Οι

Abstract

υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και ο-ΜΕΤ υποδοχείς που εκφράζονται σε πολλά κύτταρα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC). Τρέχουσες απλός παράγων θεραπευτικής στόχευσης ενός μεταλλαγμένου EGFR έχει υψηλή αποτελεσματικότητα στην κλινική, αλλά δεν είναι θεραπευτική. Εδώ, ερευνήσαμε το συνδυασμό στοχοθέτησης οδών EGFR και c-ΜΕΤ σε κύτταρα ανθεκτικά σε NSCLC αναστολείς κινάσης τυροσίνης υποδοχέα (ΤΚΙδ), χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA και αναστολή από TKIs. Διαφορετικές NSCLC κυτταρικές σειρές με διάφορα γονιδιωματικά χαρακτηριστικά (Η358, H1650 και H1975) διαμολύνθηκαν με EGFR-ειδικό-siRNA, Τ790Μ-ειδικό-siRNA, c-ΜΕΤ siRNA ή συνδυασμού. Στη συνέχεια EGFR TKIs (gefitinib, erlotinib ή afatinib) ή μονοκλωνικού αντισώματος cetuximab συνδυάστηκαν αντίστοιχα με το γ-ΜΕΤ-ειδικά su11274 ΤΚΙ σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, βιωσιμότητα, κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα και αποπτωτική μορφολογία παρακολουθήθηκαν με φασματοφωτομετρία, φθορισμομετρία και μικροσκοπία φθορισμού. Το συνδυασμένο αποτέλεσμα των EGFR TKIs, ή cetuximab και su11274, αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα δείκτη συνδυασμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι κυτταρικές σειρές που ήταν σχετικά ανθεκτικά σε EGFR TKIs, ειδικά της κυτταρικής γραμμής H1975 που περιέχει την αντίσταση Τ790Μ μετάλλαξη, βρέθηκαν να είναι πιο ευαίσθητα σε EGFR-ειδικό-siRNA. Ο συνδυασμός του EGFR siRNA συν γ-ΜΕΤ siRNA ενισχυμένη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, επαγωγή απόπτωσης και αναστολή της κατάντη σηματοδότησης σε ανθεκτικά EGFR ΤΚΙ Η358, H1650 και H1975 κυττάρων, παρά την απουσία της δραστηριότητας του μόνος του ο-ΜΕΤ siRNA. EGFR TKIs ή cetuximab συν su11274 ήταν επίσης σταθερά ανώτερη από κάθε παράγοντα ξεχωριστά. Η ισχυρότερη βιολογική δράση παρατηρήθηκε όταν afatinib, ένα μη αναστρέψιμο παν-HER blocker συνδυάστηκε με su11274, το οποίο επέτυχε μια συνεργική επίδραση στα κύτταρα Τ790Μ μεταλλαγμένο H1975. Σε ένα συμπέρασμα, τα ευρήματά μας προσφέρουν προκλινικών απόδειξη της αρχής για τη συνδυασμένη αναστολή ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για NSCLC, ειδικά για τους ασθενείς στους οποίους τρέχουσα EGFR-στοχευμένες θεραπείες αποτυγχάνουν λόγω της παρουσίας του Τ790Μ-EGFR-μετάλλαξη ή υψηλή γ-ΜΕΤ έκφρασης .

Παράθεση: Chen G, Noor A, Kronenberger P, Teugels Ε, Umelo ΙΑ, De Grève J (2013) Συνεργική Επίδραση της Afatinib με Su11274 σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα ανθεκτικά σε Gefitinib ή erlotinib. PLoS ONE 8 (3): e59708. doi: 10.1371 /journal.pone.0059708

Επιμέλεια: Ramon Andrade de Mello, Πανεπιστήμιο του Πόρτο, Πορτογαλία

Ελήφθη: 7 Δεκ, 2012? Αποδεκτές: 17 του Φεβρουαρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 του Μάρτη 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο χρηματοδοτήθηκε από το National Cancer σχέδιο Βέλγιο (Grant ΝΚΡ-29-011), το Stichting Tegen Kanker, Βέλγιο. Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται μερικώς από το ταμείο έρευνας της Boehringer Ingelheim GmbH. Gang Chen υποστηρίχθηκε από την κινεζική υποτροφία του Συμβουλίου (CSC). Gang Chen και Ijeoma Adaku Umelo υποστηρίχθηκαν από το διδακτορικό υποτροφία Vrije Universiteit Brussel (VUB). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Η μελέτη αυτή υποστηρίζεται μερικώς από το ταμείο έρευνας της Boehringer Ingelheim GmbH. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς

Εισαγωγή

Σε ορισμένα μη -. Μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς, ο υποδοχέας επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR, επίσης γνωστή ως ErbB1 ή HER1), περιέχει «ευαισθητοποίηση» μεταλλάξεις που αυξάνουν την αποτελεσματικότητα των αναστολέων κινάσης τυροσίνης EGFR-ειδικό (ΤΚΙδ) [1], [2]. Δύο κύριες αντι-ΕΟΡΚ στρατηγικές είναι επί του παρόντος σε κλινική εφαρμογή: TKIs χαμηλού μοριακού βάρους που ανταγωνίζονται με ΑΤΡ για δέσμευση με το τμήμα της τυροσίνης κινάσης ενός μεταλλαγμένου υποδοχέα EGFR, και μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) που κατευθύνονται κατά της εξωκυττάριας σύνδεσης συνδετήρα τομέα, εμποδίζοντας έτσι δέσμευσης συνδέτη, και κατά συνέπεια διμερισμός του υποδοχέα, και σηματοδότηση υποδοχέα. Αυτές οι δύο κατηγορίες παραγόντων έχουν δείξει σταθερή προκλινική και κλινική δραστηριότητα σε μια ποικιλία τύπων όγκων [3].

Μεταξύ υποδοχέα TKIs, erlotinib (Tarceva, Genentech, Inc, South San Francisco, CA, και OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, ΝΥ) βελτιώνει την επιβίωση σε προχωρημένο NSCLC ασθενών που προχώρησαν μετά από ένα ή δύο προηγούμενα σχήματα χημειοθεραπείας [4], [5], [6], [7]. Τόσο gefitinib και erlotinib είναι ανώτερα από χημειοθεραπεία για τη θεραπεία πρώτης γραμμής του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα στις οποίες ο υποδοχέας EGFR φιλοξενεί το ευαισθητοποιητικές μεταλλάξεις στο εξόνιο 19/21 [8], [9], [10]. Η συγκεντρωτική κλινική εμπειρία δείχνει ότι σήμερα μόνο οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι περιέχουν μια ευαισθητοποίηση μετάλλαξη, αποκομίζει σημαντικά κλινικά οφέλη από EGFR TKIs. Στην πραγματικότητα, τυχαιοποιημένες μελέτες δείχνουν ότι σε ασθενείς που δεν έχουν επιλεγεί για τέτοιες μεταλλάξεις, αυτά τα φάρμακα μπορεί να έχουν αρνητική επίδραση στην έκβαση [10], [11].

Η αποτελεσματικότητα των αναστολέων είναι χρονικά περιορισμένη λόγω της εμφάνιση κυττάρων με μηχανισμούς αντοχής, σχεδόν το ήμισυ των περιπτώσεων μια υποκατάσταση θρεονίνης-to-μεθειονίνη στην EGFR στην θέση αμινοξέος 790 (Τ790Μ). Afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), είναι ένας μη αναστρέψιμος αναστολέας των δύο EGFR, HER2 και HER4 κινάσες και διατηρεί κάποια δραστικότητα σε όγκους με μεταλλάξεις Τ790Μ, αλλά σε δόσεις που είναι ένα αρχείο καταγραφής υψηλότερο από αυτό που απαιτείται για καρκίνους που φιλοξενούν ερεθιστική μεταλλάξεων [ ,,,0],12], [13], [14], [15], [16], [17].

Το χιμαιρικό αντίσωμα cetuximab IgG1 μονοκλωνικό EGFR (ERBITUX, ImClone Systems Incorporated, New York, NY, και Μπρίστολ -Myers Squibb Company, Princeton, NJ) μπλοκάρει την αλληλεπίδραση συνδετήρα-υποδοχέα και έτσι ρυθμίζει προς τα κάτω σηματοδότηση EGFR, με αποτέλεσμα την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αγγειογένεσης, και επαγωγή απόπτωσης [3]. Το cetuximab σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία, έχει εγκριθεί από το FDA και ΕΜΕΑ για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) και σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία για τη θεραπεία του τοπικά προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και λαιμού (HNC) [18], [19]. Το cetuximab έχει επιδείξει μια μέτρια δραστικότητα ως μονοθεραπεία όσο και σε συνδυασμό με δοκεταξέλη σε ασθενείς με προχωρημένους, χημειοθεραπεία πυρίμαχα NSCLC [20]. Μια πολυεθνική, πολυκεντρική, ανοικτή, φάσης ΙΙΙ μελέτη έχει δείξει ότι η προσθήκη του cetuximab με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία βελτίωσε την έκβαση των ασθενών με προχωρημένο NSCLC [21]. Το συνολικό όφελος, όμως, είναι περιορισμένος, έτσι ώστε δεν υπάρχει συναίνεση σχετικά με την καταλληλότητα για κλινική εφαρμογή.

παρεμβολής RNA (RNAi), με μικρή παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA που) ή μικρή RNAs φουρκέτα (Τα siRNAs), έχει παρέχεται ένα ισχυρό εργαλείο με το οποίο να ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου για τη μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων. RNAi είναι επίσης επί του παρόντος υπό εξέταση ως θεραπευτικό εργαλείο, στο εργαστήριο και την κλινική [22], [23], [24]. Αρκετές αναφορές περιγράφονται επιδράσεις του EGFR-στοχευμένες RNAi να αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων [25], [26], [27], [28], [29], ωστόσο προσπαθεί να χτυπήσει κάτω το αλληλόμορφο Τ790Μ περιέχει (χρησιμοποιώντας λεντοϊού shRNA κατασκευάσματα) ήταν ανεπιτυχείς [26].

Η επίκτητη αντοχή σε TKIs μπορεί επίσης να αναπτυχθεί μέσω ενός «διακόπτη κινάση», με c-MET ενίσχυση και υπερέκφραση [30], [31]. Η ενίσχυση του c-met, ενός υποδοχέα κινάσης τυροσίνης διαμεμβράνης, μπορεί να συμβεί ήδη πριν από την κατεργασία με ΤΚΙδ σε NSCLC [32], [33], [34], [35], και ο-ΜΕΤ εκφράζεται στο 60% των όγκων NSCLC όπως μετρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία [34]. Τα υψηλά επίπεδα του αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF), ο συνδετήρας c-met, που παράγεται από στρωματικά κύτταρα [36], έχουν επίσης συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση των ασθενών με NSCLC [37]. γ-ΜΕΤ ενίσχυση και up-ρύθμιση εντοπίστηκαν σε ορισμένους ασθενείς με επίκτητη αντοχή σε gefitinib /erlotinib [30], [31]. Επιπλέον, ο-ΜΕΤ μπορεί να ενεργοποιηθεί από μεταλλάξεις καθώς [38]. Ως εκ τούτου, ο-ΜΕΤ αναστολή θα μπορούσε να γίνει ένα πολύτιμο στρατηγική θεραπείας για αυτούς τους ασθενείς.

Στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε πρώτα τις συνδυασμένες επιπτώσεις των EGFR ειδικά siRNAs με γ-ΜΕΤ siRNA σε διαφορετικές NSCLC κυτταρικές σειρές με διακριτή γονιδιωματική χαρακτηριστικά. Ερευνήσαμε επίσης το συνδυασμό του EGFR TKIs (gefitinib, erlotinib ή afatinib) ή το cetuximab μονοκλωνικό αντίσωμα EGFR, με τον αναστολέα su11274 γ-ΜΕΤ στο ίδιο σύνολο των κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα.

Μέθοδοι

siRNAs

Προηγουμένως, οκτώ siRNAs που στοχεύουν EGFR φυσικού τύπου και ακολουθίες Τ790Μ (NCBI ακολουθία αναφοράς: NM_005228.3) σχεδιάστηκαν με τη χρήση αλγορίθμων από Invitrogen, Eurogentec, Dharmacon, Maurice HO Ορθολογικός σχεδιασμός siRNA (http: //ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html), Reynolds [39], Ui-ΤΕΙ [40] και Jagla [41]. Η ικανότητα των υποψηφίων αυτών siRNAs να γκρεμίσουμε EGFR ή Τ790Μ-μεταλλαγμένου EGFR σε επίπεδο mRNA, και την ικανότητά τους να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ελέγχθηκε [42]. Οι πιο αποτελεσματικές siRNAs επελέγησαν για τα πειράματα στην τρέχουσα μελέτη (Πίνακας 1). ο-ΜΕΤ siRNAs (NCBI αλληλουχία αναφοράς: NM_001127500.1) αγοράστηκαν ως «επί smartpool στόχος» (Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, Αγγλία) και οι αλληλουχίες siRNA συνοψίστηκαν στον Πίνακα 1. Κωδικοποιημένα siRNAs παρήχθησαν με www.sirnawizard. com και επαληθεύεται από μια αναζήτηση BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Η αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) θετικός έλεγχος siRNA από την Invitrogen (ref. SKU # 12935 – 140 Stealth RNAi GAPDH Θετικός μάρτυρας, Merelbeke, Belgium) χρησιμοποιήθηκε ως πρωτογενής δοκιμασία για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης siRNA. Ένας έλεγχος ΤΟΧ επιμόλυνση και δείκτες SIGLO Πράσινο μετεμβολιασμού διεξήχθησαν ως θετικοί μάρτυρες για την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης (ref D-001630-01-02?. D-001500-01-05, Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, England). Το αρνητικό siRNA ελέγχου ήταν ένα ιδιόκτητο ακολουθία που δεν αντιστοιχεί σε οποιοδήποτε ευκαρυωτικό γονίδιο (OR-0030-αρν 05, Eurogentec S.A., Λιέγη, Βέλγιο). Τα siRNA δίπολα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη

TM 2000 (Cat. Νο 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Βέλγιο) σε RPMI-1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου χωρίς αντιβιοτικά, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43], [44 ], [45]. Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον εις τριπλούν και τρεις φορές ανεξάρτητα.

Η

Οι κυτταρικές σειρές και τα αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο NSCLC κυτταρικές γραμμές Η292 (CRL-1848 ™, βλεννοεπιδερμοειδής πνευμονικό καρκίνωμα), Η358 (CRL-5807 ™, βρογχοκυψελιδικό καρκίνωμα), HCC827 (CRL-2868 ™, αδενοκαρκίνωμα), H1650 (CRL-5883 ™, αδενοκαρκίνωμα? βρογχοκυψελιδικό καρκίνωμα), και H1975 (CRL-5908 ™, αδενοκαρκίνωμα) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Κάτω Χώρες). Η κυτταρική γραμμή Η292 αναφέρθηκε ως EGFR και Κ-Ras κυτταρική σειρά άγριου τύπου [46], [47], [48], [49], το οποίο επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-qPCR και ανάλυση αλληλουχίας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται ). H358 είναι EGFR φυσικού τύπου, έχει ένα κωδικόνιο 12 K-Ras μετάλλαξη [50], και μια ομόζυγη διαγραφή του γονιδίου p53 [51]. H1650 και HCC827 έχουν μια εντός πλαισίου μετάλλαξης διαγραφής στην περιοχή κινάσης τυροσίνης EGFR (διαγραφή Ε746-A750, εξόνιο 19). κύτταρα H1650 έχουν επίσης ένα ΟΟΟΗ-τερματικό διαγραφή του ΡΤΕΝ και απώλεια της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης [52] και εκφράζουν τον υποδοχέα που μοιάζει με ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα (IGF1R) [53]. Η κυτταρική γραμμή H1975 έχει ένα ευαισθητοποιητικό μετάλλαξη L858R κινάσης στο εξόνιο 21, και ένα δεύτερο Τ790Μ στο εξόνιο 20,

σε cis

, στον τομέα κινάσης του EGFR, καθιστώντας τα ανθεκτικά στην αναστρέψιμη gefitinib TKIs και erlotinib [54 ]. Επιπλέον, όλες αυτές οι πέντε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τον υποδοχέα c-MET χωρίς ενίσχυση γονιδίου [28], [30], [53], [55], [56]. Και οι πέντε κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Invitrogen Corp., Gent, Βέλγιο), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου θερμοαπενεργοποιημένο βοοειδών (Perbio Science NV, Erembodegem, Belgium), 2 mM L-γλουταμίνη και 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Δέκα mM αποθέματα του EGFR-ειδικό TKIs gefitinib (AstraZeneca, Cheshire, Ηνωμένο Βασίλειο), erlotinib (AstraZeneca, Cheshire, Ηνωμένο Βασίλειο), η μη αναστρέψιμη παν-HER αναστολέας afatinib (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Γερμανία) και ένας αναστολέας c-MET , su11274 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgium) παρασκευάστηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αποθηκεύονται στους -80 ° C. Αυτά τα φάρμακα αραιώθηκαν σε φρέσκο ​​RPMI 1640 με τελική συγκέντρωση DMSO μικρότερη από 0,1% σε όλα τα πειράματα. Το cetuximab μονοκλωνικό αντίσωμα EGFR-ειδική (2 mg /ml) αγοράστηκε από τη Merck KgaA, Darmstadt, Γερμανία.

RT-qPCR

απομόνωση RNA, RNA εξομάλυνση, αντίστροφη μεταγραφή και qPCR ήταν ως περιγράφηκε προηγουμένως [43], [44], [45].

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά την θεραπεία με τα siRNA ή διαφορετικούς παράγοντες για τις υποδεικνυόμενες περιόδους, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει Tris /HCl (ρΗ 7.6) 20 mM, NaCl 150 mM (ρΗ 6,85), EDTA 1 mM (ρΗ 8), TRITON-Χ 1%, Na-πυροφωσφορικό 2,5 mM, ορθοβαναδικό νάτριο (Na3VO4) 1 mM, λευπεπτίνη 1 μg /ml, αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ 1% και φωσφατάση αναστολέα κοκτέιλ 1% (Sigma-Aldrich NV /SA, Bornem, Βέλγιο). Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 12,000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C και έβρασαν για 5 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad Bradford (Ναζαρέτ Eke, Βέλγιο) και 25 μg μετουσιωμένης πρωτεΐνης υποβλήθηκε σε SDS-PAGE (10% SDS-πήκτωμα ακρυλαμιδίου) με ένα ρυθμιστικό φόρτωσης που περιέχει 80 mM Tris -ΗΟΙ (ρΗ 6.8), 5% SDS, 10% γλυκερόλη, 5 mM EDTA (ρΗ 8), 5% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 0.2% κυανό βρωμοφαινόλης και 1 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (BioRad) για 2 ώρες στους 100 mA. Η μεμβράνη επωάστηκε με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα όπως υποδεικνύεται: EGFR (Cell Signaling), φωσφο-EGFR (Tyr1173, κλώνος 9Η2Ο, Upstate), ο-ΜΕΤ (L41G3, Cell Signaling), φωσφο-ο-ΜΕΤ (Tyr1234 /1235, 3D7, Cell Signaling), φωσφο-AKT /ΡΚΒ (pS473, Invitrogen), φωσφο-ERK1 /2 (pTpY185 /187, Invitrogen), φωσφο-STAT3 (Tyr705, 3E2, Cell Signaling), φωσφο-STAT5 (pY694, BD Biosciences ) και β-ακτίνης (Sigma-Aldrich NV). Ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση (1:4000 αραίωση, ECL Anti-ποντίκι ή HRP IgG αντι-κουνελιού συνδεδεμένο, Na 931, GE Healthcare Bio-επιστημών /Amersham, Diegem, Βέλγιο) προστέθηκε, και οι μεμβράνες υποβλήθηκαν σε ανίχνευση χημειοφωταύγειας (ECL Plus Western Blotting αντιδραστηρίων ανίχνευσης, GE Healthcare Bio-επιστημών /Amersham, Diegem, Βέλγιο).

Διάδοση

η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια χρωματομετρική δοκιμασία τετραζολίου (υπόστρωμα MTS, CellTiter96 υδατικό One Λύση Κυττάρου Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός G3580, Promega, Madison, USA). Το πρωτόκολλο ήταν ως εξής: διαφορετικούς παράγοντες και συνδυασμούς προστέθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις, και επωάστηκαν στους 37 ° C για έως 96 ώρες (τα πειράματα συνδυασμός έως και 72 ώρες). Μετά την προσθήκη 20 μΐ αντιδραστηρίου MTS σε κάθε φρεάτιο, οι πλάκες επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5%

2 θερμοκοιτίδα CO, και η απορρόφηση στα 490 nm καταγράφηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας 96 φρεατίων (επιστημονική Multiskan MK3, Θέρμο Φινλανδία). Τα αποτελέσματα ήταν ο μέσος όρος των έξι φρεάτων και εκφράζονται ως ο λόγος της απορρόφησης διαιρείται με την απορρόφηση του ψευδο ελέγχου × 100.

Βιωσιμότητα

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανίχνευση με φθορισμομετρία ρεσορουφίνης (CellTiter Βιωσιμότητα Δοκιμασία -Μπλε κυττάρων, G8080, Promega, Madison, USA). Η διαδικασία ήταν σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Οι επεξεργασίες και οι έλεγχοι ήταν όπως προαναφέρθηκε. Φθορισμομετρία (ex: 560 nm /em: 590 nm) χρησιμοποιώντας αναγνώστη FL600 πλάκας φθορισμού (Bio-Tek, USA). Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και κάθε φορά χρησιμοποιήθηκαν έξι ανεξάρτητα φρεάτια. Τα δεδομένα φθορισμού εκφράζονται ως ο φθορισμός επεξεργασμένων δειγμάτων διαιρούνται με φθορισμό του mock ελέγχου χ 100.

Caspase-3/7 Δράση

ανίχνευση

Caspase-3/7 Δράση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα συνθετικό ροδαμίνη επισημασμένο κασπάσης-3/7 υπόστρωμα (Αρο-ONE® Ομογενή caspase-3/7 Assay, G7790, Promega, Madison, USA) αμέσως μετά την φθορισμομετρική ανίχνευση της βιωσιμότητας των κυττάρων για τα ίδια φρεάτια, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 60 λεπτά, ο φθορισμός του κάθε φρεάτιο μετρήθηκε (ex: 499 nm /em: 512 nm), χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού FL600 (Bio-Tek, USA). Κασπάσης-3/7 δραστηριότητα εκφράζεται ως φθορισμός επεξεργασμένου δείγματος /παρωδία ελέγχου × 100.

φθορισμού αξιολόγηση μικροσκόπιο της κυτταρικής απόπτωσης και της μορφολογίας

Τα αποτελέσματα των διαφόρων θεραπειών για την απόπτωση και την πυρηνική μορφολογία στα κύτταρα αξιολογήθηκαν με Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgium) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, Sigma-Aldrich NV Bornem, Βέλγιο) διπλή χρώση χρωματίνη φθορισμού. Εν συντομία, μετά από μία ή διπλή επεξεργασία των siRNAs ή παραγόντων, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS και χρωματίστηκαν 15 λεπτά με Hoechst (1 mg /ml) και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, mg /ml), και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα προηγμένο φθορισμού μικροσκόπιο (ZEISS Axiovert 25, Zaventem, Βέλγιο). Η απόπτωση και η πυρηνική μορφολογία εντοπίστηκαν από τη συμπύκνωση της πυρηνικής χρωματίνης και κατακερματισμό της. Αυτό το σύστημα καθορίζει τον απόλυτο αριθμό των βιώσιμων κυττάρων (Hoechst θετικό /ΡΙ αρνητικό), πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (Hoechst θετικό /PI αρνητική με μπλε θρυμματισμός στα κύτταρα), αργά αποπτωτικά κύτταρα (Hoechst θετικό /PI θετική, με το κόκκινο θρυμματισμός στα κύτταρα ), νεκρωτική κύτταρα (Hoechst αρνητική /PI θετικά) και τα σήματα τα συντρίμμια. Βιώσιμα και αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν σε 10 διαφορετικά πεδία κάτω από την 200 × μεγέθυνση, και σε κάθε φρεάτιο από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μετρώντας ήταν από δύο άτομα και το μέσο αποτέλεσμα εκφράστηκε σε σχέση με τον ψευδο ελέγχου. αριθμοί αποπτωτικός κυτταρικός από διαφορετικές θεραπείες συγκρίθηκαν με το να ρυθμίζεται σύμφωνα με τους αριθμούς βιώσιμων κυττάρων τους.

Στατιστική ανάλυση

SPSS19.0 χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Ανάλυση Διασποράς με έναν παράγοντα δοκιμής (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση σημαντικότητα μεταξύ των ομάδων. Η μέθοδος λιγότερο σημαντική διαφορά (LSD) πολλαπλών συγκρίσεων με διαφορετικές θεραπείες και ομάδα ελέγχου εφαρμόστηκε όταν η πιθανότητα για ANOVA ήταν στατιστικά σημαντική. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε σε ένα

P

& lt? 0,05 επίπεδο. Η ανάλυση των προσθετικότητα και συνεργία εκτιμήθηκε από το πρόγραμμα Biosoft CalcuSyn (Ferguson, ΜΟ, USA). Ο συνδυασμός Δείκτης (CI) χρησιμοποιήθηκε για να εκφράσει συνέργεια (CI & lt? 1), αθροιστική δράση (CI = 1), ή ανταγωνισμού (CI & gt? 1). [57]

Αποτελέσματα

Επίδραση του EGFR άγριου τύπου και Τ790Μ-ειδικού siRNAs στην έκφραση στόχο και κακοήθη φαινότυπο

το siRNA αλληλουχίες στόχευσης άγριου τύπου ήταν σε θέση να χτυπήσει κάτω την μεταγραφή EGFR, τη μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης EGFR, αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων και να προκαλέσουν κυτταρικής απόπτωσης σε όλες τις κυτταρικές σειρές NSCLC δοκιμάστηκαν, ωστόσο, με διαφορετικές μέγεθος ανεξάρτητη από τις συγκεκριμένες μεταλλάξεις του γονιδίου οδηγού (Σχήμα 1). Ομοίως, το Τ790Μ-ειδικού siRNA θα μπορούσε να γκρεμίσει Τ790Μ mRNA, και επίσης καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ενισχύουν τη δραστηριότητα των κυττάρων της κασπάσης σε H1975 κύτταρα που περιέχουν την μετάλλαξη Τ790Μ. Ωστόσο, το αποτέλεσμα ήταν λιγότερο ισχυρό σε σχέση με το EGFR-ειδικό-siRNA (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Όλα τα αρνητικά και κωδικοποιημένα siRNAs ελέγχου δεν είχε καμία επίδραση.

κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με EGFR-ειδικό-siRNA 1247. Τα ζωντανά κύτταρα και αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με Hoechst 33342 και διπλή χρώση φθορισμού ΡΙ. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων στο ίδιο καλά. Hoechst 33342 και PI διπλή φθορίζουσα χρώση × 200

Η

Διπλή στόχευση του EGFR και c-MET με τα siRNA

Οι κυτταρικές σειρές με διαφορετικές μεταλλάξεις (KRAS: H358? PTEN:. H1650? Τ790Μ : H1975) που τους ανθεκτικά σε EGFR TKIs καταστήσει περαιτέρω επιλεγεί για τη διπλή στόχευση. Η αντίσταση των κυττάρων H1975 προς EGFR TKIs έχει αποδοθεί στην παρουσία της μετάλλαξης Τ790Μ, αλλά και στην ενεργοποίηση του υποδοχέα c-ΜΕΤ [30], [31]. Συνέργεια του c-ΜΕΤ αναστολή με αναστολή EGFR έχει δειχθεί σε μοντέλα που έχουν ενεργοποιηθεί ή να υπερεκφράζεται ο-ΜΕΤ μονοπάτι [58]. Στο πείραμά μας ερευνήσαμε την αλληλεπίδραση της αναστολής EGFR και της αναστολής ο-ΜΕΤ σε κύτταρα όπου τέτοιες ενεργοποίηση c-met δεν είναι παρούσα. Μια ομάδα ο-ΜΕΤ siRNAs είχαν μικρή ή καμία επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη (δοκιμασία MTS) στις κυτταρικές γραμμές Η358 και H1650. Σε H1975 κύτταρα, μια εξαιρετικά περιορισμένη μείωση του ποσοστού πολλαπλασιασμού παρατηρήθηκε (έως 87%, Σχήμα 2Α). Υπήρξε μια παρόμοια έλλειψη της κασπάσης-3/7 επαγωγής για την c-ΜΕΤ αναστολή θεραπεία μόνο σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Β). Αν και ανοσοαποτύπωση αποκάλυψε ότι ο υποδοχέας γ-ΜΕΤ αποτελεσματικά χτυπηθεί κάτω, και ότι η φωσφορυλίωση ο-ΜΕΤ ανεστάλη, επίσης, σε H1975 κυττάρων (Σχήμα 3), υπήρξε μικρή επίδραση στην κατάντη σηματοδότησης (ΑΚΤ, ERK και STAT μονοπάτια). επεξεργασία γ-ΜΕΤ siRNA μόνο έχει, συνεπώς, καμία σημαντική επίδραση σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές NSCLC δοκιμαστεί

in vitro

Η

Πίνακας Α:. κυττάρων πολλαπλασιασμό μετά από επιμόλυνση με διαφορετικά siRNAs. Κυτταρικές σειρές H358 (λευκό), H1650 (γκρι) και H1975 (μαύρο) επιμολύνθηκαν με EGFR-ειδικά-siRNA 1247, Τ790Μ ειδικά siRNA, πισίνα c-MET siRNA, ή συνδυασμούς αυτών, και ο πολλαπλασιασμός αναλύθηκε 72 ώρες μετά επιμόλυνσης χρησιμοποιώντας μια χρωματομετρική δοκιμασία MTS. Πίνακας Β: Caspase 3-/7 δραστηριότητα. *

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με δύο μονά θεραπεία

Η

Πίνακας Α: Ανοσοστύπωμα ανάλυση των Η358 και H1650 κύτταρα επιμολυσμένα. με EGFR φυσικού τύπου siRNA, πισίνα ο-ΜΕΤ siRNA ή έναν συνδυασμό αυτών. Πάνελ Β: Ανάλυση με ανοσοστύπωση της H1975 κυττάρων, όπως στον πίνακα C. Εδώ, το Τ790Μ-ειδικό-siRNA συμπεριλήφθηκε επίσης. Αντισώματα που περιλαμβάνονται φωσφορυλιωμένη (ρ) EGFR, EGFR, pc-MET, c-met, π-ΑΚΤ, π-ERK1 /2, π-STAT5, π-STAT3, και β-ακτίνη.

Η

Η προσθήκη του EGFR siRNA (είτε άγριου τύπου ή Τ790Μ-ειδική) με c-met siRNAs ενισχυμένη αναστολή της ανάπτυξης σε Η358 και H1650 κυττάρων σε σύγκριση με EGFR siRNA μόνο, αλλά πολύ λιγότερο σε H1975 κύτταρα (Σχήμα 2Α). Συνδυασμένη θεραπεία αύξησε επίσης κασπάσης-3/7 Δράση. Σε H1650 κύτταρα το σήμα απόπτωσης ακόμα και αυξήθηκε σε 8,94 φορές του ελέγχου σε σύγκριση με μόνο EGFR siRNA (4,16 φορές. Στο H1975 κύτταρα, υπήρχε μια πιο μετριοπαθής αύξηση σε 3,29 φορές, το οποίο είναι ελαφρώς υψηλότερο από μόνο του EGFR siRNA (2,26 φορές σε). κηλίδωση Western, ωστόσο, αποκάλυψε ότι ο συνδυασμός EGFR /c-ΜΕΤ siRNA ήταν σε θέση να επηρεάσει το μονοπάτι ERK επίσης (εκτός από ΑΚΤ, Εικόνα 3), η οποία είναι σε αντίθεση με την αναστολή του EGFR και μόνο. ​​η οδός ΕΚΚ ήταν μειωτικά τα μέγιστα σε H1975 κύτταρα, ενώ η μεγαλύτερη μείωση του ρ-ΑΚΤ παρατηρήθηκε σε H1650 κύτταρα.

η επίδραση στην βιωσιμότητα αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας μία φθορομετρική δοκιμασία ρεζορουφίνη βιωσιμότητα και με μικροσκοπική μέτρηση των βιώσιμων (Hoechst 33342 θετική /) κύτταρα ΡΙ αρνητική. Σε αμφότερες τις δοκιμασίες, τα αποτελέσματα αντικατοπτρίζεται τη δοκιμασία τετραζολίου MTS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρομοίως, κασπάσης-3/7 δράση επιβεβαιώθηκε επίσης από την Hoechst και διπλό δοκιμασία χρώσης φθορισμού ΡΙ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

διπλή στόχευση του EGFR με TKIs ή cetuximab και γ-ΜΕΤ με su11274

Επαληθεύσαμε περαιτέρω κατά πόσον τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με συνδυασμένη θεραπεία siRNA θα μπορούσε να μιμηθεί τη χρήση διπλής EGFR και c-MET-ειδικά ανασταλτικές ουσίες που μπορούν πρέπει να εφαρμόζονται ευκολότερα

in vivo

. Πνεύμονα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το ενιαίο EGFR TKIs gefitinib, erlotinib, ή afatinib, και σε συνδυασμό με γ-ΜΕΤ αναστολέα su11274. Ο συνδυασμός του μονοκλωνικού αντισώματος EGFR cetuximab με su11274 μελετήθηκε επίσης.

Η επίδραση της su11274 μόνος στην κυτταρική ανάπτυξη και απόπτωση ήταν εξαιρετικά ασθενής και στις τρεις κυτταρικές γραμμές, αν και, υπήρξε μια ελαφρώς ισχυρότερη επίδραση σε κύτταρα H1975 , το οποίο έχει υψηλότερη έκφραση ο-ΜΕΤ από τις άλλες δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4). Σε συγκέντρωση 1 μΜ su11274, για παράδειγμα, μια μείωση 20-30% στο ρυθμό πολλαπλασιασμού και μια μέτρια αύξηση της τάξεως του 40-50% σε κασπάσης-3/7 σήματα σε αντίθεση με την έλλειψη επίδρασης σε δύο άλλες κυτταρικές γραμμές (Εικόνα 4, Εικόνα 5). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνες με τα πειράματα ο-ΜΕΤ siRNA.

Η358, H1650 και H1975 κύτταρα επωάστηκαν με ένα εύρος συγκέντρωσης από su11274, και τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες. Πίνακας Α: πολλαπλασιασμός. Πίνακας Β: κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα. Πίνακας C: απόπτωση. Πίνακας Δ:. Καμπύλες δόσης-αποτελέσματος

Η

Πίνακας Α: πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετά από εφάπαξ ή συνδυασμένη θεραπεία ΤΚΙ. Οι κυτταρικές σειρές H358 (λευκό), H1650 (γκρι) και H1975 (μαύρο) καλλιεργήθηκαν σε RPMI που περιέχει 10% FBS και 1 μΜ su11274, gefitinib, erlotinib, afatinib ή cetuximab, και οι συνδυασμοί τους. Ο πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε 72 ώρες μετά τη θεραπεία χρησιμοποιώντας μία χρωματομετρική δοκιμασία MTS. Πίνακας Β: κασπάσης -3/7 επαγωγή με ενιαία ή συνδυασμένη θεραπεία ΤΚΙ. *

P

& lt? 0,05 και **

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με δύο μονά θεραπεία

Η

Σε συνδυασμό με EGFR TKIs, οι συγκεντρώσεις διατηρήθηκαν σε 1 μΜ για όλες τις ουσίες. Σε Η358 και H1650 κύτταρα (Σχήμα 5Α), ο TKIs μόνος προκάλεσε μικρή μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων (κατά μέγιστο κατά 41% το H1975 με afatinib, Σχήμα 5Α), και μια μέτρια αύξηση της κασπάσης-3/7 σήματα (κατά 1,6 φορές -στο μέγιστο επίσης σε H1975 με afatinib, Σχήμα 5Β) συγκριτικά με τους ελέγχους οχήματος. Οι συνδυασμοί με su11274 ήταν σε θέση να μειώσει την ανάπτυξη των κυττάρων ελαφρώς περαιτέρω σε Η358 και H1650, και το αποτέλεσμα συνδυασμού ήταν περισσότερο ισχυρή σε H1975 (ιδίως su11274 + afatinib, Σχήμα 5Α). Εν τω μεταξύ, η προσθήκη su11274 προσφέρονται κάποια κέρδος της κασπάσης-3/7 σήματα, σύμφωνα με τα δεδομένα αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων (Σχήμα 5Β). Οι ισχυρότερες επιδράσεις παρατηρήθηκαν στα κύτταρα H1975, είναι γνωστό ότι είναι EGFR-ΤΚΙ ανθεκτικά. Σε αυτά τα κύτταρα, η θεραπεία με μονοθεραπεία με gefitinib και erlotinib είναι αναποτελεσματική, ενώ afatinib μπορεί να μειώσει την ανάπτυξη και επάγει την απόπτωση. Όλες οι συνδυασμοί με su11274 επιτευχθεί μια ενισχυμένη επίδραση στην κυτταρική ανάπτυξη και απόπτωση. Ο συνδυασμός su11274 + afatinib ήταν σε θέση να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων έως 49% σε συγκέντρωση 1 μΜ (Εικόνα 5Α), και αυξημένη αποπτωτικά σήματα σε 2,64 φορές (Εικόνα 5Β).

Για να εξακριβωθεί η προσθετική ή συνεργιστική φύση των διπλών θεραπείες, μια σειρά από συγκεντρώσεις έως 1 μΜ συστάθηκε για κάθε ένωση και τους συνδυασμούς. Τα αποτελέσματα βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την χρωματομετρική δοκιμασία φορμαζάνη πολλαπλασιασμού MTS, και ένα CI που διαφοροποιεί μεταξύ πρόσθετο και συνεργιστική δράση υπολογίστηκε (λογισμικό Biosoft CalcuSyn). Τα αποτελέσματα σαφώς δείχνουν ότι το συνδυασμένο αποτέλεσμα όλων των παραγόντων επί του πολλαπλασιασμού σε Η358 και H1650 ήταν πρόσθετο. Σε H1975 κύτταρα, ένα προσθετικό αποτέλεσμα από gefitinib ή erlotinib ή cetuximab + su11274 παρατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 6). Ωστόσο, ο συνδυασμός του afatinib + su11274 άνοιξε συνεργικά (CI & lt? 1) σε αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης (Εικόνα 7). Αυτή η συνεργιστική επίδραση θα μπορούσε να εξηγηθεί από συνεργατική αναστολή της πολλαπλασιαστικής /επιβίωση και αντι-αποπτωτικό σήμα τις οδούς ΑΚΤ, ERK και STAT (Σχήμα 8). κηλίδα Western προταθεί ότι η αναστολή αυτών των τριών οδών είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην H1975 κύτταρα μετά συνδυασμένη αγωγή με su11274 + afatinib (Σχήμα 8).

δείκτη συνδυασμού (CI) υπολογίστηκε H1975. ΠΙ & gt? 1, αναφέροντας πρόσθετη επίδραση (Πίνακας Α: gefinib + su11274? Πίνακας Β: erlotinib + su11274? Πίνακας Γ: cetuximab + su11274).

Η

Συνδυασμός Δείκτης (CI) της afatinib και su11274. Εδώ, CI της afatinib + su11274 & lt? 1, δείχνοντας συνεργική δράση

Η

Immuno αποτύπωση κυτταρικών λυμάτων των H358, H1650 και H1975 κύτταρα αντιμετωπίζονται με ενιαίο ή συνδυασμένο TKIs /cetuximab.. Αντισώματα που περιλαμβάνονται φωσφορυλιωμένη (ρ) EGFR, EGFR, pc-MET, c-met, π-ΑΚΤ, π-ERK1 /2, π-STAT5, π-STAT3, και β-ακτίνη.

Η

Συζήτηση

EGFR είναι ένας θεραπευτικός στόχος στον NSCLC. Σε προηγούμενη μελέτη έχουμε δείξει ότι η στόχευση με EGFR ΤΚΙ δεν επιτευχθεί το μέγιστο βιολογικό αποτέλεσμα, ακόμα και σε ευαίσθητες κυτταρικές σειρές μόνο φάρμακο παράγοντα, και ότι η προσθήκη του EGFR-ειδικό-siRNA για EGFR TKIs ή cetuximab αυξάνει τα θεραπευτικά αποτελέσματα [45 ]. Ωστόσο, η στόχευση μόνο το μονοπάτι EGFR δεν είναι αποτελεσματική σε κύτταρα που φιλοξενούν τους μηχανισμούς αντίστασης και είναι ακόμη ανεπαρκής για να ακυρώσει την πλήρη κακοήθη φαινότυπο σε ευαίσθητα κύτταρα. Έτσι, το επόμενο ερώτημα ήταν αν ταυτόχρονη αναστολή του EGFR και c-MET, με RNAi, θα οδηγήσει σε αυξημένη βιολογικές επιδράσεις, και ως εκ τούτου να είναι χρήσιμη για την υπέρβαση αντίσταση ΤΚΙ σε H1975 κυττάρων. Tang et al [28] έδειξε ότι ο συνδυασμός του EGFR siRNA και ο-ΜΕΤ siRNA σε H1975 κυττάρων οδήγησε σε ενισχυμένη αναστολή της κατάντη σηματοδότησης EGFR, συμπεριλαμβανομένων των ΑΚΤ και STAT3 οδών προ-επιβίωσης. Εδώ, διερευνήσαμε την επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων και την απόπτωση. Η προσθήκη του γ-ΜΕΤ siRNA είτε EGFR φυσικού τύπου ή Τ790Μ-ειδικά siRNAs, είχε ως αποτέλεσμα μία αυξημένη επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και την επαγωγή της κασπάσης 3-/7 δραστηριότητα. Ο EGFR άγριου τύπου siRNA ήταν πιο ισχυρό από Τ790Μ siRNA, σε συμφωνία με περιγράφεται παραπάνω και μόνο αποτελέσματα siRNA, και σύμφωνα με το βαθμό της αναστολής της οδού (βλέπε παρακάτω). Ο συνδυασμός με c-ΜΕΤ siRNA αυξημένη αναστολή της ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης πιο σημαντικά σε κύτταρα Η358 και H1650. Ανοσοκηλίδωση δείχνει μια συνεπή ρύθμιση προς τα κάτω της φωσφο-ΑΚΤ, συνεπής με Tang et al. [28], αλλά η ρύθμιση προς τα κάτω της φωσφο-STAT3 ήταν ασθενέστερη. Βρήκαμε επίσης ότι δύο κατάντη σήματα ανεστάλησαν: φωσφο-STAT5 και ιδιαίτερα φωσφο-ERK1 /2. Όταν συνδυάστηκαν Τ790Μ και γ-ΜΕΤ siRNAs, ο συνεταιρισμός επίδραση ήταν λιγότερο ισχυρή.

Η διπλή στόχευση του EGFR και c-MET στη συνέχεια πιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας TKIs (gefitinib, erlotinib και afatinib συν su11274). θεραπεία Single παράγοντα με είτε αναστολέα, στις τρεις κυτταρικές γραμμές ανθεκτικές EGFR TKIs είχε ένα σχετικά ασθενές επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης και επαγωγή απόπτωσης και ήταν ακόμη ελάχιστες ή απούσες για τον αναστολέα ο-ΜΕΤ. Ωστόσο, υψηλότερες δόσεις της erlotinib θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση στο μεταλλαγμένο κυτταρική σειρά KRAS H358 [45]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι ένας συνδυασμός su11274 και erlotinib είχαν επίσης μεγαλύτερη επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων σε H1975 κύτταρα. Ο βαθμός αναστολής (κατά 35%) ήταν στο ίδιο εύρος όπως αναφέρθηκε από άλλους (κατά 42%) [28]. Για να εξακριβωθεί η προσθετική ή συνεργιστική φύση της διπλής θεραπείας, μια σειρά αυξανόμενων συγκεντρώσεων ΤΚΙ συστάθηκε. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την χρωματομετρική δοκιμασία φορμαζάνης πολλαπλασιασμού MTS, και ένα CI υπολογίστηκε. Η επίδραση της διπλής erlotinib συν θεραπεία su11274 στα κύτταρα H1975 ήταν πρόσθετο. Ένα παρόμοιο αθροιστική επίδραση βρέθηκε με gefitinib ή cetuximab συν su11274 σε H1975 κυττάρων. Ωστόσο, ο συνδυασμός του afatinib και su11274 είχαν σαφώς μία συνεργιστική επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων σε H1975 κύτταρα.