Αφηρημένο

microRNA ρυθμίζει κυτταρικές αποκρίσεις σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) μέσω μεταφραστικό έλεγχο των γονιδίων στόχων. Αναλύσαμε αλλαγές χρονοσειρών στην έκφραση microRNA ακόλουθα γ-ακτινοβολία σε Η1299 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα με τη χρήση ανάλυσης μικροσυστοιχιών. επιλέγεται μεταβλήθηκαν σημαντικά IR αποκρίνονται microRNAs βασίστηκαν σε ανάλυση της ανάλυση διακύμανσης, και η προβλεπόμενη mRNAs στόχοι εμπλουτισμένο σε ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) σηματοδότησης. Ταυτόχρονη ανάλυση του mRNA χρονοσειρών και προφίλ microRNA αποκάλυψε ότι η έκφραση του miR-26b ήταν κάτω ρυθμίζονται, και ο στόχος της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα 2 (ΑΤΡ2) mRNA ήταν μέχρι ρυθμίζεται Η1299 κυττάρων γ-ακτινοβολημένα. IR σε miR-26β υπερεκφράζεται Η1299 κύτταρα δεν θα μπορούσαν να επάγουν την έκφραση του ΑΤΡ2. Όταν c-Jun Ν-τερματικής κινάσης δραστικότητα αναστάλθηκε χρησιμοποιώντας SP600125, η έκφραση του miR-26b προκλήθηκε εξής γ-ακτινοβολία σε Η1299 κύτταρα. Από αυτά τα αποτελέσματα, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι IR επαγόμενη ανοδική ρύθμιση του ΑΤΡ2 συντονισμένα ενισχύεται από την καταστολή της miR-26β στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, η οποία μπορεί να ενισχύσει την επίδραση του IR στο μονοπάτι σηματοδότησης ΜΑΡΚ

Citation.: Arora η Qureshi R, Πάρκο AK, Πάρκο WY (2011) συντονισμένη κανονισμού του ΑΤΡ2 από miR-26b σε κύτταρα γ-ακτινοβολημένα καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (8): e23802. doi: 10.1371 /journal.pone.0023802

Επιμέλεια: Sangdun Choi, Πανεπιστήμιο Ajou, Κορέα

Ελήφθη: 16 Ιούν 2011? Αποδεκτές: 26 Ιουλίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 25, Αυγ του 2011

Copyright: © 2011 Arora et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το χαρτί υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση του Ιδρύματος Κορέας Επιστημών και Μηχανικής (KOSEF) (M20706000020-07M0600-02010), και από το πρόγραμμα βασικής Έρευνας Εργαστήριο (BRL) μέσω του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών της Κορέας που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας (2009 -0087452) και από την Κορέα Υγειονομική περίθαλψη τεχνολογίας Ε & amp? D Έργου, Υπουργείο Υγείας, Πρόνοιας και Οικογενειακών Υποθέσεων (A084022). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή οι

τα microRNAs μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση II και συνδέονται προς την 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) να καταστείλει μετάφραση των mRNA στόχου [1]. Στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, τα microRNAs εμπλέκονται σε πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης [2], του πολλαπλασιασμού, κυτταρικό θάνατο [3], και ογκογένεση [4]. Πολλές μελέτες έχουν αναλύσει την μεταγραφική ρύθμιση των mRNA και microRNAs σε κύτταρα γ-ακτινοβολημένα να κατανοήσουν κυτταρικών αποκρίσεων σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) [5], [6], [7].

Ο ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση (ΜΑΡΚ) παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες, όπως απόπτωση, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, σηματοδότηση Wnt, και σηματοδότηση ρ53. ΜΑΡΚ σηματοδότηση συχνά απορυθμισμένη στους ανθρώπινους καρκίνους, που οδηγεί σε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση [8]. IR μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ για τον έλεγχο της κυτταρικής επιβίωσης σε έναν τύπο με τρόπο που εξαρτάται κυττάρου [9]. Η απόκριση ενεργοποίησης IR μονοπατιών σηματοδότησης ΜΑΡΚ έχει σχέση με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [10].

Πιο μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης μπορεί να ρυθμίζεται με μεταγραφικές και μετα-μεταφραστική έλεγχο των γονιδίων. Η microRNAs miR-7, miR-4, miR-79, miR-2, και miR-11 εμπλέκονται σε μονοπάτια σηματοδότησης Notch με τη στόχευση των ρυθμιστικών μοτίβων αλληλουχίας στην 3 ‘UTR των γονιδίων στόχων [11]. miR-15 και miR-16 εμπλέκονται στην οδό σηματοδότησης κόμβων [12]. Πυρηνικό παράγοντα του ενισχυτή γονιδίου του πολυπεπτιδίου κάππα ελαφριάς σε Β-κύτταρα 1, ένας μεσολαβητής DNA βλάβη σηματοδότησης, ρυθμίζεται από miR-9 και ας-7 g σε απόκριση IR στον καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές [7]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το προφίλ έκφρασης χρονοσειρών των microRNAs σε γ-ακτινοβολημένα κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα. Προσπαθήσαμε να εντοπίσει IR-απόκρισης microRNAs που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων ΜΑΡΚ σηματοδότησης μέσω ταυτόχρονης ανάλυσης των microRNA και mRNA προφίλ. Δείξαμε τη συντονισμένη ρύθμιση της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα 2 (ΑΤΡ2), η οποία κωδικοποιείται από ένα γονίδιο σηματοδότηση ΜΑΡΚ, με miR-26b σε απάντηση IR.

Αποτελέσματα

Για να καταλάβετε μετα-μεταγραφικό έλεγχο του κυτταρικές αποκρίσεις σε IR με microRNAs, το προφίλ έκφρασης γονιδιώματος πάνω από microRNA εξετάστηκε σε Η1299 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα σε 0, 4, 8, 12, και 24 ώρες μετά την θεραπεία με 2Gy του γ-ακτινοβολίας. Το προφίλ έκφρασης microRNA αναλύθηκε με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) για να επιλέξετε IR αποκρίνονται microRNAs. Μεταξύ 328 ανθρώπινα microRNAs στη μικροσυστοιχία, την έκφραση της 56 (17,1%: 30 επάνω ρυθμισμένη και 26 ρυθμισμένα προς τα κάτω) μεταβλήθηκε σημαντικά σε Η1299 κύτταρα (ρ & lt? 0,05? Εικόνα 1 και Πίνακας S1). Ευδιάκριτη αλλαγές παρατηρήθηκαν σε 8 ώρες μετά την γ-ακτινοβόληση στα περισσότερα από τα IR-απόκρισης microRNAs.

μεταγράφεται αντίστροφα μικρό RNAs από κάθε χρονικό σημείο σημάνθηκαν με Cy5. Ο κώδικας χρώμα αντιπροσωπεύει τη σχετική έκφραση υποδεικνύεται microRNAs για κάθε χρονικό σημείο. Μια λίστα όλων των microRNAs είναι διαθέσιμη στον πίνακα S1.

Η

Για να εξερευνήσετε τη φυσιολογική έννοια του IR-απόκρισης microRNA, έχουμε καταγεγραμμένο προβλέψει mRNAs στόχος του IR-απόκρισης microRNAs και τα μονοπάτια εμπλουτισμένο σηματοδότησης επιλέχθηκαν με βάση την εμπλουτισμός και η στατιστική ανάλυση του mRNA-στόχου προβλέπεται από DIANA-μΤ-3.0. Μεταξύ των εισηγμένων μονοπάτια σηματοδότησης, εστιάσαμε στην κορυφή 10 πορείες με βάση τη στατιστική σημασία (Πίνακας 1). Εμείς ειδικά Επιλέξαμε το ΜΑΡΚ μονοπάτι για περαιτέρω ανάλυση σηματοδότησης, διότι αυτό μονοπάτι σηματοδότησης είναι απαραίτητη για την επιβίωση σε απόκριση σε βλάβη του DNA [13].

Η

Για την επικύρωση ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης ΜΑΡΚ μέσω IR αποκρίνονται microRNAs, εμείς μετα-αναλύθηκαν προφίλ έκφρασης mRNA του ίδιου Η1299 κύτταρα γ-ακτινοβολημένα από δημοσιευμένα σύνολα δεδομένων μας [14]. Σε ταυτόχρονη ανάλυση του mRNA στόχου και IR-απόκρισης microRNA, εφαρμόσαμε δύο κριτήρια: 1) στατιστικά σημαντικές αλλαγές (ρ & lt? 0,05) στην έκφραση του mRNA μετά γ-ακτινοβόληση με ανάλυση ANOVA και 2) η τιμή συσχέτισης υψηλή αντίστροφη (R & lt? -0,4 ) μεταξύ του mRNA και την έκφραση microRNA. Όπως συνοψίζεται στο Σχήμα 2 και στον Πίνακα S2, εντοπίσαμε 35 ζεύγη IR αποκρίνονται microRNAs και mRNAs στόχων, συμπεριλαμβανομένων 19 microRNAs και 23 μη-επικαλυπτόμενα mRNAs για ΜΑΡΚ σηματοδότηση γονίδια οδού σε Η1299 κύτταρα.

Η

επικύρωσε τα πρότυπα έκφρασης του IR-απόκρισης microRNAs και mRNAs στόχο για το μονοπάτι σηματοδότησης ΜΑΡΚ. Μεταξύ 35 ζεύγη, επιλέξαμε και αναλύθηκαν τέσσερις (MIR-26β: ΑΤΡ2, miR-7: FOS, miR-20a: MAP3K5, και miR-128: PPARG) ζευγών με αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR? Σχήμα 3Α , Β, Γ και Δ). Όπως ανιχνεύεται σε σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών (Σχήμα 2), βρήκαμε ότι ATF2, FOS, και MAP3K5 ήταν μέχρι ρυθμίζονται και PPARG ήταν κάτω ρυθμίζεται μετά από έκθεση IR. Τα microRNAs όπως miR-26b, miR-7 και miR-20a είχαν τα κάτω ρύθμιση, και miR-128 ήταν μέχρι ρυθμίζονται κατά την έκθεση IR. Με πραγματικού χρόνου RT-PCR, αποδείξαμε ότι τα πρότυπα έκφρασης των επιλεγμένων IR αποκρίνονται microRNAs και mRNAs στόχος ήταν καλά συμφωνημένα με εκείνες των στοιχείων έκφρασης μικροσυστοιχίας.

Η έκφραση των τεσσάρων ζευγών των microRNA και mRNA στόχου όπως (Α) miR-26b: ATF2, (Β) miR-7: FOS, (C) miR-20a: MAP3K5, και (Δ) miR-128: PPARG) ποσοτικοποιούνται με την χρησιμοποίηση πραγματικού χρόνου αντίστροφης αλυσίδας μεταγραφής-πολυμεράσης αντίδραση (RT-PCR) κατά τον προκαθορισμένο χρόνο. Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με γλυκεραλδεΰδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH) mRNA για mRNAs στόχο και U6B μικρό RNA για microRNAs. Όλες οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση (SD) από πειράματα εις τριπλούν.

Η

Down-ρυθμίζεται IR-απόκρισης microRNAs μπορεί να αυξήσει την λειτουργία των mRNA στόχου. Για να δοκιμαστεί η σχέση μεταξύ της κάτω-ρυθμίζονται IR-απόκρισης microRNAs και mRNAs στόχου, επιλέξαμε το ζεύγος των ATF2 και miR-26b μεταξύ 35 ζεύγη να αποδείξουν συντονισμένη ρύθμιση μεταξύ microRNAs και τα mRNA στόχου κατά την έκθεση IR. Ένα προβλεπόμενο στόχο ταυτοποιήθηκε για miR-26β στη θέση 112-118 του ΑΤΡ2 3 ‘UTR, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α. Η υπερέκφραση του miR-26b σε Η1299 κύτταρα θα μπορούσε να καταστείλει το επίπεδο έκφρασης του ATF2 mRNA. Επιπλέον, το επίπεδο πρωτεΐνης του ΑΤΡ2 ήταν μειωμένη σε miR-26β-υπερεκφράζεται κύτταρα (Σχήμα 4Α). Σε προσδιορισμούς λουσιφεράσης, miR-26b κατέστειλε την μετάφραση του λουσιφεράσης σε κατασκευάσματα με την 3 ‘UTR του ATF2, αλλά όχι εκείνα χωρίς το 3’UTR (Σχήμα 4Β). Η κατασταλτική δράση του miR-26b επί ΑΤΡ2 παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα Η1299 γ-ακτινοβολημένα (Σχήμα 4C), η οποία διατηρήθηκε μέχρι 12 ώρες μετά την έκθεση IR.

(Α) Σε miR-26β επιμολυσμένα Η1299 κύτταρα, η έκφραση των microRNA επιβεβαιώθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Η έκφραση του mRNA σε ATF2 miR 26β-επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης ΑΤΡ2 κανονικοποιήθηκαν έναντι GAPDH και παρουσιάζονται ως μέση ± SD από πειράματα εις τριπλούν. Το επίπεδο πρωτεΐνης του ΑΤΡ2 εξετάσθηκε επίσης με western blot σε κύτταρα microRNA-επιμολυσμένα. (Β) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με το γονίδιο άδειο Renilla λουσιφεράσης (psiCHECK2) ή του γονιδίου αναφοράς συντήκεται προς το ΑΤΡ2 3 ‘UTR. Επιπλέον, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με miR-26b ή χωρίς miR-26β? Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως σχετικές μονάδες φωτός (RLU) και ομαλοποιήθηκαν με τη δραστικότητα λουσιφεράσης εκφράζεται ιδιοσυστατικά από το φορέα psiCHECK2. ώρες (Γ) Η σχετική έκφραση του ΑΤΡ2 στην miR-26b επιμολυσμένα και IR εκτίθενται τα κύτταρα σε 4 (λευκό), 8 (γκρι) και 12 (μαύρο), αντίστοιχα.

Η

Στη συνέχεια, θελήσαμε να επιβεβαιώσει η επίδραση της ΜΑΡΚ σηματοδότησης σε ρύθμιση προς τα κάτω του miR-26b σε κύτταρα γ-ακτινοβολημένα. Εμείς ανέστειλε την οδό σηματοδότησης ΜΑΡΚ χρησιμοποιώντας SP600125, έναν αναστολέα c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), σε Η1299 κύτταρα γ-ακτινοβολημένα. Η θεραπεία με SP600125 δεν άλλαξε το βασικό επίπεδο έκφρασης του ΑΤΡ2? Ωστόσο, η επαγωγή του ΑΤΡ2 κατά την γ-ακτινοβόληση αξιοσημείωτα αποκλείστηκε σε Η1299 κύτταρα SP600125 επεξεργασμένα μέχρι 12 ώρες μετά την έκθεση IR (Σχήμα 5Α). Η έκφραση του ΑΤΡ2 απαιτεί ενεργοποίηση της σηματοδότησης ΜΑΡΚ, η οποία αναστάλθηκε σε JNK από το χημικό αναστολέα. Αντιστρόφως, η έκφραση του miR-26b προκλήθηκε με κατεργασία με SP600125 σε Η1299 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 5Β). Οι επιδράσεις του SP600125 στην έκφραση του mRNA και ΑΤΡ2 miR-26b επιβεβαιώθηκε επίσης σε καρκίνο του πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή (Σχήμα 5).

Η1299 και τα κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ SP600125 για 30 λεπτά, και στη συνέχεια εκτίθενται σε IR. Οι σχετικές εκφράσεις του ATF2 mRNA (Α) και miR-26b (Β) κανονικοποιήθηκαν με το επίπεδο έκφρασης του ελέγχου στους 0 hr και στις δύο ελέγχου και SP600125-κατεργασμένων κυττάρων στα 4 (λευκό), 8 (γκρι) και 12 (μαύρο ) ώρες. (Γ) Η ιονίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται από την έκφραση του ΑΤΡ2, που κάτω-ρυθμίζεται η έκφραση του miR-26b σε γ-ακτινοβολημένα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Η

Συζήτηση

Οι κυτταρικές αποκρίσεις σε εξωγενή διέγερση μπορεί να παρακολουθείται με αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων έκφραση microRNAs. IR μπορεί να προκαλέσει προοδευτικές αλλαγές στην κυτταρική επιβίωση, την ανάπτυξη, και τον πολλαπλασιασμό επηρεάζοντας τη γονιδιακή έκφραση. Προηγούμενες αναφορές έχουν υποδείξει ότι η ακτινοβολία μπορεί να αλλάξει το πρότυπο έκφρασης των γονιδίων [15], [16]. Αναλύσαμε προφίλ microRNA για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό των microRNA-κυτταρικές αποκρίσεις στο IR, και να προσδιορίσει ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης ΜΑΡΚ με IR-απόκρισης microRNAs. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε φωτιστεί το JNK μεσολάβηση μεταγραφικό καταστολή της miR-26b σε κύτταρα γ-ακτινοβολημένα, για τις οποίες microRNA μπορεί να καταστείλει την μετάφραση του στόχου ΑΤΡ2 mRNA, ένα μέλος της οδού σηματοδότησης ΜΑΡΚ. Από αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ότι η κυτταρική απόκριση σε IR ρυθμίζεται συντονισμένα από την αλληλεπίδραση μεταξύ του μονοπατιού σηματοδότησης ΜΑΡΚ και microRNA.

ΑΤΡ2 είναι ένα στοιχείο πρόσδεσης (CREB) πρωτεΐνη cAMP-απόκρισης με ένα βασικό φερμουάρ λευκίνης (bZIP) περιοχή, μέσω της οποίας ΑΤΡ2 αλληλεπιδρά με άλλες πρωτεΐνες bZIP όπως JUN, FOS, CREB, και ATF1 [17], [18]. βλάβη του DNA και προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες μπορεί να επάγει την ενεργοποίηση του μεταγραφικής δραστικότητας ATF2 από JNK [19]. Ο ρόλος των διαφορετικών σηματοδότηση στην ενεργοποίηση του ΑΤΡ2 καταδεικνύεται επίσης από ετεροδιμερείς συνεργάτες του ΑΤΡ2, τα οποία επίσης ενεργοποιούνται σε ένα ερέθισμα-ειδικό τρόπο. Έτσι, ένα συγκεκριμένο ερέθισμα μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικά σύμπλοκα ATF2, ενεργοποιώντας έτσι ή καταστολή διακριτά υποσύνολα των γονιδίων στόχων [20].

miR-26b είναι μια ιντρονική microRNA που κατοικούν στο ιντρόνιο IV του CTDSP1, C-τερματικό τομέα μικρό φωσφατάση 1. Το μεταγραφικό έλεγχο CTDSP1 mRNA υποδοχής δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά υπάρχουν πολλές πιθανές θέσεις δέσμευσης για παράγοντες μεταγραφής όπως CREB σε ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ Transcription Factor Binding Analysis [21]. ΑΤΡ2 θα μπορούσε να καταστείλει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων μέσω διμερισμού με άλλους παράγοντες μεταγραφής bZIP. Η υπερέκφραση των πρωτεϊνών bZIP όπως ATF2 και CREB μετέβαλαν την έκφραση γονιδίων σε ανθρώπινα κύτταρα του μυομητρίου [22]. Μετα-ανάλυση σε αυτό μικροσυστοιχιών σύνολα δεδομένων σε GEO (GSE1059) αποκάλυψε τα κάτω ρύθμιση των CTDSP1 στα κύτταρα ΑΤΡ2 υπερεκφράζεται. Χρειάζεται περαιτέρω μελέτη αναφορικά με το μεταγραφικό έλεγχο του miR-26b με ΑΤΡ2 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα? Ωστόσο, η δράση JNK και έκφραση του ΑΤΡ2 κατασταλεί έκφραση του miR-26b πραγματοποιείται στην παρούσα μελέτη.

Απορρύθμιση της οδού σηματοδότησης ΜΑΡΚ μπορεί να επαχθεί με IR-προκαλούμενη βλάβη του DNA [23]. Στην παρούσα μελέτη, βρέθηκε ότι ΜΑΡΚ σηματοδότηση διεγείρεται σε Η1299 κύτταρα γ-ακτινοβολημένα, το οποίο θα μπορούσε να μεσολαβήσει την επιβίωση του καρκίνου του πνεύμονα Η1299 κύτταρα κατά την έκθεση IR. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ σηματοδότησης οδήγησε σε ρύθμιση προς τα κάτω του miR-26b, το οποίο υποστήριξε τη διατήρηση της δραστικότητας με τη σειρά του ATF2. Από τα αποτελέσματα αυτά, θα μπορούσαμε να αποδείξει ότι η έκθεση του Η1299 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε IR επαγόμενη σηματοδότηση ΜΑΡΚ που ακολουθείται από καταστολή της έκφρασης miR-26b, η οποία οδήγησε στην διαφυγή του ΑΤΡ2 mRNA από μετα-μεταφραστική καταστολή με miR-26b. Προτείνουμε ότι το miR-26b μεσολαβεί συντονίζει ρύθμιση του ATF2 και το μονοπάτι σηματοδότησης ΜΑΡΚ σε απάντηση IR.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Η1299 ανθρώπινου πνεύμονα καρκινικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 και τα κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ, Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, και 2 mM L-γλουταμίνη [αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την ATCC]. Τα καλλιεργημένα κύτταρα είτε εκτέθηκαν σε 2 Gy ακτινοβολίας χρησιμοποιώντας ένα 4-MV γραμμικό επιταχυντή (Clinac 4/100? Varian, ΡβΙο Alto, CA, USA) ή αριστερά μη εκπέμπον ως αρνητικός έλεγχος. Η συγκεκριμένη SP600125 αναστολέας JNK αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). κύτταρα Η1299 επωάστηκαν με 10 μΜ SP600125 για 30 λεπτά, και στη συνέχεια εκτίθενται σε IR (2 Gy) που ακολουθείται από τη συνολική απομόνωση RNA σε υποδεικνυόμενους χρόνους.

microRNA μικροσυστοιχιών

microRNA από κάθε κυτταρική γραμμή ήταν εκχυλίζεται με τη χρήση του κιτ απομόνωσης mirVana microRNA (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Καθαρισμένα microRNAs σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας το mirVana microRNA Kit Array Σήμανση και συζευγμένο με το Cy5 Μετα-Labeling δραστικής χρωστικής (Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, USA). Τα επισημασμένα δείγματα πλύθηκαν και υβριδοποιούνται εις διπλούν με mirVana microRNA Bioarrays (Ambion) χρησιμοποιώντας το mirVana microRNA Bioarray Essentials Kit. εντάσεις φθορισμού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και μετρήθηκαν με τη χρήση του σαρωτή GeneChip 3000 7G (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Τα επίπεδα του υβριδισμού microRNA προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας GenePix Pro 6.0 λογισμικό όπως συνιστάται από τον κατασκευαστή. Το υπόβαθρο προσαρμοσμένο έντασης για κάθε microRNA υποβλήθηκε σε γενική διαδικασία σταθεροποίησης ομαλοποίηση της διακύμανσης [24]. Όλα τα δεδομένα είναι MIAME συμβατό και η ανεπεξέργαστα δεδομένα έχει κατατεθεί σε μια βάση δεδομένων συμβατή MIAME (GEO) (αριθμός ένταξης – GSE30075).

Στατιστική και ανάλυση βιοπληροφορικής

Για την αναγνώριση microRNAs για τους οποίους τα επίπεδα έκφρασης μεταβληθεί σημαντικά καθ ‘όλη τη χρονική πορεία, χρησιμοποιήσαμε μονόδρομη ανάλυση ANOVA. Λαμβάνοντας υπόψη τη δομή συσχέτισης της εντός συστοιχία επαναλήψεις [25] στο mirVana microRNA Bioarrays, πραγματοποιήσαμε μονόδρομη ανάλυση ANOVA σε 328 ανθρώπινα microRNAs. DIANA (https://diana.cslab.ece.ntua.gr/), η οποία ενσωματώνει ανθρώπου και ποντικού microRNAs σε μονοπάτια για να προβλέψει στόχους microRNA [26], έγινε αρχικά για τον εντοπισμό οδών.

προετοιμασία RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικό RNA εκχυλίσθηκε από κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΤΚΙζοΙ, και στη συνέχεια μεταγράφεται ανάστροφα σε συμπληρωματικό DNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφάση Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και ολιγο- (dT) 12-18 εκκινητές σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ποσοτική RT-PCR για υποδεικνύεται γονιδίων πραγματοποιήθηκε σε ένα μείγμα αντίδρασης που περιέχει SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japan). Η ποσοτικοποίηση των microRNAs διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan προσδιορισμούς microRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας ΑΒΙ PRISM 7000 (Applied Biosystems). Όλες οι PCR διεξήχθησαν εις τριπλούν, και η εξειδίκευση της αντίδρασης προσδιορίζεται με ανάλυση καμπύλης τήξης κατά το στάδιο διαστάσεως. Συνθέσαμε ειδικούς εκκινητές για ATF2 (προς τα εμπρός: 5′-AGATTTATTAATTTTTCTGTGCTCAA-3 ‘? Αναστραφούν: 5’ ACACCCCCATTTATTAAAACACC-3 ‘), FOS1 (προς τα εμπρός: 5′-TGTGTTCCTGGCAATAGTGTG-3′? Αντίστροφος: 5’-CAATGAACATTGATGTTGAAGAAA-3 ‘), MAP3K5 (εμπρός: 5’-GCAGCAGCTATTGCACTTCA-3 ‘? αντίστροφη: 5′-TGGTCACATTTTGGTTTTGTTC-3′) και PPARG (εμπρός: 5’-CCTGCAGGAGATCTACAAGGA-3 ‘? αντίστροφη: 5′-GGTGTCAGATTTTCCCTCAGA-3’). Η σχετική ποσοτική μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτική ανάλυση. Ο βαθμονομητής ήταν το μέσο όρο ΔCt από τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Η ενδογενής έλεγχος ήταν γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) για τα γονίδια και U6B για microRNAs.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο και Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου-δωδεκύλ νάτριο, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε πολυβινυλιδένιο φθορίδιο μεμβράνες (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με ένα αντίσωμα ATF2 (1:1000? Santa Cruz Biotechnology Inc.) σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα Tween 20 ρυθμιστικό με άπαχο ξηρό γάλα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (αραίωση 1:5000? Bio -Rad). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το West-Q-Χημειοφωταυγές υπόστρωμα Kit Plus (BIOTANG, Waltham, ΜΑ, USA).

μορφώματα, επιμόλυνση, και δοκιμασία λουσιφεράσης

Ο πρόδρομος του miR-26b ήταν κλωνοποιήθηκε εντός pcDNA3 (Invitrogen) με γονιδιωματικό DNA PCR με εκκινητές (εμπρόσθιος: 5′-CCGGAATTCCGGATGGGAATTGGATACAT-3 ‘? αντίστροφος: 5′-ATTGCGGCCGCAGCTACCCTGACCACTGCTGC-3’). Οι 3 ‘UTRs του ΑΤΡ2 κλωνοποιήθηκαν προς τα κάτω του γονιδίου της λουσιφεράσης της Renilla στη psiCHECK2vector (Promega, Fitchburg, WI, USA). Το κατασκεύασμα διαμολύνθηκε χρησιμοποιώντας FuGENE HD αντιδραστήριο (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) για πραγματικού χρόνου RT-PCR, κηλίδωση Western και δοκιμασίες λουσιφεράσης. Λουσιφεράσης δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Dual-Luciferase δοκιμασίας (Promega). Κανονικοποίηση της έκφρασης Renilla διεξήχθη χρησιμοποιώντας λουσιφεράση πυγολαμπίδας που υπάρχει στον φορέα psiCHECK2.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

λίστα των επιλεγμένων microRNAs από Η1299 κύτταρα.

doi: 10.1371 /journal.pone.0023802.s001

(XLSX)

Πίνακας S2.

επιλεγμένου mRNA: microRNA ζεύγη του μονοπατιού σηματοδότησης ΜΑΡΚ με βάση την ανάλυση εμπλουτισμού.

doi: 10.1371 /journal.pone.0023802.s002

(XLSX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω τα μέλη του εργαστηρίου Πάρκο για συζήτηση, καθώς και H.-S . Shin και H.-J. Jeon για μικροσυστοιχίες microRNA.