You must be logged into post a comment.
Αφηρημένο
Ιστορικό
Πολλά μέλη της οικογένειας δάκτυλο ψευδαργύρου πρωτεΐνη έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι έχουν κάποιο ρόλο στην έναρξη του καρκίνου και την εξέλιξη. Ψευδάργυρος πρωτεΐνη δακτύλου 367 (
ZNF367
) είναι ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών δακτύλου ψευδαργύρου και εκφράζεται σε εμβρυϊκά ή εμβρυϊκά ερυθροειδή ιστό αλλά είναι απούσα σε φυσιολογικό ενήλικα ιστό.
Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση
Θα δείξουμε ότι
ZNF367
υπερεκφράζεται σε αδρενοκορτικοειδές καρκίνωμα, κακόηθες φαιοχρωμοκύττωμα /παραγαγγλιώματος και καρκίνου του θυρεοειδούς, σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό και καλοήθεις όγκους. Χρησιμοποιώντας και τα δύο λειτουργικά knockdown και έκτοπη υπερέκφραση σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές, δείχνουμε ότι
ZNF367
αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή, τη μετανάστευση και προσκόλληση σε εξωκυτταρικές πρωτεΐνες
in vitro
και
in vivo
. Ολοκληρωμένη γονίδιο και την έκφραση microRNA αναλύσεις έδειξαν μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ
ZNF367
και miR-195 έκφρασης. δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι το miR-195 ρυθμίζει άμεσα
ZNF367
έκφρασης και ότι το miR-195 ρυθμίζει την κυτταρική εισβολή. Επιπλέον, ιντεγκρίνης άλφα 3 (
ITGA3
) έκφραση ρυθμίζεται από
ZNF367
.
Συμπεράσματα /Σημασία
Τα ευρήματά μας μαζί δείχνουν ότι
ZNF367
ρυθμίζει την εξέλιξη του καρκίνου του
Παράθεση:. Jain M, L Zhang, Boufraqech Μ, Liu-Chittenden Υ, Bussey Κ, Demeure MJ, et al. (2014)
ZNF367
Αναστέλλει Καρκίνος Εξέλιξη και απευθύνεται από miR-195. PLoS ONE 9 (7): e101423. doi: 10.1371 /journal.pone.0101423
Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής
Ελήφθη: 12 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 6, Ιουνίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 21 του Ιουλίου 2014
Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα
Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από την εντός των τειχών ερευνητικού προγράμματος του Κέντρου για την Έρευνα του Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου
Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Μερικοί από τους συν-συγγραφείς απασχολούνται από μια εμπορική εταιρεία -SAIC Frederick INC, δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.
Εισαγωγή
Οι γνώσεις μας για τα βιολογικά γεγονότα που αναστέλλουν ή προάγουν την μεταστατική εξάπλωση των ενδοκρινών καρκίνων σε τοπικό επίπεδο και να απομακρυσμένες περιοχές περιορίζεται [1]. Η κατανόηση των μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην πρόοδο του καρκίνου έχει σημαντικές επιπτώσεις για τον εντοπισμό στόχων για θεραπευτικό όφελος. Genomic, γενετικών και επιγενετικών προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστούν οι αλλαγές στα γονίδια /μονοπάτια, παράγοντες μεταγραφής, ή υπογραφές γονίδιο με σύγκριση της κανονικής, πρωτογενών όγκων, και /ή μετάστασης. Ωστόσο, αυτές οι αναλύσεις δεν έχουν συχνά διακρίνονται μεταξύ υποκινητές, αναστολείς, ή δείκτες επιβατών σε έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου, και σπάνια ορίσει έναν ειδικό μηχανισμό για την απορυθμισμένη γονιδιακή έκφραση.
καρκίνων του ενδοκρινικού συστήματος είναι μια διαφορετική ομάδα των κακοηθειών που παρουσιάζουν το πλήρες φάσμα της βιολογικής συμπεριφοράς των κακοήθων όγκων: νωχελικός ανάπτυξης σε ταχέως εξελισσόμενη καρκίνους με κακή επιβίωση. Έτσι, ενδοκρινείς καρκίνοι αντιπροσωπεύουν ένα εξαιρετικό μοντέλο για τη μελέτη των μοριακών παραγόντων που επηρεάζουν την έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου. Προσδιορισμός γενετικές αλλαγές κοινό στοιχείο όλων αυτών diversely συμπεριφέρονται τύπους ενδοκρινών όγκων έχει δειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων. Για παράδειγμα,
BRAF
μεταλλάξεις είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη στον καρκίνο του θυρεοειδούς και άλλους καρκίνους, και σχετίζονται με πιο επιθετική ασθένεια στον καρκίνο του θυρεοειδούς [2], [3].
SDHB
μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν αρχικά στην οικογενή παραγαγγλίωμα, αλλά βρέθηκαν αργότερα να είναι διαδεδομένη σε καρκίνους του νεφρού και στρωματικών όγκων του γαστρεντερικού, και πρόσφατα υπόφυσης όγκους [2], [4], [5]. Έτσι, ανακαλύπτοντας τις μοριακές αλλαγές που σχετίζονται με την έναρξη ή /και την πρόοδο ενδοκρινικές καρκίνος είναι πιθανόν να παίζουν σημαντικό ρόλο σε μια ευρεία ομάδα των ανθρώπινων κακοηθειών.
Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε το μηχανισμό ρύθμισης γονιδιακής έκφρασης και λειτουργίας του
ZNF367
σε μία ποικιλία καρκίνων ενδοκρινών (θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, του φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα, φαιοχρωμοκύττωμα /παραγαγγλίωμα).
ZNF367
(επίσης γνωστή ως
ZFF29
και
CDC14B
) είναι ένα μέλος της οικογένειας πρωτεΐνης δακτύλου ψευδαργύρου, με ένα μοναδικό Cys2His2 ψευδαργύρου δάχτυλο μοτίβο, εκφράζεται σε εμβρυϊκά ή εμβρυακού ερυθροειδούς ιστό, και είναι απούσα σε άλλους φυσιολογικούς ενήλικους ιστούς [6], [7]. Πρόσφατα, αρκετές πρωτεΐνες δακτύλου ψευδαργύρου έχουν βρεθεί να απορυθμίζεται σε καρκίνο, για να λειτουργήσει ως καταστολείς /προωθητές όγκων, και να προκαλέσουν αντίσταση στη χημειοθεραπεία [8] – [10]. Ωστόσο, ο ρόλος του
ZNF367
στον καρκίνο δεν έχει διερευνηθεί. Εδώ, αναφέρουμε ότι
ZNF367
υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία καρκίνων ενδοκρινικών και ότι αναστέλλει
in vitro
και
in vivo
ανάπτυξη, την κυτταρική εισβολή, τη μετανάστευση και προσκόλληση . Επιπλέον,
ZNF367
υπερέκφραση συνδέεται με την απώλεια του miR-195 έκφρασης, η οποία στοχεύει άμεσα
ZNF367
. Τέλος,
ITGA3
μειώνεται με
ZNF367
υπερέκφραση, για την ίδρυση του miR-195-
ZNF367
–
ITGA3
άξονα που λειτουργεί για να αναστέλλει την εξέλιξη του καρκίνου.
Μέθοδοι
δείγματα ιστών και μελέτες σε ζώα
τα δείγματα ιστού που αγοράζονται σε ένα Institutional Review Board-εγκεκριμένο πρωτόκολλο της κλινικής μετά από γραπτή συγκατάθεση (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01005654) . Τα δείγματα ιστού συλλέγονται κατά τον χρόνο της χειρουργικής επέμβασης, και είχαν αμέσως καταψύχθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Εκατόν-και-πέντε ανθρώπινου φλοιού των επινεφριδίων (19 κανονικό φλοιό των επινεφριδίων, 79 φλοιού αδενώματα, 7 καρκινωμάτων του φλοιού), 47 θυρεοειδικού ιστού (8 κανονικό, 39 θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς), και 68 (19 κανονικό μυελό των επινεφριδίων, 28 καλοήθεις, 21 κακοήθη παραγαγγλιώματος) δείγματα φαιοχρωμοκύττωμα /ιστού χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Όλα διάγνωση επιβεβαιώθηκε από μια ενδοκρινική παθολόγο, και δείγματα όγκων επιβεβαιώθηκαν ότι περιέχουν ≥ 80% του όγκου των κυττάρων /πυρήνες. Η διάγνωση του φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα και κακόηθες φαιοχρωμοκύττωμα /παραγαγγλιώματος βασίστηκε στην παρουσία του ακαθάριστου τοπικής εισβολής ή /και μακρινή μετάσταση και σκορ Weiss της & gt? 3 για φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα. Κανονική επινεφριδίων φλοιός και ο μυελός συλλέχθηκαν από δότες υγιές όργανο χρησιμοποιώντας τη σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής υπό Institutional Review Board-εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Δύο διαθέσιμες στο κοινό σύνολα δεδομένων ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία σε δείγματα του φλοιού των επινεφριδίων όγκου χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση
ZNF367
έκφραση του mRNA (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-10927 και https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-TABM-311).
Η φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου ενέκρινε τα πρωτόκολλα για την φροντίδα των ζώων και το χειρισμό στην παρούσα μελέτη. Κάθε ποντίκι αντιμετωπίζουν σημαντικά ανώμαλα νευρολογικά συμπτώματα, αιμορραγία από κάθε στόμιο, μειωμένη κινητικότητα, γρήγορη απώλεια βάρους, εξουθενωτική διάρροια, τραχύ τρίχωμα, κυρτή στάση του σώματος, δυσκολία στην αναπνοή, λήθαργος, επίμονο κατάκλιση, ίκτερο, αναιμία, αυτο-που προκαλείται από τραύμα, καθίσταται ετοιμοθάνατα ή αλλιώς γίνεται σε θέση να λάβουν τροφή ή νερό, ή με έναν όγκο 2 cm ή μεγαλύτερη σε διάμετρο έχει αμέσως σε ευθανασία με CO
2 θαλάμου.
Οι κυτταρικές σειρές, κυτταρικές καλλιέργειες, αντιδραστήρια, siRNA, και ΜΙΚ 195 διαμόλυνση
Το αδρενοκορτικοειδές κυτταρική γραμμή καρκινώματος SW13 (ATCC, Rockville, MD) αναπτύχθηκαν και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 1% σελήνιο τρανσφερίνης ινσουλίνη (ITS? BD Biosciences, San Jose, CA) και 2,5% Nu -Serum I (BD Biosciences) σε ένα πρότυπο υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε ένα 5%
2 ατμόσφαιρα CO. Η κυτταρική σειρά καρκινώματος του φλοιού των επινεφριδίων BD140A παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Kimberly Bussey (ΓΤΕ, Pheonix, Arizona), και καλλιεργήθηκε σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη και 1 % L-γλουταμικό. Το ανθρώπινο θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς (TPC-1) κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με FBS, πενικιλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη (100 μg /ml), φουνγκιζόνη (250 ng /ml), TSH (10 IU /L ) και ινσουλίνη (10 μg /ml). Ανθρώπινα κύτταρα εμβρυονικού νεφρού (ΗΕΚ293) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 1% Pen-strep (Gibco, Grand Island, ΝΥ), και 1% Ε-γλουταμινικού (Gibco). Όλες οι κυτταρικές γραμμές επικυρώνονται από μικρής διαδοχική επανάληψη προφίλ στις 14 Οκτωβρίου, 2012.
ZNF367 siRNAs (s46962, s46963) και αρνητικό siRNAs ελέγχου (AM4613) χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 80 nM (Applied Biosystems , Foster City, CA). Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση των κυττάρων siRNAs. Ώριμη miRNA προδρόμου, προ-miR-195, και τυχαία ακολουθία προ-miR-αρνητικό έλεγχο (Applied Biosystems) στα 5 ηΜ επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη SW13 RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA). Για
ZNF367
υπερέκφραση σε κύτταρα ΗΕΚ293, κύτταρα (8 χ 10
5 σε κάθε 6 φρεάτιο) διαμολύνθηκαν με ένα
ZNF367
κατασκεύασμα cDNA ή ένα άδειο φορέα (ΟηΟεηε, Rockville, MD ) χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο διαμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Ανοσοϊστοχημεία
σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και τμήματα ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη από-παραφινοποιήθηκαν και στη συνέχεια επανυδατώθηκαν χρησιμοποιώντας ξυλόλιο και αιθανόλη. Το αντιγόνο ανάκτηση ολοκληρώθηκε χρησιμοποιώντας ένα 10% κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα ρΗ 6,0 (Thermo Scientific, Lafayette, CO) σε μια χύτρα ταχύτητας στους 120 ° C για 10 λεπτά. Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με υπεροξείδιο του υδρογόνου 6% για τη σβέση της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης για 30 λεπτά (Dako, Carpinteria, CA), που ακολουθείται από επώαση με ορό για μια ώρα (Dako, Carpinteria, CA). Πρωτογενής αντι-ZNF367 πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού (Sigma, St. Louis, ΜΟ? HPA015785) στα 5 μg ml αραίωσης /χρησιμοποιήθηκε μία νύκτα στους 4 ° C. δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού χρησιμοποιήθηκε (Dako Envision αντι-κουνελιού, Carpinteria, CA) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας 3,3′-διαμινοβενζιδίνη DAB ως χρωμογόνο (Dako, Carpinteria, CA), και αυτά με αιματοξυλίνη. Τα τμήματα ήταν αφυδατωμένο και τοποθετείται με την τοποθέτηση vectamount μέσο (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Η ανοσοχρώση των ZNF367 αξιολογήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο (Nikon, Τόκιο, Ιαπωνία), και οι εικόνες σαρώθηκαν σε μεγέθυνση 20x.
προετοιμασία του RNA, αντίστροφη μεταγραφή, και σε πραγματικό χρόνο ποσοτική PCR
RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Ολικό RNA (200-500 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα υψηλής χωρητικότητας σετ Αντίστροφη Μεταγραφή cDNA και cDNA ενισχύθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA). Οι εκκινητές PCR και ανιχνευτές για
ZNF367
(Hs00400665_m1),
ITGA3
(Hs01076873_m1), και
GAPDH
(Hs_99999905_m1) ελήφθησαν από την Applied Biosystems.
κηλίδος Western
τα προϊόντα λύσης παρασκευάζονται με 1% SDS συν 10 mM Tris [ρΗ 7,5] ρυθμιστικού διαλύματος, και κηλίδα Western εκτελέστηκε σε 10% γέλη SDS-PAGE. Πρωτογενή αντισώματα κουνελιού πολυκλωνικό αντι-ZNF367 (HPA015785? Sigma, ΜΟ) και αντι-ITGA3 (Sigma? SAB1100194) χρησιμοποιήθηκαν σε 5 μg /ml και 2 μg /ml, αντίστοιχα, και αντι-GAPDH (SC-32233? Santa Cruz βιοτεχνολογία Inc., Santa Cruz, CA) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1,000. Δευτερογενής αντίσωμα αντι-κουνελιού χρησιμοποιήθηκε σε 1:5,000 αραίωσης (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ).
Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων
Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 2.000 κυττάρων σε ένα 96-φρεατίων πλάκα σε έξι αντίγραφα. Το κιτ δοκιμασίας CyQUANT ™ (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί ο αριθμός των κυττάρων, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Κλωνογόνος
δοκιμασία
ΗΕΚ293 κύτταρα (8 χ 10
5) διαμολύνθηκαν με ο κενός φορέας ή
ZNF367
κατασκευάσει. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, αιωρούνται εκ νέου στα μέσα ενημέρωσης, και μετρήθηκαν. Τα κύτταρα επανα-εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 250, 500 και 1000 κύτταρα. Μετά από 10 ημέρες, τα μέσα απομακρύνθηκαν από τα φρεάτια και πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά και χρωματίστηκαν με 2 ml κρυσταλλικού ιώδους για 60 λεπτά σε μια κουνιστή πλατφόρμα. Οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και ξηραίνεται στον αέρα, και οι αποικίες φωτογραφήθηκαν σε FluorChem Imager (San Jose, CA).
Κυττάρων εισβολή και τη μετανάστευση δοκιμασία
κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση ήταν αξιολογήθηκε με τη χρήση του BD BIOCOAT Matrigel εισβολής Επιμελητηρίου (BD Biosciences) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. 1 × 10
5 κύτταρα σπάρθηκαν πάνω στα ενθέματα (8-μΜ μέγεθος πόρων πολυανθρακικό μεμβράνες) με και χωρίς ένα λεπτό στρώμα Matrigel Υπόγειο Membrane Matrix (BD Biosciences) παλτό. Τα ένθετα τοποθετήθηκαν σε φρεάτια πυθμένα, με 10% μέσο καλλιέργειας που περιέχει ορό ως χημειοελκτικό. Οι πλάκες επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C. Κύτταρα που εισέβαλαν τη μήτρα Matrigel ή ότι μετανάστευσαν μέσω των πόρων χωρίς μήτρα Matrigel να μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με Diff-Quik (Dade Behring, Newark, NJ), η κάτω επιφάνεια της μεμβράνης και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός σε τέσσερις ξεχωριστές πεδία με Image J λογισμικού (ΝΙΗ, Bethesda, MD).
η προσκόλληση κυττάρου δοκιμασία
κύτταρα SW13 επιμολύνονται με
ZNF367
siRNA και ο αρνητικός μάρτυρας. Μετά από 120 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και 1 × 10
5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα 48-φρεατίων που περιέχει πέντε μόρια προσκόλλησης (ινωδονεκτίνης, κολλαγόνου Ι, κολλαγόνου IV, λαμινίνη Ι και ινωδογόνο) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 90 λεπτά σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (CytoSelect, Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA). Τα φρεάτια πλύθηκαν δύο φορές με PBS, και προστέθηκαν και επωάστηκαν για 10 λεπτά 200 μl του διαλύματος χρώσης. Τα φρεάτια πλύθηκαν δύο φορές με απιονισμένο νερό. Τα φρεάτια ξηραίνονται στον αέρα, και προστέθηκαν και επωάστηκαν για 10 λεπτά 200 μl του διαλύματος εκχύλισης. Ένα σύνολο 150 μί μεταφέρθηκαν από κάθε εκχυλίζεται δείγμα σε μια πλάκα 96 φρεατίων, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 560 nm σε αναγνώστη μικροπλάκας SpectraMax M5e (Sunnyvale, CA).
Genome κλίμακα μικροσυστοιχιών mRNA έκφραση
κύτταρα SW13 επιμολύνονται με
ZNF367
siRNA και του αρνητικού ελέγχου εις τριπλούν. Μετά την επιμόλυνση, το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) κιτ, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA ανάστροφη μεταγραφή, τη σύνθεση, την ενίσχυση, τον κατακερματισμό, και τερματικό επισήμανση των 150 ng ολικού RNA διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το GeneChip WT Sense Target Σήμανση και αντιδραστήρια ελέγχου (Affymetrix, Santa Clara, CA). Ένα σύνολο 25 ng /μΙ cDNA υβριδοποιήθηκε στο Affymetrix Human Gene 1,0 ST Array GeneChip. ανάλυση οδός διεξήχθη με τη χρήση των πόρων βιοπληροφορικής DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov, Frederick, MD).
Στο silico
ταυτοποίηση των microRNA που στοχεύουν ZNF367
βάσεις δεδομένων MiR (Target σάρωσης (https://www.targetscan.org) και mirDB (https://mirdb.org/miRDB/) χρησιμοποιήθηκαν για την αναγνώριση microRNA που μπορούν να στοχεύουν
ZNF367
. υποψήφιες microRNAs προβλέπεται να στοχεύσετε
ZNF367
αναλύθηκαν στη συνέχεια για να προσδιοριστεί αν ήταν διαφορικά εκφρασμένα σε φλοιού των επινεφριδίων carcioma και θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς.
λουσιφεράσης δοκιμασία
Άγρια τύπου
ZNF367
3’UTR κλωνοποιήθηκε στο κατασκεύασμα GoClone (μεταγωγής Genomics, Menlo Park, CA). το μεταλλαγμένο κατασκεύασμα του
ZNF367
3’UTR ελήφθη με την εισαγωγή της μετάλλαξης στα τρία πρώτα νουκλεοτίδια της περιοχής σπόρου (143-150, GCTGCTA – CGAGCTA). για miR-195 Άγρια τύπου
ZNF367
3’ΙΙΤΡ ή μεταλλαγμένο
ZNF367
3’ΙΙΤΡ και ο κενός 3’ΙΙΤΡ διάνυσμα με προ- miR-195 ή προ-NC συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα SW13 (διακοπής Genomics). Η μέθοδος κανονικοποίησης για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης σε δοκιμασία λουσιφεράσης ήταν σύμφωνα με τη σύσταση της διακοπής της διανομής Genomics (Menlo Park, CA) με άδειο φορέα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την επιμόλυνση. Ο κενός 3’UTR φορέας περιέχει ένα συστατικό προαγωγό (που βρίσκεται σε όλα τα UTR κατασκευάζει) και το γονίδιο της λουσιφεράσης (RenSP). Αυτό το κατασκεύασμα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για την επιμόλυνση. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και συν-επιμολύνθηκαν με 5 ηΜ miR-195 ή τον αρνητικό μάρτυρα (Applied Biosystems), 0.12 μ§ του φορέα (μεταγωγής με Genomics), και 0,75 μΙ Lipofectamine (Invitrogen). Η φωταύγεια διαβάστηκε μετά από 24 ώρες με το σύστημα προσδιορισμού διακόπτη φώτων, χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας SpectraMax M5e.
In vivo
ξενομόσχευμα δοκιμασία
αθυμικά γυμνά θηλυκά ποντίκια (πέντε έως των έξι εβδομάδων? σωματικό βάρος: 20-22 g) ελήφθησαν από το Εθνικό Εργαστήριο Frederick για τις εγκαταστάσεις των ζώων Cancer Research (Frederick, MD). Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης με
ZNF367
siRNA και ο αρνητικός μάρτυρας, τρία εκατομμύρια κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε 100 μΐ DMEM και Matrigel (1:01), και εγχύθηκαν στο πλευρό αθυμικών γυμνών ποντικών .
Στατιστικές αναλύσεις
Συνεχής δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD) ή τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Η δοκιμή Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση μη παραμετρικά δεδομένα από τρεις ή περισσότερες ομάδες. t-test του Student ή δοκιμασία Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων για παραμετρικές και μη παραμετρικές μεταβλητές, αντίστοιχα. Το τεστ συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση συσχετίσεων μεταξύ δύο ομάδων. Ένα
σ
-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η στατιστική ανάλυση ολοκληρώθηκε χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 5.0 λογισμικό στατιστικής.
Αποτελέσματα
ZNF367
υπερεκφράζεται στον καρκίνο
ZNF367
Είναι υπερεκφράζεται σε φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα, θηλώδες θυρεοειδικό καρκίνο και κακοήθεις φαιοχρωμοκύττωμα /παραγαγγλίωμα, σε σύγκριση με καλοήθη και φυσιολογικά δείγματα ιστού για κάθε τύπο του όγκου (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 1). έκφραση πρωτεΐνης ZNF367 ήταν παρούσα στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα. Υπήρχε ισχυρότερη χρώση ZNF367 στον πυρήνα από ότι στο κυτταρόπλασμα σε κάθε δείγμα καρκίνου (καρκίνος του φλοιού των επινεφριδίων, θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς και φαιοχρωμοκυτώματος κακοήθεις /παραγαγγλιώματος). Για να επιβεβαιώσετε την αυξημένη έκφραση του
ZNF367
στο φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα σε ένα μεγαλύτερο σύνολο του δείγματος, αναλύσαμε την έκφραση προφίλ δεδομένα από δημόσια διαθέσιμες σύνολα δεδομένων κατατεθεί σε συλλογικούς γονιδιακής έκφρασης. Σε δύο ανεξάρτητα σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία,
ZNF367
ήταν υπερεκφράζεται σε φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα σε σύγκριση με του φλοιού των επινεφριδίων αδενώματος και φυσιολογικά δείγματα ιστού (p & lt? 0.001? Σχήμα S1). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι
ZNF367
υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία καρκίνων, με συνεπή αποτελέσματα σε διάφορα ανάλυση και γονιδιώματος πλατφόρμες που χρησιμοποιούνται.
(Α και Β) επίπεδο έκφρασης στην κανονική φλοιό των επινεφριδίων, της καλοήθους αδενωμάτων και καρκινωμάτων του φλοιού? (Γ και Δ) φυσιολογικό μυελό των επινεφριδίων, καλοήθων και κακοήθων δείγματα φαιοχρωμοκύττωμα /παραγαγγλιώματος ιστού? και (Ε και F) κανονική θυρεοειδούς και δείγματα ιστού θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς. Ο άξονας Υ σε κάθε γράφημα αντιπροσωπεύει το ποσοστό της έκφρασης mRNA χρησιμοποιώντας το 2
∧-ΔCt μέθοδο * 100% ± SEM. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0.001, *** p & lt? 0.001 (δοκιμασία Kruskal-Wallis). Εκπρόσωπος εικόνες ανοσοϊστοχημεία είναι από το κανονικό, καλοήθεις και κακοήθεις δείγματα όγκων σε μεγέθυνση 20x.
Η
ZNF367
αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή, τη μετανάστευση και την προσκόλληση
Επειδή
ZNF367
υπερεκφράζεται σε ενδοκρινικές καρκίνο, μελετήσαμε την επίδρασή της επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εισβολή, και τη μετανάστευση, τα γεγονότα τα οποία είναι αναγκαία για την εξέλιξη του καρκίνου.
ZNF367
εκφράστηκε σε αδρενοκορτικοειδές καρκίνωμα (SW13, BD140A), θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς (TPC-1), και κυτταρικές σειρές ΗΕΚ293. Έτσι, και τα δύο χρησιμοποιούνται
ZNF367
knockdown και υπερέκφραση προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό της επίδρασης του
ZNF367
επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εισβολή, και τη μετανάστευση. SiRNA knockdown επιτευχθεί έως το 80% του knockdown ZNF367 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε σύγκριση με siRNA αρνητικού μάρτυρα (Εικόνα S2).
ZNF367
knockdown σε κύτταρα SW13, αυξημένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό (30-40% )
in vitro
και (3,5-πλάσια)
in vivo
(ρ & lt? 0,05? Σχήμα 2).
ZNF367
νοκ ντάουν επίσης αυξημένη κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση (p & lt? 0,05? Σχήμα 3Α). Με δεδομένη τη δραματική επίδραση του
ZNF367
στην κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων SW13, η επίδραση του
ZNF367
νοκ ντάουν στην κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση εκτιμήθηκε επίσης σε BD140A, TPC-1, και ΗΕΚ293 κυττάρων γραμμές. Η knockdown είχε μια παρόμοια επίδραση στην κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση των BD140A, TPC-1, και κυτταρικές σειρές ΗΕΚ293 (p & lt? 0,05? Σχήμα 3, Β-Δ). Η επίδραση του
ZNF367
στην κυτταρική ανάπτυξη, την εισβολή και τη μετανάστευση επιβεβαιώθηκε και από υπερεκφράζουν
ZNF367
στα κύτταρα ΗΕΚ293.
ZNF367
υπερέκφραση μειωμένη κυτταρική εισβολή, τη μετανάστευση, και το σχηματισμό αποικιών σε σύγκριση με τον κενό φορέα ελέγχου (Σχήμα 3Ε-G).
(Α)
ZNF367
νοκ ντάουν αυξάνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό . Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU), και ο άξονας Χ δείχνει ημέρες μετά την επιμόλυνση. * Ρ & lt? 0,05 σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SD. (Β)
ZNF367
νοκ ντάουν ενισχύει την ανάπτυξη του όγκου in vivo. κύτταρα SW13 επιμολύνθηκαν με τον αρνητικό μάρτυρα (n = 4) και siRNA (n = 4) εντός του δεξιού και αριστερού πλευρό κάθε ποντικού. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, 3 × 10
6 κύτταρα ενέθηκαν σε αθυμικά γυμνά ποντίκια, και η ανάπτυξη του όγκου μετρήθηκε σε εβδομαδιαία βάση. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει τον όγκο του όγκου και το Χ άξονας τις εβδομάδες μέτρησης του όγκου μετά την έγχυση πλευρό. * P & lt? 0.05 και μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SD
Η
ZNF367
υπερέκφραση μειώνει την κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση.. (Α) SW13, (Β) BD104A, (Γ) TPC-1, και κυτταρικές σειρές ΗΕΚ293 (D). Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επιστρώθηκαν εντός ενός θαλάμου Boyden για 48 ώρες. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν σε 4 τομείς. Το αριστερό πάνελ δείχνει την αντιπροσωπευτική εικόνα (12.5x) από το νοκ ντάουν siRNA και αρνητικές ομάδες ελέγχου. Το δεξί πάνελ δεικνύει την ποσοτική μέτρηση της εισέβαλαν και μετανάστευσαν κύτταρα knockdown και του αρνητικού μάρτυρα. * P & lt? 0,05 και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν ± SD.
ZNF367
υπερέκφραση μειώνει τον αριθμό των αποικιών, την κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση σε κύτταρα ΗΕΚ293. (Ε) στύπωμα Western του
ZNF367
υπερέκφραση σε κύτταρα ΗΕΚ293 και SW13 (κενό φορέα, XL4). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (F) Εκπρόσωπος κλωνογονικού εικόνα για τα κύτταρα με έκτοπη
ZNF367
έκφρασης και αντίστοιχο έλεγχο του (Κενό φορέα, XL4). (G) κυτταρική εισβολή και η μετανάστευση μειώθηκε με
ZNF367
υπερέκφραση σε κύτταρα ΗΕΚ293. Η ποσοτική μέτρηση της εισέβαλαν και μετανάστευσαν κύτταρα ανά ομάδα (ΗΕΚ293-ΗΕΚ293-κενό φορέα ή
ZNF367
) εκπροσωπείται στο γράφημα μπαρ στη δεξιά πλευρά. (Η) Η εξωκυττάρια πρωτεΐνη πρόσδεσης των κυττάρων SW13 με
ZNF367
νοκ ντάουν. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με
ZNF367
siRNA και αρνητικού ελέγχου siRNA, και απλώθηκαν σε πλάκες προσκόλλησης και επωάστηκαν για 90 λεπτά. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει την απορρόφηση στα 540 nm των κυττάρων προσκολλημένων σε κάθε πρωτεΐνη. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM. * Ρ & lt? 0,05, *** ρ & lt?. 0.001
Η
Επειδή κυτταρική εισβολή και η μετανάστευση απαιτούν προσκόλληση κυττάρου προς την εξωκυτταρική μήτρα, αξιολογήσαμε την επίδραση της
ZNF367
knockdown στην κυτταρική προσκόλληση για πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας. Βρήκαμε αυξημένη κυτταρική προσκόλληση, με
ZNF367
νοκ ντάουν, να λαμινίνη Ι (δύο έως τρεις φορές υψηλότερη) και το ινωδογόνο (3-6 φορές υψηλότερη) (p & lt? 0,05? Σχήμα 3Η). Αυτές οι πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι λειτουργούν για να ενισχύσει την κυτταρική προσκόλληση στη βασική μεμβράνη ή εξωκυτταρική μήτρα μέσω υποδοχέων ιντεγκρίνης, οι οποίες επιτρέπουν προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση.
ZNF367
ρυθμίζει ITGA3 έκφραση
Ήμασταν ενδιαφέρονται για τον εντοπισμό του γονιδίου (ες) και μονοπατιού (s) ρυθμίζεται από
ZNF367
, με δεδομένη την επίδραση του
ZNF367
στην κυτταρική εισβολή, τη μετανάστευση και την προσκόλληση, και επειδή είναι ένας παράγοντας μεταγραφής αναμένεται να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση. Χρησιμοποιώντας την ανάλυση της έκφρασης του mRNA του γονιδιώματος-ευρεία σε κύτταρα επιμολυσμένα με
ZNF367
και αρνητικές siRNAs έλεγχο, εντοπίσαμε δύο υποψήφια γονίδια (
ITGA3, αναστολέα πεπτιδάσης
serpin, clade Β (ωολευκωματίνη), μέλος 9 [ ,,,0],
SERPINB9
]) ενδεχομένως ρυθμίζονται από
ZNF367
βασίζεται σε εφαρμογή διάφορα κριτήρια φίλτρου (FDR & lt? 0,25, διπλώστε-αλλαγή & gt? 1.5, κοινό για όλα τα νοκ ντάουν siRNA, και ισχυρή συσχέτιση με την έκφραση σε ανθρώπινα καρκινικά δείγματα) (Σχήμα S3).
ITGA3
επιλέχθηκε ως μια πολλά υποσχόμενη υποψήφιος για περαιτέρω μελέτη, επειδή παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική προσκόλληση και εισβολή και ελέγχθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω μέχρι 2,5 φορές με
ZNF367
νοκ ντάουν (p & lt? 0,05? Σχήμα 4Α) [11]. Επιπλέον, η έκφραση του mRNA ITGA3 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση ZNF367 mRNA σε δείγματα ανθρώπινου φλοιού των επινεφριδίων όγκου (r = – 0.37, ρ = 0.015? Σχήμα 4Β). έκφραση ITGA3 πρωτεΐνη ήταν επίσης αυξημένη με siRNA νοκ ντάουν του
ZNF367
(Σχήμα 4C). Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του
ZNF367
ελαττωμένη
ITGA3
έκφραση σε σύγκριση με τον κενό φορέα (Σχήμα 4D-Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το
ZNF367
ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση, εισβολή, και της μετανάστευσης μέσω της επίδρασής της, τουλάχιστον εν μέρει, στο
ITGA3
έκφρασης.
(Α)
ZNF367
νοκ ντάουν απορυθμίζει
ITGA3
έκφραση στα κύτταρα SW13. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM. (Β) Η συσχέτιση μεταξύ
ITGA3
και
ZNF367
έκφραση του mRNA σε δείγματα φλοιού των όγκων. Χ και Υ άξονες αντιπροσωπεύουν log 2-μεταμορφωθεί τιμές. (C) ποσοτικός προσδιορισμός κηλίδος Western της πρωτεϊνικής έκφρασης ITGA3 με
ZNF367
νοκ ντάουν. (D-Ε) έκφραση ITGA3 με ZNF367 υπερέκφραση. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM.
Η
MiR-195 στοχεύει άμεσα
ZNF367
και ρυθμίζει την κυτταρική εισβολή
Για να κατανοήσουμε το μηχανισμό με τον οποίο
ZNF367
έκφραση απορυθμίζεται στον καρκίνο, θα υποτεθεί ότι microRNAs μπορεί να είναι υπεύθυνη για
ZNF367
υπερέκφραση. Για τον προσδιορισμό των υποψήφιων microRNAs που μπορούν να στοχεύουν
ZNF367
, εμείς αμφισβήτησε τη σάρωση Target και miRDB βάσεις δεδομένων για microRNAs προβλέπεται να στοχεύσετε
ZNF367
. Συνολικά 3 από 14 microRNAs, προβλέπεται να στοχεύσετε
ZNF367,
βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε φλοιού των επινεφριδίων καρκίνωμα (Πίνακας S1). Ωστόσο, μόνο το miR-195 ήταν σημαντικά αντιστρόφως ανάλογη με το
ZNF367
έκφρασης. (R = -0,44? Σχήμα 5Α)
(Α) Η συσχέτιση μεταξύ miR-195 και
ZNF367
έκφρασης σε ένα φλοιού των όγκων. Ο συντελεστής συσχέτισης Pearson υποδεικνύεται με το r με ρ αξία του. (Β) έκτοπη υπερέκφραση της προ-miR-195 αποτελέσματα στην αρνητική ρύθμιση του
ZNF367
.
ZNF367
έκφραση mRNA σε κύτταρα επιμολυσμένα με SW13 προ-miR-195 και προ-αρνητικό έλεγχο στα 5 ηΜ για 24 ώρες (παρουσιάζεται ως πολλαπλάσια μεταβολή σε σχέση με το προ-αρνητικός έλεγχος). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM. Ο δεξιός πίνακας δείχνει την κηλίδα Western της πρωτεΐνης ZNF367 από κύτταρα επιμολυσμένα SW13 με προ-miR-195 και του αρνητικού μάρτυρα. (C) Προ-miR-195 υπερέκφραση αυξάνει εισβολή σε κύτταρα SW13 σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο. Ο δεξιός πίνακας δείχνει τον μέσο αριθμό των κυττάρων που εισέβαλαν στον άξονα Υ. (D)
ITGA3
έκφραση του mRNA αυξάνεται μετά την επιμόλυνση του miR-195 και του αρνητικού ελέγχου στα κύτταρα SW13. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM. (Ε) Η θέση δέσμευσης του miR-195 στο
ZNF367
3’ΙΙΤΡ, μαζί με το μεταλλαγμένο κατασκεύασμα στην προβλεπόμενη περιοχή σπόρου. Στο δεξιό πάνελ, η δοκιμασία λουσιφεράσης επιδεικνύει μειωμένη φωταύγεια σε κύτταρα SW13 συν-επιμολυσμένα με miR-195 και του αρνητικού ελέγχου στα 5 ηΜ, με τον κενό φορέα, άγριου τύπου
ZNF367
3’UTR, ή MUT –
ZNF367
3’ΙΙΤΡ φορέα (μεταλλαγμένο κατά τα τρία πρώτα νουκλεοτίδια της αλληλουχίας των σπόρων). Η φωταύγεια διαβάστηκε μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει την αναλογία του
ZNF367
3’UTR προς τον κενό φορέα. * Τιμή p & lt? 0.05 σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± SEM.
Η
Για να διερευνηθεί εάν miR-195 ρυθμίζει
ZNF367
έκφρασης, τα κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-195 και προ-αρνητικός έλεγχος (προ-NC) , η οποία έδειξε μειωμένη
ZNF367
έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-195 έδειξαν αυξημένη
ITGA3
έκφραση του mRNA (δύο φορές) και στην κυτταρική εισβολή σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα (ρ & lt? 0,05? Σχήμα 5, C-D). Για να επιβεβαιώσετε ότι
ZNF367
είναι ένας άμεσος στόχος του miR-195, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς λουσιφεράσης να καθοριστεί αν miR-195 συνδέεται με την 3’UTR του
ZNF367
mRNA. Παρατηρήσαμε σημαντική μειωμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης με miR-195 υπερέκφραση σε άγριου τύπου 3’UTR σε σύγκριση με αρνητικό μάρτυρα και των μεταλλαγμένων
ZNF367
3’UTR-επιμολυσμένα κύτταρα (p & lt? 0,01? Σχήμα 5Ε). Έτσι, αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι miR-195 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση του
ZNF367 από
κατευθείαν στόχευση 3’UTR της, με αποτέλεσμα μειωμένη κυτταρική εισβολή, το πιο δραματικό αποτέλεσμα του
ZNF367
που παρατηρήσαμε σε λειτουργικές μελέτες μας.
Συζήτηση
για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που χαρακτηρίζουν τη λειτουργία του
ZNF367
σε καρκίνους. Βρήκαμε ότι
ZNF367
υπερεκφράστηκε σε μία ποικιλία καρκίνων ενδοκρινών (αδρενοκορτικοειδές καρκίνωμα, θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, κακοήθη φαιοχρωμοκυτώματος /παραγαγγλιώματος) σε σύγκριση με τα δείγματα καλοηθών και ή φυσιολογικό ιστό. Λειτουργική
in vitro
και
in vivo
μελέτες νοκ ντάουν και υπερέκφραση έδειξε ότι
ZNF367
ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την εισβολή, τη μετανάστευση και την προσκόλληση. Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία ώστε να εντοπιστούν υποψήφια γονίδια που ρυθμίζονται από το
ZNF367
, και εντοπίσαμε
ITAG3
ως ένα γονίδιο που πιθανώς μεσολαβεί στην επίδραση του
ZNF367
για την κυτταρική προσκόλληση, εισβολή, και τη μετανάστευση. Επιπλέον, στην ανάλυση silico ανάλυση του ανθρώπινου γονιδιώματος σε επίπεδο δείγματος όγκου γονιδιακής έκφρασης έδειξε μια αντίστροφη σχέση μεταξύ ZNF367
και
ITAG3
έκφραση
. Τέλος, αποδεικνύουμε ότι απορρυθμισμένης
ZNF367
έκφραση συσχετίστηκε με την απώλεια του miR-195 έκφραση σε δείγματα όγκων και ότι αυτό το microRNA στοχεύει άμεσα
ZNF367
και ρυθμίζει την κυτταρική εισβολή, παρέχοντας μια κατανόηση της μηχανισμό για δυσρυθμισμένη
ZNF367
έκφρασης. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ότι υπάρχει μια miR-195-
ZNF367-ITAG3
άξονα που ρυθμίζει την εξέλιξη του ενδοκρινικού καρκίνου.
Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που χαρακτηρίζουν την έκφραση και τη λειτουργία της
ZNF367
στον καρκίνο.
ZNF367
νοκ-άουτ σε ποντίκια έδειξε σημαντικές ανωμαλίες [12].
You must be logged into post a comment.