Αφηρημένο

Ιστορικό

Η τυπική δυτική διατροφή δεν είναι ισορροπημένη σε μεθυλική θρεπτικά συστατικά που ρυθμίζουν το επίπεδο της δότης μεθυλίου S-αδενοσυλομεθειονίνη (SAM) και παράγωγο μεταβολίτη S-αδενοσυλομοκυστεΤνη της (ΥΑΑ ), η οποία με τη σειρά της μπορεί να ελέγχει τη δραστηριότητα ορισμένων μεθυλτρανσφερασών. Σίτιση τρωκτικά με αμινοξύ ορίζεται και μεθυλο-ισορροπημένη διατροφή μειώνει την ηπατική SAM και προκαλεί καρκίνους του ήπατος. RIZ1 (PRDM2 ή KMT8) είναι ένα ογκοκατασταλτικό και λειτουργίες σε μεταγραφική καταστολή με μεθυλίωση των ιστονών H3 λυσίνη 9.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι μια μεθυλο-ισορροπημένη διατροφή παρέχει πρόσθετες επιβίωσης οφέλη σε σύγκριση με ένα μεθυλ-ισορροπημένη δίαιτα που προκαλούν όγκο μόνο σε ποντίκια με άγριου τύπου RIZ1 αλλά όχι σε ποντικούς με έλλειψη RIZ1. Ενώ η απουσία της RIZ1 ήταν ογκογόνο σε ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε η ισορροπημένη διατροφή, η παρουσία του δεν εμπόδισε το σχηματισμό όγκων σε ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε η μη ισορροπημένη διατροφή. Μικροσυστοιχιών και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι, σε αντίθεση με τις περισσότερες από τις συνδεδεμένες ένζυμα, RIZ1 ρυθμίζεται αυξητικά από τη διατροφή μεθυλο-ισορροπημένη. δίαιτα μεθυλο-ισορροπημένη δεν καταστέλλει πλήρως ογκογονίδια όπως c-Jun σε απουσία RIZ1. Υψηλότερη δραστηριότητα RIZ1 σχετίστηκε με μεγαλύτερη H3 λυσίνη 9 μεθυλίωσης σε γονίδια-στόχους RIZ1 όπως φαίνεται από χρωματίνης ανάλυση immunoprecipiation.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα στοιχεία που προσδιορίζουν RIZ1 ως ένα κρίσιμο στόχο της μεθυλ-ισορροπημένη διατροφή στην πρόληψη του καρκίνου. Η μοριακή κατανόηση των διατροφικών καρκινογένεσης μπορεί να βοηθήσει τους ανθρώπους να κάνουν συνειδητές επιλογές σχετικά με τη διατροφή, η οποία μπορεί να μειώσει σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του

Παράθεση:. Zhou W, Alonso S, D Takai, Lu SC, Yamamoto F, Περούτσο Μ, et al. (2008) Απαίτηση RIZ1 για την πρόληψη του καρκίνου από μεθυλο-ισορροπημένη διατροφή. PLoS ONE 3 (10): e3390. doi: 10.1371 /journal.pone.0003390

Επιμέλεια: Yihai Cao, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 2 του Ιούνη, 2008? Αποδεκτές: 16 του Σεπτεμβρίου του 2008? Δημοσιεύθηκε: 13 Οκτωβρίου 2008

Copyright: © 2008 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ CA105347 επιχορήγηση για Sh, CA63585 να MP, CA087069 να FY, και DK51719, AA13847 και AT001576 να SCL

συμφέροντα

Οι ανταγωνιστικές:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Η τυπική δυτική διατροφή συνδέεται με το ένα τρίτο όλων των θανάτων από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Η διατροφή είναι πλούσια σε κρέας και χαμηλή σε λαχανικά και φρούτα. Δεν είναι ισορροπημένη σε μεθυλική θρεπτικά συστατικά ή χαμηλό σε φολικό οξύ. Διαιτητικά θρεπτικά συστατικά, και μεταβολικά ενδιάμεσα και τα προϊόντα τους, επηρεάζουν άμεσα τη δραστηριότητα πολλών κυτταρικών ενζύμων. Μία κατηγορία τέτοιων ενζύμων είναι SAM-εξαρτώμενες μεθυλτρανσφεράσες, μια ευρεία ομάδα ενζύμων που έχουν μία ιδιότητα από κοινού, η χρήση των S-αδενοσυλμεθειονίνης (SAM), όπως μεθυλομάδα δότη. Το κυτταρικό επίπεδο του SAM εξαρτάται από διαιτητική πρόσληψη των δοτών μεθυλίου ομάδα, όπως η μεθειονίνη, φολικό οξύ, βιταμίνη Β6, Β12, και χολίνη. Ορισμένες αντιδράσεις μεθυλίωσης αναστέλλεται από χαμηλό επίπεδο SAM ή υψηλό επίπεδο του αναστολέα προϊόντος S-αδενοσυλομοκυστεΤνη (ΥΑΑ). Μεθυλο ισορροπημένη διατροφή που είναι χαμηλή σε φολικό οξύ, μεθειονίνη, ή χολίνη είναι γνωστό ότι μειώνουν το επίπεδο SAM και ο λόγος SAM /υπαραχνοειδή αιμορραγία.

Διατροφή τρωκτικών με αμινοξύ ορίζεται και μεθυλο-ισορροπημένη διατροφή μειώνει την ηπατική SAM και προκαλεί καρκίνους του ήπατος [2], [3], [4]. Οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τη σχέση μεταξύ διατροφής και καρκίνου παραμένουν ελάχιστα κατανοητή. Έχουμε προτείνει στο παρελθόν ότι μεθυλο-ισορροπημένη διατροφή προλαμβάνει τον καρκίνο με την ενεργοποίηση των ιστονών λυσίνη μεθυλοτρανσφεράσης (KMT) καταστολείς τάξη όγκου όπως RIZ1 (PRDM2 ή KMT8) [5], [6]. Οι RIZ1 ογκοκατασταλτικό λειτουργίες στην μεταγραφική καταστολή με μεθυλίωση των ιστονών H3 λυσίνη 9 [7], [8], [9]. Εδώ, θα εξετασθεί αν RIZ1 μπορεί να είναι ένας κρίσιμος στόχος του μεθυλίου ισορροπημένης διατροφής στην πρόληψη του καρκίνου. Πραγματοποιήσαμε επίσης ανάλυση μικροσυστοιχιών και γονιδιακής έκφρασης για να μελετηθεί η επίδραση της διατροφής στην RIZ1 και άλλα γονίδια. Η επίδραση της διατροφής στη δραστηριότητα του ενζύμου μεθυλίωση RIZ1 αναλύθηκε με τη δοκιμασία της χρωματίνης immunoprecipiation. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι RIZ1 ρυθμίζεται από τη διατροφή και μπορεί να είναι ένα κρίσιμο στόχο της διατροφής μεθυλο-ισορροπημένη στην πρόληψη του καρκίνου.

Αποτελέσματα

σύγκριση RIZ1 μεταλλαγμένα και ποντίκια άγριου τύπου σε μεθυλ-ισορροπημένη δίαιτα (δίαιτα 1), έναντι ενός μη ισορροπημένη διατροφή χωρίς μεθειονίνη και η χολίνη (διατροφή 2). Η μεθυλ-ισορροπημένη δίαιτα 2 (βλέπε συμπληρωματικό πίνακα S1) είναι καλά γνωστό ότι μειώνουν την ηπατική SAM και να προκαλέσουν καρκίνους ήπατος σε τρωκτικά [2], [3], [4]. Έτσι, αυτή η μεθυλο-ισορροπημένη δίαιτα προκάλεσε όγκους του ήπατος και μειωμένη επιβίωση σε σύγκριση με την μεθυλο-ισορροπημένη διατροφή (Σχήμα 1Α). Τα περισσότερα από τα νεκρά ή ετοιμοθάνατα ζώα τα οποία ήταν κατάλληλα για αυτοψία ανάλυση βρέθηκαν να έχουν hepatocarcinomas. Σε αντίθεση, απουσία του άγριου τύπου RIZ1, δεν υπήρχε διαφορά στην επιβίωση ανεξάρτητα από τη διατροφή (Εικόνα 1Β). Αυτά τα ζώα RIZ1 νοκ-άουτ αναπτύχθηκε κυρίως hepatocarcinomas ανεξάρτητα από τη διατροφή. Ως εκ τούτου, ενώ η ισορροπημένη διατροφή 1 ανατίθενται πρόσθετα οφέλη επιβίωσης σε σύγκριση με την ισορροπημένη διατροφή 2 σε ποντίκια με άγριου τύπου RIZ1, παρέλειψε να το πράξει σε ποντικούς με έλλειψη RIZ1.

Α. Η βιωσιμότητα των RIZ1 ζώα άγριου τύπου σχετικά με τη διατροφή 1 σε σχέση με τη διατροφή 2. B. Η βιωσιμότητα των RIZ1 μεταλλαγμένα ζώα για διατροφή 1 σε σχέση με τη διατροφή 2. C. Η βιωσιμότητα των RIZ1 άγριου τύπου και μεταλλαγμένα ζώα σχετικά με τη διατροφή 1. Δ Η βιωσιμότητα των RIZ1 άγριου τύπου και μεταλλαγμένα ζώα για διατροφή 2. τα περισσότερα από τα νεκρά ή ετοιμοθάνατα ζώα τα οποία ήταν κατάλληλα για αυτοψία ανάλυση βρέθηκαν να έχουν όγκους. Το γράφημα σχεδιάστηκε με το πρόγραμμα Prism στατιστικών λογισμικού (GraphPad Software) με βάση την θεωρία Kaplan-Meyer.

P τιμές

υπολογίστηκαν με την ακριβή δοκιμή του Fisher (2 tailed) χρησιμοποιώντας το ποσοστό επιβίωσης στις ηλικίες 20 έως 22 μήνες.

Η

Τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι, σύμφωνα με προηγούμενες εργασίες [7 ], RIZ1 + /+ ποντικοί είχαν χαμηλότερη θνησιμότητα και όγκου συχνότητα από RIZ1 – /- ποντίκια όταν τροφοδοτείται μεθυλ-ισορροπημένη διατροφή 1 (Σχήμα 1C). Ωστόσο, όταν τροφοδοτείται ισορροπημένη δίαιτα 2, + /+ ποντίκια RIZ1 έδειξε παρόμοια θνησιμότητα όπως RIZ1 – /- ποντίκια (Εικόνα 1D). Έτσι, η λειτουργία καταστολής όγκου του RIZ1 εξαρτάται σε δίαιτα μεθυλ-ισορροπημένη. Τα παρόμοια ποσοστά επιβίωσης των RIZ1 ανεπάρκεια και άγρια ​​ζώα τύπου σχετικά με τη διατροφή 2 (Σχήμα 1D) προτείνει, επίσης, ότι η ικανότητα της δίαιτας 1 για να προσδώσουν επιπλέον οφέλη επιβίωσης σε σύγκριση με δίαιτα 2 RIZ1 άγριου τύπου (Εικόνα 1Α), αλλά όχι σε RIZ1 ανεπάρκεια ζώα (Εικόνα 1Β) δεν είναι λόγω του τετριμμένα λόγο ότι οι RIZ1 ανεπάρκεια ζώα μπορεί να είναι πολύ άρρωστος σε γενικές γραμμές να ανταποκριθεί στη διατροφή 1.

για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της διατροφής στην RIZ1, εξετάσαμε την έκφραση του γονιδίου RIZ1 στον ιστό στόχο ήπατος χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western. επίπεδο RIZ1 mRNA ήταν μειωτικά 4,2 φορές μετά τη θεραπεία με δίαιτα 2 για 2 μήνες (συμπληρωματικός Πίνακας S2). Η ρύθμιση προς τα κάτω δεν ήταν εμφανής σε 1 μήνα με τη δίαιτα 2, αλλά έγινε φανερό σε 2, 4, και 6 μήνες (συμπληρωματικός Πίνακας S2). Η ρύθμιση προς τα κάτω του RIZ1 από την δίαιτα μεθυλο-ισορροπημένη επιβεβαιώθηκε με ανάλυση western blot (Σχήμα 2). Σε αντίθεση με RIZ1, τη μικρότερη πρωτεΐνη RIZ2 που στερείται τον τομέα PR /SET [10] δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τη διατροφή.

Α. Ολικού κυττάρου εκχυλίσματα ήπατος από τα ζώα για διατροφή 1 και 2 δίαιτα για δύο μήνες αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα που αντιδρά με αμφότερα RIZ1 και πρωτεΐνες RIZ2. στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα βήτα-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. B. Η ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης με ανάλυση πυκνομετρίας. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD από 4 ζώα ανά υποομάδα. *

P

= 0,012 (t-test του Student, 2 tailed).

Η

Επίσης εξετάσαμε άλλα μεθυλτρανσφεράσες και συναφών ενζύμων με ποσοτική ανάλυση RT-PCR και DNA μικροσυστοιχιών. Εξετάστηκαν συνολικά 25 μεθυλτρανσφερασών ιστόνης, συμπεριλαμβανομένων τουλάχιστον ένα ένζυμο ειδικό για κάθε ένα από τα υπολείμματα αμινοξέων που είναι γνωστό ότι είναι μεθυλιωμένα. Κανένα από αυτά τα ένζυμα, εκτός από RIZ1, ήταν σημαντικά μειωτικά (& gt? 2 φορές). Σε 2 μήνες δίαιτας 2 θεραπείας (συμπληρωματικός Πίνακας S2)

Για να καθοριστεί περαιτέρω αν η έκφραση RIZ1 είναι ευαίσθητο σε επίπεδα SAM, που χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο ποντίκια knockout MATA1 [11]. Αυτά τα ζώα έχουν χαμηλότερη (3 έως 4 φορές) ηπατική SAM και επίσης να αναπτύξουν καρκίνους του ήπατος. Ποσοτική ανάλυση RT-PCR των ζώων κατά 4/5 έως 5/5 μηνών έδειξε ότι η έκφραση RIZ1 σε ήπατα αγρίου τύπου (n = 6) ήταν 2,0 φορές υψηλότερη από ό, τι στις knockouts MATA1 (n = 5, Ρ = 0,03, δοκιμή t του Student, 2 ουρά), συγκρίσιμη με την φορές μείωση για τους ίδιους ηλικιωμένα ποντίκια άγριου τύπου σχετικά με τη διατροφή 2 (συμπληρωματικός Πίνακας S2).

επόμενο εξέτασε κατά πόσον RIZ1 γονίδια στόχοι που ρυθμίζονται από τη διατροφή. ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA των συκωτιών των RIZ1 ζώα άγριου τύπου σε 2 μήνες θεραπείας δίαιτα αποκάλυψε μια λίστα με 1636 γονίδια που επηρεάζονται από τη διατροφή κατά περισσότερο από 2 φορές (συμπληρωματικός Πίνακας S3). ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA των συκωτιών των RIZ1 ζώα νοκ-άουτ εντοπίστηκαν 97 υποτιθέμενο γονιδίων στόχων RIZ1 δείχνει περισσότερο από 2 φορές η διαφορά μεταξύ του άγριου τύπου και νοκ-άουτ (συμπληρωματικός Πίνακας S4). Από αυτούς, 29 ήταν επίσης παρόντα στον κατάλογο των γονιδίων που ρυθμίζονται από τη διατροφή, υποδεικνύοντας μία σημαντική εμπλουτισμό των γονιδίων στόχων RIZ1 στον κατάλογο των γονιδίων δίαιτα ρυθμιζόμενων (29/97 έναντι 1636/48000,

P

& lt? 0,0001, Chi τετράγωνο τεστ, 2 tailed). Τα γονίδια ενδιαφέροντος που απορυθμίζεται τόσο από RIZ1 νοκ-άουτ και μεθυλο-ισορροπημένη διατροφή περιλαμβάνει c-Jun, c-Fos, και CTGF. Ορισμένα από αυτά τα γονίδια μπορεί να παίζουν άμεσο ρόλο σε καρκίνους του ήπατος (δηλαδή c-Jun) [12]. Η επίδραση της RIZ1 νοκ-άουτ ή δίαιτα για την έκφραση αυτών των γονιδίων επιβεβαιώθηκε με ποσοτική ανάλυση RT-PCR (Πίνακας 1). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των RIZ1 με δίαιτα 2 σχετίζεται με απορρύθμιση των γονιδίων στόχων RIZ1

Η

Επειδή η έκφραση RIZ1 δεν επηρεάσθηκε σημαντικά από τη διατροφή 2 σε 1 μήνα θεραπείας (συμπληρωματικός Πίνακας S2), οποιαδήποτε έκφραση. αλλαγές των γονιδίων στόχων του RIZ1 σε θεραπεία διατροφή 1 μήνα μπορεί να αντικατοπτρίζει τις αλλαγές στη δραστηριότητα RIZ1 και όχι σε επίπεδο έκφρασης. Έχουμε επιλέξει επτά γονιδίων στόχων RIZ1 και προσδιορίζονται τα επίπεδα έκφρασης τους είτε σε 1 μήνα ή δύο μήνες θεραπείας δίαιτα. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, έξι από τα επτά γονίδια βρέθηκαν απορυθμίζεται με δίαιτα 2 σε θεραπεία διατροφή 1 μήνα. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η δίαιτα 2 προκάλεσε απορρύθμιση των γονιδίων στόχων RIZ1 μείωση πριν από σημαντικά επίπεδα έκφρασης RIZ1.

Εμείς θα χρησιμοποιηθούν την επόμενη χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία για να εξετάσει αλλαγές στο ιστονών μεθυλίωσης σε γονίδια-στόχους RIZ1 ως αποτέλεσμα της μειωμένης RIZ1 δραστηριότητα. Χρησιμοποιήσαμε ένα RIZ1-ειδικό αντίσωμα ab9710 (Abcam) που δεν αντιδρά με RIZ2 (βλέπε συμπληρωματικό σχήμα S1 για μία κηλίδα Western του RIZ1 από αυτό το αντίσωμα). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, το εγγύς υποκινητή c-Jun δεσμεύεται από RIZ1 και έδειξε υψηλότερα επίπεδα λυσίνης Η3 9 μονομεθυλίωσης σε RIZ1 άγριου τύπου έναντι knockout ήπατα. RIZ1 δεν δεσμεύτηκε στην απώτερη περιοχή του υποκινητή c-Jun ή τον προαγωγό του γονιδίου Elovl3 που δεν είχε κατασταλεί από RIZ1. Σε 1 μήνα δίαιτα 2 θεραπεία, H3K9me1 του c-Jun προαγωγός μειώθηκε ακόμα κι RIZ1 πρόσδεση δεν αλλάξει, υποδηλώνοντας πάλι ότι η δραστηριότητα RIZ1 μειώθηκε ακόμη και όταν η έκφραση RIZ1 ήταν σε φυσιολογικά επίπεδα (Εικόνα 3).

Α . Διαλυτό χρωματίνη παρασκευάστηκε από ήπατα RIZ1 άγριου τύπου και τα ζώα knockout. Ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας σύνολα εκκινητών που καλύπτουν το εγγύς ή άπω τις περιοχές υποκινητή του c-Jun και γονίδιο Elovl3. B. Διαλυτό χρωματίνη παρασκευάστηκε από ήπατα των ζώων άγριου τύπου σε κάθε δίαιτα 1 ή 2 δίαιτα για 1 μήνα. Ανοσοκαταβύθιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. DNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας σύνολα εκκινητών που καλύπτουν το εγγύς ή άπω τις περιοχές υποκινητή του c-Jun και γονίδιο Elovl3. Ένας εκπρόσωπος των δεδομένων που παρουσιάζεται από τα τέσσερα πειράματα που εκτελέστηκαν.

Η

Θα εξεταστεί επίσης το συνολικό αλλαγές μεθυλίωσης του DNA σε απάντηση μεθυλο-ισορροπημένη διατροφή στο DNA από το συκώτι των ζώων κατά 15 μηνών θεραπείας. Ενώ βρήκαμε ότι η διατροφή 2 μειώθηκε συνολικά μεθυλίωση του DNA (Συμπληρωματική Εικόνα S2), δεν βρήκαμε αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA (είτε υπερ ή υπο μεθυλίωση) σε μεμονωμένες τυχαία CpG πλούσιων περιοχών (Συμπληρωματική Εικόνα S3) χρησιμοποιώντας την τεχνική του

Not1 -Mse1

MS-AFLP (μεθυλίωση ευαίσθητα ενισχυμένο θραύσμα μήκους πολυμορφισμός) [13]. Με ανάλυση Western blot, δεν βρήκαμε σημαντικές αλλαγές (& gt? 2 φορές). Στη μεθυλίωση του H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3, H4K20me1, και H4K20me2 στο ήπαρ των ζώων που ήταν σε δίαιτα 2 για έξι μήνες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

Συζήτηση

Δεδομένου ότι μόνο RIZ1 και 4 μικρά μεθυλτρανσφεράσες μόριο (GNMT, GAMT, NNMT και TEMT) βρέθηκαν μειωτικά από τη διατροφή 2 σε ένα μη-προκατειλημμένη διαλογή χρησιμοποιώντας τόσο μικροσυστοιχιών DNA και RT-PCR μεθόδους (βλέπε συμπληρωματικό πίνακα S2), εξετάσαμε αν αυτά τα 5 ένζυμα μοιράζονται κάποιες κοινές ιδιότητες που θα μπορούσαν να εξηγήσουν την ευαισθησία τους στη διατροφή. Βρήκαμε από τις τιμές της βιβλιογραφίας Km για SAM για 3 από τα 4 μικρά μεθυλτρανσφεράσες μόριο και οι τρεις αποδείχθηκε ότι έχουν υψηλή αξία Km (& gt? 49 μΜ) (βλέπε συμπληρωματικό πίνακα S5). Για το μεγάλο αριθμό των μεθυλτρανσφερασών που δεν ρυθμίζονται από τη διατροφή, εντοπίσαμε τιμές Km για 7 από αυτά και όλα 7 έχουν Km τιμές χαμηλότερες από 10 μΜ (βλέπε συμπληρωματικό πίνακα S5). Έτσι, υπάρχει μία σημαντική συσχέτιση μεταξύ υψηλής Km για SAM και προς τα κάτω ρύθμιση από τη διατροφή 2 (

P

= 0.0083, ακριβές τεστ του Fisher, 2 tailed).

συγκέντρωση Ηπατική SAM είναι περίπου 60 μΜ και μεθυλ-ισορροπημένη δίαιτα συνήθως προκαλεί μια 1,5 έως 3 φορές πτώση στα επίπεδα SAM [3], [14], η οποία θα είναι ακόμα αρκετά υψηλή ώστε να επιτρέπει κοντά μέγιστη δραστηριότητα για τα περισσότερα μεθυλτρανσφεράσες με χαμηλή Km για την SAM, αλλά θα αναστέλλει σημαντικά αυτά τα ένζυμα με υψηλή τιμές χλμ. Η προνομιακή ρύθμιση προς τα κάτω από τη διατροφή 2 των μεθυλτρανσφερασών με υψηλή Km για SAM μπορεί να αντανακλά μια αναστολή ανατροφοδότηση σχετικά με τη δική τους έκφραση των γονιδίων από unliganded ή αχρησιμοποίητα ένζυμα. Η κανονική SET τομέα συμμερίζονται οι περισσότεροι KMTs έχει χαμηλό Km για SAM [15]. Αλλά RIZ1 μπορεί να αποτελεί εξαίρεση από το πεδίο SET του είναι διαφορετικό από τα άλλα [16], [17].

Πολλές επιπτώσεις της διατροφής μεθυλο-ανισόρροπες, όπως συσσώρευση λίπους, η ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης C, μη φυσιολογική ανανέωση των κυττάρων, οξειδωτικό στρες, χαμηλή αναλογία SAM /υπαραχνοειδή αιμορραγία, DNA υπομεθυλίωση, και την ενσωμάτωση ουρακίλη στο DNA ή μετάλλαξη, εμποδίζονται από μια δίαιτα μεθυλο-ισορροπημένη. Επιπλέον, μία μεθυλ-ισορροπημένη διατροφή επηρεάζει την έκφραση πολλών γονιδίων, όπως φαίνεται εδώ. Η παρατήρησή μας ότι η ανεπάρκεια ενός μόνο γονιδίου μπορεί να εξουδετερώσει τον καρκίνο προληπτικό όφελος μιας δίαιτας μεθυλ-ισορροπημένη δείχνει ότι τουλάχιστον ένα από τα πολλά αποτελέσματα μιας τέτοιας δίαιτας μπορεί να παίζει ένα ρόλο περιορισμού του ρυθμού κατά τη διαδικασία την πρόληψη του καρκίνου.

από όλες αυτές τις παρατηρήσεις, μπορεί να υποτεθεί ότι το μοριακό μονοπάτι καρκινογένεσης με δίαιτα μεθυλ-ισορροπημένη μπορεί να είναι οι εξής: α-μεθυλο ισορροπημένη δίαιτα – χρόνια χαμηλή αναλογία SAM /SAH στα περισσότερα κύτταρα μιας δίαιτας που αποκρίνονται-αναστολή ιστού στόχου και προς τα κάτω ρύθμιση RIZ1 στα περισσότερα κύτταρα του ιστού στόχου – προς τα πάνω ρύθμιση prosurvival και progrowth ογκογονίδια όπως c-Jun στα περισσότερα κύτταρα του ιστού στόχου – στοχαστικές αθροιστικά γενετικές και επιγενετικές μεταβολές σε ένα μόνο κύτταρο – κλωνικό πολλαπλασιασμό του απλού κυττάρου – καρκίνος. Σε αυτό το μοντέλο προέλευσης πολλαπλών κυψελίδων για την έναρξη του καρκίνου [6], η αδρανοποίηση του RIZ1 και αυξορρύθμιση ορισμένων ογκογονιδίων όπως c-Jun στα περισσότερα κύτταρα μιας δίαιτας που ανταποκρίνεται ιστός μπορεί να μην είναι επαρκής για να προκαλέσει κλωνικό πολλαπλασιασμό αλλά μπορεί να επιτρέψει μια μεγάλη πισίνα λιγότερο από πλήρως τα φυσιολογικά κύτταρα να είναι πιο επιρρεπή σε κλωνικό πολλαπλασιασμό σε απόκριση σε στοχαστικά ισχυρή ογκογόνους μεταλλάξεις σε ένα μόνο κύτταρο. Σε αντίθεση, πλήρως φυσιολογικά κύτταρα μπορούν να υποστούν γήρανση ή κυτταρικό θάνατο σε απόκριση σε ογκογόνες μεταλλάξεις [18]. Έτσι, ένα βήμα περιορισμού του ρυθμού στην πρόληψη του καρκίνου μπορεί να είναι η διατήρηση της δραστηριότητας RIZ1 στα περισσότερα κύτταρα ενός ιστού στόχου [6].

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα, δίαιτες, και ιστών

RIZ1 knockout ποντίκια σε 129Sv /C57BL6 υπόβαθρο διασταυρώθηκαν με 129Sv ποντίκια για 8 γενιές για την παραγωγή RIZ1 knockout ποντικών σε 99,625% 129Sv φόντο. Αυτές RIZ1 – /- ποντικοί στη συνέχεια διασταυρώθηκαν με p53 +/- 129Sv ποντίκια (από Jackson Laboratory) για να δημιουργήσει RIZ1 +/- p53 +/- ποντικού σε 129Sv φόντο. Τα ζώα των ακόλουθων γονοτύπων διατηρήθηκαν για πειραματική χρήση: RIZ1 – /- ρ53 +/- και RIZ1 + /+ p53 +/-. Η εισαγωγή της ρ53 ετερόζυγη μετάλλαξη είχε ως στόχο να μειώσει την καθυστέρηση της ανάπτυξης του όγκου στα ποντίκια knockout RIZ1 [7]. Αρσενικά ζώα του κάθε γονότυπου τυχαιοποιήθηκαν σε δύο ομάδες των -30 κάθε μία. Ξεκινώντας από περίπου 4 εβδομάδων, όλα τα ζώα τρέφονταν με μια δίαιτα ή δίαιτα 1. Αφού σε αυτή τη δίαιτα για μία εβδομάδα οξύ ορίζεται μεθυλο-ισορροπημένη και αμινοξέα, μία ομάδα ζώων συνέχισε να παραμείνουν στην διατροφή 1 για την εναπομένουσα περίοδο το πείραμα. Η άλλη ομάδα τράφηκαν με μεθειονίνη και δίαιτα με ανεπάρκεια χολίνης ή δίαιτα 2. Οι συνθέσεις των δίαιτες (βλέπε συμπληρωματικό πίνακα S1) ήταν ουσιαστικά οι ίδιες με εκείνες που συνήθως χρησιμοποιούνται στο πεδίο [2], [3], [4]. Δίαιτες φυλάχθηκαν στους 4 ° C και δίνεται κατά βούληση με δεκαπενθήμερη αντικατάστασης. την ανάπτυξη των ζώων ακολούθησε μηνιαία μέτρηση του σωματικού βάρους για έως και 15 μήνες. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στο βάρος σώματος παρατηρήθηκε για διαφορετικούς γονότυπους. Ζώα σε δίαιτα 2 έδειξε μειωμένη (15% μικρότερο σε ηλικία 15 μηνών) σωματικού βάρους σε σύγκριση με τα ζώα για διατροφή 1. Αυτή η μικρή επίδραση της διατροφής 2 στο σωματικό βάρος ήταν παρόμοιο με αυτό που άλλοι έχουν βρει [2]. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meyer χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Prism στατιστικά στοιχεία (λογισμικό GraphPad). Οι ιστοί του ήπατος σταθεροποιήθηκαν για ιστολογική αναλύσεις ή καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθεί για βιοχημικές αναλύσεις. Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη σαν ρουτίνα σε επεξεργασία για εμβάπτιση σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Για τις μετρήσεις των διατροφικών επιδράσεις στην γονιδιακή έκφραση και ιστόνης μεθυλίωση, επιπλέον ζώα τράφηκαν δίαιτα 1 ή 2 για 1 έως 6 μήνες πριν να θυσιαστούν για τη συλλογή ιστού.

δεοντολογική έγκριση για όλες τις εργασίες σε ζώα λήφθηκε από το ζώο Επιτροπή Ερευνών του Burnham Institute for Medical Research.

κηλίδωση Western

οι ιστοί homoginized σε ρυθμιστικό RIPA (150 mM NaCl, 1% Nonidet Ρ-40, 0,25% Na-δεοξυχολικό, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, ρΗ 7.4, συν αναστολείς πρωτεϊνάσης). Το σύνολο προϊόντα λύσης στη συνέχεια αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα SDS φόρτωσης γέλης ακολουθούμενη από κλασμάτωση σε πήκτωμα SDS και κηλίδωση Western. RIZ αντίσωμα ήταν κουνελιού KG7.1S ορού έναντι RIZ1 aa 245-573 που αντιδρά τόσο με RIZ1 και RIZ2, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (διατίθεται από την Abcam ab3790) [19]. Για Western Blot έναντι RIZ1 αλλά δεν RIZ2, χρησιμοποιήσαμε το Abcam RIZ1 ab9710 αντισώματος. Αντισώματα για μεθυλιωμένο ιστόνες ήταν από Abcam και Upstate.

Ποσοτική RT-PCR

Ολικά RNAs που εξάγονται από ιστούς χρησιμοποιώντας τις Magna Lyser πράσινες χάντρες (Roche) και το κιτ RNAmini (Qiagen). Ποσοτική RT-PCR αναλύσεις (SYBR πράσινο) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το σύστημα Mx3000P QPCR του Stratagene. Όλα γονίδιο ειδικοί εκκινητές επιβεβαιώθηκαν για να δώσουν μία μοναδική ζώνη του αναμενόμενου μεγέθους. Κυκλοφιλίνη Α γονίδιο (PPIA) χρησίμευσε ως έλεγχος για ποσό RNA. Αυτό το γονίδιο δεν ρυθμίζεται από δίαιτα ή RIZ1 knockout όπως υποδεικνύεται από ανάλυση μικροσυστοιχιών.

μικροσυστοιχίες DNA ανάλυση

cDNAs συντέθηκε από ολικό RNA που υβριδοποιήθηκαν με Sentrix Mouse-6 Έκφραση BeadChip από Illumina περιέχουν 48000 γονίδιο συστοιχίες. Τα δεδομένα ελήφθησαν από πανομοιότυπα βιολογικά δείγματα. κανονικοποίηση των δεδομένων έγινε με τη χρήση κυβικά εξομάλυνση spline.

ChIP ανάλυση

αντίσωμα κουνελιού ειδικό για RIZ1 αλλά δεν RIZ2 από Abcam (ab9710) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση τσιπ RIZ1 δεσμευτική για τη στόχευση γονιδίων. Αντισώματα για methylationed ιστόνες ήταν από Abcam (ab9045 για H3K9me1, ab8898 για H3K9me3, ab9051 για H4K20me1) και Upstate (07-212 για H3K9me2). Οι ιστοί του ήπατος (-30 mg ανά ανοσοκαταβύθιση αντίσωμα) ψιλοκομμένο σε κομμάτια χρησιμοποιώντας ξυραφάκια και διασταυρωμένο σε 1% φορμαλδεΰδη σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Χρωματίνης ήταν κατακερματισμένη σε μέσο μέγεθος 700 bp χρησιμοποιώντας μια συσκευή υπερήχων Misonix ΧΙ.2020. Χρησιμοποιήθηκε το κιτ δοκιμασίας μάρκα από Upstate. Για PCR, χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών: 5′-AAATCTCTGGTTTCCAGGTACAGC-3 ‘(-801 έως -777) και 5′-GAGAAAGGGCTGAATGATCTGAGT-3’ (-595 έως -571) για την περιοχή του υποκινητή εγγύς c-Jun, και 5 ‘ -GTGTGGGGGTAGAGGAGTGA-3 ‘(-4 337 να -4.317) και 5′-AGTGTCACTGGACCCTCACC -3′ (-4 128 να -4,108) για περιφερική περιοχή c-Jun. Για την PCR του γονιδίου υποκινητή Elovl3, χρησιμοποιήσαμε τα ζεύγη εναρκτήρα 5’-CCCCATTTTTCTCTCCAACA-3 ‘(-768 να -748) και 5′-CCAAGCTGGACCATAAGGAA-3’ (-578 να -558) για την περιοχή προαγωγέα Elovl3, και 5 ‘ -CCAGGCTGTCCTGAAACTAATTCT-3 ‘(-8325 να -8301) και 5′-CTGTAGACCAGGTGACTGCAAACT-3’ (-8.132 να -8.108) για την απομακρυσμένη περιοχή Elovl3.

μεθυλίωσης του DNA ανάλυση

Γενωμικό DNAs εκχυλίστηκαν από ιστούς χρησιμοποιώντας πρότυπες διαδικασίες. Ανάλυση της μεθυλίωσης στην CpG πλούσιων περιοχών με την

Not1-Mse1

μέθοδο MS-AFLP έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Γονιδιωματικής μεθυλο-κυτοσίνη περιεχόμενο αναλύθηκε με τη μέθοδο του ενζύμου μεθυλίωσης Sss1 [20].

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Σύνθεση του αμινοξέος καθορισμένες και μεθυλο-ισορροπημένη βασική δίαιτα (Teklad προϊόντος Αρ TD 99366). Αυτό αναφέρεται ως Δίαιτα 1. Η μεθυλ-ισορροπημένη δίαιτα ή δίαιτα σκεύασμα 2 ((Teklad προϊόντος Αρ TD 01513) είναι η ίδια όπως η διατροφή 1, εκτός από το ότι περιέχει 9,0 g /Kg DL-ομοκυστίνη και στερείται της μεθειονίνης και διτρυγική χολίνη.

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0003390.s001

(0,05 MB DOC)

Πίνακας S2

ποσοτική RT-PCR και ανάλυση μικροσυστοιχιών ορισμένων μεθυλτρανσφερασών ιστόνης και τα συγγενικά ένζυμα άγριου τύπου αρσενικά ζώα ήταν κατεργάζεται με δίαιτα ή δίαιτα 1 2 (ξεκινώντας από 3-4 εβδομάδες της ηλικίας) για 1, 2, 4, και 6 μήνες πριν από την εκχύλιση RNA από τα συκώτια. Επίπεδα 25 μεθυλτρανσφερασών ιστόνης και 8 άλλα συναφή ένζυμα προσδιορίστηκαν είτε με ποσοτική RT- . PCR ή μικροσυστοιχιών ή και τα δύο, και ο λόγος (fold change) Δίαιτα 1 έναντι Διατροφή 2 υπολογίζεται δεδομένα από ποσοτική RT-PCR αντιπροσωπεύουν τη βοήθεια τουλάχιστον 3 ζώα ανά υποομάδα * P & lt?. 0.05 Δίαιτα 1 εναντίον Διατροφή 2 (t-Μαθητή δοκιμή, 2 tailed). μεθυλτρανσφεράσες ιστόνης που δεν αναφέρονται εδώ δεν έδειξε σημαντική έκφραση στο ήπαρ, όπως αποκαλύπτεται με ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA. Τα δεδομένα από την ανάλυση μικροσυστοιχιών αντιπροσωπεύουν μέσο 2 ζώα ανά υποομάδα. ανάλυσης μικροσυστοιχιών DNA αποκάλυψε ρύθμιση προς τα κάτω από τη διατροφή 2 από τέσσερα μικρά μεθυλτρανσφερασών μόριο, GNMT, GAMT, NNMT και TEMT, τα οποία στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε από ποσοτική RT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003390.s002

(0,08 MB DOC)

πίνακα S3.

γονίδια που ρυθμίζονται από τη διατροφή, όπως αποκαλύπτεται με ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA. άγριου τύπου ποντίκια τράφηκαν με δίαιτα είτε 1 ή 2 δίαιτα για δύο μήνες πριν συλλέχθηκαν τα συκώτια τους για την εκχύλιση RNA. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο 2 ζώα ανά υποομάδα. Μόνο γονίδια που εμφανίζουν περισσότερα από 2 αλλαγές φορές αναφέρονται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003390.s003

(0.85 MB XLS)

Πίνακας S4.

γονίδια που ρυθμίζονται από RIZ1 νοκ-άουτ, όπως αποκαλύπτεται με ανάλυση μικροσυστοιχιών DNA. Τα RNA χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση ήταν από άγριου τύπου και knockout ποντίκια τεσσάρων μηνών για ισορροπημένη διατροφή. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο 2 ζώα ανά υποομάδα. Γονίδια με έντονους επίσης ρυθμίζονται από τη διατροφή. Μόνο γονίδια που εμφανίζουν περισσότερα από 2 αλλαγές φορές αναφέρονται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003390.s004

(0,06 MB XLS)

Πίνακας S5.

μεθυλτρανσφεράσες με υψηλή τιμή Km για SAM ρυθμίστηκαν προς τα κάτω από τη διατροφή μεθυλο-ισορροπημένη. Η τιμή Km για SAM και τιμή Ki για υπαραχνοειδή αιμορραγία εμφανίζονται για διάφορες μεθυλτρανσφεράσες. Η αναλογία (πάσο μεταβολές) Δίαιτα 1 έναντι Δίαιτα 2 στα επίπεδα έκφρασης των μεθυλτρανσφερασών υπολογίστηκε από ποσοτικής RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη βοήθεια τουλάχιστον 3 ζώα ανά υποομάδα στους 2 μήνες θεραπείας διατροφής. * P & lt? 0,05 Δίαιτα 1 εναντίον Διατροφή 2 (έλεγχος τ, 2 tailed)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003390.s005

(0,03 MB DOC)

Εικόνα S1.

ανάλυση Western blot που επιβεβαιώνει την αναγνώριση των RIZ1 αλλά όχι RIZ2 από την Abcam RIZ1 ειδικό ab9710 αντισώματος. Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίσματα ήπατος από είτε RIZ1 άγριου τύπου ή νοκ άουτ ζώα αναλύθηκαν με SDS γέλη ακολουθούμενη από στύπωμα Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα ab9710 RIZ1. Ίση φόρτωση επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western με χρήση αντισώματος β-ακτίνης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003390.s006

(0,07 MB PDF)

Εικόνα S2.

DNA υπομεθυλίωση σε ποντίκια που τρέφονταν με δίαιτα 2. Συνολικός γενωμική DNA που απομονώθηκαν από το συκώτι των ποντικών σε κάθε δίαιτα 1 ή δίαιτα 2 για 15 μήνες. Τα επίπεδα μεθυλίωσης αυτών των DNAs προσδιορίστηκαν με την δοκιμασία ενζύμου Sss1. Τα δεδομένα είναι τα μέσα + SD από 3 ζώα ανά υποομάδα. . * Ρ = 0,03 (έλεγχος τ, 2 tailed)

doi: 10.1371 /journal.pone.0003390.s007

(0,02 MB PDF)

Εικόνα S3.

Ανάλυση των μεταβολών μεθυλίωσης στην CpG πλούσιες περιοχές του γονιδιώματος από το MS-AFLP. Α Γενωμικό DNA που απομονώθηκε από κύτταρα MCF7 που είτε επεξεργασμένο ή όχι αγωγή με το παράγοντα απομεθυλίωσης Αζα-C χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για τη μέθοδο MS-AFLP. B. Οι γενωμικά DNAs που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση ήταν από εγκέφαλο (Β) και το ήπαρ (L) σε ιστούς ποντικών σε κάθε δίαιτα ή δίαιτα 1 2 15 μήνες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0003390.s008

(1.49 MB PDF)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Emily Larson για τα δείγματα ιστού.