Αφηρημένο

ένωση Ginsenoside K (CK), ένα σπάνιο ginsenoside που προέρχονται από

Panax Ginseng

, έχει βρεθεί ότι διαθέτουν μοναδικές φαρμακολογικές δραστικότητες ειδικώς ως αντι-καρκίνου. Ωστόσο, ο ρόλος του κυτοχρώματος Ρ450 (CYP που) στο μεταβολισμό της CK είναι ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, εξετάσαμε τις CYPs για το μεταβολισμό των CK

in vitro

χρήση μικροσωμάτων ανθρώπινου ήπατος (HLMs) ή ανθρώπινη ανασυνδυασμένη CYPs. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CK ανέστειλαν το ένζυμο δραστηριότητες των CYP2C9 και CYP3A4 στα HLMs. Η

K

m

και

V

max

αξίες της CK ήταν 84.20 ± 21.92 μΜ και 0,28 ± 0,04 nmol /mg πρωτεΐνης /λεπτό, αντίστοιχα, για τους HLMs? 34,63 ± 10,48 μΜ και 0,45 ± 0,05 nmol /nmol P450 /λεπτό, αντίστοιχα, για CYP2C9? και 27,03 ± 5,04 μΜ και 0,68 ± 0,04 nmol /nmol P450 /λεπτό, αντίστοιχα, για το CYP3A4. Η

IC

50

τιμές ήταν 16,00 μΜ και 9,83 μΜ, και

K

i

τιμές ήταν 14,92 μΜ και 11,42 μΜ για CYP2C9 και CYP3A4, αντίστοιχα. Άλλες ισομορφές του ανθρώπινου CYP, συμπεριλαμβανομένων των CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1, και CYP2C19, παρουσίασαν ελάχιστη ή καμία επίδραση στο μεταβολισμό της CK. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CK ήταν ένα υπόστρωμα και αναστολείς επίσης τόσο για CYP2C9 και CYP3A4. Οι ασθενείς που χρησιμοποιούν CK σε συνδυασμό με θεραπευτικά φάρμακα που είναι υποστρώματα των CYP2C9 και CYP3A4 για διαφορετικούς λόγους θα πρέπει να είστε προσεκτικοί, αν και η ανασταλτική δραστικότητα της CK είναι πολύ φτωχότερη από αυτή του ενζύμου-ειδική

Παράθεση:. Xiao J, Chen D, Λιν XX, Peng SF, Xiao MF, Huang WH, et al. (2016) Έλεγχος των φαρμάκων ένζυμα μεταβολισμού για την Ένωση Ginsenoside Κ

In Vitro

: Μια Αποτελεσματική Anti-Cancer ουσία που προέρχεται από το

Panax Ginseng

. PLoS ONE 11 (2): e0147183. doi: 10.1371 /journal.pone.0147183

Επιμέλεια: Olorunseun Ogunwobi, Hunter College του City University of New York, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: May 23, 2015? Αποδεκτές: 30ης Δεκεμβρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 4 Φεβρουαρίου, 2016

Copyright: © 2016 Xiao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (Επιχορηγήσεις 81302850, 81300204, 31400306)? το Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός Επιστημών της Κίνας (Επιχορηγήσεις 2013M531817, 2014T70793)? και οι Επιστήμης και Τεχνολογίας Πρόγραμμα Έργων της επαρχίας Χουνάν (Grant 2014RS4011)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Χάρη σε Zhejiang Hisun Φαρμακευτική Εταιρεία Λίμιτεδ (Zhejiang, Κίνα) για την παροχή της ένωσης Ginsenoside Κ Η φαρμακευτική εταιρεία δεν έχει ένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Εισαγωγή

Panax Ginseng

είναι μια συμπληρωματική και εναλλακτική ιατρική ( CAM) που έχει πολλές φαρμακολογικές δραστηριότητες, όπως η διατήρηση φυσική ζωτικότητα και την ενίσχυση της αντοχής στο στρες και γήρανση [1].

Panax Ginseng

χρησιμοποιείται ευρέως σε κλινικές για την πρόληψη του καρκίνου, της στυτικής δυσλειτουργίας, και την ενίσχυση των φυσικών λειτουργιών, μεταξύ άλλων [2]. Τα κύρια ενεργά συστατικά του

Panax Ginseng

είναι ginsenosides, και μέχρι σήμερα, έχουν περισσότερα από 150 φυσικά παραγόμενα ginsenosides έχουν ληφθεί από

Panax Ginseng

[3]. Τα κύρια συστατικά που περιλαμβάνουν πάνω από το 80% του περιεχομένου των

Panax Ginseng

είναι Rb1, Rb2, Rc, Rg1, και Re. Τα υπόλοιπα είναι γνωστά ως σπάνιες ginsenosides, τα οποία αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό μέρος των συνολικών σαπωνίνες, και έχουν μοναδικό φαρμακολογικές δράσεις [4].

Ginsenoside ένωση Κ (CK), ή 20-O-β- (D-γλυκοπυρανοσυλο) -20 (S) -protopanaxadiol (Η μοριακή δομή παρουσιάζεται στο Σχήμα 1), είναι φυσικά απουσιάζει. Ανήκει στο σπάνιο ginsenoside, η οποία μετατρέπεται από ginsenosideRb1 και Rb2 από τα εντερικά βακτήρια [5]. Οι Ginsenosides απορροφώνται ελάχιστα από το έντερο ενώ μεταβολίτη CK τους απορροφάται. Δεδομένου ότι η τελική μορφή, CK παίζει ένα φαρμακολογικό ρόλο έχει προκαλέσει αυξανόμενο ενδιαφέρον. CK μπορεί να αντισταθεί όλα τα είδη των κυττάρων του όγκου και την προώθηση της κυτταρικής απόπτωσης, όπως του ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα, γαστρικό καρκινικά κύτταρα, καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, και πολλαπλό μυέλωμα [1, 6, 7]. CK αυξάνει την αντίσταση σε λειτουργία ανοσία να παρατείνει το χρόνο επιβίωσης μοσχεύματος σε μεταμόσχευση καρδιάς, έχει μια αντι-φλεγμονώδη λειτουργία, αντιστέκεται γήρανση του δέρματος, και προστατεύει το μυοκάρδιο [1, 8].

Η

Η μοναδική βιολογική δραστηριότητα της CK έχει προσελκύσει πολλή προσοχή, και ως εκ τούτου έχει μια ευρεία προοπτική εφαρμογής. Η τρέχουσα χρήση CAM από τους ασθενείς αυξάνεται [9]. Η ταυτόχρονη χρήση της CAM και θεραπευτικά φάρμακα μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρά ζητήματα ασφάλειας σε ασθενείς. CAM έχει τη δυνατότητα να προκαλέσει φαρμακοκινητικές αλληλεπιδράσεις με θεραπευτικά φάρμακα. Μπορεί είτε να αυξήσουν ή να μειώσουν τα επίπεδα των θεραπευτικών φαρμάκων στο πλάσμα και να οδηγήσει σε απρόσμενες τοξικότητας ή μειωμένης αποτελεσματικότητας [10].

Οι περισσότερες φαρμακοκινητικές αλληλεπιδράσεις CAM-φάρμακο περιλαμβάνει φάρμακο μεταβολισμό του κυτοχρώματος P450 (CYP) ένζυμα [11, 12] . Οι CYPs είναι μία μεγάλη οικογένεια ενζύμων που μεταβολίζουν το φάρμακο που παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στο μεταβολισμό του φαρμάκου Ι φάση. Επιπλέον, οι περισσότεροι από τους ενδογενείς και εξωγενείς ουσίες είναι τα υποστρώματα του CYP που. Οι μεγάλες CYPs που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των περισσότερων φαρμάκων είναι τα CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP2C19 και CYP3A4, που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 90% του μεταβολισμού των ενδογενών και εξωγενών ουσιών [13].

CK είναι ένα από τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενες CAM για πολλές ασθένειες σε κλινικές. Καθώς η συγχορήγηση δεν μπορεί να αποφευχθεί, πώς να αποτρέψει CK-φάρμακο αλληλεπιδράσεων έχει γίνει ένα βασικό ζήτημα μεταξύ των ασθενών. Να παρέχουν λογική συμβουλές για τη χρήση των φαρμάκων, εξετάσαμε τα ένζυμα CYP ευθύνονται για το μεταβολισμό της CK στην παρούσα μελέτη.

Μέθοδοι

Τα ένζυμα και χημικές ουσίες

Τα ένζυμα και τα χημικά ware παρασκευάστηκε σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας με ορισμένες τροποποιήσεις [14]. Μικροσώματα ανθρώπινου ήπατος, ανασυνδυασμένα ανθρώπινα ένζυμα CYP, και NADPH αγοράστηκαν από Cypex Ltd. (UK) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Ginsenoside ένωση Κ (CK, C

36Η

62o

8, MW: 622.873, assay≥99.2%, Lot: P1201-1) παρασχέθηκε από τη Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited (Zhejiang, Κίνα). Φουραφουλίνης, τρανυλκυπρομίνη, κετοκοναζόλη, σουλφαφαιναζόλη, κινιδίνη, υδροχλωρική χλωρομεθιαζόλη και υδροχλωρική τικλοπιδίνη αγοράστηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Τροφίμων και Φαρμάκων Ελέγχου (Πεκίνο, Κίνα). Φαινακετίνη, κουμαρίνη, μιδαζολάμη, τολβουταμίδη, S-μεφαινυτοϊνη, μετοπρολόλη, χλωρζοξαζόνη, και τα πρότυπα για τους μεταβολίτες τους, περιλαμβάνοντας ακεταμινοφένη, 7-υδροξύλιο κουμαρίνη, 1-υδροξύλιο μιδαζολάμη, 4-υδροξύλιο τολβουταμίδιο, 4-υδροξύλιο μεφαινυτοϊνη, α-υδροξύλιο μετοπρολόλη , 6-υδροξυλίου χλωρζοξαζόνη, και ιρβεσαρτάνης (το εσωτερικό πρότυπο), αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Shanghai, Κίνα). Όλα τα άλλα χημικά και διαλύτες ήταν από υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) βαθμού.

Συσκευή και λειτουργία συνθήκες

Οι συγκεντρώσεις των υποστρωμάτων CYP και των μεταβολιτών τους προσδιορίστηκαν ποσοτικά σύμφωνα με τη μέθοδο που αναφέρεται στο προηγούμενη μελέτη μας με ορισμένες τροποποιήσεις [14]. Ένα σύστημα μονάδα διαχωρισμού HPLC Waters 2695 συνδέεται με ένα Quattro μικρο

™ διπλό τριπλό φασματόμετρο μάζας διαδοχικό ΑΡΙ (Waters Corp., Milford, Massachusetts, USA) με πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού χρησιμοποιήθηκε. Τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε μία HyPURITY C

18 στήλη (150 mm × 2,1 mm, 5 μm, Θέρμο, USA). Οι κινητές φάσεις αποτελούνταν από 20 mM μυρμηκικό αμμώνιο και ακετονιτρίλιο σε αναλογία 60:40. Κλάσματα των 20 μι ενέθηκαν σε ένα ρυθμό κινητή φάση ροής 0.3 mL /min. Πολλαπλές παρακολούθησης αντίδραση διεξήχθη με τον θετικό τρόπο, εκτός από την CK που διεξήχθη με τον αρνητικό τρόπο (μητρικό ιόν m /z 621.4 με την κόρη ιόν m /z 160.8). Τα άλλα μεταβάσεις ήταν τα ίδια με εκείνα που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη μελέτη μας [14]. Τα φάσματα μάζας των μεταβολιτών που σχηματίζονται στις επωάσεις ήταν ταυτόσημες με εκείνες των αντίστοιχων αυθεντικά πρότυπα.

Γενικές συνθήκες επώασης

Η μέθοδος διεξήχθη σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας με ορισμένες τροποποιήσεις [14] . Οι CYP ισομορφή ειδικές αντιδράσεις ανιχνευτής που χρησιμοποιήθηκε ήταν φαινακετίνη O-deethylation (για CYP1A2), κουμαρίνη 7-υδροξυλίωση (για CYP2A6), τολβουταμίδη 4-υδροξυλίωση (για CYP2C9), μετοπρολόλη α-υδροξυλίωση (για CYP2D6), χλωροζοξαζόνη 6-υδροξυλίωση ( για CYP2E1), S-μεφαινυτοϊνη 4-υδροξυλίωση (για CYP2C19), και μιδαζολάμη 1-υδροξυλίωση (για το CYP3A4). Η κινητική μελέτη της CK διεξήχθη με HLMs. Ένα μίγμα 0.2 κ.εκ. επώασης που συνίστατο από CK (ως υπόστρωμα), οι HLMs (0,5 mg /ml) ή CYP ισομορφές (10 pmol), και ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου 0,1 Μ (ρΗ 7,4) ήταν προθερμασμένο για 5 λεπτά στους 37 ΝΤΟ. Η αντίδραση ξεκίνησε με την προσθήκη 1 mg mL νουκλεοτιδίων /triphosphopyridine (NADPH). Όλα τα αντιδραστήρια διαλύθηκαν σε μεθανόλη, και η τελική συγκέντρωση του διαλύτη σε όλες τις επωάσεις (συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων) ήταν 1%. Οι τελικές επωάσεις διεξήχθησαν σε ανακινούμενο υδατόλουτρο (37 ° C) για 30 λεπτά. Οι αντιδράσεις σταμάτησαν με την προσθήκη 0,2 mL παγωμένου ακετονιτριλίου, το οποίο περιέχει ιρβεσαρτάνης (114,9 ng /mL) ως το εσωτερικό πρότυπο. Τα δείγματα στροβιλίστηκαν για 5 λεπτά. Μετά από φυγοκέντρηση (12000 χ g για 10 min), τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν, και κλάσματα των 20 μί ενέθηκαν στο σύστημα HPLC-MS /MS για ανάλυση.

Κινητική ανάλυση των CK

Οι κινητικές παράμετροι για το μεταβολισμό των CK προσδιορίστηκαν με επώαση αυξανόμενων συγκεντρώσεων του CK (10-100 μΜ) στους 37 ° C με τα HLMs και NADPH υπό τις συνθήκες επώασης όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [14]. Η εξίσωση της ταχύτητας αντίδρασης CK (

V

) στις HLMs ή ισομορφών CYP εκφράζεται ως

V = (C

0

-C

t

) /

Τ

/C

p

, όπου em

C

0

και

C

t

είναι οι αρχικές και τελικές συγκεντρώσεις της CK στο διάλυμα επώασης, αντίστοιχα, Τ είναι ο χρόνος επώασης (min), και

Cp

είναι η συγκέντρωση πρωτεΐνης (mg /mL ή nmol). Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Ο μέσος ρυθμός ενδογενή κάθαρση (

CL

int

) για το

in vitro

επώασης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το

V

max

/Κ

m

.

ειδικές ισομορφών CYP ελέγχονται για το μεταβολισμό CK

για να προβάλλει την ειδική ισομορφή του CYP υπεύθυνο για το μεταβολισμό CK, προσδιορίσαμε την ανασταλτική δράση των ειδικών αναστολέων για το μεταβολισμό των CK στα HLMs όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [14]. Αναστολείς συμπεριλαμβανομένων φουραφουλίνης (για CYP1A2), τρανυλκυπρομίνη (για CYP2A6), σουλφαφαιναζόλη (για CYP2C9), κινιδίνη (για CYP2D6), χλωρομεθιαζόλη (για CYP2E1), τικλοπιδίνη (για CYP2C19), και κετοκοναζόλη (για το CYP3A4) επωάστηκαν ξεχωριστά με CK ( 50 μΜ), οι HLMs και NADPH κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης όπως αναφέρθηκε ανωτέρω.Το συγκεντρώσεις των αναστολέων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν περίπου κατά τους αντίστοιχους

IC

50

αξίες σύμφωνα με τις προηγούμενες εκθέσεις [15-18]. Τα ανασταλτικά αποτελέσματα των παραπάνω ειδικών αναστολέων για την μεταβολικό ρυθμό κάθαρσης της CK αξιολογήθηκαν ξεχωριστά για τη διαλογή των ισομορφών CYP υπεύθυνο για το μεταβολισμό CK. Η σχετική δραστικότητα των ισομορφών CYP υπολογίστηκε διαιρώντας το εμβαδόν της κορυφής του CK όταν επωάζεται με τον αναστολέα από αυτή των CK από τους αρνητικούς μάρτυρες.

Μελέτες αναστολής στο

IC

50

αποφασιστικότητα

CK (10-100 μΜ) και ένα μονό CYP ισομορφή-ειδικό υπόστρωμα (με συγκέντρωση παρόμοια με το αντίστοιχο

K

m

αξία) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η ανασταλτική δράση της CK σε συγκεκριμένα ισόμορφα CYP όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [14]. Υποστρώματα συμπεριλαμβανομένων φαινακετίνη, κουμαρίνη, τολβουταμίδιο, μετοπρολόλη, χλωρζοξαζόνη, S-μεφαινυτοϊνη, και μιδαζολάμη χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις 10, 5, 100, 7.5, 40, 100, και 5 μΜ, αντίστοιχα. Όλες οι συνθήκες επώασης ήταν οι ίδιες όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Οι ανασταλτικές επιδράσεις στα ισόμορφα CYP ερευνήθηκαν ξεχωριστά με επώαση των HLMs απουσία ή παρουσία CK. Το διάλυμα επώασης με το διαλύτη που χρησιμοποιήθηκε για να διαλύσει CK θεωρήθηκε ως αρνητικός έλεγχος, και τα διαλύματα που περιέχουν τα ειδικά αναστολείς που αναφέρθηκαν παραπάνω θεωρήθηκαν οι θετικοί έλεγχοι.

Προσδιορισμός

K

i

η

στο

IC

50

πειράματα αποφασιστικότητα, CK σημαντικά ανέστειλε το CYP2C9 και CYP3A4, ενώ η επίδραση της στην CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 και CYP2C19 ήταν ελάχιστη. Ως εκ τούτου, Dixon οικόπεδα για την αναστολή της CYP2C9 και CYP3A4 προσδιορίστηκαν με επώαση του ανιχνευτή υπόστρωμα σε πολλαπλές συγκεντρώσεις με ή χωρίς τον αναστολέα δοκιμή με τις HLMs και συμπαράγοντες. Τα δεδομένα αναστολής που λαμβάνονται από τα πιλοτικά πειράματα χρησιμοποιήθηκαν ως οδηγός για την δημιουργία των κατάλληλων συγκεντρώσεις υποστρώματος ανιχνευτή και αναστολέα δοκιμή για τον προσδιορισμό του

K

i

τιμές για κάθε ισομορφή CYP . Οι συγκεντρώσεις υποστρώματος καθετήρα ισομορφής ειδικά χρησιμοποιήθηκαν ήταν 25-200 μΜ τολβουταμίδη για το CYP2C9 και 5-50 μΜ μιδαζολάμη για CYP3A4. Οι συγκεντρώσεις της CK χρησιμοποιήθηκαν ήταν 10-100 μΜ.

Προσδιορισμός

K

i

«

Η

Σύμφωνα με την Cornish-Bowden

et al

. [19], σε οικόπεδο Dixon περιορίζεται από το γεγονός ότι δεν διακρίνει σαφώς μεταξύ ανταγωνιστικών και μικτών αναστολέων και, για μικτές ή μη ανταγωνιστικών αναστολέων, προβλέπει κανένα μέτρο του

K

i ‘

, η σταθερά διάστασης του συμπλόκου ΔΠΕ. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε S /V έναντι [Ι] οικόπεδα για να καθορίσει το

K

i ‘

τιμές για την αναστολή των CYP2C9 και CYP3A4. Όταν

K

i

& gt?

K

i

», η τομή ήταν πάνω από το [Ι] άξονα στο οικόπεδο του S /V έναντι [Ι] και κάτω από αυτό στο οικόπεδο Dixon? το αντίθετο ήταν αλήθεια αν

K

i

& lt?

K

i

«

. Στην ειδική περίπτωση όπου

K

i

=

Κι ‘

(απλό μη-ανταγωνιστική αναστολή), οι διασταυρώσεις συνέβη την [Ι] άξονα και στα δύο οικόπεδα. Οι ασυμπτωτική περιπτώσεις ανταγωνιστικών και μη ανταγωνιστικών αναστολή μπορεί να δημιουργηθεί εισάγοντας τους όρους

K

i ‘

να ∞ για ανταγωνιστική αναστολή, ή

K

i

να ∞ για μη ανταγωνιστική αναστολή [19].

Υπολογισμός της κινητικής ενζύμου και στατιστική μέθοδος

Όπως περιγράφεται λεπτομερώς προηγουμένως [14], για να καθορίσει τα κύρια ένζυμα υπεύθυνο για το μεταβολισμό της CK στο HLMs, το μεταβολικό ρυθμό κάθαρσης του διαλύματος επώασης χωρίς συγκεκριμένη αναστολέα για CK θεωρήθηκε ως 100%. Τα αποτελέσματα των ειδικών αναστολέων για την μεταβολικό ρυθμό κάθαρσης της CK αξιολογήθηκαν με SPSS μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική σε όλες τις περιπτώσεις. Οι εμφανείς κινητικές παράμετροι της CK (

K

m

και

V

max

) καθορίστηκαν με την τοποθέτηση του Michaelis- εξίσωση Menten χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism Enzyme Kinetic 5 λογισμικού Demo (GraphPad Co. Ltd, San Diego, CA, USA). Η εξίσωση εκφράζεται ως

V = V

max

[S] /(Κ

m

+ [S])

, όπου

K

m

είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος στην οποία η ταχύτητα της αντίδρασης είναι 50% των

V

max

. Για να προσδιοριστεί η αναστολή των ισόμορφων CYP, η δραστηριότητα του κάθε ισομορφής CYP υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το μεταβολικό ρυθμό κάθαρσης του αντίστοιχου ανιχνευτικού υποστρώματος της. Ο ρυθμός κάθαρσης του υποστρώματος ανιχνευτή θεωρήθηκε 100% όταν δεν υπάρχει ειδικός αναστολέας και CK προστέθηκαν στη δοκιμασία επώασης. Η

IC

50

s

προσδιορίστηκαν αναλύοντας την πλοκή του λογαρίθμου της συγκέντρωσης αναστολέα έναντι ποσοστού της δραστηριότητας που απομένει μετά την αναστολή με τη χρήση του λογισμικού SPSS για Windows (έκδοση 11.5, SPSS, Chicago, IL). Για να υπολογίσετε το

K

i

αξίες, τα δεδομένα αναστολής προσαρμόστηκαν σε διαφορετικά μοντέλα της αναστολής του ενζύμου (ανταγωνιστική, μη ανταγωνιστικός) με ανάλυση παλινδρόμησης μη γραμμικών ελαχίστων τετραγώνων χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 5 λογισμικό (GraphPad Co. Ltd),

K

i

τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση της μη γραμμικής παλινδρόμησης σύμφωνα με την εξίσωση

v =

(

V

max

S

)/(

K

m

(1+

I/K

i

)+

S

) για την ανταγωνιστική αναστολή και την εξίσωση

ν

= (

V

max

S

)/(

K

m

+

S

)(1+

I/K

i

) για μη-ανταγωνιστική αναστολή, όπου

I

είναι ένωση συγκέντρωσης,

K

i

είναι σταθερή η αναστολή,

S

είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος, και

K

m

είναι η συγκέντρωση του υποστρώματος στο μισό της μέγιστης ταχύτητας (

V

max) της αντίδρασης [20].

K

i

«αξίες

υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δευτερεύουσα πλοκή πλαγιές του S /V έναντι [Ι] [19].

Αποτελέσματα

Κινητική ανάλυση των CK

Σχήμα 2Α, 2Β και 2Γ δείχνουν το μεταβολισμό των CK μετά την επώαση με το HLMs, CYP2C9, και CYP3A4. Οι κινητικές οικόπεδα έδειξαν ότι το

K

m

και

V

max τιμές

ήταν 84.20 ± 21.92 μΜ και 0,28 ± 0.04 nmol /mg πρωτεΐνης /λεπτό για τα HLMs, 34,63 ± 10,48 μΜ και 0,45 ± 0,05 nmol /nmol P450 /λεπτό για CYP2C9, 27.03 ± 5.04 μΜ και 0,68 ± 0,04 nmol /nmol P450 /min για το CYP3A4, αντίστοιχα. Η

στο vitroCL

int

αξίες της CK στο HLMs, CYP2C9 και CYP3A4 ήταν 0,0033 mL /mg πρωτεΐνης

-1 · min

-1, 0,0130 mL /nmol P450

-1 · min

-1, και 0,0252 mL /nmol P450

-1 · min

-1, αντίστοιχα

Σημείωση:. Οι συνθήκες επώασης περιγράφεται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι. Η καμπύλη αυτόματα εφοδιασμένα με χρήση μη γραμμικής παλινδρόμησης και την εξίσωση Michaelis-Menten. Τα δεδομένα ελήφθησαν εις τριπλούν.

Η

Ειδικές ισόμορφα CYP για το μεταβολισμό των CK

Τα ανασταλτικά αποτελέσματα των ειδικών αναστολέων CYP στο μεταβολικό ρυθμό κάθαρσης του CK στους HLMs φαίνονται στο Σχήμα 3. Οι συγκεντρώσεις των φουραφουλίνης, τρανυλκυπρομίνη, σουλφαφαιναζόλη, κινιδίνη, τικλοπιδίνη, και κετοκοναζόλη ήταν 1 μΜ, με εξαίρεση χλωρομεθειαζόλης στα 5 μΜ. Οι συγκεντρώσεις επιλέχθηκαν με βάση προηγουμένως αναφερθεί

IC

50

ή

K

i

τιμές για τις ισομορφές CYP για την εξασφάλιση επαρκούς ανασταλτική επιλεκτικότητα και μέγιστη ανασταλτική δραστικότητα. Με την παρουσία του σουλφαφαιναζόλη και κετοκοναζόλη, ο μεταβολικός ρυθμός κάθαρσης (MCR) του CK μειώθηκε στα 73,5 ± 20,9% και 74,6 ± 28,1% του ότι του μάρτυρα, αντίστοιχα (Σχήμα 3). Ωστόσο, άλλοι αναστολείς δεν είχε προφανή ανασταλτικές επιδράσεις στο μεταβολισμό των CK. Οι διαλογή ένζυμα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με ανθρώπινη ανασυνδυασμένη CYPs χρησιμοποιώντας τις ειδικούς αναστολείς. Η MCRs του CK μειώθηκε στο 22.0% εκείνης του ελέγχου για το CYP2C9 και σε 13,2% εκείνου του μάρτυρα για το CYP3A4 (Σχήμα 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CYP2C9 και CYP3A4 ήταν τα κύρια ένζυμα που είναι υπεύθυνα για το μεταβολισμό των CK

in vitro

Η

Σημείωση:. Φουραφουλίνης, τρανυλκυπρομίνη, σουλφαφαιναζόλη, κινιδίνη, χλωρομεθιαζόλη, χρησιμοποιήθηκαν τικλοπιδίνη, και κετοκοναζόλη καθώς οι ειδικοί αναστολείς για CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, και CYP2C19, αντίστοιχα. Οι συνθήκες επώασης που περιγράφονται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο του τριπλού προσδιορισμών και οι ράβδοι σφάλματος. Με την παρουσία του σουλφαφαιναζόλη (1 μΜ) και κετοκοναζόλη (1 μΜ), το μεταβολικό ρυθμό κάθαρσης της CK μειώθηκε σε 73,5% και 74,6% εκείνης του ελέγχου, αντίστοιχα, ενώ οι άλλοι αναστολείς δεν είχαν σημαντικές ανασταλτικές επιδράσεις επί του μεταβολισμού του CK

η

Σημείωση:. Περίπου 50 μΜ CK επωάστηκε με τα προϊόντα ανασυνδυασμού CYP και συμπαράγοντες απουσία (έλεγχος) ή παρουσία των αναστολέων με σουλφαφαιναζόλη (1 μΜ) και κετοκοναζόλη (1 μΜ), αντίστοιχα. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το μέσο όρο των εις τριπλούν επωάσεων. Η MCRs της CK ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με αυτά του ελέγχου για το CYP3A4 και CYP2C9.

Η

Εκτίμηση του

IC

50

s

η

τα ανασταλτικά αποτελέσματα των πολλαπλών συγκεντρώσεων CK (10-100 μΜ) επί της δράσεως της κάθε ισομορφής CYP καθορίζεται από το μεταβολισμό του μία μόνη συγκέντρωση του ισομορφής-ειδικού ανιχνευτή ελέγχθηκαν με τις HLMs (ή εξέφρασε CYPs όταν χρειάζεται). CK έδειξε την ισχυρή αναστολή του CYP2C9 (τολβουταμίδη 4-υδροξυλίωση) και CYP3A4 (μιδαζολάμη 1-υδροξυλίωση) (Σχήμα 5), με το

IC

’50

των 16,00 μΜ και 9,83 μΜ , αντίστοιχα. Η ανασταλτική επίδραση του CK στη δραστηριότητα των CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 και CYP2C19 ήταν αμελητέα

Σημείωση:. Οι συνθήκες επώασης που περιγράφονται στην ενότητα υλικά και μέθοδοι. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο όρο της τριπλής προσδιορισμών και οι ράβδοι σφάλματος.

Η

Εκτίμηση του

K

i

τιμές

Για το CYP2C9 , η

K

i

τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τολβουταμίδη ως υπόστρωμα καθετήρα. Η

V

max

και

K

m τιμές

υπολογίζεται χρησιμοποιώντας ένα μη γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης για την ανταγωνιστική αναστολή του ενζύμου της CYP2C9 καταλυθείσες τολβουταμίδη 4-υδροξυλίωση στις HLMs, οι αντιπροσωπευτικές οικόπεδα Lineweaver-Burk (Σχήμα 6) και η δευτερεύουσα πλοκή της δραστηριότητας του CYP2C9 χρησιμοποιώντας τις πλαγιές των πρωτογενών οικοπέδων Lineweaver-Burk σε σχέση με τις συγκεντρώσεις της CK δείχνουν ότι

K

i

του CK ήταν 14,92 μΜ (Σχήμα 7) [20]. Οι αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις Dixon της επίδρασης της CK στο τολβουταμίδης σχηματισμό 4-υδροξυλίωση και S /V έναντι [Ι] οικόπεδα (Σχήμα 6) προτείνει ότι τα δεδομένα αναστολής ταιριάζουν καλά σε ένα μεικτό τύπο της αναστολής [19]. Για το CYP3A4, η

K

i

τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μιδαζολάμη ως υπόστρωμα καθετήρα. Η

V

max

και

K

m τιμές

υπολογίζεται χρησιμοποιώντας ένα μη γραμμικό μοντέλο παλινδρόμησης για την ανταγωνιστική αναστολή του ενζύμου του CYP3A4 -καταλυόμενη μιδαζολάμη 1-υδροξυλίωση στους HLMs (Σχήμα 8). Τα αντιπροσωπευτικά οικόπεδα Lineweaver-Burk (Σχήμα 8) και η δευτερεύουσα πλοκή της δραστηριότητας του CYP2C9 χρησιμοποιώντας τις πλαγιές των πρωτογενών οικοπέδων Lineweaver-Burk σε σχέση με τις συγκεντρώσεις της CK δείχνουν ότι

K

i

του CKvalues ​​ήταν 11,42 μΜ (Σχήμα 9) [20]. Οι αντιπροσωπευτικές γραφικές παραστάσεις Dixon της επίδρασης της CK στο σχηματισμό μιδαζολάμη 1-υδροξυλίωση και S /V έναντι [Ι] οικόπεδα (Σχήμα 8) έδειξε ότι τα δεδομένα αναστολής ταιριάζουν καλά σε ένα μη ανταγωνιστικό αναστολή [19].

Η σημεία δεδομένων είναι οι μέσες τιμές των εις τριπλούν επωάσεων. . Φυματίωση, τολβουταμίδη

Η

Σημείωση: Μη γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης της τολβουταμίδης 4-υδροξυλίωση σε σχέση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος διεξήχθη για να ληφθεί η

K

i

αξίες. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο τριπλών προσδιορισμών

Η

Σημείωση:. Η αναστολή της δραστικότητας του CYP3A4 περιγράφεται καλύτερα ως μια μη-ανταγωνιστική αναστολή με διαφορετικές συγκεντρώσεις του CK (10-100 μΜ) σε επωάσεις HLM (0,5 mg · mL

-1 πρωτεΐνη). Τα σημεία δεδομένων είναι οι μέσες τιμές των εις τριπλούν επωάσεων. . MDZ, μιδαζολάμη

Η

Σημείωση: Μη γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης της CK έναντι της συγκέντρωσης του υποστρώματος διεξήχθη για να αποκτήσετε το

K

i

τιμές. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει τον μέσο όρο των τριπλών προσδιορισμών.

Η

Συζήτηση

Επί του παρόντος, η ταυτόχρονη χρήση CAM και θεραπευτικά φάρμακα είναι δημοφιλείς. CAM έχει τη δυνατότητα να προκαλέσει φαρμακοκινητικές και δυναμικές αλληλεπιδράσεις με θεραπευτικά φάρμακα. Επομένως, οι μειωμένη ή αυξημένα επίπεδα αυτών των φαρμάκων στο πλάσμα θα μπορούσε να οδηγήσει σε χαμηλότερη θεραπευτική αποτελεσματικότητα ή υψηλότερο κίνδυνο τοξικότητας [9, 10]. Ειδικά για αντικαρκινικά φάρμακα, τα οποία έχουν στενό θεραπευτικό, φαρμακοκινητικές αλληλεπιδράσεις θα μπορούσε εύκολα να οδηγήσει σε κλινικά σημαντικές επιδράσεις [9]. CK είναι ένα CAM που έχει μια μελλοντική εφαρμογή για τη θεραπεία του καρκίνου [5-7]. Ως εκ τούτου, η διαλογή των ενζύμων που μεταβολίζουν το φάρμακο του CK μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες για την αποφυγή αλληλεπιδράσεων CK-φάρμακα.

Ο CYP υπεροικογένεια περιλαμβάνει σημαντική φάση Ι ένζυμα που μεταβολίζουν το φάρμακο που οξειδώνουν περισσότερο από το 90% των σημερινών θεραπευτικών φαρμάκων. Πάνω από το 90% της οξείδωσης της ανθρώπινης φαρμάκου μπορεί να αποδοθεί στο CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP 2C19, CYP2E1, CYP2D6 και CYP3A4 [12]. Φάρμακα που ανταγωνίζονται με το ίδιο ένζυμο μεταβολισμού μπορεί να οδηγήσει σε αλληλεπιδράσεις φαρμάκου-φαρμάκου, με αποτέλεσμα αλλαγμένη αποτελεσματικότητα ή τοξικότητα σε άτομα [13].

Στην παρούσα μελέτη, τα δεδομένα μας πρότεινε ότι CYP2C9 και CYP3A4 ήταν τα κύρια ένζυμα που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των CK

in vitro

, όχι τα υποστρώματα του CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1 και CYP2C19. Επιπλέον, η μελέτη μας έδειξε ότι το CYP2C9 και CYP3A4 ήταν ευαίσθητα στην αναστολή από CK, και τους

IC

50

valueswere 16,00 μΜ και 9,83 μΜ, αντίστοιχα. CYP1A2, CYP2A6, CYP2D6, CYP2E1, και CYP2C19 ήταν δύσκολα ευαίσθητη στην αναστολή της CK (

IC

’50

ήταν όλες μεγαλύτερες από 100 μΜ). Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζονται εν μέρει από τη μελέτη του Hao et al. (2008), ότι ginsenosides, Rh2, CK, και όλα τα σαπωγενινών παρουσίασαν μέτρια αναστολή του CYP3A4 στο baculosomes. Σύμφωνα με Κονγκ

et al

[21], η δραστικότητα μιας ένωσης μπορεί να ταξινομηθεί σύμφωνα με τους

IC

50

αξίες, ως ισχυροί, εάν

IC

50

≤ 20 μg /mL ή ≤10 μΜ? μέτρια, εάν

IC

50

20-100 μg /mL ή 10-50 μΜ? ή αδύναμη, εάν

IC

50

≥100 μg /mL ή ≥50 μΜ. CK έχει ταξινομηθεί ως ένας ισχυρός αναστολέας του CYP3A4, μέτριος αναστολέας του CYP2C9, και ένας ασθενής αναστολέας των άλλων πέντε CYPs εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη.

CYP2C9 είναι ένα από τα πιο άφθονα ένζυμα CYP (περίπου 20% του η ηπατική συνολική περιεκτικότητα CYP) [22]. Είναι μεταβολίζει έναν αριθμό σημαντικών κλινικών φαρμάκων, συμπεριλαμβανομένων των αντι-καρκίνου, αντιβιοτικό, αντι-διαβητικό, αντι-επιληπτικά, αντι-υπερτασικά, αντι-πηκτική, και αντι-υπερλιπιδαιμικοί φάρμακα [23]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το CYP2C9 μεσολάβηση του μεταβολισμού των φαρμάκων με στενό θεραπευτικό δείκτη, όπως η βαρφαρίνη και η φαινυτοΐνη [24]. Ως εκ τούτου, σε ανταγωνισμό με το μεταβολισμό CYP2C9 μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρή τοξικότητα. CYP3A4 είναι ένα σημαντικό κυτοχρώματος P450 σε ανθρώπινο ήπαρ που έχει ευρεία υποστρώματα [25]. CYP3A4 μεταβολίζει όχι μόνο ξενοβιοτικών, συμπεριλαμβανομένης της πλειοψηφίας των φαρμάκων και καρκινογόνες ουσίες, αλλά και πολλές ενδογενείς ενώσεις, όπως χοληστερόλη, χολικά οξέα, λιπαρά οξέα, προσταγλανδίνες, λευκοτριένια, ρετινοειδή, και βιογενών αμινών, και ως εκ τούτου πιο φαρμακοκινητικές αλληλεπιδράσεις CAM-φαρμάκου περιλαμβάνουν CYP3A4 [26]. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η CK είναι ένας αναστολέας τόσο CYP2C9 και CYP3A4. Ως εκ τούτου, οι ασθενείς που χρησιμοποιούν CK σε συνδυασμό με συμβατικά θεραπευτικά φάρμακα που είναι υποστρώματα των CYP2C9 και CYP3A4 για διαφορετικούς λόγους θα πρέπει να είστε προσεκτικοί.

Ωστόσο, σε αντίθεση με τους ειδικούς αναστολείς του CYP2C9, το

IC

50

και Κ

i

αξίες της CK ήταν 11-53 φορές και 49 φορές υψηλότερες από εκείνες των σουλφαφαιναζόλη στο HLMs, αντίστοιχα [15, 16]. Για το CYP3A4, το

IC

50

και Κ

i

αξίες της CK ήταν 41-123 φορές και 761 φορές υψηλότερη από ό, τι εκείνα της κετοκοναζόλης σε HLMs, αντίστοιχα [17]. Η ισχυρή αναστολή της CK ήταν φτωχότερη από εκείνη των αναστολέων ενζύμου-ειδική. Πιθανώς, η αναστολή της δραστικότητας των CK είναι πολύ χαμηλή για να προκαλέσει σημαντικά κλινικά CYP2C9 και αναστολή του CYP3A4. Σημειώστε ότι στην άλλη μελέτη μας πραγματοποιείται σε υγιείς εθελοντές, 10 υγιείς άρρενες εθελοντές έλαβαν χορηγήσεις 800 mg δισκία καθαρού CK (100 mg /δισκίο, που παρέχονται από Zhejiang Hisun Pharmaceutical Company Limited, Κίνα) καταποθούν από 150 mL νερού, στη συνέχεια σειρά δείγματα φλεβικού αίματος 5 ml συλλέχθηκαν σε σωλήνες που περιέχουν EDTA σε 0, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72 και 96 ώρες. Τα δείγματα πλάσματος αναλύθηκαν με HPLC-MS /MS, η μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα (C

max) και ο χρόνος έως τη μέγιστη συγκέντρωση στο πλάσμα (Τ

max) ήταν άμεσα ελήφθησαν από τα παρατηρούμενα δεδομένα συγκέντρωσης-χρόνου. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκεντρώσεως πλάσματος-χρόνου (AUC) από το χρόνο μηδέν να διαρκέσει μετρούμενη συγκέντρωση (AUC

(0-t)) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον γραμμικό τραπεζοειδή κανόνα, η εκτίμηση του στόματος κάθαρση (CL /F) ήταν υπολογίζεται ως CL /F = Δόση /AUC

(0-t) [27]. Τα αποτελέσματα έδειξαν την C

max της CK ήταν 4,07 μΜ (95% CI: 2,89, 5,24). Το C

max της CK κάποιων εθελοντών βρέθηκαν να είναι κοντά στο 5 μΜ μέσω μίας ημέρας συμπλήρωση των 800 mg, η οποία είναι κοντά στο

IC

50

και

Κι

τιμές της CK για CYP2C9 και CYP3A4 (Σχήμα 10). Έτσι, ακόμα προειδοποιούν ενάντια αλληλεπίδραση CK-φάρμακο παρά ηπιότητα του.

Ένθετο απεικονίζει τα ίδια δεδομένα σε ημιλογαριθμικό κλίμακα, κάθε τιμή είναι η μέση τιμή ± SD.

Η

Ευχαριστίες

Χάρη σε Zhejiang Hisun Φαρμακευτική Εταιρεία Λίμιτεδ (Zhejiang, Κίνα) για την παροχή της ένωσης Ginsenoside K. το ερευνητικό έργο χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (Επιχορηγήσεις 81302850, 81300204, 31400306)? το Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός Επιστημών της Κίνας (Επιχορηγήσεις 2013M531817, 2014T70793)? και οι Επιστήμης και Τεχνολογίας Πρόγραμμα Έργων της επαρχίας Χουνάν (Grant 2014RS4011). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.