και τα μαλλιά θύλακα

Για να προσδιοριστεί η κυτταρική εντόπιση του GPR109A /Β σε ανθρώπινο δέρμα, διεξήχθησαν ανοσοχρώση αναλύσεις. Παρατηρήσαμε ότι GPR109A /B εκφράζονται από την βασική στιβάδα μέσω των ακανθώδη και κοκκώδη στρώματα της επιδερμίδας και των θυλάκων των τριχών του φυσιολογικού ανθρώπινου δέρματος (Σχ. 4Α). Μεγαλύτερη μεγέθυνση (Σχ. 4Β) αποκαλύπτει ότι η έκφραση GPR109A /Β φαίνεται να κατανέμεται πιο ομοιόμορφα σε όλο το κύτταρο στα βασικά κυτταρικά στρώματα της επιδερμίδας και δείχνει μια πιο περιφερειακές κατανομή στα ακανθώδη και κοκκώδη στρώματα όπου τα κερατινοκύτταρα είναι σε μεταγενέστερα στάδια του τερματικού διάκριση. Μια εναλλακτική φθορίζουσα ετικέτα, ισοθειοκυανική φθορεσκεΐνη (FITC), για την ανίχνευση αντι-δεσμευτικό πεπτίδιο αντίσωμα χρησιμοποιείται στο Σχ. 4C για να αποδειχθεί ότι το πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για να δημιουργηθεί το αντίσωμα εμπόδισε αποτελεσματικά δέσμευσης σε αυτούς τους ιστούς (Εικ. 4D).

ανοσοϊστοχημεία (IHC) αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ανθρώπινο δέρμα τομές ενσωματωμένες σε παραφίνη χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι GPR109A /B. Πάνελ Α και Β χρησιμοποιούνται Στρεπταβιδίνη Quantum Dot 605 Συζυγή για ανίχνευση. Πάνελ C και D που χρησιμοποιούνται FITC κατσίκας αντι-κουνελιού IgG για την ανίχνευση. Πίνακας Α: Αντιπροσωπευτικό δείγμα ανοσοχρώση εμφανίζεται στο 200 × μεγέθυνση. Πίνακας Β: Εκπρόσωπος IHC δείγμα που εμφανίζεται στο 400 × μεγέθυνση. Πάνελ Ο και D: Τα δείγματα Αντιπροσωπευτικά IHC δείχνεται στα 400 × μεγέθυνση απουσία (Πλαίσιο C) ή παρουσία (Πάνελ D) του ανταγωνισμού με το πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για να δημιουργηθεί το αντίσωμα. Συντομογραφίες: SC, της κεράτινης στιβάδας? SG, κοκκώδης στοιβάδα? SS, στρώμα spinousum? SB, στρώμα basale. δείκτης μεγέθους αντιπροσωπεύει 2 μικρά.

Η

υποδοχέα νικοτινικό οξύ κυτταρικό εντοπισμό ποικίλλει μεταξύ των καλλιεργημένων επιδερμικών κυττάρων

κύτταρα ΝΗΕΚ χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το αντι-πεπτίδιο αντίσωμα (Σχ. 5Α) και το πεπτίδιο ανταγωνισμός μπλοκαριστεί η χρώση (Εικ. 5Β). Χρώση εμφανίζεται στην περιφέρεια του συσσωματώματα κυττάρων που σχηματίζουν «δομές πλακόστρωτο» ενώ η απομονωμένη κύτταρα φαίνεται να έχουν μια πιο διάχυτη μορφή της επισήμανσης (σχ. 5Α). Σε HaCaT κυττάρων, έκφραση GPR109A /B εντοπίζεται κυρίως στην περιφέρεια (Εικ. 5C). Αντίθετα, σε Ras-μετασχηματισμένα HaCaT (Σχ. 5D), Α-431 (Σχ. 5Ε) και SCC-25 (Εικ. 5F) ο εντοπισμός μεμβράνης πλάσματος συνοδεύεται από σήμανση σε όλο το κυτταρόπλασμα. έκφραση των υποδοχέων σε ινοβλάστες δέρματος, CF3, είναι μη ανιχνεύσιμο (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

Πλαίσια Α και Β:. ανοσοκυτταροχημεία (ICC) αναλύσεις χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα έναντι GPR109A /B εκτελέστηκαν σε ΝΗΕΚ φαίνεται στο κόκκινο και συγχωνεύθηκε με την πυρηνική χρώση DAPI σε μπλε χρώμα. Το πάνελ Α δείχνει χρώση με τη χρήση του Β αντισώματος /GPR109A και Πάνελ Β δείχνει χρώση υπό την παρουσία 1000 φορές περίσσειας πεπτιδίων που χρησιμοποιούνται για την αύξηση του αντισώματος. Πίνακας C: HaCaT, Πίνακας D: Ras-μετασχηματισμένα HaCaT, Πάνελ Ε: Α-431, Πίνακας ΣΤ: SCC-25. Για όλα τα πάνελ, μεγέθυνση ήταν 400 × και δείκτη μεγέθους αντιπροσωπεύει το 10 microns.

Η

Κανονική κερατινοκύτταρα επιδεικνύουν λειτουργικό υποδοχέα συζευγμένου με G πρωτεΐνη νικοτινικό οξύ σηματοδότησης μέσω G

i του οποίου η λειτουργία είναι μειωμένη σε καρκίνο του δέρματος κύτταρα

οι περισσότερες χαρακτηρισμούς της λειτουργικότητας των υποδοχέων νικοτινικού οξέος έχουν μελετηθεί σε κύτταρα που δεν εκφράζουν ενδογενώς τους υποδοχείς, αλλά στα οποία τα γονίδια των υποδοχέων επιμολυσμένα και υπερεκφράζεται. Στις μελέτες μας, εξετάσαμε τη λειτουργικότητα εγγενή υποδοχέα με μέτρηση της ικανότητας του νικοτινικού οξέος να αναστέλλει το σχηματισμό οΑΜΡ που διεγείρεται από φορσκολίνη σε απουσία ετερόλογη έκφραση. Υπό αυτές τις συνθήκες, η σχετική συμβολή του σχηματισμού cAMP ευαίσθητων νικοτινικό οξύ είναι μικρότερη από ότι σε επιμολυσμένα κύτταρα. θεραπεία φορσκολίνη προκάλεσε σχηματισμό cAMP σε όλα τα κύτταρα που μελετήθηκαν με τη συσσώρευση των 170-200 pmol cAMP ανά mg πρωτεΐνης σε ένα επώαση 1 ώρας και παρουσία 100 μΜ νικοτινικό οξύ ανέστειλε την επαγόμενη από φορσκολίνη παραγωγή cAMP διαφορικά στους διάφορους τύπους κυττάρων ( Σχ. 6Α). Ο σχετικός βαθμός της αναστολής στις διάφορες κυτταρικές σειρές από το νικοτινικό οξύ παρουσιάζεται στο Σχ. 6Β. Αναστολή του σχηματισμού cAMP με νικοτινικό οξύ μέσω των εγγενών υποδοχέων ήταν περίπου 44% σε κύτταρα ΝΗΕΚ, 43% σε HaCaT και το 39% σε Ras-μετασχηματισμένα κύτταρα HaCaT. Σε αντίθεση, cAMP που διεγείρεται από φορσκολίνη ήταν σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα που προέρχονται από όγκους. Το νικοτινικό οξύ ανέστειλε μόνο το 23% σε Α-431 κύτταρα και 13% σε SCC-25 κύτταρα. Σύκο.