Αφηρημένο

δείγματα όγκων συχνά διατηρούνται ως (FFPE) τμήματα ιστού φορμόλη-σταθερής παραφίνη-ενσωματωμένες, την πιο συχνή κλινική πηγή για το DNA προσδιορισμού αλληλουχίας. Εδώ, αξιολογήσαμε την επίδραση των παραμέτρων προ-αλληλούχιση για να καθοδηγήσει την κατάλληλη επιλογή του δείγματος για στοχευμένη αλληλούχιση γονιδίου. Τα δεδομένα από 113 δείγματα όγκου πνεύμονα FFPE συλλέχθηκαν, και στοχευμένη αλληλούχιση του γονιδίου εκτελέστηκε. Οι βιβλιοθήκες κατασκευάσθηκαν χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένους ανιχνευτές και ζευγαρώθηκαν-άκρο αλληλουχία σε μια πλατφόρμα προσδιορισμού αλληλουχίας επόμενης γενιάς. Μία δοκιμασία PCR-based έλεγχο ποιότητας (QC) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ποιότητας του DNA, και μία αναλογία παράχθηκε σε σύγκριση με τον έλεγχο DNA. Παρατηρήσαμε ότι FFPE χρόνος αποθήκευσης, η αναλογία PCR /QC, και η είσοδος του DNA κατά την προετοιμασία της βιβλιοθήκης συσχετίζονταν σημαντικά με τις περισσότερες παραμέτρους της απόδοσης αλληλουχίας συμπεριλαμβανομένων βάθος της κάλυψης, ο ρυθμός της ευθυγράμμισης, μέγεθος ενθέματος, και διαβάστε την ποιότητα. Μια συνδυασμένη βαθμολογία χρησιμοποιώντας τις τρεις παραμέτρους δημιουργήθηκε και αποδείχθηκε εξαιρετικά ακριβείς μετρήσεις για την πρόβλεψη αλληλουχίας. Δείξαμε επίσης μεγάλη διαβάσει μεταβλητότητα μέτρηση εντός του γονιδιώματος, με χειρότερη κάλυψη σε περιοχές με χαμηλή περιεκτικότητα σε GC, όπως το

KRAS

. Δείγμα ποιότητα και το περιεχόμενο σε GC είχε ανεξάρτητες επιδράσεις επί βάθος αλληλούχιση, και τα χειρότερα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε περιοχές χαμηλής περιεκτικότητας σε GC σε δείγματα με χαμηλή ποιότητα. Τα στοιχεία μας επιβεβαιώνουν ότι τα δείγματα FFPE είναι μια αξιόπιστη πηγή για στοχευμένη αλληλουχίας γονιδίων στον καρκίνο, παρέχονται οι έλεγχοι ποιότητας κατάλληλο δείγμα ασκείται. την ποιότητα των ιστών θα πρέπει να αξιολογούνται τακτικά για προ-αναλυτική παράγοντες, και το βάθος αλληλουχίας μπορεί να περιορίζεται σε περιοχές του γονιδιώματος του χαμηλή περιεκτικότητα σε GC, εάν αναντίστοιχο δείγματα χρησιμοποιούνται

Παράθεση:. Araujo LH, Timmers C, Shilo K, Zhao W , Zhang J, Yu L, et al. (2015) Επίδραση της προ-Αναλυτική μεταβλητές για τον Καρκίνο Στοχευμένες Gene αλληλουχίας απόδοση. PLoS ONE 10 (11): e0143092. doi: 10.1371 /journal.pone.0143092

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 4η Σεπτεμβρίου του 2015? Αποδεκτές: 26 του Σεπτεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Νοεμβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Araujo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. LHA υποστηρίζεται από ένα Conquer Ίδρυμα Καρκίνου του ASCO Long-Term Διεθνές υποτροφία (LIFE) και ένα βραβείο Landon Ίδρυμα-AACR INNOVATOR για τη Διεθνή Συνεργασία στην Cancer Research. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από ένα ΝΙΗ /NCI 1RC1 CA146260-01, NCI R01CA60691, NCI R01CA87895, NCI P30CA022453, και το Ohio State Cancer Center Grant Υποστήριξης (CCSG), NCI CA16058. T.G.N και C.J.M. απασχολούνται από GenomOncology. Αυτό χρηματοδότη παρέχεται στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς (T.G.N και C.J.M), αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι αυτών των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα συγγραφέα εισφορές

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. T.G.N και C.J.M. απασχολούνται από GenomOncology. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Κατά την τελευταία δεκαετία, η καλύτερη κατανόηση της βιολογίας του καρκίνου και ο προσδιορισμός των σωματικών μεταλλάξεων στον καρκίνο έχουν οδηγήσει σε μια νέα εποχή στην εξατομικευμένη ογκολογία. [1] παραδείγματα Landmark περιελάμβανε την ανακάλυψη των μεταλλάξεων στα πρωτο-ογκογονίδια C-

KIT

στο γαστρεντερικό στρωματικών όγκων (GIST), [2] του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (

EGFR

) σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα, [3] και v-Raf σαρκώματος ποντικού ογκογονίδιο ιού ομόλογο Β1 (

BRAF

) σε μελανώματα. [4] Οι όγκοι που φιλοξενούν αυτές τις μεταλλάξεις αποδεικνύουν εξαιρετική ευαισθησία σε ειδικούς κινάσης οι αναστολείς που κατευθύνονται έναντι των αντίστοιχων ενεργοποιημένων μονοπάτια.

τα ογκογόνων μεταλλάξεων ορίζεται συχνά ως οδηγοί του καρκίνου, δεδομένου ότι προσφέρουν ένα εκλεκτικό πλεονέκτημα σε ένα κύτταρο κλώνος, που απαιτούνται για την έναρξη και τη διατήρηση του όγκου. [5] στην κλινική, μπορούν χρησιμεύσει ως δακτυλικά αποτυπώματα που βοηθούν τους κλινικούς ιατρούς να υπότυπο καρκίνους που, διαφορετικά, παρουσιάζουν παρόμοια ιστολογική πρότυπα. [6-9] Ενώ μεταλλάξεων προφίλ έχει γίνει ένα χρήσιμο εργαλείο για την καλύτερη προσαρμογή στοχευμένες θεραπείες, έχουν προκύψει νέες προκλήσεις, συμπεριλαμβανομένης της συχνής ανάγκης για την επίτευξη της βέλτιστης δείγματα όγκων για επιπλέον γενετικό έλεγχο. [10-12] επιπλέον, πολλαπλές εξετάσεις μπορεί να συστηθεί σε ένα κλινικό περιβάλλον όπου πρέπει να αξιολογηθεί μια πληθώρα των μεταλλάξεων του οδηγού υποψηφίου. Σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), οι μεταβολές σε τουλάχιστον 10 πρωτο-ογκογονίδια έχουν προταθεί ως δυνητικά «druggable», με συχνότητες μετάλλαξης που κυμαίνεται από 1% έως 25% για το

MAP2K1

και

KRAS

, αντίστοιχα, σύμφωνα με την μελέτη πληθυσμού. [13] Ο καλύτερος αλγόριθμος για τη δοκιμή, συμπεριλαμβανομένων των διαδοχική έναντι multiplex αξιολόγηση αυτών των αλλαγών είναι ακόμα ένα θέμα συζήτησης.

Αν και αλληλουχίας Sanger έχει χρησιμοποιηθεί παραδοσιακά για την ανίχνευση της υποτροπιάζουσας σημειακές μεταλλάξεις στον καρκίνο, νεότερες τεχνολογίες επέτρεψαν μια πιο ολοκληρωμένη ανάλυση των γενετικών διαταραχών. Σε αυτό το σενάριο, η αλληλούχιση επόμενης γενιάς (NGS) Πλατφόρμες-επίσης γνωστή ως μαζικά παράλληλη αλληλουχίας-προσφέρουν ένα ευρύ φάσμα ευκαιριών για τον χαρακτηρισμό του γονιδιώματος του καρκίνου. [14-16] Για παράδειγμα, η διαθεσιμότητα των τεχνικών υβριδοποίησης-σύλληψης παρέχει υπηρεσίες υψηλής -throughput και αποδοτική στρατηγική για την αξιολόγηση εκατοντάδες γονίδια ταυτόχρονα. [16-19] Ως μια σύντομη μεθοδολογική κριτική, γονιδιωματικό DNA (gDNA) καθαρίζεται από δείγματα όγκου και ψαλιδισμένα είτε ηχητική επεξεργασία ή ένζυμα περιορισμού σε εκατομμύρια μικρά θραύσματα (δεκάδες ή εκατοντάδες νουκλεοτίδια μακρύ). Αυτά τα θραύσματα στη συνέχεια υβριδοποιείται προς ένα προσαρμοσμένο σύνολο ανιχνευτών που περιέχει δολώματα ειδικές για τα γονίδια ενδιαφέροντος και ενισχύονται για να δημιουργηθεί η βιβλιοθήκη αλληλούχιση. Ένα μοναδικό barcode προσδένεται σε κάθε βιβλιοθήκη-αντιστοιχεί σε κάθε δείγμα το οποίο επιτρέπει πολλαπλά δείγματα να συγκεντρωθούν για αλληλούχιση. Αρκετές εμπορικές τεχνολογίες δέσμευσης του DNA είναι διαθέσιμα σήμερα, και πολλά ιδρύματα έχουν σχεδιαστεί και υλοποιείται με προσαρμοσμένη στοχευμένες πάνελ με γονότυπο δείγματα καρκίνου. [10, 20, 21]

Τα κλινικά δείγματα όγκων συχνά διατηρούνται ως φορμόλη σταθερό παραφίνη-ενσωματωμένες (FFPE) τμήματα ιστού σε biorepositories, και αυτό είναι το πιο άμεσα διαθέσιμη πηγή για την απόκτηση gDNA τόσο σε κλινικές και ερευνητικές ρυθμίσεις. [22-24] Ωστόσο, αρκετά στάδια στην επεξεργασία FFPE γνωστό ότι προκαλούν βλάβη του DNA, οι οποίες επηρεάζουν άμεσα DNA την ποιότητα και την επάρκεια για αλληλούχιση. Για παράδειγμα, στερέωση με φορμαλίνη μπορεί να οδηγήσει σε διάφορους τύπους διασταυρωμένων συνδέσεων μεταξύ δύο αμινοξέων, δύο νουκλεϊκά οξέα, ή μεταξύ ενός αμινοξέος και μιας βάσης νουκλεϊνικού οξέος. [25-27] Αυτές οι χημικές τροποποιήσεις μπορεί να επηρεάσει την μοριακή δοκιμή μέσω της αναστολής της ενζυματικής χειραγώγηση του DNA. στερέωση με φορμαλίνη μπορεί επίσης να προκαλέσει νουκλεοτίδιο οξείδωση και την απαμίνωση, με το τελευταίο να σχετίζεται με την ανάπτυξη της τεχνητής μεταβάσεις νουκλεοτιδίων (ως επί το πλείστον C & gt? Τ σε CpG δινουκλεοτίδια) μεταξύ των δειγμάτων που αποθηκεύονται ως FFPE [23, 28] Τέλος, σταυροδεσμοί μεθυλένιο προκαλείται φορμαλίνη μπορεί να οδηγήσει. τον κατακερματισμό του DNA, γεγονός που περιορίζει το μήκος του DNA για αλληλούχιση. Εκτός από την μονιμοποίηση φορμαλίνης, την προετοιμασία του ιστού, εμβάπτιση σε παραφίνη, και αρχειακή αποθήκευση

per se

μπορεί όλοι τελικά παίζουν ρόλο στην ποιότητα των δειγμάτων. [29] Επιπλέον, μπλοκ FFPE συχνά λαμβάνονται από μικρές βιοψίες, και η χαμηλή ιστός ποσότητα αυτή μπορεί να αποτελέσει ένα πρόσθετο περιορισμό για αλληλούχιση. Προκειμένου να αξιολογηθεί η ποιότητα των gDNA προέρχονται από δείγματα FFPE, που βασίζεται στην PCR ποιοτικού ελέγχου έχουν (QC) δοκιμασίες προταθεί. [30-33] Άλλες μεταβλητές που ενδέχεται να επηρεάσουν τα τελικά αποτελέσματα αλληλουχίας περιλαμβάνει το ποσό του DNA που χρησιμοποιείται ως πρώτη ύλη για τη βιβλιοθήκη την προετοιμασία, το βάθος αλληλουχίας, και η στοχευμένη περιοχή ενδιαφέροντος (GC περιεχόμενο και ομολογία αλληλουχίας).

Εδώ, αξιολογήσαμε την ατομική και συνδυασμένη επίδραση των παραμέτρων προ-αλληλουχίας για στοχευμένη απόδοση αλληλουχίας του γονιδίου. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε ένα πλήρως σχολιασμένα σύνολο του δείγματος που χαρακτηρίζεται από τη γνώση ενός ευρέος φάσματος προ-αναλυτικών μεταβλητών, το οποίο ο γονότυπος για μια προσαρμοσμένη πάνελ γονίδιο χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο στοχευόμενου γονιδίου αλληλούχιση προσέγγιση-ο Agilent Haloplex Target Εμπλουτισμός System (Agilent Technologies ). Η πλατφόρμα αυτή διαφέρει από τις άλλες τεχνικές υβριδοποίησης-σύλληψης από το ότι χρησιμοποιείται μια δεξαμενή από περιοριστικά ένζυμα για την πέψη το δείγμα DNA (σε αντίθεση με επεξεργασία με υπερήχους), και οι ανιχνευτές έχουν σχεδιαστεί με ομολογία μόνο με τα άκρα των στοχευμένων τεμαχίων διασπάσεως DNA. [34] στη συνέχεια, τα καθολικούς εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν τις ληφθείσες περιοχές και θα δημιουργήσει ένα υψηλής συχνότητας παρόμοιων διαβάζει, που μοιάζει με τα αποτελέσματα σε πλατφόρμες αμπλικονίου-based (S1 Σχήμα) αποτελέσματα. Για το λόγο αυτό, ορισμένες μετρήσεις αλληλουχίας σαν ποσοστό επικαλύψεις και μοναδική διαβάζει ποσοτικοποίηση δεν εφαρμόζονται σε αυτή την τεχνολογία. Εμείς επαλήθευσε επίσης το βάθος μεταβλητότητα ανάγνωσης εντός του γονιδιώματος, αποκαλύπτονται προβληματικές περιοχές με βάση το περιεχόμενο GC, και προσδιορίζεται η επίδραση των παραμέτρων αυτών στην παραλλαγή κλήση. Τα δεδομένα αυτά θα μπορούσαν να είναι πολύ κατατοπιστική για να καθοδηγήσει την κλινική και ερευνητική κοινότητα στην κατάλληλη επιλογή των κλινικών δειγμάτων για στοχευμένες αλληλουχίας του γονιδίου, και στη σωστή ερμηνεία των αποτελεσμάτων αλληλουχίας ως συνάρτηση της ποιότητας του δείγματος και την ομοιομορφία αλληλουχίας.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

το μελετηθεί σύνολο δεδομένων αποτελείται 113 δείγματα όγκου πνεύμονα εκτομή από τους ασθενείς στο James Αντικαρκινικού Νοσοκομείου /το Ohio State University (OSU, Columbus, OH) μεταξύ του 1988 και του 2011. Όλα τα δείγματα είχαν αρχειοθετηθεί ως τμήματα του όγκου FFPE, και επιλέχθηκαν με βάση τη διαθεσιμότητα των ιστών. Εκατόν δέκα δείγματα ήταν πρωταρχικός NSCLC (60 αδενοκαρκινώματα, 31 ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα, 10 αδενοχοληδωτό, και 9 άλλες ιστολογικές υποτύπους), ενώ 3 δείγματα ήταν κεφαλής και τραχήλου (όλα τα καρκινώματα πλακωδών κυττάρων) μετάστασης στους πνεύμονες (Πίνακας Α σε S1 Αρχείο). Κάθε δείγμα αποδίδεται ένα μοναδικό, αδιευκρίνιστες κώδικα, και την ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης αναθεωρήθηκε και σχολιασμένη να εκτιμηθεί ο χρόνος του όγκου αποθήκευσης μπλοκ. Το Διοικητικό κριτική Θεσμικών εγκριθεί αυτό το έργο, και παραιτήθηκε από την ανάγκη για συναινούντων.

επεξεργασία ιστών

επιλέχθηκαν οι διαχωρισμένοι δείγματα με εκπρόσωπο ιστό του όγκου για δοκιμή NGS. Για να αυξηθεί η περιεκτικότητα του όγκου, ένας παθολόγος (K.S.) σηματοδότησε μια H & amp? Ε βάφονται διαφάνεια για να οριοθετηθούν οι περιοχές του όγκου που περιέχουν, καθώς και οι περιοχές αυτές macrodissected με χειροκίνητη απόξεση των επισημαίνονται περιοχές από σειριακή μη-χρωματισμένα τμήματα FFPE. Tumor κυτταρικότητα προσδιορίστηκε με οπτική εξέταση του αριθμού των πυρήνων του όγκου σε σύγκριση με το υπόβαθρο στρωματικά στις περιοχές που σημειώνονται για macrodissection, και τα περισσότερα δείγματα (88%) είχαν ταξινομηθεί ως περιέχουν είτε υψηλή ή μέτρια κυτταροβρίθεια του όγκου (Πίνακας Β σε S1 αρχείων και S2 Εικ ). gDNA εκχυλίζεται από δείγματα FFPE με τη χρήση του Maxwell

® 16 FFPE Plus LEV DNA κιτ καθαρισμού (Promega). Δύο έως δέκα πλάκες που περιέχουν 10 μm πάχους τομές αποξέστηκαν σε έναν μικροσωλήνα και επωάζεται όλη τη νύκτα στους 70 ° C με διάλυμα πρωτεϊνάσης Κ και το ρυθμιστικό διάλυμα επώασης. Στη συνέχεια, κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρυθμιστικό λύσης, μεταφέρθηκαν σε δοχεία φόρτωση και εκτελούνται στο αυτοματοποιημένο όργανο. Τοπική δοκιμή έδειξε ότι αυτό το πρωτόκολλο έδωσε παρόμοιες ποσότητες DNA σε σύγκριση με το εγχειρίδιο συστήματα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). gDNA ποσοτικοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας το Quant-iT

™ υψηλής ευαισθησίας-DNA Assay Kit (Life Technologies

™).

ποιότητα του DNA

αξιολόγηση

Για να προσδιοριστεί η συνολική ποιότητα των ο gDNA, μία δοκιμασία QC βασιζόμενη σε PCR εφαρμόστηκε, και χρησιμοποιούνται ως οδηγός για να συστήσει την ποσότητα εισροής DNA στο παρασκεύασμα βιβλιοθήκη, όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. [35] εν συντομία, 10 ng από κάθε δείγμα DNA ενισχύθηκε με 2 ανεξάρτητος ζεύγη εκκινητών ώστε να δημιουργηθούν αμπλικόνια στοιχειωδών μεγέθη: 105 ζεύγη βάσεων (bp), και 236 bp. Ως μη υποβαθμισμένη θετικός έλεγχος, χρησιμοποιήσαμε gDNA εξάγεται από μια κυτταρική γραμμή NSCLC (Α549). Μετά την PCR, τα προϊόντα αξιολογήθηκαν για απόδοση και το επίπεδο του κατακερματισμού με τη χρήση της Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies). Ο λόγος QC υπολογίστηκε διαιρώντας το ζώνες ποσοτικού προσδιορισμού για κάθε δείγμα από την αντίστοιχη ζώνη στον θετικό έλεγχο, και στη συνέχεια, κατά μέσο όρο κάθε αναλογία μπάντα. Ένας λόγος παραπάνω QC 0,20 δείχνει ευνοϊκή ποιότητας, ενώ οι αναλογίες κάτω από 0.20 υποδηλώνει μέτρια ή κακή ποιότητα. [35]

Η υβριδοποίηση σύλληψης και αλληλούχιση

Ένα έθιμο πάνελ σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας το internet-based Σίγουρα Σχεδιασμός λογισμικού (Agilent Technologies) για την κάλυψη των περιοχών κωδικοποίησης των 81 επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με NSCLC (Πίνακας C σε S1 File). Το σύνολο του πίνακα καλύπτεται 920.980 ζεύγη βάσεων, και περιλάμβανε 44.234 αμπλικόνια. Βιβλιοθήκες κατασκευάστηκαν και αναπροσαρμόζονται με τη χρήση της Agilent Haloplex Target Εμπλουτισμός Συστήματος (Agilent Technologies). Οι ευρετήριο βιβλιοθήκες συνενώθηκαν σε ισομοριακές ποσότητες και σε συνδυασμό τέλος αλληλουχία (2 χ 100 ζεύγη βάσεων) σε 1000Χ μέση κάλυψη σε Illumina HiSeq 2500.

Η επεξεργασία δεδομένων

αλληλουχίας διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με το ανθρώπινο γονιδίωμα (hg19 συναρμολόγηση) και μπαμ αρχεία δημιουργήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SureCall (Agilent Technologies). Παραλλαγή κλήση έγινε με τη χρήση του Γονιδιώματος εργαλείο ανάλυσης Kit (GATK) Ενιαίο Genotyper. Παραλλαγή σχολιασμό πραγματοποιήθηκε σε GenomAnalytics πλατφόρμα GenomOncology του (GenomOncology, Cleveland, ΟΗ), και η Ολοκληρωμένη Γονιδιωματική Viewer (IGV, Broad Institute) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιωθεί πραγματικά θετικά. απόδοση αλληλουχίας αξιολογήθηκε με τη μέτρηση του αριθμού των διαβάζει, χαρτογραφήθηκαν διαβάζει, κάλυψη βάσης στόχου, και να διαβάσετε ποιότητας χρησιμοποιώντας Picard (Broad Institute), SAMtools και BEDTools. [36, 37] Το βάθος της κάλυψης σε περιοχές του γονιδιώματος πιστοποιήθηκε με το βάθος του εργαλείο κάλυψης (GATK), [38] και σε συγκεκριμένη γενετική θέση (hotspots) χρησιμοποιώντας IGV.

Στατιστικές μέθοδοι

Τρία προ-αναλυτική μεταβλητές χρησιμοποιούνται για την πρόβλεψη του τελικού χρόνου αποθήκευσης αλληλουχίας βάθος FFPE , αναλογία PCR /QC, και την εισαγωγή του DNA. FFPE χρόνος αποθήκευσης σε παραφίνη μπλοκ υπολογίστηκε ως το διάστημα (σε έτη) από την ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης για την ημερομηνία επεξεργασίας όγκου (εξαγωγή DNA) για αλληλούχιση. Για να δοκιμαστεί η επίδραση αυτών των μεταβλητών για τη συνολική απόδοση της αλληλουχίας, χρησιμοποιήσαμε διάφορες παραμέτρους όπως το βάθος της κάλυψης, το ποσοστό ευθυγράμμιση, ποσοστό off-στόχο, την ποιότητα βάση, μεταξύ άλλων. Η ζεύγη συσχέτιση μεταξύ των προ-αναλυτικών μεταβλητών (χρόνος αποθήκευσης, PCR /QC αναλογία και το DNA των εισροών) και παραμέτρων απόδοσης αλληλουχίας αξιολογήθηκε με τη μέθοδο του Pearson. Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε ένα σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης περιλαμβάνει γενωμική αλλαγές που βρίσκονται σε γονίδια με το λιγότερο μεταβλητότητα κάλυψη. Δέκα γονίδια διηθούνται σε:

ALK

,

BCL11A

,

REL

,

VGLL4

,

RAF1

,

FBLN2

,

RET

,

FGFR2

,

MAP2K1

,

U2AF2

. Στη συνέχεια εξαιρείται γονιδιωματικές περιοχές με συνολική κακή κάλυψη (λιγότερο από 100 μέσος αναγνώσεις) ή με υψηλή μεταβλητότητα βάθος (με τυπική απόκλιση στα ανώτερα τεταρτημόρια διακύμανσης) εντός αυτών των γονιδίων. Τα κριτήρια αυτά οδήγησαν σε εκπαίδευση σύνολο δεδομένων των 33 γονιδιωματικών περιοχών, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των μεταβλητών προ-αλληλούχιση. Πολυμεταβλητή γραμμική παλινδρόμηση διεξήχθη για τη συσχέτιση μεταξύ το μεσαίο διαβάζει και οι τρεις προ-αναλυτικών μεταβλητών και για το δυναμικό πολυσυγγραμμικότητα μεταξύ των τριών παραγόντων. Αυτή η ανάλυση έδειξε αν κάθε συμμεταβλητή που περιλαμβάνονται στο μοντέλο εξακολουθεί να συσχετίζεται σημαντικά με την απόδοση αλληλουχίας μετά την προσαρμογή για άλλους συμπαράγοντες. Μια εξίσωση με βάση την κλιμακωτή διαδικασία επιλογής μοντέλο των τριών μεμονωμένων παραγόντων και 2-way όρων αλληλεπίδρασης κατασκευάστηκε για να δημιουργηθεί το συνδυασμένο αποτέλεσμα ή την απόδοση πρόβλεψης αλληλούχιση. Το τελικό μοντέλο επιλογής των τριών μεμονωμένων παραγόντων προ-αλληλούχιση. Ο τύπος παρουσιάζεται εδώ:…

Η συνδυασμένη βαθμολογία = 202

95-7

86 * Αποθήκευση χρόνο + 249

95 * PCR αναλογία + 0

.

08 * DNA

εισόδου. Προκειμένου να αξιολογηθεί η μεταβλητότητα της κάλυψης εντός του γονιδιώματος (σε ανάλυση GC περιεχόμενο), η συνολική κάλυψη ήταν quantile-ομαλοποιημένη και, στη συνέχεια, κατανεμημένες ανάλογα με την αναλογία περιεχόμενο GC. Να συγκρίνει την επίδραση της GC περιεχόμενο και την ποιότητα των ιστών συνολικά, τα δείγματα κατανεμημένες ανάλογα με την αρχική τιμή της ποιότητας (που ορίζεται από την προ-αλληλουχίας συνδυασμένη βαθμολογία τεταρτημόρια), και το συνολικό βάθος της κάλυψης ήταν quantile-ομαλοποιηθεί μέσα σε κάθε ομάδα. P-τιμή είναι ≤ 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση R έκδοση 3.0.1, SAS 9.3, και η IBM SPSS έκδοση 22.0.

Αποτελέσματα

Δείγμα και αλληλούχιση παραμέτρους

Παρατηρήσαμε μια μεγάλη διακύμανση της δείγματος και προ-αλληλούχιση παραμέτρων QC μήκος των επιλεγμένων δειγμάτων (Πίνακας 1), συμπεριλαμβανομένου ενός φάσματος σε χρόνο αποθήκευσης FFPE 0,32 χρόνια για 24,22 χρόνια. Η δοκιμασία QC με βάση την PCR έδειξε μια διάμεση αναλογία 0.19 (εύρος 0,03 έως 0,58), προτείνοντας ότι το gDNA είχαν ευνοϊκή ποιότητα σε περίπου τα μισά από τα δείγματα, ενώ το άλλο μισό είχε χαμηλότερη ποιότητα. Το ποσό των gDNA χρησιμοποιούνται ως εισροές για την παρασκευή της βιβλιοθήκης κυμαινόταν από 77 ng έως 2337 ng, με διάμεση τιμή των 899 ng.

Η

Ο διάμεσος αριθμός των ζεύγη τέλος διαβάζει και χαρτογραφήθηκαν διαβάζει ανά δείγμα ήταν 5,0 εκατομμύρια (εύρος 1.4 έως 7.7) και 4,9 εκατομμύρια (εύρος 1.1 έως 7.6), αντίστοιχα, και το 98,1% (εύρος 78,4 – 98,9) των διαβάζει χαρτογραφηθεί στην περιοχή-στόχο. Η διάμεση πραγματική κάλυψη στόχος ήταν 881X (εύρος 204-1,373), με μέση εκατοστιαία ποσοστά στοχευόμενων αναγνώσεις καλύπτεται τουλάχιστον 20 φορές (20x), 50-πλάσιο (50x), και 100-πλάσιο (100χ) να είναι 95,4% (εύρος 78,9 – 98,8), 90,8% (εύρος 66,7 – 97,7) και 84,6% (εύρος 52,1 – 95,1), αντίστοιχα. Το μέσο μέγεθος ενθέματος ήταν 89,4 ζεύγη βάσεων (εύρος 73,5 έως 120,7), και 98,5% των κλήσεων βάσης είχε μια βαθμολογία ποιότητας Phred τουλάχιστον 30. Αυτές οι παράμετροι συνοψίζονται στον Πίνακα 1 και S3 Εικ.

Συσχέτιση προ-αναλυτική μεταβλητές και

αποτελεσματικότητα αλληλουχίας

Η προ-αναλυτική μεταβλητές (χρόνος αποθήκευσης FFPE, αναλογία PCR /QC, και την εισαγωγή DNA) συσχετίζονταν σημαντικά με τις περισσότερες παραμέτρους της απόδοσης αλληλουχίας (Σχήμα 1 και Πίνακας Α S1 αρχείου ). FFPE χρόνος αποθήκευσης σχετίστηκε αρνητικά με το συνολικό αριθμό των διαβάζει (

r

= -0,356), σημαίνει την κάλυψη του στόχου (

r

= -0,405), ποσοστό ευθυγράμμιση (

r

= -0,354), ένθετο μεγέθους (

r

= -0,764, p & lt? ποιότητα 0,01 σε όλες τις περιπτώσεις), και η μέση βάση (

r

= -0.188, p = 0.046), και θετικά συσχετίζεται με ποσοστό off-στόχο (

r

= 0,285, p & lt? 0.01), συμβατό με καλύτερα αποτελέσματα εάν έχουν επιλεγεί πιο πρόσφατα δείγματα. Ο λόγος QC συσχετίστηκε να εισάγετε το μέγεθος (

r

= 0,601, p & lt? 0.01), και σε ασήμαντο βαθμό συσχετίζονται με στόχο την κάλυψη (

r

= 0.183, p = 0.058), ποσοστό ευθυγράμμισης (

r

= 0.169, p = 0,08), και η βάση της ποιότητας (

r

= 0,162, p = 0,094). εισόδου DNA συσχετίζεται με το συνολικό αριθμό των διαβάζει (

r

= 0,548), σημαίνει την κάλυψη του στόχου (

r

= 0.549), ποσοστό ευθυγράμμιση (

r

= 0,449), σημαίνει ποιότητα βάσης (r = 0,477), και ο ρυθμός off-στόχο (

r

= -0,336, p & lt? 0,01 σε όλες τις περιπτώσεις), αλλά όχι για να εισάγετε το μέγεθος (

r

= 0,081, p = 0,395). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η καλύτερη αναλογία, QC, και υψηλότερη συμβολή του DNA κατά την προετοιμασία της βιβλιοθήκης μπορεί να προβλέψει μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα αλληλουχίας.

Τρία προ-αναλυτικών μεταβλητών (FFPE χρόνος αποθήκευσης, η αναλογία PCR /QC, και η είσοδος του DNA κατά την προετοιμασία της βιβλιοθήκης) συσχετίζονταν σημαντικά με τις περισσότερες παραμέτρους μετα-αλληλουχίας (Α). Οι προ-αναλυτική μεταβλητές ταξινομήθηκαν ως κάτω ή πάνω μέσες τιμές για να δείχνουν την επίδραση στο μέγεθος ένθετο (Β) και για να διαβάσετε την ποιότητα /βαθμολογία Phred (C). Συντομογραφίες: FFPE, τμήματα ιστού σε παραφίνη ενσωματωμένο φορμόλη-σταθερό? PCR /QC, που βασίζεται στην PCR τον έλεγχο της ποιότητας.

Η

Η συνδυασμένη επίδραση των προ-αναλυτικών μεταβλητών

Η συνδυασμένη επίδραση των προ-αναλυτικών μεταβλητών εκτιμήθηκε σε ένα σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης του 33 γονιδιωματικής περιοχές, με μέση βάθος της κάλυψης του 267 (εύρος 43 έως 464). FFPE χρόνος αποθήκευσης σχετίστηκε αρνητικά με το βάθος της κάλυψης (

r

= -0,558, p & lt? 0,01? Σχήμα 2Α), ενώ ο δείκτης QC, και εισόδου του DNA συσχετίζεται θετικά (

r

= 0,37 και 0,47, αντίστοιχα? ρ & lt? 0,01 και στις δύο? Σχήμα 2Β και 2C). Χρησιμοποιώντας μια πολυπαραγοντική ανάλυση, δείξαμε ότι κάθε μία από αυτές τις μεταβλητές ήταν ακόμη σημαντική συσχέτιση με την απόδοση αλληλουχίας (Πίνακας Ε σε S1 File). Για να δημιουργηθεί ένα μοναδικό αποτέλεσμα που προβλέπει ποιότητα του δείγματος στην ομάδα αυτή, θα συγχωνευθούν όλες τις τρεις μεταβλητές σε μια συνδυασμένη βαθμολογία, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Όπως ήταν αναμενόμενο, το συνδυασμένο αποτέλεσμα ήταν υψηλή συσχέτιση με το βάθος της κάλυψης στο σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης (

r

= 0.751? P & lt? 0,01? Σχήμα 2D). Για να επιβεβαιώσετε την ακρίβεια, εμείς σε σύγκριση με τη μέση κάλυψη στόχου σε όλες μελετήθηκαν περιοχές του γονιδιώματος (ανεξάρτητα από την προκατάληψη που προκαλείται από αριθμό αντιγράφων αλλοιώσεις) και στο βάθος ανάγνωση στις βάσεις που φέρουν συχνές βλαστική ή σωματικών παραλλαγές μοναδικού νουκλεοτιδίου (SNV), που βρίσκεται στα γονίδια δεν χρησιμοποιείται στο σύνολο δεδομένων εκπαίδευσης. Υπήρξε ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ του συνδυασμένου σκορ και το βάθος της κάλυψης σε όλες αυτές τις περιπτώσεις. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ του συνδυασμένου σκορ και το 20x, 50x και 100x βάσης στόχου κάλυψης (

r

= 0.779, 0.790 και 0.792, αντίστοιχα? P & lt? 0.01), καθώς και σε άλλα παραμέτρους αποτελεσματικότητας αλληλουχίας (Πίνακας 2 και Σχήμα 3Α).

χρόνος αποθήκευσης FFPE (Α), αναλογία PCR /QC (Β), και η είσοδος του DNA (C) συσχετίστηκαν με βάθος αλληλουχίας της κάλυψης. Μια συνδυασμένη βαθμολογία (D) κατασκευάστηκε με βάση αυτές τις τρεις παραμέτρους, και ιδιαίτερα συσχετίζεται με το βάθος αλληλουχίας. Συντομογραφίες: FFPE, τμήματα ιστού σε παραφίνη ενσωματωμένο φορμόλη-σταθερό? PCR /QC, που βασίζεται στην PCR τον έλεγχο της ποιότητας.

Η

Η συνδυασμένη βαθμολογία έντονα συσχετίζεται με τις παραμέτρους μετα-αλληλουχίας (Α). Συσχέτιση με την 50x κάλυψη χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει προ-αναλυτική όρια που θα μπορούσε να προβλέψει την αποτελεσματικότητα αλληλουχίας, και απεικονίζονται με εξομάλυνση καμπύλες (Β).

Η

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να ορίσει ένα προ-αναλυτική τιμή αποκοπής που θα μπορούσε να προβλέψει ικανοποιητικά αποτελέσματα αλληλούχισης. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάζονται τα μεταβλητές προ-αλληλουχίας (συμπεριλαμβανομένης της συνδυασμένης βαθμολογίας) έναντι της κάλυψης 50x στο σύνολο δεδομένων μας, και ορίζεται το 90% 50x κάλυψη ως παράμετρος για ευνοϊκά αποτελέσματα. Σύμφωνα με αυτή την ανάλυση, ένα χρόνο αποθήκευσης FFPE του 8,6 χρόνια, ένας λόγος PCR /QC από 0,22, μία είσοδο DNA 960 ng, ή μια συνδυασμένη βαθμολογία των 266 είχαν κατωφλίων που σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα αλληλουχίας (Σχ 3Β).

χαμηλό βάθος της κάλυψης ήταν χαρακτηριστικό των περιοχών με χαμηλή περιεκτικότητα σε GC

Εκτός από την ποιότητα του δείγματος, αξιολογήσαμε την επίδραση της σύνθεσης βάσης σε βάθος αλληλουχίας. Για να εκτιμηθεί το βάθος της ομοιομορφίας κάλυψης, αξιολογήσαμε τη μέση κανονικοποιημένη κάλυψη σε όλες τις περιοχές του γονιδιώματος που καλύπτεται από τα σχεδιασμένα ανιχνευτές. Δείξαμε μεγάλη μεταβλητότητα, και παρατήρησε ότι η κακή κάλυψη συσχετίστηκε σημαντικά με τις περιοχές που παρουσιάζουν χαμηλότερη περιεκτικότητα GC (Σχήμα 4Α). Η καλύτερη κάλυψη παρατηρήθηκε σε περιοχές με αναλογίες περιεχόμενο 0,5-0,7 GC, με μια σημαντική επιδείνωση κάτω από 0,4 (p & lt? 0,01). Στη συνέχεια, μπορούμε στρωματοποιημένη δείγματα σύμφωνα με την αρχική τιμή της ποιότητας (που μετράται από την προ-αλληλουχίας συνδυασμένη βαθμολογία), και την εκ νέου αξιολόγησε την επίδραση περιεχόμενο GC. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι περιοχές με χαμηλή περιεκτικότητα σε GC (κάτω από 0,4) είχε χειρότερη κάλυψη σε κάθε στρώμα, με έντονη χαμηλότερη κάλυψη σε δείγματα με κακής ποιότητας προ-αλληλουχίας (Σχήμα 4Β).

Κανονικοποιημένη βάθος της κάλυψης παρουσιάζει μεγάλη μεταβλητότητα στο εσωτερικό το γονιδίωμα, με χειρότερη κάλυψη που παρατηρείται σε περιοχές με χαμηλότερη περιεκτικότητα σε GC (Α). Η επίδραση περιεχόμενο GC ήταν πρόσθετο για να δοκιμάσετε την ποιότητα για να προβλέψει το βάθος της κάλυψης, όπως παρατηρήθηκε μετά από στρωματοποίηση ποιότητα του δείγματος χρησιμοποιώντας το συνδυασμένο σκορ (Β). Συντομογραφίες:. Στ Dev, την τυπική απόκλιση. OBS: ** δείχνει διαφορά p & lt? 0,01

Η

Επιπτώσεις της μεταβλητότητας κάλυψη για γονιδιακή hotspots

Όπως μετρήσεις αλληλουχίας είναι τελικά ένα υποκατάστατο για τη βέλτιστη παραλλαγή κλήση, θα ανακριθεί αν η ποιότητα του δείγματος. και το περιεχόμενο GC θα έχουν αντίκτυπο στην κάλυψη του στόχου σε θέσεις hotspot στο

KRAS

και

EGFR

. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 3, αυτά τα γονίδια αποτελούν παραδείγματα τα αντίθετα άκρα του φάσματος κάλυψης που παρατηρείται στο παρόν. Ενώ οι θέσεις hotspot στο

EGFR

παρουσίασε μια ιδανική περιεκτικότητα σε GC (0,51 – 0,55) και τη βέλτιστη κάλυψη,

KRAS

έδειξε χαμηλότερη περιεκτικότητα GC (0,33 – 0,36) και δραματικά χειρότερη κάλυψη. Ο διάμεσος αριθμός των διαβάζει στο

KRAS

κωδικόνιο 12 ήταν μόνο 51 (εύρος 3-183), και η κάλυψη 20x και 50x στόχος ήταν 87,9% και 51,4%, αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, όλα τα

EGFR

θέσεις hotspot παρουσίασε ικανοποιητική κάλυψη (Πίνακας 3). Όπως NGS παραλλαγή καλώντας αγωγοί θα περιλαμβάνουν συχνά τα φίλτρα βάσεις για μια ελάχιστη κάλυψη (π.χ.. 20x ή 50x), επαναλαμβανόμενες

KRAS

μεταλλάξεις θα μπορούσαν εύκολα να χαθεί λόγω της χαμηλής κάλυψης. Στην πραγματικότητα, 12 από τις 22

KRAS

μεταλλαγμένο περιπτώσεις εντοπίστηκαν μεταξύ των δειγμάτων με 50 διαβάζει ή λιγότερο, και 3 περιπτώσεις βρέθηκαν με λιγότερο από 20 διαβάζει (Πίνακας ΣΤ στο S1 File), οι οποίες επιβεβαιώθηκαν από επιθεώρηση Διαβάστε οπτική. Κακή κάλυψη σε αυτές τις περιοχές θα μπορούσε επίσης να μειώσει την ευαισθησία για την ανίχνευση μεταλλάξεων χαμηλής συχνότητας αλληλόμορφο. Χρησιμοποιώντας ένα ελάχιστο συνδυασμό ορίου βαθμολογίας των 266, ο μέσος αριθμός των διαβάζει στο

KRAS

κωδικόνιο 12 ήταν 72,5 (εύρος 18-183), και η κάλυψη 20x και 50x ήταν 98,2% και 80,4%. Σύμφωνα με πρόσφατα δημοσιεύματα, παρατηρήσαμε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της αναλογίας PCR /QC, και την δινουκλεοτίδιο CpG σε TpG μεταβάσεις (

r

= -0.186? P = 0.049). Παρόμοιες συσχετίσεις δεν παρατηρήθηκαν σε άλλες προ-αναλυτικών μεταβλητών ή άλλες αλλαγές δινουκλεοτίδιο.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαίωσε ότι κλινικά δείγματα FFPE είναι μια αξιόπιστη πηγή DNA για οι στοχευμένες αλληλουχίας γονιδίων στον καρκίνο, με την προϋπόθεση έλεγχοι ποιότητας κατάλληλο δείγμα ασκείται. Δείξαμε ότι τρία προ-αναλυτική μεταβλητές-FFPE χρόνο αποθήκευσης, αναλογία PCR /QC, και η είσοδος του DNA στην βιβλιοθήκη παρασκεύασμα-συσχετίζονταν σημαντικά με τις περισσότερες παραμέτρους αποτελεσματικότητας αλληλούχιση. Η συνδυασμένη εξέταση των χαρακτηριστικών αυτών μπορεί να είναι ιδιαίτερα χρήσιμος για τον ορισμό δείγμα επάρκεια για αλληλούχιση, όπως αποδεικνύεται από μια συγκεντρωτική μοντέλο που προέρχονται από αυτά, η οποία σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό την αποτελεσματικότητα αλληλούχιση. Δείξαμε επίσης σημαντική μεταβλητότητα σε βάθος της κάλυψης εντός του γονιδιώματος, εξαρτάται από την αναλογία GC περιεκτικότητα. Περιοχές του γονιδιώματος με χαμηλότερη περιεκτικότητα σε GC παρουσίασε χειρότερα βάθος της κάλυψης, και αυτό το αποτέλεσμα ήταν προσθετικό για να δοκιμάσετε την ποιότητα.

Έχει αποδειχθεί ότι τα δεδομένα NGS από δείγματα FFPE έχουν μικρότερα βιβλιοθήκη μεγέθη ενθέτου και μεγαλύτερη μεταβλητότητα κάλυψη. [23] εδώ, πήγαμε περαιτέρω να αποδείξει ότι ο χρόνος αποθήκευσης FFPE, αναλογία PCR /QC, και την εισαγωγή DNA μπορεί όλα να προβλέψει την ποιότητα αλληλουχίας σε αυτήν την ομάδα. Για παράδειγμα, FFPE χρόνος αποθήκευσης (ή την ηλικία του όγκου) αρνητική συσχέτιση με διάφορες παραμέτρους μετά την αλληλούχιση, συμπεριλαμβανομένων βάθος της κάλυψης, μέγεθος ενθέματος, και την ποιότητα βάσης. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τα ευρήματα από Hedegaard et al [12], ο οποίος επίσης έδειξε καλύτερα αποτελέσματα όταν χρησιμοποιήθηκαν πιο πρόσφατα ελήφθησαν δείγματα FFPE. Με αυτή την έννοια, διάφοροι παράγοντες μπορεί να έχουν επηρεάσει αρνητικά τα αποτελέσματα σε μεγαλύτερα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων των μη-τυποποιημένων μεθόδων που χρησιμοποιούνταν στο παρελθόν για τη στερέωση του όγκου, την επεξεργασία, την ενσωμάτωση, καθώς και του χρόνου αποθήκευσης

per se

. Από την άλλη πλευρά, Schweiger et al [39] δεν βρήκε επίδραση της ηλικίας του όγκου σε βάθος αλληλουχίας, ωστόσο, ότι η μελέτη περιορίστηκε από ένα πολύ μικρό μέγεθος του δείγματος (μόνο 7 δείγματα FFPE). Παρά το γεγονός ότι τα μεγαλύτερα όγκοι μπορεί να αποτελεί εξαίρεση σε κλινικό περιβάλλον, οι παθολόγοι μπορεί να χρειαστεί να χρησιμοποιήσουν την αρχαία δείγματα FFPE σε συγκεκριμένες ρυθμίσεις της έρευνας. Μερικά πιθανά σενάρια περιλαμβάνουν αναδρομική ανάλυση μοναδικά δείγματα που αποκτήθηκαν σε κλινικές δοκιμές, η μελέτη των σπάνιων νόσων, και όταν τα δείγματα τράπεζα ιστών είναι η μόνη διαθέσιμη πηγή. Εάν μεγαλύτερα δείγματα πρέπει να συμπεριληφθούν, μπορεί να είναι απαραίτητη για να επιλεγούν εκείνοι με την καλύτερη ποιότητα του DNA (χρησιμοποιώντας εκτιμήσεις του κατακερματισμού του DNA). Όταν εναλλακτικές πηγές δεν είναι μια επιλογή, αυξάνοντας την είσοδο του DNA ή του βάθους αλληλουχίας μπορεί να βοηθήσει να ξεπεραστούν οι εγγενείς περιορισμοί που σχετίζονται με την μεγαλύτερη διάρκεια αποθήκευσης των δειγμάτων και παλαιότερες μεθόδους χειρισμού.

Διαφορετικές μέθοδοι έχουν αναφερθεί για την αξιολόγηση της ποιότητας των gDNA προέρχονται από κλινικά δείγματα FFPE. Αυτές περιλαμβάνουν την επαλήθευση της 280 αναλογία Α260 /χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο Nanodrop (αναλογία 1.8 ή μεγαλύτερη υποδεικνύει λογική καθαρότητα), τον υπολογισμό του εκτιμώμενου ποσού διπλής έλικας του DNA διαίρεση qubit

® εκτίμηση DNA από Nanodrop (σχέσεις 0.4 ή νεότερη έκδοση είναι ιδανικό) , τρέχει ένα υποπολλαπλάσιο gDNA σε πήκτωμα αγαρόζης ή TapeStation (θραύσματα 200 bp ή λιγότερο ένδειξη κακής ποιότητας), ή χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση που βασίζεται σε PCR. [30-33] σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα πρότυπο πρωτόκολλο που συνιστάται από τον κατασκευαστή , με βάση την PCR ενίσχυση γονιδιωματικών περιοχών διαφορετικών μεγεθών. [35] Χαμηλή ποιότητα του DNA θα παραγάγει λιγότερο άφθονες αμπλικονίων, προσομοιώνοντας τα αναμενόμενα αποτελέσματα κατά την διάρκεια του εμπλουτισμού στόχο. Αυτού του είδους η ανάλυση ανεξάρτητα συσχετίζεται με το βάθος της κάλυψης, με υψηλότερες αναλογίες δίνοντας την καλύτερη κάλυψη. Αυτή η δοκιμή που βασίζεται σε PCR είναι σχετικά απλή, φθηνή, χρησιμοποιεί χαμηλή ποσότητα DNA ως πρώτη ύλη, και ως εκ τούτου εφαρμόζονται εύκολα στα περισσότερα εργαστήρια.

input DNA στο παρασκεύασμα βιβλιοθήκη είναι ένας σημαντικός προγνωστικός παράγοντας της επιτυχίας αλληλούχιση. [21 ] Για την πλατφόρμα που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη, ο κατασκευαστής συνιστά ένα ελάχιστο των 225 ng του gDNA (που εκτιμάται με μεθόδους φθορισμού όπως PicoGreen

® ή qubit

®), το οποίο μπορεί να αυξηθεί σε περίπτωση χαμηλής ποιότητας DNA . Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η είσοδος του DNA συσχετίζεται με το βάθος αλληλουχίας, ευθυγράμμιση ρυθμό, την ποιότητα βάση, και ο ρυθμός off-στόχο. Το πιο σημαντικό, η είσοδος του DNA ήταν εναλλάξιμες με άλλες παραμέτρους προ-αλληλουχίας (ηλικία όγκου, PCR /QC) για να προβλέψει το βάθος αλληλουχίας. Αυτό σημαίνει ότι οι υψηλότερες εισόδου DNA μπορεί συχνά αντισταθμίσει χαμηλής ποιότητας DNA, ενώ η υψηλή ποιότητα του DNA θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε ουσιαστικά χαμηλότερα εισόδου, όπως φαίνεται από την συνδυασμένη ανάλυση βαθμολογίας που παρουσιάζονται εδώ.

δημιουργείται ένα μοναδικό αποτέλεσμα που λαμβάνει υπόψη τα στοιχεία από τρία προ-αναλυτική μεταβλητές που αποδεικνύεται ανεξάρτητη επίδραση στις βάθος αλληλουχίας. Επιπλέον, έχουμε σκεφτεί για πιθανές τιμές αποκοπής για κάθε μία από αυτές τις μεταβλητές που θα μπορούσαν να βοηθήσουν στον καθορισμό της επάρκειας των ιστών για ανάλυση ακολουθίας. Αν και μπορεί να είναι ελκυστικό για να εξετάσει αυτές τις αξίες στη ρουτίνα των εργαστηρίων αλληλουχίας, ορισμένοι περιορισμοί πρέπει να συζητηθούν. Για παράδειγμα, εξακολουθεί να είναι αβέβαιο εάν η αξιολόγηση αυτή θα μπορούσε να εφαρμοστεί και σε άλλες ρυθμίσεις, ειδικά αν είναι διακριτές QC ή NGS δοκιμασίες που χρησιμοποιούνται.