Αφηρημένο

V-Raf σαρκώματος ποντικού ογκογονίδιο ιού ομόλογο Β (BRAF) μεταλλαγμένο καρκίνο του πνεύμονα είναι σχετικά επιθετική και είναι ανθεκτική σε στιγμή διαθέσιμες θεραπείες. Σε μια πρόσφατη μελέτη φάσης ΙΙ για ασθενείς με BRAF-V600E μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), αναστολέα V600E BRAF έδωσαν στοιχεία δραστηριότητας, αλλά το 30% αυτής της επιλεγμένης ομάδας προχώρησε τη διάρκεια της θεραπείας, γεγονός που υποδηλώνει την ανάγκη για την ανάπτυξη εναλλακτικών στρατηγικών. Δοκιμάσαμε δύο διαφορετικές επιλογές για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας των vemurafenib (αναστολέας V600E BRAF) στο BRAF μεταλλαγμένα NSCLC. Η πρώτη επιλογή ήταν η προσθήκη της erlotinib να vemurafenib για να δούμε αν ο συνδυασμός παρέχεται συνέργεια. Το δεύτερο ήταν να προκληθεί ΜΕΚ αναστολή (κατάντη της RAF) με trametinib (αναστολέας ΜΕΚ). Βρήκαμε ότι ο συνδυασμός vemurafenib και erlotinib δεν ήταν συνεργιστική στην αναστολή της σηματοδότησης ρ-ERK σε κύτταρα BRAF-V600E. Vemurafenib προκάλεσε σημαντική απόπτωση, G1 σύλληψη και την προς τα πάνω ρύθμιση των BIM στα κύτταρα BRAF-V600. Trametinib ήταν αποτελεσματικό ως μονοθεραπεία σε BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα, είτε V600E ή μη-V600E. Τέλος, ο συνδυασμός των vemurafenib και trametinib προκάλεσε μια μικρή αλλά σημαντική αύξηση στην απόπτωση όπως επίσης και μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του BIM σε σύγκριση με είτε απλός παράγων. Έτσι, υπαινίχθηκε την πιθανότητα χρησιμοποιώντας μια συνδυαστική προσέγγιση για τη διαχείριση αυτής της ομάδας των ασθενών. Σημαντικά, trametinib μόνη προκάλεσε αυξητική ρύθμιση του π-ΑΚΤ σε BRAF V600 μη μεταλλαγμένα κύτταρα, ενώ το αποτέλεσμα αυτό εξουδετερωθεί με το συνδυασμό. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι, ο συνδυασμός ενός αναστολέα ΜΕΚ με έναν αναστολέα BRAF θα είναι πιο αποτελεσματική στην κλινική ρύθμιση για τους ασθενείς με NSCLC BRAF μεταλλαγμένο

Παράθεση:. Joshi Μ, Rice SJ, Liu Χ, Miller Β, Belani CP (2015) Trametinib με ή χωρίς Vemurafenib στο BRAF Μεταλλαγμένα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (2): e0118210. doi: 10.1371 /journal.pone.0118210

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 10 Σεπτεμβρίου του 2014? Αποδεκτές: 9 του Ιανουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 του Φλεβάρη του 2015

Copyright: © 2015 Joshi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Η πλειοψηφία των ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) διαγιγνώσκονται σε μεταγενέστερο στάδιο και σήμερα διαθέσιμες θεραπείες, συμπεριλαμβανομένων της χημειοθεραπείας και της ακτινοθεραπείας φαίνεται να είναι ανεπαρκής για την ήττα αυτή τη θανάσιμη ασθένεια. Η παρουσία ενός ενεργοποιητική μετάλλαξη στον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) συνδέεται με υψηλά ποσοστά ανταπόκρισης και βελτιωμένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) με τη χρήση των αναστολέων της κινάσης τυροσίνης EGFR (ΤΚΙδ) [1-3]. Η erlotinib και gefitinib είναι TKIs πρώτης γενιάς που προκαλούν αναστρέψιμη αναστολή της περιοχής της κινάσης της τυροσίνης του EGFR. Erlotinib είχε αρχικά εγκριθεί για κλινική χρήση σε προχωρημένο NSCLC στη δεύτερη ρύθμιση γραμμή στη βάση των θετικών αποτελεσμάτων της BR.21 δοκιμή φάσης 3 [4]. 3 δοκιμές Φάσης, όπως OPTIMAL (erlotinib σε σχέση με τη χημειοθεραπεία ως θεραπεία πρώτης γραμμής για ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα EGFR με θετικό στη μετάλλαξη μη μικροκυτταρικό-κυττάρων) [5] και IPASS (Iressa Pan Μελέτη Ασίας) [6], έχουν δείξει σαφείς βελτιώσεις στα ποσοστά ανταπόκρισης και επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) με TKIs πρώτη γενιά στην πρώτη ρύθμιση γραμμή σε σύγκριση με την παραδοσιακή χημειοθεραπεία βασισμένη στο λευκόχρυσο. Αυτό έχει ήδη οδηγήσει στη χρήση του EGFR TKIs ως θεραπεία πρώτης γραμμής για ασθενείς με ΜΜΚΠ που στεγάζει την ευαισθητοποίηση μετάλλαξη του EGFR σε αντίθεση με τη συνήθη χημειοθεραπεία συνδυασμού. Ομοίως, BRAF (v-Raf σαρκώματος ποντικού ογκογονίδιο ιού ομόλογο Β1) μετάλλαξη μπορεί επίσης να οδηγήσουν την ανάπτυξη του όγκου σε NSCLC. Μεταλλάξεις στο

BRAF

γονιδίου έχουν μια συχνότητα ~ 2-3% σε NSCLC [7,8]. Μια μετάλλαξη V600E στο εξόνιο 15 περιλαμβάνει περίπου 50% του συνόλου των μεταλλάξεων BRAF ενώ οι μη-V600E μεταλλάξεις BRAF συνθέτουν το υπόλοιπο 50% [9].

BRAF μεταλλαγμένο NSCLC πιστεύεται ότι είναι επιθετική και δείχνουν resistanceto σήμερα διαθέσιμες θεραπείες [10]. Vemurafenib είναι ένα από του στόματος αναστολέας BRAF εκλεκτικός για την μετάλλαξη V600E, και έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική στη θεραπεία ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα με την ίδια μετάλλαξη. Υπάρχουν στοιχεία που υποστηρίζουν ότι οι αναστολείς BRAF, χρησιμοποιείται μόνο του σε NSCLC με BRAF-V600E θετική μετάλλαξη, δείχνουν μόνο ένα μικρό όφελος χωρίς πλήρη απαντήσεις, το 40% μερική ανταπόκριση, και 30% με την εξέλιξη της νόσου κατά τη θεραπεία [11]. Η επίδραση της ΜΕΚ αναστολής (ΜΑΡΚ /ΕΚΚ κινάσης) σε BRAF μεταλλαγμένο NSCLC δεν έχει διερευνηθεί διεξοδικά και μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι ο συνδυασμός ενός αναστολέα BRAF (dabrafenib) και αναστολέα ΜΕΚ (trametinib) ήταν επίσης αποτελεσματικό στη θεραπεία προχωρημένο μελάνωμα [12 ]. Trametinib είναι ένας από του στόματος διαθέσιμη ΜΕΚ αναστολέα που εγκρίθηκε πρόσφατα από το Food and Drug Administration (FDA) για χρήση στη θεραπεία του μεταστατικού μελανώματος σε ασθενείς με BRAF-V600E και BRAF-V600K μεταλλάξεις, με βάση τα αποτελέσματα μιας κλινικής δοκιμής από Flaherty

et al.

, δείχνοντας ένα σημαντικό όφελος τόσο ελεύθερη εξέλιξης και τη συνολική επιβίωση [13].

σε προκλινικές ρύθμιση, υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (RTK) αναστολή έχει δεσπόζουσα επίδραση στην καταστολή των φωσφολιπιδίων της 3-κινάση (PI3K ) μονοπάτι σηματοδότησης. Ένας από τους μηχανισμούς αντοχής για την αναστολή RTK σε μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές KRAS είναι μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης RAS [14]. Μια κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου με μια μετάλλαξη BRAF V600E δείχθηκε να διαφύγει vemurafenib αναστολή από ενεργοποίηση του υποδοχέα επιθηλιακού αυξητικού παράγοντα (EGFR)? Ωστόσο, η θεραπεία αυτών των κυττάρων με vemurafenib και ένα EGFR αναστολέα εμπόδισε vemurafenib αντίσταση και απόπτωση που επάγεται [15]. Υποθέτουμε ότι η μετάλλαξη στην οδό BRAF προκαλεί υπερ-ενεργοποίηση της ERK και ως εκ τούτου, συνδυάζοντας αναστολή του EGFR με αναστολή BRAF θα ήταν επωφελής. Έχουμε, επίσης, έθεσε ως στόχο να προσδιορίσει εάν ο αναστολέας trametinib ΜΕΚ θα ευαισθητοποιήσει κύτταρα το γονίδιο BRAF μεταλλαγμένο άγριου τύπου (WT) EGFR NSCLC στην αναστολή BRAF από vemurafenib. Υποθέσαμε ότι τα κύτταρα BRAF-V600E έχουν περιορισμένη ευαισθησία στον αναστολέα BRAF λόγω της ενεργοποίησης της οδού ΜΑΡΚ [12]. Ως εκ τούτου, trametinib θα μπορούσε να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα ενός αναστολέα BRAF σε BRAF μεταλλαγμένα NSCLC. Αντοχή σε αναστολείς BRAF επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση πολλαπλών μηχανισμών που προκαλεί επανενεργοποίηση του ΜΑΡΚ μονοπατιού [16-19]. Trametinib στοχεύει ΜΕΚ, η οποία είναι κατάντι του BRAF στην οδό ΜΑΡΚ. Ως εκ τούτου, συνδυάζοντας trametinib με έναν αναστολέα BRAF, είτε vemurafenib ή dabrafenib, θα ήταν πιο αποτελεσματική. Ο στόχος μας ήταν να διερευνηθεί αν trametinib και vemurafenib θα μπορούσαν να συνεργαστούν για να καταστείλει την /ΜΑΡΚ μονοπατιού σηματοδότησης ΕΚΚ στο BRAF μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές NSCLC. Εμείς συνέκρινε την αποτελεσματικότητα του ενιαίου παραγόντων, vemurafenib ή trametinib, με εκείνη του συνδυασμού vemurafenib συν trametinib στο BRAF μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές NSCLC, HCC364 [V600E-BRAF, WT EGFR] και H1755 [μη-V600E, G469A BRAF μεταλλαγμένο, WT EGFR ].

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές, αντιδραστήρια και αντισώματα

Α549, Η460, H1755 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Μανασσή, VA). Ότι, η HCC364 κυτταρική σειρά ελήφθη από το εργαστήριο έρευνας Δρ Adi F. Gazdar, το Πανεπιστήμιο του Τέξας, Southwestern Medical Center (Dallas, TX) [20]. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός, στρεπτομυκίνη και πενικιλίνη στους 37 ° C με 5% CO

2. BRAF V600E και G469A μεταλλάξεις στα κύτταρα HCC364 και H1755, αντίστοιχα, επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ανάλυσης θραύσμα στιγμιότυπο σύμφωνα με το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε από Su et al. (S1 Σχ.) [21]. Αντισώματα αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ). Erlotinib, vemurafenib και trametinib ελήφθησαν από Selleckchem (Houston, TX).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και δοκιμασίες μακροπρόθεσμης ανάπτυξης

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1×10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια 96 -Καλά πλάκα καλλιέργειας ιστού. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με erlotinib, trametinib, vemurafenib, ή συνδυασμούς όπως υποδεικνύεται στο σχήμα θρύλους. Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος του οχήματος. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε 48 ή 72 ώρες μετά την αγωγή φαρμάκου χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο Titer 96 υδατικά δοκιμασία μη ραδιενεργό κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega, Madison WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Σχετική βιωσιμότητα υπολογίστηκε για κάθε φρεάτιο με αφαίρεση της απορρόφησης υποβάθρου πριν από την κανονικοποίηση για τον έλεγχο του οχήματος αγωγή φρεάτια.

δοκιμασίες Μακροπρόθεσμη αύξηση διεξήχθησαν με εμβολιασμό κυττάρων στα 1500 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μια πλάκα 12. Φάρμακα προστέθηκαν κατευθείαν σε κάθε φρεάτιο την επόμενη ημέρα, και φρέσκα μέσα με φάρμακο προστέθηκε μετά από 4 ημέρες. Μετά από 7 ημέρες, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 2% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), επωάστηκαν με 70% αιθανόλη για 5 λεπτά, και στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,1% trypan blue για 60 λεπτά σε RT. Μετά τον αποχρωματισμό σε PBS τρεις φορές, φρεάτια σαρώθηκαν. Στη συνέχεια, η χρωστική διαλυτοποιήθηκε σε 1% SDS και μετρήθηκε η απορρόφηση στα 590 nm για τρία κλάσματα 100 μΐ από κάθε φρεάτιο σε αναγνώστη πλακός Synergy ΗΤ (BioTek, Shoreline WA). Ιστορικό απορρόφηση από ένα καλά χωρίς κύτταρα αφαιρέθηκε από πειραματικές τιμές, και πειραματικές τιμές ομαλοποιήθηκαν με την αγωγή του οχήματος.

Ανοσοστύπωμα δοκιμασία

Οι πρωτεΐνες συλλέχθηκαν από κύτταρα σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει 40 mM Tris.Cl ρΗ 7,6, 1% Triton Χ-100, 1% δεοξυχολικό, 150 mM NaCl συν πρωτεάσης και φωσφατάσης κοκτέιλ αναστολέα (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Η συνολική πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε με κιτ BCA (Thermo Scientific, Waltham ΜΑ), και ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν έως 10% πηκτώματα SDS-PAGE, ηλεκτροκηλιδώθηκαν σε PVDF, και δεσμεύτηκαν με 5% NFDM. Αποκλεισμένα μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα, με τα κατάλληλα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα, πριν από την ανίχνευση χημειοφωταύγειας.

Η κυτταρομετρία ροής

Η απόπτωση προσδιορίστηκε με χρώση των κυττάρων με FITC-επισημασμένο Annexin-V ( BD Pharmingen, San Jose CA)) και ViaProbe (7-AAD, BD Pharmagen) πριν από την ανάλυση σε μια ροή Calibur κυτταρομετρητή (BD Biosciences, San Jose CA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε μία πλάκα 6 φρεατίων, και τις επόμενες ημέρες κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τους υποδεικνυόμενους φάρμακα. Η πακλιταξέλη χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για τα πειράματα απόπτωσης. Εικοσιτέσσερις έως 48 ώρες μετά τις θεραπείες, τα επιπλέοντα κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν έπειτα χρωματίζονται με αννεξίνη-V-FITC και 7-AAD σε 1χ ρυθμιστικό δέσμευση αννεξίνης V (BD Biosciences) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Ο φθορισμός μετρήθηκε με ένα κυτταρόμετρο ροής και προκύπτοντα δεδομένα αναλύθηκαν με WinMDI 2,8 λογισμικό (The Scripps Institute, https://facs.scripps.edu/software.html).

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε με αιθίδιο βρωμιούχο χρώση. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τριπλούν σε μία πλάκα 6-φρεατίων μια μέρα πριν από τη θεραπεία φαρμάκων. Μετά από 24 ώρες, οι πυρήνες συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν σε ένα υποτονικό διάλυμα λύσης (7 mM κιτρικό νάτριο, 0,2% Triton Χ-100) με βρωμιούχο αιθίδιο (50 ng /ml) και RNase Α (50 μg /ml) για 30 λεπτά στο σκοτάδι. Ο φθορισμός μετρήθηκε σε ένα κυτταρόμετρο ροής Calibur. Τα αποκτηθέντα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση ModFitLT 3.2 του λογισμικού (Verity Software House, Topsham ME).

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των δύο ομάδων ή μεταξύ πολλών ομάδων αναλύθηκε με δύο όψεων t-τεστ αταίριαστα Φοιτητών (για ίσες διακυμάνσεις), όπως εφαρμόζεται από το Excel 2007 (Microsoft Corp., Redmond WA). Όλα τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SEM των τριπλών τιμών από τρία ξεχωριστά πειράματα. * P & lt? 0.05, ** p & lt? 0.01, και *** ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. t-tests Ανεξάρτητα του Student ή μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση των συνεχών μεταβλητών μεταξύ των δύο ομάδων ή περισσότερες από δύο ομάδες. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε ρ & lt? 0.05. Η κυτταροτοξική συνέργεια αναλύθηκε και γράφημα με τη χρήση του λογισμικού CalcuSyn (Biosoft, Cambridge UK) και εκφράστηκε ως ο δείκτης συνδυασμού στο LC99 (δηλαδή, συγκέντρωση θανατηφόρα για το 99% των κυττάρων). Περαιτέρω επιβεβαίωση ελήφθη με σε μια μήτρα 5×5 χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία CellTiter-Glo και Bliss προσθετικό μοντέλο ανάλυσης.

Αποτελέσματα

Η έκφραση της p-ERK και p-ΑΚΤ σήματα στα κύτταρα NSCLC

Η απελευθέρωση των δύο RAF /ΜΑΡΚ και AKT /mTOR μονοπάτια σηματοδότησης θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου σε NSCLC [22]. Πολυάριθμες συστατικά αυτών των οδών σηματοδότησης μπορούν να δράσουν ως μοριακοί στόχοι σε θεραπευτικά καρκίνου, αλλά είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε την παρουσία αυτών των εκτροπών σε καρκινικά κύτταρα για κλινική επίπτωση [23]. Προσδιορίσαμε πρώτα την βασική έκφραση της φωσφορυλιωμένης (ρ) -Akt και π-ERK 1/2 σε κυτταρικές γραμμές μας (Εικ. 1Α). Η φωσφορυλιωμένη σήμα ERK ανιχνεύθηκε σε όλες τις 4-κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στα πειράματά μας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η οδός ERK παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου σε KRAS ή BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα. Φάρμακα που στοχεύουν αυτό το μονοπάτι μπορεί να αποδειχθεί αποτελεσματική. Ωστόσο, ρ-ΑΚΤ ήταν αχνά ανιχνεύθηκε σε BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα, HCC364 και H1755 σε σύγκριση με Α549 και Η460 κυτταρικές γραμμές, όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α. Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι AKT δεν μπορεί να παίξει ως ζωτικής σημασίας ρόλο στην BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα

Α:. Κηλίδα Western φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ και σηματοδότησης ERK στη μητρική ανεπεξέργαστων κυτταρικές σειρές ([+] μεταλλαγμένα? [-] άγριος τύπος). Όλες οι λωρίδες είναι από την ίδια γέλη και διακοπή δημιουργήθηκε ώστε να περιλαμβάνει μόνο τις σχετικές κυτταρικές σειρές Β: Α549, κυτταρικές σειρές Η460, H1755 και HCC364 αγωγή με D (DMSO) ή υποδεικνύεται φάρμακα, Ε (erlotinib), V (vemurafenib) και EV (erlotinib-vemurafenib) αναλύθηκαν μετά από 72 ώρες με δοκιμασία MTS. Η IC50 για Vemurafenib σε HCC364 ήταν 0,8 μΜ. C: κηλίδα Western διαφόρων NSCLC κυτταρικές γραμμές, που δείχνουν τις μεταβολές σε ρ-ERK, ρ-ΑΚΤ και PARP με όχημα D (DMSO), Ε (erlotinib) 1,6 μΜ, V (vemurafenib) 1,6 μΜ, EV (erlotinib + vemurafenib) 1,6 /1.6, μΜ μετά τη θεραπεία 24 ώρες. D: Η απόπτωση με κυτταρομετρία ροής 48 ώρες μετά την αγωγή με D (DMSO), Ε (erlotinib) 1,6 μΜ, V (vemurafenib) 1,6 μΜ, EV (erlotinib /vemurafenib 1.6 /1.6 μΜ). κηλίδα Western, μετά από 48 ώρες, υποστηρίζοντας διάσπαση PARP με V και EV σε HCC364 αλλά όχι H1755 κυττάρων.

Η

Η erlotinib και vemurafenib

Η αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού με erlotinib και vemurafenib. Ο συνδυασμός ενός EGFR στοχευμένων μονοκλωνικό αντίσωμα (cetuximab) και BRAF (vemurafenib) αναστολή είχε δείξει αποτελεσματικότητα σε καρκινικά κύτταρα κόλου με BRAF μετάλλαξη [15]. Επιδιώξαμε να καθοριστεί εάν μια παρόμοια έννοια του συνδυασμού BRAF και EGFR αναστολές θα μπορούσε να είναι αποτελεσματικό σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Α549, Η460, H1755 και HCC364 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις της erlotinib, vemurafenib, ή ο συνδυασμός της erlotinib και vemurafenib (5-φορές σειριακές αραιώσεις για απλούς παράγοντες και 2,5 φορές αραιώσεις 1: 1 αναλογία του συνδυασμού). προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων έδειξε ότι μόνο HCC364 κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε vemurafenib και ο συνδυασμός των vemurafenib και erlotinib δεν ήταν αποτελεσματικό (Σχ. 1Β). κύτταρα H1755 ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε vemurafenib και καμία σημαντική συνέργεια παρατηρήθηκε με το συνδυασμό της erlotinib και vemurafenib. Vemurafenib ήταν αναποτελεσματική στην KRAS μεταλλαγμένα κύτταρα (Α549, Η460). Επιπλέον, η έλλειψη συνέργειας μεταξύ erlotinib και vemurafenib επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BLISS (S2 Εικ.) [24].

Οι ογκογόνο μεταβολές της σηματοδότησης μετά τη θεραπεία για 24 ώρες με το συνδυασμό των vemurafenib συν erlotinib (1,6 μΜ /1.6 μΜ) αναλύθηκαν με προσδιορισμό ανοσοστυπώματος (σχ. 1C). Vemurafenib μειωμένη φωσφορυλίωση της ERK στο HCC364 κύτταρα μόνο χωρίς επακόλουθη αύξηση σε ενεργοποιημένα ΑΚΤ. Αυτό το εύρημα πρότεινε ότι η έλλειψη συνέργειας μεταξύ erlotinib και vemurafenib δει σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού είναι λόγω της σχέσης ERK-ΑΚΤ εμφανίζονται σε καρκίνο του παχέος εντέρου και δεν είναι παρούσα στα κύτταρα HCC364. Αυτό πιθανώς δεν σχετίζονται με την επιλογή του αναστολέα του EGFR (cetuximab εναντίον erlotinib). Vemurafenib μόνη που προκαλείται από την ενεργοποίηση της σηματοδότησης ERK σε μη-BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα, Α549 και Η460. Καμία σημαντική αλλαγή στην ενεργοποιημένη ERK σημειώθηκε σε H1755 κυττάρων μετά από θεραπεία vemurafenib. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι ο συνδυασμός vemurafenib και erlotinib οδήγησε σε μείωση στην ενεργοποιημένη ΑΚΤ σε KRAS μεταλλαγμένα κύτταρα (Εικ. 1 C).

Τέλος, εκτιμήσαμε τις αλλαγές στην απόπτωση μετά erlotinib και vemurafenib θεραπείες μόνες ή σε συνδυασμό . κύτταρα HCC364 ήταν ευαίσθητα στην vemurafenib επαγόμενη απόπτωση και διάσπαση PARP, ενώ H1755 κύτταρα ήταν ανθεκτικά (Σχ. 1D). Ο μηχανισμός της απόπτωσης αξιολογήθηκε με δοκιμασίες ανοσοστυπώματος μετά από 48 ώρες επεξεργασίας με vemurafenib και προκάλεσε αύξηση των ΒΙΜ (προ-αποπτωτικά), σε σύγκριση με DMSO. Μια μείωση στην MCL-1 (αντι-αποπτωτική) παρατηρήθηκε επίσης με vemurafenib αλλά καμία αλλαγή παρατηρήθηκε σε BCL-xL (αντι-αποπτωτική), BCL-2 (αντι-αποπτωτική), ΒΑΚ (προ-αποπτωτικά), και ΒΑΧ ( προ-αποπτωτική) σε σύγκριση με DMSO (S3 Εικ.).

Επίδραση της vemurafenib μονοθεραπεία σε BRAF μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές NSCLC. Χρησιμοποιώντας μια μακροπρόθεσμη vemurafenib δοκιμασία ανάπτυξης βρέθηκε να είναι αποτελεσματική σε BRAF-V600E μεταλλαγμένης HCC364 κύτταρα και όχι σε μη V600E BRAF μεταλλαγμένα H1755 κύτταρα (Σχ. 2Α). Στη συνέχεια ήθελε να αξιολογήσει περαιτέρω το μοριακό μηχανισμό πίσω από αυτή τη δραστηριότητα κατά του όγκου. Αναλύσαμε τις αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο 24 ώρες μετά τη θεραπεία με vemurafenib τόσο HCC364 και τα κύτταρα H1755. Σε HCC364 κύτταρα, vemurafenib προκάλεσε σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων G1 με επακόλουθη μείωση σε κύτταρα φάσης S, υποστηρίζοντας G1 σύλληψη στην V600E μεταλλαγμένα κύτταρα. Vemurafenib, όμως, ήταν αναποτελεσματική στην πρόκληση ενός μπλοκ G1 σε H1755 κύτταρα (Εικ. 2Β). Ανοσοαποτύπωση έδειξε αλλαγές στις πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου σε HCC364 κύτταρα, μετά τη θεραπεία vemurafenib συμπεριλαμβανομένου, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης CDK2 και προς τα πάνω ρύθμιση του p21 και p27 εκφράσεις (Σχήμα 2C).

Α:. Μακροχρόνια δοκιμασία ανάπτυξης, 7 ημέρες μετά θεραπεία με όχημα-D (DMSO), vemurafenib 50 ηΜ, 500 ηΜ, 5000 ηΜ τόσο HCC364 και H1755 κυττάρων. HCC364 κύτταρα πιο ευαίσθητα στην vemurafenib. * P & lt? 0,05? *** Ρ & lt? 0.001 σε σύγκριση με DMSO. Β: κυτταρικού κύκλου αναλύει με κυτταρομετρία ροής 24 ώρες μετά τη θεραπεία με DMSO, V (vemurafenib) σε κύτταρα HCC364 και H1755. φάσεις του κυτταρικού κύκλου που εμφανίζονται είναι G1, S και G2 φάση. V επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα HCC364, όπως αποδεικνύεται από την αύξηση των G1 και σημαντική μείωση σε φάση S. C: κηλίδα Western στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία που υποστηρίζουν την απόδειξη για G1 σύλληψης, που δείχνει αύξηση σε ρ27 και μείωση της CDK2 με V (vemurafenib) συγκριτικά με D (DMSO). Καμία επίδραση παρατηρήθηκε σε H1755 κυττάρων. Όλες οι λωρίδες για HCC364 και όλες οι λωρίδες για H1755 είναι από την ίδια πηκτή. Το διάλειμμα έχει δημιουργηθεί για να αφαιρέσετε λωρίδες αντιμετωπίζονται erlotinib.

Η

Trametinib και vemurafenib

Η επίδραση της θεραπείας συνδυασμού με trametinib και vemurafenib. Η θεραπεία με συνδυασμό αναστολέα και BRAF αναστολέας ΜΕΚ υπήρξε αποτελεσματική σε προχωρημένο μελάνωμα με BRAF V600-μετάλλαξη, αλλά η επίδραση του αναστολέα της ΜΕΚ ή αυτή παρόμοιος συνδυασμός δεν έχει διερευνηθεί σε BRAF μεταλλαγμένα NSCLC [12]. Αναλύσαμε αν η προσθήκη trametinib να vemurafenib θα δείξει καμία αποτελεσματικότητα στην BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα, H1755 και HCC364. Trametinib ήταν πιο αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης μετά από επτά ημέρες και στις δύο κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με vemurafenib, ωστόσο ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από ότι μόνο trametinib (Σχ. 3Α, Β). Αξιολογήσαμε διαφορές στο κυτταρικό κύκλο και για τα δύο μεταλλαγμένα κύτταρα NSCLC BRAF μετά από μια θεραπεία 24 ώρες με DMSO, vemurafenib, trametinib και του συνδυασμού (Σχ. 3C). Τόσο vemurafenib και trametinib ήταν αποτελεσματικά στην πρόκληση σύλληψη G1 όπως αποδεικνύεται από μία σημαντική αύξηση στη φάση G1 και μία μείωση σε κύτταρα φάσης S σε σύγκριση με θεραπεία DMSO. Ωστόσο, ο συνδυασμός δεν ήταν περισσότερο αποτελεσματική από οποιοδήποτε από τα απλούς παράγοντες μόνο. Η διακοπή του κυτταρικού κύκλου που παρατηρείται με κυτταρομετρία ροής στα κύτταρα HCC364 επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό ανοσοστυπώματος για πρωτεΐνες του κυτταρικού κύκλου μετά από 24 ώρες θεραπείας με αντίστοιχα μέσα. Έδειξε ρύθμιση προς τα κάτω της CDK2 με προς τα πάνω ρύθμιση της ρ21 και ρ27 με vemurfenib, trametinib και το συνδυασμό σε σύγκριση με το DMSO (Εικ. 3D). Ωστόσο δεν υπήρχε διαφορά σημειώνεται στα κύτταρα κατεργασμένα με trametinib, vemurafenib, ή τον συνδυασμό trametinib συν vemurafenib στις εκφράσεις του CDK2, ρ21 ή ρ27 σε αυτά τα κύτταρα (Σχ. 3D). Επιπλέον, δεν παρατηρήσαμε καμία διαφορά στην pJAK2 και εκφράσεις pSTAT3 (S4 Εικ.) Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα H1755 δεν εμφανίζουν παρόμοια τάση σε CDK2 ή p21 και p27 παρά G1 σύλληψη και μείωση στην S φάση φαίνεται με κυτταρομετρία ροής ( Σχ. 3D). Αυτό μας κάνει να πιστεύουμε ότι υπάρχει ένας άλλος μηχανισμός που εμπλέκεται στην G1 σύλληψη, η οποία είναι ανεξάρτητη από CDK2 ρύθμιση προς τα κάτω σε αυτά τα κύτταρα

Α, Β:. Δοκιμασία μακροπρόθεσμη ανάπτυξη, 7 ημέρες μετά τη θεραπεία με όχημα DMSO (D ), V (vemurafenib) 1 μΜ, T (trametinib) 1 μΜ και τηλεόραση (trametinib + vemurafenib, 1 μΜ έκαστο) σε HCC364 (Α), και H1755 κυττάρων (Β). C: κυτταρικού κύκλου αναλύσεις με κυτταρομετρία ροής σε κύτταρα HCC364 και H1755 μετά από 24 ώρες αγωγή με D, V 0.5 μΜ, 0,5 μΜ Τ, τηλεόραση 0.5 /0.5 μΜ. D: κηλίδα Western μετά από 24 ώρες από H1755 και HCC364 αντιμετωπίζονται όπως και στην Γ (*** p & lt? 0.001 σε σύγκριση με το DMSO)

Η

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω την αποπτωτική δράση του συνδυασμού vemurafenib και trametinib στο. BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα NSCLC. Trametinib επαγόμενη απόπτωση σε δύο BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα γραμμές. Ο συνδυασμός των vemurafenib και trametinib προκάλεσε σημαντικά υψηλότερη από ό, τι απόπτωση είτε μονοθεραπεία σε HCC364 και H1755 (Σχ. 4Α). Η απόπτωση μετά από διάφορες δόσεις της θεραπείας trametinib επιβεβαιώθηκε με την παρουσία της διάσπασης PARP σε HCC364 κύτταρα, ενώ μία μείωση στην PARP παρατηρήθηκε σε H1755 κυττάρων χωρίς την παρουσία διασπασμένη PARP (Εικ. 4Β). Η εμφάνιση της απόπτωσης υποστηρίχτηκε περαιτέρω από αυξητική ρύθμιση των προ-αποπτωτική πρωτεΐνη, ΒΙΜ, και στις δύο HCC364 και H1755 κυττάρων κατά την κατεργασία με trametinib. Ο συνδυασμός προκάλεσε μεγαλύτερη αύξηση του BIM σε σύγκριση με trametinib μόνο. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι ο συνδυασμός του vemurafenib και trametinib είναι καλύτερη στην προώθηση της απόπτωσης από trametinib μόνος στο BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα (Σχ. 4C). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση του BCL-2, BCL-XL, MCL-1, ΒΑΧ και ΒΑΚ

Α:. Η απόπτωση με κυτταρομετρία ροής, 48 ώρες μετά την θεραπεία με όχημα-D (DMSO), V ( vemurafenib 1 μΜ), T (trametinib 1 μΜ), τηλεόραση (trametinib + vemurafenib 1/1 μΜ) σε κύτταρα HCC364 και H1755. (* P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001). Β: στύπωμα Western διασπασμένη PARP σε HCC364 και H1755, 48 ώρες μετά την αγωγή με D (DMSO) και κυμαινόμενες δόσεις vemurafenib (0,25, 0,5, 1 μΜ) και trametinib (0,25, 0,5, 1 μΜ) C: μεταβολές blot που δείχνει Western σε ΕΚΚ, ΑΚΤ, BIM, διάσπαση PARP, 48 ώρες μετά την αγωγή με όχημα D (DMSO), V (vemurafenib 1 μΜ), T (trametinib 1 μΜ), τηλεόραση (trametinib + vemurafenib 1/1 μΜ) σε HCC364 και H1755 κυττάρων. Τέσσερις λωρίδες υποβλήθηκαν σε θεραπεία εις διπλούν για κάθε κυτταρικές σειρές και έχουν μόνο οι αριστεροί 4 λωρίδες από κάθε κυτταρικές σειρές έχουν φαίνεται στην εικόνα.

Η

Trametinib ως μονοθεραπεία σε BRAF μεταλλαγμένα NSCLC. Ο αναστολέας ΜΕΚ, selumetanib έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω σηματοδότηση ERK σε προκλινικά μοντέλα πνεύμονα με KRAS μεταλλαγμένο NSCLC, αλλά ένα παρόμοιο αποτέλεσμα δεν έχει αποδειχθεί σε BRAF μεταλλαγμένο NSCLC [25]. Θέλαμε να συγκρίνουμε τις ογκογόνο μεταβολές του σήματος που προκύπτει από την εισαγωγή ενός αναστολέα BRAF, ενός αναστολέα της ΜΕΚ, ή ο συνδυασμός και των δύο στο BRAF μεταλλαγμένα NSCLC. Οι αλλαγές σε ογκογόνα σήματα αξιολογήθηκαν με την εκτέλεση μιας προσδιορισμό ανοσοστυπώματος να αξιολογηθούν οι αλλαγές στα σήματα απόπτωση στα δύο κύτταρα με vemurafenib εναντίον trametinib εναντίον του συνδυασμού στις 48 ώρες αγωγή με 1 δόση μΜ απλούς παράγοντες και 1: 1 αναλογία του συνδυασμού, 1: 1 μΜ δόσεις το καθένα. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία με trametinib προκάλεσε σημαντική καταστολή σε φωσφορυλίωση της ERK σε σύγκριση με το DMSO ή vemurafenib μόνος τόσο HCC364 και H1755 κύτταρα (Σχ. 4C). Ο συνδυασμός των trametinib και vemurafenib δεν ήταν καλύτερη από μόνη trametinib. Επιπλέον παρατηρήσαμε ότι ρΑΚΤ δεν ήταν αυξημένη στα κύτταρα HCC364 με τη χρήση είτε απλούς παράγοντες ή συνδυασμού (ρ-ΑΚΤ ήταν αχνά ανιχνεύθηκε σε HCC364 κύτταρα και η έκφραση δεν άλλαξε-ο ανοσοστύπωμα δεν φαίνεται). Ωστόσο, είδαμε μια αύξηση στην ρ-ΑΚΤ έκφραση με τη χρήση του trametinib μονοθεραπεία σε μη-V600E BRAF μεταλλαγμένα H1755 κυττάρων και έχει ενδιαφέρον ο συνδυασμός των trametinib και vemurafenib δεν δείχνουν αύξηση του ρ-ΑΚΤ, σε σύγκριση με το DMSO, υποδηλώνοντας ότι ίσως μονοπάτι p-ΑΚΤ μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην αντίσταση στην αγωγή με trametinib μόνο παράγοντα. Trametinib είναι επίσης αποτελεσματική στην πρόκληση απόπτωσης σε τόσο HCC364 και κυττάρων H1755 (Σχ. 4Α). Επιπλέον, trametinib προκάλεσε επίσης G1 σύλληψη τόσο BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα (Σχ. 3C). Αν και οι αλλαγές σε πρωτεΐνες κυτταρικού κύκλου, μειορρύθμιση της CDK2 και προς τα πάνω ρύθμιση του p21 και ρ27 εκφράσεις, παρατηρήθηκαν μόνο σε HCC364 κύτταρα.

Συζήτηση

BRAF οδός παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση σε NSCLC, αναστολείς BRAF, vemurafenib και dabrafenib έχουν δείξει μόνο μέτρια αποτελεσματικότητα στην μετάλλαξη BRAF καρκίνους-V600E [11,13]. Παρά στοχεύει τη συγκεκριμένη μετάλλαξη, η χρήση των dabrafenib, σε NSCLC με μετάλλαξη BRAF, V600E έχει ως αποτέλεσμα μόνο ένα ποσοστό ανταπόκρισης 40%, μαζί με μια απογοητευτική εξέλιξη της νόσου κατά 30% [11]. Τα αποτελέσματα αυτά αντικατοπτρίζουν ότι BRAF αναστολή από μόνη της δεν είναι μια ιδανική επιλογή θεραπείας και νεότερες στρατηγικές για βελτιστοποιημένη και αποτελεσματική θεραπεία αυτής της επίλεκτης ομάδας των ασθενών είναι δικαιολογημένη. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζεται επίσης από μια κλινική μελέτη σε μελάνωμα που δείχνει ένα σημαντικό πλεονέκτημα στην επιβίωση χωρίς εξέλιξη με συνδυασμό dabrafenib συν trametinib εναντίον dabrafenib μόνη της [12]. Τα πειράματά μας in-vitro επιβεβαίωσε ότι vemurafenib είναι αποτελεσματική στην αναστολή της ανάπτυξης, μειώνοντας σηματοδότηση ΕΚΚ, και επάγει απόπτωση στην μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά BRAF V600E HCC364, ενώ σε μη-V600E μεταλλαγμένη κυτταρική γραμμή BRAF, H1755, δεν ήταν τόσο ευαίσθητος. Prahallad

et al.

, Έχουν δείξει αυξημένη δραστηριότητα με τη συνδυασμένη θεραπεία του cetuximab αναστολέας του EGFR με vemurafenib συνδέοντας ERK και AKT σηματοδότησης μέσω CDC25C στο BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [15]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας αντανακλούν το γεγονός ότι ο συνδυασμός της erlotinib και vemurafenib δεν είναι αποτελεσματική σε κύτταρα NSCLC. Παρά το γεγονός ότι ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσουν CDC25C στις μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές BRAF HCC364 (V600E) και H1755 (μη-V600E), τα κύτταρα αυτά δεν ανταποκρίνονται σε ERK αναστολή με αυξημένη ενεργοποίηση ΑΚΤ γεγονός που υποδηλώνει ότι ERK και σηματοδότησης AKT δεν συνδέονται μέσω CDC25C σε αυτές κυττάρων.

Vemurafenib ήταν σε θέση να ρυθμίζουν την απόπτωση που σχετίζονται με πρωτεΐνες και του κυτταρικού κύκλου [26,27]. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με vemurafenib οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα του αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη MCL-1 και τα αυξημένα επίπεδα της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη BIM σε κυτταρικές σειρές NSCLC. MCL-1 απώλεια μαζί με την αυξημένη BIM [28-30], οδηγεί σε επαγωγή απόπτωσης, και αυξημένα επίπεδα BIM μπορεί επίσης να ξεκινήσει απόπτωση [31-33]. Επιπλέον, το κυτταρικό κύκλο πρωτεΐνη που σχετίζεται, CDK2, ήταν μειωτικά ενώ ανασταλτικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, ρ21 και ρ27, ήταν προς τα πάνω ρυθμισμένη μετά την αγωγή vemurafenib σε HCC364 κύτταρα, με αποτέλεσμα την διακοπή της ανάπτυξης. Θεωρούμε ότι αυτές οι αλλαγές την έκφραση της πρωτεΐνης είναι πιθανόν να σχετίζονται με τη μειωμένη δραστηριότητα του ΕΚΚ [34,35], δεδομένου ότι παρόμοια επίδραση παρατηρήθηκε κατά την αγωγή με trametinib (Εικ. 3D). Αυτό ενισχύει την υπόθεση μας ότι η διαφοροποίηση του ΒΙΜ και MCL-1 σχετίζονται με την μειωμένη δράση της ERK σε HCC364 κύτταρα. Δυστυχώς, H1755, τα κύτταρα BRAF-μη-V600E, έδειξε G1 του κυτταρικού κύκλου σύλληψης εξαρτάται από την προς τα κάτω ρύθμιση των ERK με κατεργασία με trametinib. Παρουσιάστηκε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, χωρίς αλλοίωση των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, CDK2, ρ21 και ρ27. Αυτό υποδηλώνει ότι H1755 κύτταρα μπορεί να έχει διαφορετικό μηχανισμό που εμπλέκονται στην G1 σύλληψη ανεξάρτητη από σημείο ελέγχου CDK2 στον κυτταρικό κύκλο.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν trametinib είναι αποτελεσματική στην πρόκληση απόπτωσης σε τόσο BRAF V600E και μη V600E μεταλλαγμένα κύτταρα. Trametinib ήταν ισχυρή στη μείωση της σηματοδότησης ERK στα μεταλλαγμένα κύτταρα BRAF, και αυτό καταστολή είναι πιο έντονη με trametinib σε σύγκριση με vemurafenib ακόμη και σε BRAF V600E μεταλλαγμένα κύτταρα. Τα μακροπρόθεσμα αποτελέσματα της ανάλυσης της ανάπτυξης καταδεικνύουν επίσης ότι trametinib έχει καλύτερη αποτελεσματικότητα ως μονοθεραπεία σε σύγκριση με vemurafenib στα κύτταρα BRAF V600E αλλά αυτό θα μπορούσε να είναι ως αποτέλεσμα μικρότερο χρόνο ημίσειας ζωής της vemurafenib [36,37]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία με trametinib απλού παράγοντα προκάλεσε αυξητική ρύθμιση της σηματοδότησης ΑΚΤ σε μόνο BRAF κύτταρα μη-V600E, υποδηλώνοντας μια πιθανή μηχανισμός διαφυγής για ανάπτυξη αντοχής σε αγωγή με αναστολέα ΜΕΚ και μόνο. Αυτό μπορεί να δώσει μια εικόνα για την ανάπτυξη της αντίστασης στους αναστολείς ΜΕΚ. Η οδός ΑΚΤ δεν φαίνεται να ρυθμίζεται προς τα πάνω όταν BRAF κύτταρα μη-V600E υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το συνδυασμό trametinib και vemurafenib, γεγονός που υποδηλώνει ότι η θεραπεία συνδυασμού μπορεί να είναι ανώτερη από κάθε ένα από τα δύο μονά παράγοντες σε αυτήν την ομάδα, καθώς και. Η μηχανιστική σχέση μεταξύ της αναστολής ERK και την ενεργοποίηση ΑΚΤ στο BRAF μεταλλαγμένο NSCLC με αναστολέα της ΜΕΚ πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω. Μπορούμε επίσης έδειξαν για πρώτη φορά ότι η θεραπεία συνδυασμού προκάλεσε σημαντική αύξηση στην προς τα πάνω ρύθμιση του BIM και στα δύο κύτταρα V600E και μη-V600E, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο στην απόπτωση [31]. Η θεραπεία συνδυασμού προκάλεσε επίσης μικρή αλλά σημαντική αύξηση στην απόπτωση σε BRAF μεταλλαγμένα κύτταρα σε σύγκριση με μόνο παράγοντα, γεγονός που υποδηλώνει το σκεπτικό για τη χρήση συνδυασμού του αναστολέα BRAF και ΜΕΚ σε αυτή την επίλεκτη ομάδα. Επιπλέον, ο συνδυασμός του trametinib και vemurafenib μπορούσε να ξεπεράσει την αντίσταση προς trametinib μόνο και ως εκ τούτου καλύτερα από trametinib απλός παράγων. Λούπινο et al. τόνισαν ο πιθανός μηχανισμός πίσω από την αντίσταση στην BRAF-V600E μεταλλαγμένα κύτταρα NSCLC με τον αναστολέα BRAF [38]. Οι δύο διακριτές μοριακοί μηχανισμοί για την απόκτηση ανθεκτικότητας αναστολέα BRAF περιλαμβάνουν απώλεια πλήρους μήκους σε BRAF-V600E σε συνδυασμό με την έκφραση ενός παρεκκλίνουσα μορφή BRAF-V600E που διατηρεί την εξάρτηση RAF μονοπάτι και ιδιοσυστατική σηματοδότηση αυτοκρινής EGFR οδηγείται από c-Jun-διαμεσολαβούμενη έκφραση EGFR συνδέτη. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την υπόθεση της μετάλλαξης BRAF- ανεξάρτητη ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ μονοπάτι που οδηγεί στην ανάπτυξη αντίστασης στην αναστολέα BRAF κατά τη θεραπεία BRAF-V600E μεταλλαγμένα NSCLC. Επιπλέον, η παρενέργεια και το προφίλ τοξικότητας (19% του δερματικού ακανθοκυτταρικού καρκινώματος σε βραχίονα αναστολέα BRAF

vs

. 7% στο σκέλος του συνδυασμού σε ασθενείς με μελάνωμα) ευνοεί τη συνδυαστική θεραπεία [12].