Αφηρημένο

Ιστορικό

Η απόπτωση παίζει κεντρικό ρόλο στην παθογένεση της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας (COPD), και αυτή η διαδικασία μπορεί να ρυθμίζεται με μιτοχονδριακή μεταγραφικού παράγοντα Α (mtTFA). Επιγενετική εμπλέκεται στη ρύθμιση και την τροποποίηση των γονιδίων που εμπλέκονται στον καρκίνο του πνεύμονα και COPD. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε την έκφραση του mtTFA και τα επίπεδα μεθυλίωσης του σε ασθενείς με ΧΑΠ με ​​καρκίνο του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Είκοσι ένας ασθενείς πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα, 11 με ΧΑΠ και 10 χωρίς ΧΑΠ, που υποβάλλεται pneumonectomy φοιτούσαν. Το αποπτωτικό δείκτη (ΑΙ) του πνευμονικών αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων αναλύθηκε με δοκιμασία nick τέλος επισήμανση τρανσφεράσης διαμεσολαβείται δεοξυουριδίνη τριφωσφορική-βιοτίνη. Η έκφραση του mtTFA mRNA και της πρωτεΐνης μετρήθηκε με τη χρήση PCR, ανοσοϊστοχημεία και στύπωμα Western. Μεθυλίωση του

mtTFA

υποκινητή ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας διθειώδους αλληλούχισης PCR.

Αποτελέσματα

Σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς ΧΑΠ, το AI ήταν υψηλότερη, και η έκφραση του mRNA και mtTFA πρωτεΐνης ήταν χαμηλότερη στην ομάδα ΧΑΠ (

P

& lt? 0.001). Έκφραση της πρωτεΐνης mtTFA συσχετίστηκε θετικά με FEV

1 /Προ (

r

= 0,892,

P

& lt? 0.001), και αρνητική συσχέτιση με την ΑΙ (

r

= -0,749,

P

& lt? 0.001) και δείκτη καπνού (

r

= -0,763,

P

& lt? 0.001). Ποσοστό

mtTFA

μεθυλίωση προαγωγού σε ασθενείς με ΧΑΠ ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σύγκριση με τους ασθενείς που δεν ΧΑΠ (

P

& lt? 0,05).

Συμπέρασμα

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση του mtTFA mRNA και της πρωτεΐνης ρυθμίζεται προς τα κάτω στον πνευμονικό ιστό από τους ασθενείς με ΧΑΠ και πλακωδών καρκίνο του πνεύμονα, και το επίπεδο της πρωτεΐνης mtTFA σχετίζεται με την απόπτωση των πνευμονικών αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων. Παρεκκλίνουσα

mtTFA

μεθυλίωση μπορεί επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ΧΑΠ

Παράθεση:. Peng Η, Γιανγκ Μ, Chen Ζ-Υ, Chen P, Guan C-x, Xiang X-d, et al. (2013) Έκφραση και μεθυλίωση του μιτοχονδριακού Μεταγραφή Παράγοντα Α στην Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια ασθενείς Νόσος με καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (12): e82739. doi: 10.1371 /journal.pone.0082739

Επιμέλεια: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, Γαλλία

Ελήφθη: 28 Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 28 Οκτ 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Peng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30800503, Αρ 30770931 και Νο 81070039) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Χουνάν (Νο 09JJ3036). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) είναι μία από τις πιο κοινές χρόνιες παθήσεις. Η παγκόσμια επικράτηση σε ενήλικες άνω των 40 ετών υπολογίζεται σε 10% [1]. Πολλά μηχανισμούς όπως η χρόνια φλεγμονή, πρωτεϊνάσης /αντι-πρωτεϊνάσης ανισορροπία, και το οξειδωτικό στρες που εμπλέκονται στην παθογένεση της COPD [2], και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης της νόσου. Πρόσφατα στοιχεία από τις δύο ζωικά μοντέλα και ανθρώπινες μελέτες [3] – [6] προτείνει ένα σημαντικό ρόλο για ενδοθηλιακή απόπτωση στα παθολογικές διαδικασίες της ΧΑΠ

παράγοντα Μιτοχονδριακή μεταγραφής Α (mtTFA, TFAM) είναι ένας πυρήνας-κωδικοποιημένα. πρωτεΐνη που δεσμεύεται άνωθεν του υποκινητή φωτός κλώνου (LSP) και βαριά υποκινητή κλώνου (HSP) του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA). mtTFA προάγει τη μεταγραφή του μιτοχονδριακού DNA και ρυθμίζει την αντιγραφή mtDNA [7]. Η διακοπή του

mtTFA

γονιδίου στα αποτελέσματα ποντίκια στην εξάντληση των mtDNA, η απώλεια της μιτοχονδριακής μεταγραφές, την απομείωση της αναπνοής αλυσίδας, κυτταρική απόπτωση, και τη μείωση του mtDNA-κωδικοποιημένα πολυπεπτίδια [8], [9]. Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του mtTFA μπορεί να βελτιώσει τη μείωση του αριθμού αντιγράφων mtDNA και την απόπτωση σε διαγονιδιακά (Tg) ποντίκια [10]. Remels et al [11] βρήκαν ότι η ποσότητα της πρωτεΐνης mtTFA ήταν σημαντικά χαμηλότερη στον τετρακέφαλο μυ των ασθενών με μέτρια έως πολύ σοβαρή ΧΑΠ από ότι στους ελέγχους. Ανέφεραν επίσης ότι το ποσό του mtTFA mRNA και της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε ασθενείς με ΧΑΠ καχεκτικούς σε σύγκριση με ότι και στις δύο ασθενείς που δεν καχεκτικούς και άτομα ελέγχου [11]. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η διάσπαση του mtTFA συνδέεται με ανωμαλίες των σκελετικών μυών στους ασθενείς με ΧΑΠ. Ωστόσο, η έκφραση της mtTFA στον πνεύμονα των ασθενών με ΧΑΠ δεν έχει μελετηθεί και οι υποκείμενοι μηχανισμοί δεν έχουν αποσαφηνιστεί.

Επιγενετική αναφέρεται σε κληρονομικές αλλαγές στη λειτουργία του γονιδίου που συμβαίνουν μέσω αλλαγών στη δομή της χρωματίνης, χωρίς καμία αλλαγή στην η αλληλουχία DNA. Ένα από τα βασικά επιγενετικών μηχανισμών είναι μεθυλίωσης του DNA, η οποία καταστέλλει τη μεταγραφή γονιδίων, και τροποποιεί τα βασικά ιστόνες εξασθενημένης DNA στο χρωμόσωμα. Μεθυλίωσης του DNA μπορεί να οδηγήσει είτε σε ενεργοποίηση ή την καταστολή των γονιδίων [12]. Μέχρι σήμερα, το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας στον τομέα αυτό επικεντρώνεται στον καρκίνο, την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση. Ωστόσο, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι η επιγενετική μπορεί επίσης να παίζουν έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στο άσθμα και ΧΑΠ [13]. DeMeo et al βρήκαν ότι μεταβλητή μεθυλίωσης του DNA συνδέεται με ΧΑΠ και την πνευμονική λειτουργία [14]. Βρήκαν επίσης ότι

Alu

και LINE-1 υπομεθυλίωση σχετίζονται με χαμηλότερη πνευμονική λειτουργία ή /και ταχεία μείωση της πνευμονικής λειτουργίας στους ηλικιωμένους ασθενείς [15]. Ως εκ τούτου, επιγενετικής αιτιολογία παρουσιάζει ένα νέο στόχο για τη θεραπεία του άσθματος και της ΧΑΠ [16].

Ο καπνός του τσιγάρου αποτελεί βασικό παράγοντα κινδύνου για τη ΧΑΠ. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι το κάπνισμα μπορεί να αλλάξει το DNA μεθυλίωση. Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι υπήρχε τουλάχιστον μία παρεκκλίνουσα γονίδιο μεθυλίωσης σε 32 τοις εκατό των βρογχικών δείγμα πινέλου από άτομα με ιστορικό καπνίσματος [17]. Kikuchi et al [18] Επίσης, διαπιστώθηκε TSLC1 /IGSF4 μεθυλίωση συσχετίστηκε με το δείκτη του καπνίσματος. Το κάπνισμα και το χρονικό διάστημα της αποχής συνδέονται με διαφορική μεθυλίωση του DNA σε όλον τον ανθρώπινο γονιδίωμα [19]. Η ανάλυση της αλληλουχίας αποκάλυψε ότι υπάρχουν 67 δυνητικές CpG μεθυλίωσης loci μεταξύ -2246 bp και 132 bp του ανθρώπινου

mtTFA

υποκινητή, υποδηλώνοντας ότι η μεθυλίωση της κυτοσίνης μπορεί να παίζει ρόλο στην ρύθμιση της έκφρασης mtTFA. Choi et al [20] βρήκαν τα λουσιφεράσης δραστηριότητες του pGL2-hTfam σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα HepG2 καταστέλλεται από τοποειδική μεθυλίωση. Αυτή η

in vitro

μελέτη έδειξε ότι η μεθυλίωση της πυρηνικής αναπνευστικού παράγοντα 1 (NRF-1) περιοχή δέσμευσης παρεμποδίζει ισχυρά την δραστικότητα του

mtTFA

υποκινητή σε παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα HepG2.

στην παρούσα μελέτη, ελέγξαμε την υπόθεση ότι οι αλλαγές στην έκφραση των mtTFA και ανώμαλης

mtTFA

μεθυλίωση μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ΧΑΠ.

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την θεσμική επιτροπή δεοντολογίας του δευτέρου Xiangya Νοσοκομείο της Κεντρικής-Νότιας Πανεπιστήμιο και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα άτομα πριν από την εγγραφή τους στη μελέτη.

Οι ασθενείς και οι γενικές πληροφορίες

τους

Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελείτο από 11 ασθενείς καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα (στάδιο ΙΙ) με ΧΑΠ και 10 ασθενείς καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα (στάδιο ΙΙ), χωρίς ΧΑΠ οι οποίοι υποβλήθηκαν σε πνευμονεκτομή. Το πνευμονικό ιστό 5 cm μακριά από το περιθώριο του όγκου χρησιμοποιήθηκε στις μελέτες μας. Όλοι οι ασθενείς με ΧΑΠ υπέφερε από χρόνιο περιορισμό της ροής του αέρα, που ορίζεται ως μια μετα-βρογχοδιαστολή εκπνεόμενο όγκο σε ένα δευτερόλεπτο πάνω από αναγκαστική ζωτική χωρητικότητα (FEV

1 /FVC) είναι & lt? 70%, ελλείψει εναλλακτικών αιτίες. Όλοι οι ασθενείς δεν είχαν λάβει μεταμόσχευση πνεύμονα, ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία ή εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή. Τα συμμετέχοντα άτομα δεν έχουν καμία άλλη confoundable ιατρικές παθήσεις, όπως η γαστρεντερική, νεφρική, ενδοκρινικές, μεταβολικές και φλεγμονώδεις νόσους. FEV

1 και FVC αξιολογήθηκαν από την καμπύλη ροής-όγκου που λαμβάνεται χρησιμοποιώντας ένα σπιρόμετρο (SensorMedics AutoBox-6200D, USA). Lung παραμέτρους λειτουργίας εκφράστηκαν ως ποσοστό των τιμών αναφοράς. Τα γενικά χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται στον πίνακα 1. Δεν υπήρχαν διαφορές στην ηλικία ή το φύλο μεταξύ των δύο ομάδων (

P

& gt? 0,05). Σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς ΧΑΠ, ο δείκτης του καπνίσματος της ομάδας ΧΑΠ ήταν σημαντικά υψηλότερη (

P

& lt? 0.001), ενώ και οι δύο FEV

1 /Προ (%) (ποσοστό FEV

1 πραγματική της FEV

1 αφιερωθεί) και FEV

1 /FVC (%) ήταν χαμηλότερη στην ομάδα ΧΑΠ (

P

& lt?. 0.001)

η

Μέθοδοι

οι ιστολογικές μελέτες.

εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα ανθρώπινου πνευμονικού ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν με ξυλόλιο και αιθανόλη. Οι τομές συνοπτικά πλύθηκαν, χρωματίστηκαν σε διάλυμα αιματοξυλίνης Harris για 5 έως 10 λεπτά, διαφοροποιούνται σε αλκοόλη 1% οξύ για 30 δευτερόλεπτα, και στη συνέχεια πλένονται. Οι τομές στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν σε διάλυμα ηωσίνης-Φλοξίνη για 30 δευτερόλεπτα έως 1 λεπτό, αφυδατωμένο με 95% αλκοόλη και 2 αλλαγές απόλυτης αλκοόλης για 5 λεπτά το καθένα, καθαρίστηκαν σε 2 αλλαγές ξυλένιου 5 λεπτά κάθε, και τοποθετείται με ξυλόλιο μέσου στερέωσης βασίζονται . Ιστολογία αξιολογήθηκε από έναν παθολόγο με τυφλό τρόπο. Όπως εμφύσημα είναι μια δομική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από την καταστροφή των τοιχωμάτων των κυψελίδων και η διεύρυνση των κυψελιδικών χώρων, η διεύρυνση του κυψελιδικούς χώρους αξιολογήθηκε με ποσόστωση της μέσης γραμμικής τομής (MLI) και καταστροφή των κυψελιδικών τοιχωμάτων με μέτρηση της καταστρεπτικής δείκτης (DI). Το MLI, ένα μέτρο της δια-κυψελιδικών απόσταση τοίχο, προσδιορίστηκε με μικροσκοπία φωτός σε ολική μεγέθυνση 100 ×. Τα πεδία που περιλαμβάνονται μεγάλους αεραγωγούς ή σκάφη αποκλείστηκαν από την ανάλυση. Η MLI ορίστηκε ως το συνολικό μήκος της εγκάρσιας γραμμής διαιρούμενο με τον αριθμό των κυψελιδικών τοιχωμάτων που τέμνουν τις γραμμές δοκιμής, όπως περιγράφεται από τους Xu et al [21]. Το DI υπολογίστηκε ως ένα μέτρο της καταστροφής παρεγχύματος χρησιμοποιώντας μια μικροσκοπική τεχνική σημείο-count [22]. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις διπλούν μετρώντας τυχαία πάνω από 3.000 κυψελίδες από 50 HE τμήματα από κάθε ασθενή σε μεγέθυνση 200 ×.

Μέτρηση της απόπτωσης.

Terminal δεοξυνουκλεοτιδυλτρανσφεράσης Μεσολαβεί dUTP Nick End επισήμανση (TUNEL) Δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων στους πνεύμονες των ασθενών με ΧΑΠ. Κρυοστάτης τομές ιστών του πνεύμονα σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. χρώση TUNEL διεξήχθη με το

In Situ

κυτταρικού θανάτου Detection Kit-POD (ROCHE). TUNEL θετικά και αρνητικά κύτταρα σε ολόκληρο το τμήμα μετρήθηκαν από έναν παθολόγο με τυφλό τρόπο, και ο αποπτωτικός δείκτης υπολογίστηκε ως ο αριθμός των TUNEL θετικών ενδοθηλιακών κυττάρων /ολόκληρα τα ενδοθηλιακά κύτταρα.

Αντίστροφη Μεταγραφάση-Polymerase Chain Αντίδραση (RT-PCR).

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ μέθοδο εκχύλισης ενός σταδίου (Invitrogen, USA). Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο και η ποιότητα επαληθεύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. RNA (2 mg ανά δείγμα) μεταγράφηκε αντίστροφα για να κάνουν συμπληρωματικό DNA (cDNA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (κιτ RT, Fermentas, USA). cDNA ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας Platinum Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, Breda, the Netherlands) σε συσκευή θερμικού κυκλοποιητή (Applied Β PE4500, USA). Θερμικές συνθήκες ποδηλασίας σχεδιάστηκαν ως ακολούθως: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 55 ° C για 45 sec, και ένα στάδιο επέκτασης 5 λεπτών στους 72 ° C. Τα ζεύγη εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για PCR είχαν ως εξής: 5′-TATCAAGATGCTTATAGGGC-3 ‘και 5′-ACTCCTCAGCACCATATTTT-3′ για mtTFA (amplicon αναμενόμενο μέγεθος: 441 bp)? 5’-ACCCACACTGTGCCCATCTAC-3 ‘και 5′-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3’ για β-ακτίνη (amplicon αναμενόμενο μέγεθος: 103 bp). επίπεδο πρακτικά της συστατικής γονίδιο βασικών λειτουργιών της β-ακτίνης μετρήθηκε ποσοτικά ως μάρτυρας του RNA φόρτωσης. Η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε και εκφράζεται σε αυθαίρετες μονάδες (AU).

σε πραγματικό χρόνο RT-PCR (qRT-PCR).

Απομονωμένα RNA μεταγράφηκε ανάστροφα σε cDNA με RT-PCR. cDNA ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας Platinum Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, Breda, the Netherlands) σε συσκευή Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, USA). Θερμικές συνθήκες ποδηλασίας σχεδιάστηκαν ως ακολούθως: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα και 57 ° C για 20 δευτερόλεπτα, και ένα στάδιο επέκτασης 5 λεπτών στους 72 ° C. Τα ζεύγη εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για PCR είχαν ως εξής: 5′-GAACAACTACCCATATTTAAAGCTCA-3 ‘και 5′-GAATCAGGAAGTTCCCTCCA-3′ για mtTFA? 5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3 ‘και 5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3’ για β-ακτίνη. Αναμενόμενα μεγέθη amplicon ήταν 95 bp και 97 bp. Η ειδικότητα της ενίσχυσης επαληθεύτηκε με ανάλυση καμπύλης τήξης και αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της ενίσχυσης PCR. επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου συστατική housekeeping προϊόν β-ακτίνης ποσοτικά μετρήθηκαν για τον έλεγχο της φόρτωσης. Σχετικές μεταβολές στην μεταγραφή αφθονία εκφράστηκαν ως ΔΟ

τιμές Τ (ΔΟ

T = ΔΟ

αναφοράς Τ -ΔC

T-στόχο), όπου higherΔC

αξίες Τ δείχνουν υψηλότερη αφθονία μεταγραφής.

ανάλυση κηλίδος Western.

ένα σύνολο 40 μg πρωτεΐνης από κάθε δείγμα διαχωρίζεται επί 12% πηκτή πολυακρυλαμιδίου SDS, και ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνη φθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS που περιέχει 0.05% Tween (PBST) για 1 ώρα. Μετά από πλύση με PBST, η μεμβράνη επωάστηκε με μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού mtTFA (1:100? Abcam, USA) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Η μεμβράνη πλύθηκε τέσσερις φορές και επωάζονται με υπεροξειδάση κρένου συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (αντι-κουνελιού, 1:10,000? Santa Cruz, CA) για 1 ώρα. Η ταινία αναπτύχθηκε από ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (ECL, BestBio Pharmacia Biotech). Τα επίπεδα του ιδιοσυστατικού γονιδιακού προϊόντος housekeeping β-ακτίνης μετρήθηκαν επίσης ως έλεγχος φόρτωσης. Η έκφραση της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε και εκφράζεται σε αυθαίρετες μονάδες (AU).

ανοσοϊστοχημεία.

εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα ανθρώπινου πνευμονικού ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν με ξυλόλιο και αιθανόλη. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μικροκυμάτων με διάλυμα κιτρικού οξέος για 20 λεπτά. Αβιδίνη και βιοτίνη μπλοκ διεξήχθη, και ενδογενούς υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%. Μετά από αποκλεισμό με 5% φυσιολογικό ορό κατσίκας, ένα αντι-ανθρώπινο αντίσωμα mtTFA κουνελιού (1:100) (Abcam, USA) εφαρμόστηκε επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι τομές πλύθηκαν με PBS με 0,05% Tween και επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένα αίγας αντι-κουνελιού IgG (1:10,000? Santa Cruz, CA). Μετά την πλύση, οι τομές χρωματίστηκαν με αντιδραστήρια ABC Vectastatin (Wuhan Boster Βιολογική Technology Corporation, Ltd) και DAB (Beijing Zhong Shan-Χρυσή Γέφυρα Βιολογική Technology Corporation). Οι τομές στη συνέχεια σκόραρε από έναν παθολόγο σε έναν τυφλό τρόπο (αριθμός mtTFA θετικά ενδοθηλιακά κύτταρα /100 ενδοθηλιακά κύτταρα ανά περίπτωση) για τη χρώση mtTFA σε τριχοειδή αγγεία, μικρές /μεσαίες αρτηρίες.

Bisulfite αλληλουχίας PCR (BSP).

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τον ιστό του πνεύμονα χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης DNeasy DNA (Qiagen, Valencia, CA) ακολουθούμενη από χώνευση EcoRI. Τροποποίηση όξινου θειώδους γονιδιωματικού DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 μg καθαρισμένου DNA (20 μΐ) επωάστηκε σε 130 μΙ αντιδραστηρίου μετατροπής CT στους 98 ° C για 10 λεπτά και 64 ° C για 2,5 ώρες, με αποτέλεσμα την μετατροπή μη μεθυλιωμένων κυτοσίνες σε ουρακίλη. Μετά τον καθαρισμό του DNA, το όξινο θειώδες-τροποποιημένο DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας PCR. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας την ηλεκτρονική πρόγραμμα MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/): PCR εκκινητών, 5′-TATTAGAATTTGTTAAATTTTGGGGAAT-3 ‘και 5′-ACAAACAATCCTACATCCAAAACC-3’. Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 3 λεπτά στους 94 ° C? 35 κύκλοι των 30 sec στους 94 ° C, 30 sec στους 56 ° C, και 40 sec στους 72 ° C? και ένα στάδιο επέκτασης 5 λεπτών στους 7 ° C. Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα 1% αγαρόζης (QIAquick κιτ εκχύλισης πηκτής? Qiagen), που ανακτάται ή χρησιμοποιώντας καθίζηση με αιθανόλη, και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε χρησιμοποιώντας απολίνωση σε pCR 2.1-ΤΟΡΟ κλωνοποίησης με ένα κιτ κλωνοποίησης ΤΑ (Takara, USA) που ακολουθείται χρησιμοποιώντας τις αρμόδιες βακτηρίων ϋΗ5α (Εργαστήριο Ανθρωπίνων Κλειδί της Ιατρικής Epigenomics, το δεύτερο Xiangya Νοσοκομείο, Κεντρική-Νότια Πανεπιστήμιο). Το πλασμίδιο DNA που απομονώθηκε από τουλάχιστον πέντε κλώνοι για κάθε προϊόν αντίδρασης PCR υποβλήθηκαν σε ανάλυση αλληλουχίας DNA στο Shanghai εταιρεία βιοτεχνολογίας. Σε σύγκριση με την αρχική γονιδιωματική αλληλουχία mtTFA DNA, η μεθυλίωση του CpG προσδιορίστηκε όπως εμφανίζεται μη μετατραπέντος κυτοσίνες στις θέσεις CpG σε όξινο θειώδες-τροποποιημένου DNA.

Στατιστική ανάλυση.

Η στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS έκδοση 13.0. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέσοι ± SD. δοκιμή Τ συγκρίθηκε η διαφορά μεταξύ των ομάδων. Η ανάλυση γραμμικής συσχέτισης διεξήχθη χρησιμοποιώντας Pearson συσχετίσεις στιγμή προϊόν. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές εάν

P

& lt?.. 0.05

Αποτελέσματα

Η ιστολογική ανάλυση των πνευμόνων ιστών

Η παθολογική αλλαγή του πνευμονικού ιστού

δεν υπήρχαν σημαντικές παθολογικές διαφορές μεταξύ της ομάδας μη-ΧΑΠ και την ομάδα ΧΑΠ. Η μορφολογία του ιστού των πνευμόνων ήταν φυσιολογική στην ομάδα χωρίς ΧΑΠ. Κυψελιδικών διαφραγμάτων ήταν άθικτα και υπήρχε μικρή διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων (Σχήμα 1Α). Αλλά στην ομάδα ΧΑΠ, υπήρξε σοβαρή φλεγμονώδη διήθηση τόσο των αεραγωγών και κυψελίδες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, cilium defluxion και πολλαπλασιασμό λαγηνοειδών κυττάρων παρατηρήθηκαν στους αεραγωγούς, εν τω μεταξύ καταστροφή και αραίωση ανιχνεύθηκαν σε κυψελίδες των ασθενών με ΧΑΠ. Σε σύγκριση με την ομάδα που δεν ΧΑΠ, η MLI και DI ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα ΧΑΠ (MLI:. 70 ± 23 μm

vs

43 ± 6 μm,

P

& lt? 0.001? DI: 55 ± 4%

vs

16 ± 3%,

P

& lt? 0.001)

Οι μικροφωτογραφίες του πνευμονικού ιστού από την ομάδα μη-ΧΑΠ (πάνελ.. Α) και η ομάδα ΧΑΠ (πίνακας Β) (μεγέθυνση: 100 ×). Η μέση γραμμική τομής (MLI) και η καταστροφική δείκτης (DI) στην ομάδα ΧΑΠ ήταν σημαντικά υψηλότερες σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς ΧΑΠ (

P & lt?

0.001).

Η

Οι παθολογικές αλλαγές του πνευμονικό αγγειακό σύστημα.

Η μορφολογία των πνευμονικά αγγεία μεταξύ των μη ΧΑΠ και ΧΑΠ ομάδες ήταν διαφορετική. Το πνευμονικό αγγειακό σύστημα ήταν φυσιολογική και υπήρχε μικρή διείσδυση φλεγμονωδών κυττάρων στην ομάδα χωρίς ΧΑΠ (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, στην ομάδα ΧΑΠ, τα τοιχώματα των αγγείων ήταν πολύ παχύτερο, ειδικά στην ομαλή στρώμα μυών. Ο αυλός στένεψαν ως συνέπεια της αυξημένης πάχος αγγειακού τοιχώματος στην ομάδα ΧΑΠ (Σχήμα 2Β).

Οι μικροφωτογραφίες πνευμονικών αγγείων από τη μη COPD (πίνακας Α) και την ομάδα ΧΑΠ (πίνακας Β) (μεγέθυνση: 100 ×). Η ιστολογική παρουσίαση της πνευμονικής αγγείωσης μεταξύ της ομάδας ομάδα ΧΑΠ και χωρίς ΧΑΠ ήταν διαφορετική.

Η

Η πνευμονική αγγειακή ενδοθηλιακή απόπτωση

Η απόπτωση πνευμονικών αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων στην μη-ΧΑΠ και ομάδες ΧΑΠ αναλύθηκε με δοκιμασία TUNEL. Τα αποπτωτικά θετικά κύτταρα βάφτηκαν σε κίτρινο καφέ δοκιμασία TUNEL. Το αποπτωτικό δείκτη πνευμονικών αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων στην ομάδα ΧΑΠ ήταν πολύ υψηλότερη από ότι στην ομάδα χωρίς ΧΑΠ (

P

& lt? 0.001). (Εικόνα 3 και Πίνακας 2)

Η θετικά κύτταρα βάφτηκαν σε κίτρινο καφέ με δοκιμασία TUNEL. Μικροφωτογραφίες των TUNEL βάφονται πνευμονικού ιστού της ομάδας χωρίς ΧΑΠ (πίνακας Α) και την ομάδα ΧΑΠ (πίνακας Β) (μεγέθυνση: 400 ×). Ο αριθμός των TUNEL θετικών πνευμονικών αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων στην ομάδα ΧΑΠ ήταν πολύ υψηλότερη από ότι στην ομάδα χωρίς ΧΑΠ.

Η

Έκφραση mtTFA mRNA και της πρωτεΐνης σε πνευμονικό ιστό από μη-ΧΑΠ και ασθενείς με ΧΑΠ

πνεύμονα ιστού

mtTFA

mRNA ανιχνεύεται με RT-PCR και qRT-PCR.

Αναλύσαμε την έκφραση του

mtTFA

mRNA σε πνεύμονα ιστούς με ημι-ποσοτική RT-PCR. Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης έδειξε έκφραση του

mtTFA

mRNA σε ιστό πνεύμονα από τους ασθενείς με ΧΑΠ ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με εκείνη από τους ασθενείς χωρίς ΧΑΠ (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, η έκφραση του

mtTFA

mRNA στον πνευμονικό ιστό προσδιορίστηκε επίσης με qRT-PCR. Η σχετική ποσότητα του

mtTFA

έκφραση του mRNA στους ασθενείς με ΧΑΠ ήταν μικρότερη από ότι στους ασθενείς χωρίς ΧΑΠ (COPD ομάδα: 0,59 ± 0,07

vs

μη ΧΑΠ ομάδα:. 0.78 ± 0.09,

P

& lt?. 0.001) (Σχήμα 4Β)

η έκφραση της πνευμονικής

mtTFA

mRNA μετρήθηκε με RT-PCR (πίνακας Α). Γραμμή 1, 2 και 3 ήταν οι ασθενείς χωρίς ΧΑΠ και γραμμή 4, 5 και 6 ήταν οι ασθενείς με ΧΑΠ. Το επίπεδο της mtTFA mRNA σε ιστούς των πνευμόνων από την ομάδα ΧΑΠ ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς ΧΑΠ. Η έκφραση της πνευμονικής

mtTFA

mRNA μετρήθηκε με qRT-PCR (πίνακας Β). οικόπεδα κουτί εμφανίζει το εύρος και την κατανομή των δεδομένων με τα άνω, κάτω τεταρτημόρια, και η διάμεση τιμή της μέγιστης διαφοράς των

mtTFA

mRNA στην ομάδα μη-ΧΑΠ και την ομάδα ΧΑΠ. Η διάμεση τιμή για κάθε σύνολο δεδομένων αναφέρεται επίσης από την κεντρική γραμμή. Η έκφραση της πρωτεΐνης mtTFA (πίνακας C): Γραμμή 1 και 2 ήταν οι ασθενείς χωρίς ΧΑΠ και της γραμμής 4 και 5 ήταν οι ασθενείς με ΧΑΠ. Η ποσοτική ανάλυση της πυκνότητας πρωτεΐνης παρουσιάζεται επίσης (πίνακας D).

Η

Η έκφραση της πρωτεΐνης mtTFA του πνευμονικού ιστού σε ασθενείς με μη-ΧΑΠ και COPD.

επόμενο μετρηθεί έκφραση της πρωτεΐνης mtTFA στον πνευμονικό ιστό με στύπωση Western. Η σχετική έκφραση της πρωτεΐνης mtTFA στην ομάδα ΧΑΠ ήταν χαμηλότερη από ότι στην ομάδα χωρίς ΧΑΠ (COPD: 0,32 ± 0,07

vs

χωρίς ΧΑΠ:. 0.55 ± 0.09,

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 4C & amp? 4D). Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό του εντοπισμού της πνευμονικής πρωτεΐνης mtTFA, ανοσοϊστοχημική χρώση σε τομές πνευμονικού ιστού χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα ειδικό για mtTFA εκτελέστηκε. mtTFA πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων αγγείων, και συνεπείς με αποτέλεσμα κηλίδος Western, η έκφραση της ήταν χαμηλότερη στην ομάδα ΧΑΠ σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς ΧΑΠ (Σχήμα 5).

πρωτεΐνη έκφραση mtTFA του η ομάδα χωρίς ΧΑΠ (πλαίσιο Α) και η ομάδα ΧΑΠ (πίνακας Β) (μεγέθυνση: 400 ×). mtTFA πρωτεΐνη ήταν κίτρινο καφέ χρώση DAB. Σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς ΧΑΠ, η έκφραση της πρωτεΐνης ήταν mtTFA χαμηλότερη στην ομάδα ΧΑΠ.

Η

Η κατάσταση μεθυλίωσης του

mtTFA

υποκινητή στον πνευμονικό ιστό των μη ΧΑΠ

vs

. ασθενείς με ΧΑΠ

Εμείς καθορίζεται περαιτέρω την κατάσταση του

mtTFA

μεθυλίωση υποστηρικτής στον πνευμονικό ιστό από την μη-ΧΑΠ και ΧΑΠ ασθενή από BSP και ανάλυση αλληλουχίας DNA. Η

mtTFA

πρότυπο μεθυλίωσης του υποκινητή ιστούς των πνευμόνων από ασθενείς χωρίς ΧΑΠ και ΧΑΠ δείχνονται στο Σχήμα 6Α και 6Β. Το ποσοστό των

mtTFA

μεθυλίωση προαγωγού (%) σε ασθενείς με ΧΑΠ ήταν υψηλότερος σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς ΧΑΠ (ΧΑΠ:. 38,6 ± 14,7

vs

μη ΧΑΠ 27,8 ± 8,8?

P

& lt?.. 0,05) (Σχήμα 7)

το μοντέλο της mtTFA μεθυλίωση της ομάδας μη-ΧΑΠ (ομάδα Α) και την ομάδα ΧΑΠ (πίνακας Β)

Η

οικόπεδα κουτί οθόνη τα άκρα, τα άνω και κάτω τεταρτημόρια, και η διάμεση τιμή της μέγιστης διαφοράς των μη ΧΑΠ και ΧΑΠ ομάδες. Η διάμεση τιμή για κάθε σύνολο δεδομένων υποδεικνύεται από την κεντρική γραμμή,

P

αξία ποσοστό μεθυλίωσης του

mtTFA

υποστηρικτής ήταν 0,013 μεταξύ των μη-ΧΑΠ και την ομάδα ΧΑΠ.

Η

ανάλυση συσχέτισης

Η ανάλυση συσχέτισης των απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τη λειτουργία των πνευμόνων και το δείκτη του καπνίσματος.

Το αποπτωτικό δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων συσχετίζεται αρνητικά με FEV

1 /FVC (

r

= -0,796,

P & lt?

0.001) και FEV

1 /προ (

r

= -0,827,

P & lt?

0.001) (Σχήμα 8Α & amp? 8Β) και συσχετίζεται θετικά με το δείκτη του καπνίσματος (

r

= 0.703,

P & lt?

0.001) (Σχήμα 8C)

Το διάγραμμα διασποράς της ανάλυσης συσχέτισης των ενδοθηλιακών. αποπτωτικό δείκτη κυττάρων και FEV

1 /FVC (

r

= -0,796,

P

& lt? 0.001) (πίνακας Α). Το διάγραμμα διασποράς της ανάλυσης συσχέτισης των αποπτωτικών δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων και FEV

1 /Προ (

r

= -0,827,

P

& lt? 0.001) (πίνακας Β). Το διάγραμμα διασποράς της ανάλυσης συσχέτισης των αποπτωτικών δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων και ο δείκτης του καπνίσματος (

r

= 0.703,

P

& lt? 0.001). (Πίνακας Γ)

Η

Η ανάλυση συσχέτισης του πνευμονικού ιστού mtTFA πρωτεΐνη και FEV

1 /Pre, δείκτης κάπνισμα, αποπτωτικό δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων.

η έκφραση της πρωτεΐνης mtTFA του πνευμονικού ιστού συσχετίστηκε θετικά με FEV

1 /προ (

r

= 0,892,

P & lt?

0.001) (Σχήμα 9Α), συσχετίζεται αρνητικά με αποπτωτικό δείκτη αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων (

r

= -0,749,

P & lt?

0.001) και ο δείκτης του καπνίσματος (

r

= -0,763,

P & lt?

0.001) (Σχήμα 9Β & amp?. 9Γ)

Το διάγραμμα διασποράς της ανάλυσης συσχέτισης του πνεύμονα ιστού mtTFA πρωτεΐνης και FEV

1 /προ (

r

= 0,892,

P

& lt? 0.001) (πίνακας Α). Το διάγραμμα διασποράς της ανάλυσης συσχέτισης του πνευμονικού ιστού mtTFA πρωτεΐνη και ενδοθηλιακά αποπτωτικό δείκτη (

r

= -0,749,

P

& lt? 0.001) (πίνακας Β). Το διάγραμμα διασποράς της ανάλυσης συσχέτισης του πνευμονικού ιστού mtTFA πρωτεΐνη και το δείκτη του καπνίσματος (

r

= -0,763,

P

& lt? 0.001). (Πίνακας Γ)

Η

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι η αγγειακή αποπτωτικό δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων σε ασθενείς με ΧΑΠ ήταν πολύ υψηλότερη σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς ΧΑΠ, και ήταν αρνητικά με FEV

1 /Pre, αλλά συσχετίζεται θετικά με το δείκτη του καπνίσματος. Δείξαμε ότι 1) η έκφραση του mtTFA mRNA και της πρωτεΐνης ήταν χαμηλότερη στην πνευμονικό ιστό των ασθενών με ΧΑΠ και πλακώδους καρκίνου του πνεύμονα, σε σύγκριση με τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα πλακώδους χωρίς ΧΑΠ? 2) η έκφραση του mTFA συσχετίστηκε θετικά με αγγειακές αποπτωτικό δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων? 3) αλλά συσχετίζεται αρνητικά με δείκτη το κάπνισμα τσιγάρων. Βρήκαμε επίσης ότι το ποσοστό των

mtTFA

μεθυλίωση υποστηρικτής ήταν υψηλότερη στην ομάδα ΧΑΠ σε σύγκριση με την ομάδα μη-ΧΑΠ.

ΧΑΠ είναι η κύρια αιτία για τη χρόνια νοσηρότητα και θνησιμότητα σε όλο τον κόσμο, και έχει προκάλεσε σημαντική οικονομική και κοινωνική επιβάρυνση [23]. Αρκετοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παθογένεση της νόσου. Περιλαμβάνουν 1) φλεγμονώδη διήθηση? 2) ανισορροπία μεταξύ πρωτεολυτική και αντι-πρωτεολυτικής δράσης? 3) το οξειδωτικό στρες? και 4) την απόπτωση /πολλαπλασιασμό ανισορροπία [3]. Μία από τις συνέπειες μετά τις διαδικασίες αυτές είναι κυτταρική απόπτωση, ένα σύνθετο και καλά οργανωμένη διαδικασία που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Παρουσία του υψηλότερου επιπέδου αποπτωτικών στο ανθρώπινο εμφυσηματικές πνεύμονα έχει αναφερθεί [24], [25]. Έχει προταθεί ότι τα επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κυτταρικό θάνατο λόγω της μείωσης των παραγόντων συντήρησης κύτταρο μπορεί να είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη του εμφυσήματος. Σύμφωνα με αυτή την αντίληψη, COPD μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί παράγονται με διέγερση πνευμονικών ενδοθηλιακών απόπτωσης σε μοντέλα ζώων [26], [27]. Παρόμοια με αυτές τις παρατηρήσεις, βρήκαμε έναν αυξημένο αριθμό αποπτωτικών πνευμονικών ενδοθηλιακών κυττάρων στους ασθενείς με ΧΑΠ σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς ΧΑΠ. Το αποπτωτικό δείκτη συσχετίστηκε θετικά με FEV

1 /Pre, FEV

1 /FVC και το κάπνισμα δείκτη [6], [28]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πνευμονική ενδοθηλιακή απόπτωση μπορεί να παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της COPD.

mtTFA είναι ένας σημαντικός παράγοντας που ρυθμίζει μιτοχονδριακή βιογένεση. Ενεργοποιεί τη μεταγραφή και την αντιγραφή του μιτοχονδριακού DNA [29]. Παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μιτοχονδριακής αναπνοής, αντι-οξειδωτικό στρες και κυτταρική απόπτωση. Προηγούμενη μελέτη από Remels et al [11] πρότεινε ότι mtTFA μπορεί να εμπλέκεται στην παθογένεση της ΧΑΠ. Βρήκαμε ότι η έκφραση του mRNA και mtTFA πρωτεΐνη μειώθηκε στους ιστούς των πνευμόνων από ασθενείς με ΧΑΠ σε σύγκριση με ασθενείς χωρίς ΧΑΠ. Η έκφραση της mtTFA συσχετίστηκε θετικά με FEV

1 /Pre και FEV

1 /FVC, και συσχετίζεται αρνητικά με το δείκτη του καπνίσματος και των αγγειακών αποπτωτικό δείκτη ενδοθηλιακών κυττάρων. Σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις, τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν επίσης ρόλο του mtTFA στην απόπτωση των πνευμονικών ενδοθηλιακών κυττάρων και στην παθογένεση της ΧΑΠ. Ωστόσο, οι υποκείμενοι μηχανισμοί υπεύθυνοι για αυτό είναι ελάχιστα κατανοητή. Υπάρχουν συσσωρευμένα στοιχεία ότι επιγενετική μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην παθογένεση ορισμένων αναπνευστικών ασθενειών όπως το άσθμα και η ΧΑΠ [13]. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι το ποσοστό των

mtTFA

μεθυλίωση προαγωγού σε ιστό πνεύμονα των ασθενών με καρκίνο πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα με ΧΑΠ είναι πολύ υψηλότερη σε σύγκριση με τους ασθενείς καρκίνο πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα χωρίς ΧΑΠ, υποδηλώνοντας επιγενετική ρύθμιση μπορεί να είναι υπεύθυνος για η έκφραση της mtTFA.

ΧΑΠ και καρκίνο του πνεύμονα είναι και οι δύο κύριες αιτίες νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως. Μοιράζονται μια κοινή περιβαλλοντικού κινδύνου έκθεσης στον καπνό του τσιγάρου και μια γενετική προδιάθεση. Ο κίνδυνος καρκίνου του πνεύμονα σε ασθενείς με ΧΑΠ έχει προταθεί για πάνω από 30 χρόνια [30], και παρόλο που η έκθεση του καπνού παραμένει ως ένα σημαντικό σύγχυσης μεταβλητή, πιθανόν υπάρχει μια ανεξάρτητη ένωση. Punturieri et al [31] πρότεινε ότι ο καρκίνος του πνεύμονα και η ΧΑΠ μπορεί να είναι δύο όψεις του ίδιου νομίσματος. Επειδή μεθυλίωσης του DNA, απακετυλίωση ιστόνης, και φωσφορυλίωση πρωτεΐνης εμπλέκονται στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα [32] – [34], προτείνεται ότι επιγενετικές τροποποιήσεις μπορούν επίσης να αποδίδουν στην παθογένεση της ΧΑΠ, είτε μόνη είτε όταν συνδέεται με τον καρκίνο του πνεύμονα [ ,,,0],35], [36]. DeMeo et al [14] διαπιστώθηκε ότι η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA σε διακριτές θέσεις CpG συνδέθηκε τόσο με την παρουσία και τη σοβαρότητα της ΧΑΠ και την πνευμονική λειτουργία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεθυλίωση του DNA μπορεί να είναι ένας βιολογικός δείκτης της ΧΑΠ και μπορεί να αναδείξει νέα μονοπάτια της ΧΑΠ παθογένεια.

η ανώμαλη μεθυλίωση της περιοχής του υποκινητή των ογκογονιδίων και γονιδίων καταστολής όγκων παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα και η κατάσταση μεθυλίωσης είναι στενά συνδεδεμένη με το κάπνισμα [37], [38]. Υπάρχουν πολλές καρκινογόνες ουσίες στον καπνό. Επιπλέον, ο καπνός είναι ένα ερεθιστικό του βλεννογόνου που επάγει φλεγμονή, με αποτέλεσμα την παραγωγή ριζών χωρίς οξυγόνο. Επιπλέον, το κάπνισμα αυξάνει τη δραστικότητα της DNA μεθυλοτρανσφεράση [39], η οποία οδηγεί το

de novo

υπερμεθυλίωση των ευπαθών loci [40]. Αυτές οι άμεσες ή έμμεσες αλληλεπιδράσεις θα μπορούσαν να συμμετέχουν στην ενισχυμένη μεθυλίωσης του DNA σε βαρείς καπνιστές. Δύο πρόσφατες μελέτες ανέφεραν μοριακές αλλαγές στην αυθόρμητη πτύελα του καρκίνου χωρίς βαρείς καπνιστές [41], [42]. Athough υπάρχουν διαφορετικές απόψεις σχετικά με την επίδραση του καπνού στο μεθυλίωσης του DNA [43] – [45].