Αφηρημένο

4-μεθυλθειοβουτυλ ισοθειοκυανικό (MTBITC), ένα αλειφατικό, θειικό ένωση από το

Brassica

λαχανικά, κατέχει

in vitro

και

in vivo

αντικαρκινική δράση. Πρόσφατα δείξαμε την ισχυρή δυναμικό αναστολής αύξησης του DNA παράγοντα βλάβης MTBITC σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του ήπατος. Εδώ μπορούμε να δείξουμε τώρα ότι MTBITC ρυθμίζει προς τα κάτω την τελομεράση που ευαισθητοποιεί τα κύτταρα στην επαγωγή της απόπτωσης. Αυτό προκαλείται από την ενεργοποίηση ΜΑΡΚ, αλλά ανεξάρτητα από την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Μέσα σε μία ώρα, MTBITC προκαλούμενη βλάβη του DNA σε κύτταρα καρκίνου που σχετίζεται με μία παροδική αύξηση της έκφρασης hTERT mRNA το οποίο στη συνέχεια μετατράπηκε σε καταστολή τελομεράσης, εμφανής στο mRNA, καθώς και το επίπεδο δραστηριότητας ενζύμου. Να διευκρινιστεί ο ρόλος της ΜΑΡΚ για τη ρύθμιση της τελομεράσης, τα καρκινικά κύτταρα ήπατος προ-επεξεργασία με ΜΑΡΚ-ειδικοί αναστολείς πριν από την MTBITC έκθεσης. Αυτό έδειξε καθαρά ότι παροδική αύξηση της έκφρασης hTERT mRNA ήταν κατά κύριο λόγο διαμεσολαβείται από το μέλος της οικογένειας ΜΑΡΚ JNK. Αντίθετα, ενεργοποιείται ERK1 /2 και P38, αλλά όχι JNK, επισημαίνεται κατάργηση της τελομεράσης και επαγωγή επακόλουθη απόπτωση. βλάβη του DNA από MTBITC επίσης έντονα καταργήθηκε με αναστολή ΜΑΡΚ. Το οξειδωτικό στρες, όπως αναλύθηκε με τη δοκιμασία φθορισμού DCF, φασματοσκοπία συντονισμού spin ηλεκτρονίου και το σχηματισμό της 4-hydroxynonenal βρέθηκε ως μη σημαντικές για τη διαδικασία αυτή. Επιπλέον, η Ν-ακετυλοκυστεϊνη προεπεξεργασία δεν είχε επίδραση MTBITC επαγόμενη καταστολή ή αποπόλωση του δυναμικού μιτοχονδριακής μεμβράνης ως δείκτη για την απόπτωση τελομεράσης. Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι κατά βλάβες του DNA από MTBITC, ΜΑΡΚ είναι απαραίτητα για τη ρύθμιση της τελομεράσης και η συνακόλουθη ανεπάρκεια της ανάπτυξης σε κύτταρα όγκου ήπατος και αυτή η λεπτομέρεια παίζει πιθανώς ένα σημαντικό ρόλο στην κατανόηση του δυναμικού χημειοθεραπευτική αποτελεσματικότητα του ITC

Citation.: Lamy E, Herz C, Lutz-Bonengel S, Hertrampf Α, Márton MR, Mersch-Sundermann V (2013) Η ΜΑΡΚ Διαδρομή Σήματα τελομεράση Διαμόρφωση σε απάντηση ισοθειοκυανική-Induced βλάβες στο DNA των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του ήπατος. PLoS ONE 8 (1): e53240. doi: 10.1371 /journal.pone.0053240

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Ιούλ του 2012? Αποδεκτές: 27 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 31, Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Lamy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ε.Ι. χρηματοδοτείται από μια ακαδημαϊκή επιχορήγηση από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Fond και το Υπουργείο Επιστημών, Έρευνας και Τεχνών Baden-Württemberg, Γερμανία. Μ-R. Μ. εν μέρει χρηματοδοτήθηκε για το έργο αυτό με τις τομεακές Επιχειρησιακού Προγράμματος «Ανάπτυξη Ανθρώπινου Δυναμικού 2007-2013» του Υπουργείου Εργασίας, Οικογένειας και Κοινωνικής Προστασίας της Ρουμανίας μέσω της Χρηματοοικονομικής Συμφωνίας POSDRU /88 /1.5 /S /60203. Η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση από Mattern Ιδρύματος, Γερμανία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η τελομεράση παρέχει έναν υποσχόμενο στόχο για μια

επιλεκτική

θεραπευτική προσέγγιση των κακοηθειών σε αυτό το 80 έως 90% των καρκινικών κυττάρων σταθερά (επαν) εκφράζουν το ένζυμο αυτό, ενώ καταστέλλεται στους περισσότερους φυσιολογικούς σωματικούς ιστούς [ ,,,0],1]. hTERT, η καταλυτική υπομονάδα του ενζύμου, είναι γνωστό ότι ασκούν αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα και να αλληλεπιδρούν με την οδό του DNA απόκριση βλάβη. Κατά συνέπεια τα καρκινικά κύτταρα είναι περισσότερο ανθεκτικά έναντι χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή την ακτινοθεραπεία [2], [3], [4], [5].

Τα ισοθειοκυανικά (ITC), που απαντούν στη φύση δευτερογενή συστατικά των φυτών της οικογένειας

Brassicaceae,

είναι γνωστά για χημειοπροληπτικές τους και Θεραπευτικές δράσεις τόσο

in vitro

και

in vivo

[6], [7], [8]. Ένας αριθμός μελετών ανέφερε την ανάπτυξη καταστολή και την απόπτωση που επάγουν δραστικότητα αυτής της ομάδας σε καρκινικά κύτταρα και υποκείμενα μονοπάτια σηματοδότησης ερευνήθηκε [9]. ITC έχει αποδειχθεί ότι παρεμβαίνει με πολλούς παράγοντες που έχουν αλλοιωθεί σε καρκινικά κύτταρα όπως αλληλεπίδραση με την οικογένεια Bcl-2 αλλά έχουν επίσης δειχθεί ότι μειώνουν επιλεκτικά την HDAC δραστικότητα [10]. Πρόσφατα ITC εμφανίζονται ως ισχυροί αναστολείς της τελομεράσης κατά την επαγωγή απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα διαφόρων [11], [12], [13], [14]. Η σουλφοραφάνη (SFN), e. σολ. κατέστειλε τελομεράσης κατά την διάρκεια της αναστολής του πολλαπλασιασμού του MCF-7 καθώς και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού [11]. Η τελομεράση κατάργηση από SFN ή φαινυλαιθυλ ITC επίσης συσχετίστηκε με προγραμματισμένο θάνατο σε HeLa του τραχήλου της μήτρας, καθώς και PC-3 προστάτη καρκινικά κύτταρα [13], [14]. SFN ανέστειλε επιπλέον τελομεράσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα Hep3B ήπατος που παραλληλίζεται προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο [12]. Αυτή η αναστολή στη συνέχεια προτείνεται να διαμεσολαβείται από την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Άλλες μελέτες έχουν δείξει μέχρι τώρα ότι το οξειδωτικό στρες και την ενεργοποίηση του (ΜΑΡΚ) σηματοδότησης που ενεργοποιείται από μιτογόνο συμμετείχαν στη δολοφονία των καρκινικών κυττάρων από ITC [15]. Ωστόσο, τα στοιχεία που δημοσιεύτηκαν μέχρι στιγμής υποδηλώνουν ότι ROS εξάρτηση του κυτταρικού θανάτου, καθώς και η συμμετοχή ΜΑΡΚ θα μπορούσε να είναι συγκεκριμένο κελί.

Σε προηγούμενες μελέτες, έχουμε ήδη αποδείξει την αποτελεσματική απομείωση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του ήπατος από την ITC [16]. Εμείς έτσι αποσκοπούν στην παρούσα μελέτη για τη διερεύνηση της συνάφειας της ενεργοποίησης ΜΑΡΚ και οξειδωτικού στρες για κυτταρικό θάνατο και τη ρύθμιση της τελομεράσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του ήπατος. Γι ‘αυτό χρησιμοποιείται τελομεράση κυτταρικές σειρές θετικές HCC (HepG2, Huh7 και Hep3B) διαφέρουν στο ογκοκατασταλτικό τους p53 (TP53) κατάσταση όπως και τα πρωτογενή υγιή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα, στερείται της τελομεράσης. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν την ενεργοποίηση όλων των τριών ΜΑΡΚ (JNK, ERK1 /2 και Ρ38) δια κατεργασίας MTBITC ανεξάρτητα από την ΤΡ53 ή κατάσταση κακοήθεια των κυττάρων. Θα μπορούσαμε να δείξουμε επιπλέον ότι η απομείωση της ανάπτυξης, καθώς και οι αλλαγές στο επίπεδο της τελομεράσης σηματοδοτήθηκε από ΜΑΡΚ, αλλά δεν σχετίζονται με την παραγωγή ROS. βλάβες στο DNA που προκαλούνται από MTBITC ανεστάλη στα κύτταρα όταν ΜΑΡΚ είχαν αποκλειστεί ρητά.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC), menadione, 2 ‘, 7 «διχλωροφθορεσκεϊνης diacetat (DCF-DA), δεξαμεθαζόνη, Tween® 20, το βενζο [a] πυρένιο (B (a) P και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) αποκτήθηκαν από την Sigma Aldrich (Steinheim, Γερμανία) DMSO (καθαρότητα & gt?. 99% ) ήταν από Applichem (Darmstadt, Germany). β-μερκαπτοαιθανόλη και βαλινομυκίνη αγοράστηκε από την Fluka (Buchs, Swiss). Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM), ορό εμβρύου μόσχου (FCS), θρυψίνη 10 Χ (25 mg /ml), θρυψίνη-ΕϋΤΑ 10 × (5 mg /ml, αντίστοιχα 2,2 mg /ml), L-γλουταμίνη και ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα φωσφορικών (PBS, χωρίς Ca και mg) ήταν από ΡΑΑ Laboratories GmbH (Coelbe, Germany). Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (P /S) διάλυμα, RPMI-1640, 5,5 ‘, 6,6′-τετραχλωρο-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine ιωδίδιο (JC-1), ινσουλίνη-τρανσφερίνης-Selen (ITS) και SYBR χρυσό 10.000 × ήταν από τις τεχνολογίες της ζωής Invitrogen (Darmstadt, Γερμανία) ,. 4-Hydroxynonenal (ΗΝΕ) αγοράστηκε από την Cayman Ευρώπη (Ταλίν, Εσθονία). 4-μεθυλθειοβουτυλ ισοθειοκυανικό (MTBITC, erucin) συντέθηκε από το Ινστ. Οργανικής Χημείας, Πανεπιστήμιο του Giessen, Γερμανία, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

Το p38 αναστολέα SB203580, αναστολέα JNK SP600125 και αναστολέα JNK V αγοράστηκαν από την Santa Cruz, (Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Η ERK1 /2 αναστολέα U0126, αναστολέα ρ38 SB202190 και ERK1 /2 αναστολέα PB98059 ελήφθησαν από την Cell σηματοδότηση (Boston, USA). Τα ακόλουθα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκηλίδωση: anti-ρ-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr201, 1:2000), αντι-ρ-ΙΝΚ (Thr 183 /Tyr185, 1:2000, κλώνος G9), αντι-pc-Jun Ser73 και αντι-p-p38 (Thr180 /Tyr182, 1:500) από την Cell σηματοδότηση, αντι-4-Hydroxynonenal (1:250? κλώνος 198960) από την R &? D Systems Europe (Abingdon, Αγγλία) και αντι-β-ακτίνης (1:10000, κλώνο AC-74) από την Sigma Aldrich. Η υπεροξειδάση (HRP) δευτερεύοντα αντισώματα αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού αγοράστηκαν από την Cell σηματοδότηση. Νερό χωρίς νουκλεάση ήταν από την Qiagen (Hilden, Germany). Caspase 3/7 αντιδραστήριο GLO ήταν από την Promega (Mannheim, Germany). MTBITC, μεναδιόνη και ο ΜΑΡΚ αναστολείς διαλύθηκαν σε αποστειρωμένο DMSO. ΗΝΕ διαλύθηκε σε αιθανόλη.

HCC Κυτταρικές Γραμμές

HepG2 (wt-p53) και Hep3B (null-p53) κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την Γερμανική Συλλογή Μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών (DSMZ) , Braunschweig, Γερμανία. κύτταρα Huh-7 (mut-p53) που αρχικά ιδρύθηκε από Nakabayashi et al. [18] ήταν ευγενική προσφορά από τον H. Blum (University Medical Center Freiburg, Γερμανία). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε χαμηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 15% (HepG2) ή 10% (Huh7, Hep3B) FCS και 1% Ρ /δ σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C μέχρι 70% συρροής και στη συνέχεια συλλέχθηκαν με τρυψίνη. επαλήθευση γραμμή κυττάρων έγινε με μικροσκόπιο τον έλεγχο της μορφολογίας των κυττάρων και την πραγματοποίηση ανάλυσης καμπύλη ανάπτυξης σε τακτική βάση. Μόνο τα κύτταρα σε αριθμό πέρασμα τέσσερα να χρησιμοποιούνται οι δέκα. Η κυτταρική καλλιέργεια, επιπλέον, βρέθηκαν αρνητικά για τη μόλυνση του μυκοπλάσματος.

Πρωτοβάθμια ανθρώπινα ηπατοκύτταρα

Κανονική ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν μέσα σε 2 ώρες από το υλικό που λαμβάνονται από ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε μερική ηπατεκτομή και από ποιον προηγούμενη γραπτή συγκατάθεση είχε έχουν ληφθεί. Αυτό το μέρος είχε εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Freiburg. Η αξιολόγηση της μη νεοπλασματικών ηπατικό παρέγχυμα διεξήχθη από έναν ανώτερο παθολόγο με εμπειρία στο ήπαρ παθολογία. Τα ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας την τεχνική δύο σταδίων διάχυση κολλαγενάσης σύμφωνα με ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο από Guguen-Guillouzo

et al.

[19] και Strom

et al.

[20]. Τα κύτταρα στη συνέχεια τελικά επαναιωρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 15% FCS, 2 mM L-γλουταμίνη 1% Ρ /δ, 1% ITS, 100 ηΜ δεξαμεθαζόνης και καλλιεργούνται σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C για 20 ώρες.

Προσδιορισμός της επίδρασης Φαρμάκου

αποτέλεσμα φαρμάκου δοκιμάστηκε σε πρώιμα περάσματα (P4-P10). Για τα πειράματα, τα κύτταρα σπάρθηκαν, συμπληρωμένο με μέσο καλλιέργειας και επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Μετά από αυτό, τα κύτταρα ταπήτιο εκτέθηκαν σε MTBITC επί 1 έως 48 ώρες και στη συνέχεια σε επεξεργασία για τους προσδιορισμούς. Σε μερικά πειράματα, ταπήτιο κύτταρα προ-επεξεργασία με το αντιοξειδωτικό Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) σε συγκεντρώσεις μεταξύ 1,25 μέχρι τα 10 mM για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν σχολαστικά με PBS πριν από την προσθήκη MTBITC για άλλες 24 ώρες και ακόλουθη παρασκευή του προσδιορισμού. Σε άλλα πειράματα, συρρέοντα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-αγωγή επί μία ώρα με ειδικούς αναστολείς ΜΑΡΚ, είτε 10 μΜ SB203580, 2.5 μΜ ή 5 μΜ SP600125 ή 40 μΜ PB98059 ή προ-επεξεργασία για 2 ώρες με 10 μΜ U0126, 20 μΜ JNK αναστολέα V ή 20 μΜ SB202190. Ένας συνδυασμός αναστολέων δοκιμάστηκε επίσης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν σχολαστικά με PBS πριν από την προσθήκη MTBITC ή 0.1% DMSO ελέγχου ως διαλύτη και ακόλουθη παρασκευή του προσδιορισμού.

απλού κυττάρου Gel Electrophoresis (SCGE) Δοκιμασία

Η δοκιμασία SCGE επίσης γνωστή ως κομήτη δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [21]. Το DNA% Tail υπολογίσθηκε ως δείκτης της βλάβης του DNA. Για κάθε δείγμα, 102 συστηματική διαλογή κύτταρα αξιολογήθηκαν.

Περιεχόμενο SubG1 DNA και του κυτταρικού κύκλου διανομής

κυτταρικό περιεχόμενο DNA μετρήθηκε μετά διαπερατότητας των κυττάρων που συλλέγονται HCC από στερέωση με 70% παγωμένης αιθανόλης για τουλάχιστον 24 ώρες και χρώση του DNA με κύριο PI μείγμα (/ml ιωδιούχου προπιδίου 40 μg, 100 μg /ml Rnase (DNase δωρεάν), PBS), επιτρέποντας την ανάλυση του ιστογράμματος συχνότητας περιεχόμενο DNA. Η ανάλυση διεξήχθη με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα FACSCalibur (BD). Η ΜΟϋΡΙΤ

© λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για deconvolute τα ιστογράμματα για να εκτιμηθούν οι αναλογίες των κυττάρων σε συγκεκριμένα στάδια του κυτταρικού κύκλου? η Cell Quest Pro

© λογισμικού FlowJo (Treestar Inc, Ashlandd, USA), το λογισμικό και χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ποσοστού των αποπτωτικών κυττάρων στο «υπο-G1″ ή «hypoploid» αιχμής.

κασπάσης 3 /7 διάσπαση Δοκιμασία

κασπάσης 3/7 διάσπαση χρησιμοποιήθηκε ως ειδική παράμετρος για την επαγωγή της απόπτωσης. Αυτό προσδιορίστηκε σε κύτταρα HepG2 με τη χρήση της ανιχνεύσεως Caspase3 /7-Glo (Promega, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Αξιολόγηση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού (ΜΜΡ)

Για την ανίχνευση αλλαγές στο ΜΜΡ στο επίπεδο του ενός κυττάρου, χρησιμοποιήθηκε το λιπόφιλο κατιόν JC-1. Τα επεξεργασμένα δείγματα συλλέχθηκαν με κατεργασία τρυψίνης, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν σε 1 ml μέσου καλλιέργειας συμπληρωμένου με τον ιχνηλάτη JC-1 σε μια τελική συγκέντρωση 2.5 μg /ml. Τα δείγματα επαναιωρήθηκαν και επωάστηκαν υπό συνθήκες κυτταρικής καλλιέργειας για 30 λεπτά. Πριν από την ανάλυση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και στη συνέχεια αναλύθηκαν απ ‘ευθείας από ένα FACSCalibur (BD, Heidelberg, Germany).

Ανίχνευση κυτταρικής γήρανσης με β-γαλακτοσιδάση Χρώση

Γήρανση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ χρώσης γήρανση β-γαλακτοσιδάσης (Cell Signaling Technology, Boston, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά τη θεραπεία των κυττάρων με MTBITC ή ελέγχει τις εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα έντονο φως μικροσκόπιο (συμπαγής 8100E σύστημα μικροσκοπίου, Keyence, Osaka, Ιαπωνία) με στόχο Σχέδιο Apo 4 × /0.2 και μία οπτική μεγέθυνσης των 4 × (Nikon, Ιαπωνία).

Protein Ανάλυση με ανοσοστύπωση

οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση μετά ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο του Burnette [22]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται από τον Bradford [23]. Για ανοσοστύπωση, 20 μg πρωτεΐνης αναμείχθηκαν με έτοιμα ρυθμιστικό δείγματος που περιέχει SDS, συμπληρωμένο με 1% β-μερκαπτοαιθανόλη. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο του Laemmli [24]. Η γέλη στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με υγρή αποτύπωση (0,7 mA /cm

2, 90 λεπτά)., Αποκλείστηκαν με 5% χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά γάλα σε TBS /Tween 0,1% και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε RT ή όλη τη νύχτα στους 4 ° C, και στη συνέχεια με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) -επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε RT, κάθε μία. Μετά την επώαση του αντισώματος, οι πρωτεΐνες που ενδιαφέρουν ανιχνεύθηκαν με τεχνική χημειοφωταύγειας. Μια ψηφιακή εικόνα της Western Blot συνελήφθη από το σύστημα τεκμηρίωσης τζελ Μοριακής Imager® ChemiDoc ™ XRS sytem (Bio-Rad, Μόναχο, Γερμανία). προσεγγίσεις Μέγεθος ελήφθησαν με σύγκριση των χρωματισμένες ζώνες με εκείνη ενός προτύπου πρωτεΐνης φορτώνεται κατά την ηλεκτροφόρηση. Η διαδικασία επαναλήφθηκε για την δομική πρωτεΐνη β-ακτίνης. Η ποσότητα πρωτεΐνης-στόχου θα μπορούσε στη συνέχεια να αναπροσαρμόζονται στο δομική πρωτεΐνη για τον έλεγχο μεταξύ των ομάδων.

Η τελομεράση μέτρηση δραστικότητας με TRAP-Δοκιμασία

δραστικότητα τελομεράσης ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας το TeloTAGGG ELISA Kit, εμπορικά διαθέσιμο από την Roche (Mannheim, Germany). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε μετά από τις οδηγίες του κατασκευαστή με ελαφρές τροποποιήσεις. Για ολόκληρο προϊόντα λύσης πρωτεΐνης κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο κύτταρο λυτικό από την Sigma Aldrich περιέχει 10 mM PSMF και 5 mM βητα-μερκαπτοαιθανόλης για 30 λεπτά στους 4 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε μετά τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Bradford [23]. Για την αντίδραση της τελομεράσης, ένα συνολικό όγκο αντίδρασης 50 μΙ με ίσες ποσότητες πρωτεΐνης και 2 × TeloTAGGG μείγμα αντίδρασης επωάστηκε στους 25 ° C για 20 λεπτά ακολουθούμενη από μετουσίωση στους 94 ° C, 5 λεπτά, 30 κύκλους (στους 94 ° C για 30 s, στους 50 ° C για 30 s, και στους 72 ° C, 90 s). Τελική επιμήκυνση διεξήχθη στους 72 ° C, 10 min. Ως αρνητικοί έλεγχοι, ίσο όγκο διαλύματος λύσης, νερό χωρίς νουκλεάση και απενεργοποιημένο με θέρμανση 0,1% δείγμα επεξεργασμένο DMSO (95 ° C για 5 λεπτά) χρησιμοποιήθηκαν. 5 μl ή 2,5 μΙ PCR προϊόντα χρησιμοποιήθηκαν για πρωτόκολλο ELISA σύμφωνα κατασκευαστή. 30 μΐ των προϊόντων PCR φορτώθηκαν με 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης σε ΤΒΕ /12.5% ​​πηκτή πολυακρυλαμιδίου? ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σε 50 V για 30 λεπτά και εν συνεχεία 180 V για 5-6 ώρες. Η γέλη χρωματίστηκε με 1 χ SYBR χρυσό /διάλυμα ΤΒΕ για 20 λεπτά και ανιχνεύθηκε κάτω από υπεριώδες φως. Για τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους, χρησιμοποιήθηκε 1 μg των 50 bp DNA σκάλα (Fermentas, St. Leon-Rot, Γερμανία).

Ποσοτική Real Time-PCR της πλήρους μήκους hTERT Απομαγνητοφώνηση

Το συνολικό RNA απομονώθηκε με το κιτ RNeasy μίνι Απομόνωση από Qiagen (Hilden, Germany) που ακολουθείται από ένα στάδιο καθαρισμού με τη χρήση του κιτ RNase-free DNase από την Qiagen. Η αντίστροφη μεταγραφή 1 μα ολικού RNA από κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκε σε 20 μΐ χρησιμοποιώντας το First Strand cDNA Synthesis Kit από Fermentas. Ένα θραύσμα 168 bp του hTERT cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ολιγονουκλεοτίδια στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση τέλος: αίσθηση 5’GACACCATCCCCCAGGAĆ3 (50 ηΜ) και αντινόημα 5’TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 (50 ηΜ). Ποσοτική πραγματικού χρόνου (qRT -) – αντίδραση PCR διεξήχθη σε ένα συνολικό όγκο 25 μΙ, που περιέχει Maxima SYBR Green qPCR Κύριο Μείγμα 2 × (Fermentas), ένδειξη της συγκέντρωσης του προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή και 2,5 μΐ cDNA χρησιμοποιώντας 96 φρεατίων 0,2 ml λεπτού τοιχώματος πλάκες PCR και Real time MyIQ PCR System (Bio-Rad, München, Germany). Οι συνθήκες qRT-PCR ήταν: 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 10 s, 54 ° C για 60 s. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια του σταδίου επιμήκυνσης. Στη συνέχεια μια καμπύλη τήξης διεξήχθη για να επαληθευτεί η εξειδίκευση των ζευγών εκκινητών. Για την ομαλοποίηση των ποσών, το γονίδιο αναφοράς ΡΒϋΟ με τα ακόλουθα ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν: 5’AGGATGGGCAACTGTACCTG3 αίσθηση (150 nM) και αντίθετης φοράς 5’TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 (150 nM). Ένα τμήμα 116 bp παράχθηκε. Η συγκριτική μέθοδος ct χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των σχετικών ποσοτήτων hTERT mRNA [25]. Κάθε αντίδραση qRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Ανίχνευση των ROS Παραγωγής με DCF-DA και Electron Spin Resonance Spectroscopy

Για την ανίχνευση ROS χρήση DCF-DA, MTBITC εκτεθειμένα τα κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας και αμέσως επωάζεται με DCF-DA σε συγκέντρωση 5 ηΜ για 15 λεπτά. στους 37 ° C στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, DCF φθορισμός μετρήθηκε με ένα FACSCalibur.

Για την ανίχνευση ROS χρησιμοποιώντας συντονισμό στροφορμής ηλεκτρονίου (ESR) του υψηλού κύτταρο ανιχνευτή διαπερατό σπιν 1-υδροξυ-3-μεθοξυ-καρβονυλ-2,2,5,5 χρησιμοποιήθηκε και η απήχηση σπιν των ηλεκτρονίων (ESR) φασματοσκόπιο E-Scan εξοπλισμένο με ρυθμιστή θερμοκρασίας και του φυσικού αερίου BioIII (Noxygen)? υδροχλωρική -tetramethylpyrolidine (Diagnostics GmbH, Elzach, Γερμανία ΕΜΥ, Noxygen Επιστήμη Transfer & amp). Τηρούνται αναπτυσσόμενα κύτταρα επωάστηκαν για 1 έως 6 ώρες με MTBITC, 100 μΜ μεναδιόνη ή 0.1% DMSO σε μέσο καλλιέργειας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό Krebs-HEPES συμπληρωμένο με 25 μΜ δεφεροξαμίνη (DFO) και 5 μΜ diethyldithiocarbonate (DETC, Noxygen) και επωάστηκαν με 100 μΜ CMH ιχνηλάτη σπιν σε ρυθμιστικό Krebs-HEPES για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα υπερκείμενα μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνες αντιδράσεως και διατηρείται επί πάγου. Τα φάσματα ESR μετρήθηκε σε 50 μΙ γυάλινα τριχοειδή. Μετά τη ρύθμιση μέσου χρησιμοποιήθηκαν: φούρνο μικροκυμάτων 9.772GHZ συχνότητας και ισχύος 21.120 mW, το κέρδος του δέκτη 1.00e + 003, στάδιο 0,20 μοίρες, αρμονική και τροποποιημένα πλάτους 2,32 G, η μετατροπή του καναλιού σήματος 10.240 ms, σταθερά χρόνου 40,960 ms και σαρώνουν χρόνο 5.24 s. Ο αριθμός των σαρώσεων ήταν 5 έως 20.

κυτταρομετρίας ροής και εναπόθεση μεμονωμένων κυττάρων

Single κύτταρα (HepG2) αποτέθηκαν σε ανεξάρτητα φρεάτια πλακών 96 φρεατίων (Thermo Scientific, Βόννη, Γερμανία ) χρησιμοποιώντας έναν ταξινομητή κυττάρων MoFlo (Dako, Glostrup, Δανία). Τα κύτταρα ταξινομήθηκαν με χρήση προς τα εμπρός (χαμηλή γωνία, FSC) έναντι πλευρικής σκέδασης (90 ° -scatter, SSC) σήματα για τη διάκριση μεταξύ ζώντων και νεκρών κυττάρων και τα συντρίμμια και την περιοχή του προς τα εμπρός σκέδασης έναντι πλάτος παλμού να γίνει διάκριση μεταξύ απλών κυττάρων και κυττάρων που επισυνάπτεται ο ένας στον άλλον. Δεν κύτταρα τοποθετήθηκαν σε σειρά 12, και αυτές οι κηλίδες χρησιμοποιήθηκαν για 4 PCR θετικά και αρνητικά δείγματα αναφοράς 4, αντίστοιχα.

κατεργασία των κυττάρων με UV ακτινοβολία

Οι Ανοιχτό 96 φρεατίων που περιέχουν μονά κύτταρα υποβλήθηκαν σε υπεριώδη ακτινοβολία για 10 λεπτά. χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο UV απολύμανσης. Η πηγή υπεριώδους ακτινοβολίας ήταν 30 watt Osram μικροβιοκτόνο λυχνία (UVC εκπεμπόμενη ισχύς 200-280 nm 13.4 W). Η αποτελεσματικότητα της υπεριώδους ακτινοβολίας για την καταστροφή δίκλωνο DNA προσδιορίστηκε με ενίσχυση θραυσμάτων DNA από τέσσερα μεγέθη από 143 bp έως 1337 bp.

mtDNA Amplification

Η ενίσχυση του mtDNA από επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα διεξήχθη σε πλάκες των 96 φρεατίων όπως λαμβάνεται από την τεχνική ενιαία απόθεσης κυττάρων. Σε κάθε φρεάτιο 5 μΙ PCR μάστερ μιξ που περιέχει 1 χ Advantage 2 ρυθμιστικό διάλυμα PCR (Clontech, BD Biosciences, CA, USA), 0.1 μΙ Advantage 2 μείγματος πολυμεράσης (Clontech), 200 μΜ από κάθε dNTP (Bioline, Luckenwalde, Γερμανία) και 0,4 μΜ από κάθε εκκινητή προστέθηκαν (F14816 /R16152, F16197 /R00293, F00314 /R00639 και F08294 /R08436, βλέπε πίνακα 1) (Biomers, Ulm, Γερμανία). PCR ενίσχυση πραγματοποιήθηκε σε ένα θερμικό κυκλοποιητή PTC 200 (MJ Research, Waltham, ΜΑ, USA) με τις ακόλουθες συνθήκες θερμικού κύκλου: 95 ° C για 2 λεπτά, 38 κύκλοι των 95 ° C για 15 s, 56 ° C για 30 s , 72 ° C για 90 s, που ακολουθείται από μία τελική φάση επέκτασης στους 72 ° C για 10 λεπτά. Η όλη αντίδραση έγινε ορατή κάτω από τυποποιημένες συνθήκες σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2% (50 ml αγαρόζης με 4 μλ SybrSafe (Invitrogen Carlsbad, CA), ηλεκτροφόρηση επί 25 λεπτά στους 60 V, που ακολουθείται από έκθεση σε υπεριώδες φως για 160 msec).

Ανάλυση δεδομένων

τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Graphpad Prism 5 λογισμικού (GraphPad Software Inc., LaJolla, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Η στατιστική σημαντικότητα (p ≤ 0,05, p≤0.01) της θεραπείας MTBITC στις παραμέτρους διερευνήθηκε σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος υπολογίστηκε κατά τον έλεγχο διαλύτη, 0,1% DMSO. Για να προσδιοριστεί η σημασία της ΜΑΡΚ ειδική αναστολή για τα τελικά σημεία που ερευνήθηκαν, MTBITC επεξεργασμένα δείγματα που υπολογίζεται κατά το αντίστοιχο αναστολέα επεξεργασμένο ομόλογό χρησιμοποιώντας τη μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από διόρθωση Bonferroni.

Αποτελέσματα

nDNA έχει καταστραφεί από MTBITC η οποία διεγείρει την έκφραση Παροδικές hTERT mRNA

Θα διερευνηθεί πρώτα τις ζημιές των nDNA στα κύτταρα HepG2 μετά την έκθεση MTBITC 25 μΜ. Μετά από 1 ώρα, nDNA του MTBITC-κατεργασμένων κυττάρων ήταν σημαντικά καταστραφεί, όπως προσδιορίζεται από την δοκιμασία κομήτη (Σχήμα 1Α). Αυτό συσχετίστηκε με μια γρήγορη απόκριση των κυττάρων από την άποψη της παροδικής έκφρασης mRNA hTERT όπως ανιχνεύεται μέσα σε 1 h (Σχήμα 1Β). έκφραση ΙιΤΕΚΤ mRNA ήταν πίσω στα επίπεδα ελέγχου μετά από έκθεση 6 ώρες για να MTBITC (Εικόνα 1Β) και την έκθεση των κυττάρων στην ITC για περισσότερο από 6 ώρες είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική καταστολή της μεταγραφής hTERT mRNA, το οποίο θα μπορούσε επίσης να παρατηρηθεί μακροπρόθεσμη χαμηλής δόση έκθεσης (figure1b).

α) τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 25 μΜ MTBITC ή τον έλεγχο διαλύτη (0,1% DMSO) για 1 ώρα και στη συνέχεια αναλύθηκαν για βλάβες του DNA τους, χρησιμοποιώντας το κομήτη προσδιορισμού. Το DNA% ουρά χρησιμοποιήθηκε για ποσοτικοποίηση ζημιά. Οι στήλες είναι μέσες ± SD, η = 3. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 100 μΜ βενζο (α) πυρένιο (Β (α) P) για 1 ώρα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. β) Έκφραση του πλήρους μήκους mRNA hTERT μετά από έκθεση σε MTBITC ή έλεγχος διαλύτη για 1 h έως 96 h αναλύθηκε με RT-PCR. ΡΒϋΟ χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα πειράματα ως γονίδιο αναφοράς. έκφραση mRNA υπολογίστηκε σε σχέση με τον έλεγχο διαλύτη? μπαρ είναι μέση τιμή ± SD (n = 3).

Η

MTBITC Θεραπεία προκαλεί ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ Διαδρομή

Η ΜΑΡΚ μονοπάτι μεταγωγής σήματος κατά προτίμηση ενεργοποιείται σε απάντηση στις περιβαλλοντικές και γονοτοξικό στρες και καταλαμβάνει ένα κεντρικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [26]. απομείωση της ανάπτυξης με ITC έχει αποδοθεί στην ενεργοποίηση του μονοπατιού MAPK σε διαφορετικά μοντέλα κελί πριν [27]. Ως εκ τούτου, το επόμενο διερευνήθηκε η απόκριση του ΜΑΡΚ σε καρκινικά κύτταρα του ήπατος να MTBTIC. Παρατηρήσαμε ότι σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές MTBITC θεραπεία οδήγησε σε σημαντική ενεργοποίηση των ERK1 /2 στη Thr202 /Tyr204, ΙΝΚ στο Tyr183 /Tyr185 και Thr180 P38 στο /Tyr182 με φωσφορυλίωση σε ένα χρονικό (σχήμα 2α), αλλά επίσης εξαρτάται από τη συγκέντρωση τρόπο ( Σχήμα 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε υγιείς ανθρώπινα ηπατοκύτταρα στερείται τελομεράσης, αυτή η οδός επίσης ενεργοποιημένα (Σχήμα 2C). Για να καθοριστεί εάν τότε αυτή η ενεργοποίηση αντικατοπτρίζεται από δυσλειτουργία των κυττάρων, ασχοληθήκαμε επόμενη τη βιωσιμότητα των φυσιολογικών πρωτογενών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Δ, ακόμη και μετά από 72 ώρες έκθεση σε MTBITC, καμία δυσμενή επίπτωση μπορεί να ανιχνευθεί, όπως προσδιορίζεται με μικροσκοπική παρατήρηση της μορφολογίας των κυττάρων.

Τα κύτταρα λύθηκαν και το συνολικό προϊόν λύσης υποβλήθηκε σε ανοσοκηλίδωση. α) κύτταρα HCC υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ MTBITC ή τον έλεγχο διαλύτη (0,1% DMSO) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. κύτταρα HepG2 (β) ή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (γ) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MTBITC για 3 ώρες στις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Αντιπροσωπευτικά κηλίδες εμφανίζονται. Κάθε κηλίδωση επανελέγχθηκε με αντίσωμα αντι-β-ακτίνης για να εξασφαλιστεί η ίση πρωτεΐνη φόρτωσης. δ) Πρωτοβάθμια φυσιολογικά ανθρώπινα ηπατοκύτταρα δεν επηρεάστηκαν αρνητικά από MTBITC, όπως είναι εμφανές σε αντιπροσωπευτικές εικόνες, συλλαμβάνεται από οπτικό μικροσκόπιο. SC: έλεγχος διαλύτη = 0,1% DMSO. +, Θετικός έλεγχος = 0,01% Triton Χ-100. Bar = 100 μm. Όλοι οι πίνακες έχουν την ίδια μεγέθυνση.

Η

Ο ρόλος της ΜΑΡΚ σε MTBITC μεσολάβηση τελομεράση κανονισμού

Για να προσδιοριστεί η σημασία της παρατηρούμενης ενεργοποίησης ΜΑΡΚ στη διαμόρφωση της τελομεράσης, καθώς και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εμείς προ-επεξεργασμένα κύτταρα HepG2 με αναστολέα JNK (SP600125 ή αναστολέα JNK V), αναστολέα Ρ38 (SB203580 ή SB202190), /αναστολέα ERK1 2 (U0126 ή PB98059) ή συνδυασμός, που ακολουθείται από κατεργασία με MTBITC. Η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ μέσω MTBITC σχεδόν καταργήθηκε πλήρως από την προ-επώαση με τους αναστολείς, όπως απεικονίζεται στο σχήμα 3α. Προ-επεξεργασία των κυττάρων HepG2 με είτε των αναστολέων – εκτός από την JNK αναστολέα V – απέτυχε να επηρεάσει σημαντικά MTBITC-ενεργοποιείται η έκφραση του mRNA hTERT παρατηρήθηκε μετά από 1 h (Σχήμα 3Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, ένας συνδυασμός και των τριών αναστολέων ΜΑΡΚ (SP600125, SB203580, U0126 ή SB202190, αναστολέα JNK V και U0126) μείωσε MTBITC-ενεργοποιείται ανύψωση έκφραση ΙιΤΕΚΤ mRNA (σχήμα 3β). Αυτό μπορεί κάλλιστα να οφείλεται στην αναστολή της JNK ενεργοποίησης, είτε ως προ-θεραπεία με SP600125 ή JNK αναστολέα V μόνος καταργηθεί ενίσχυση επίπεδο hTERT mRNA (σχήμα 3β). Τέλος, προσδιορίζεται η συνάφεια των ΜΑΡΚ για την καταστολή δραστικότητα του ενζύμου τελομεράση MTBITC που προκαλείται. Μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση προς τα κάτω ρύθμιση της δραστικότητας του ενζύμου ήταν ήδη εμφανής μετά από 3 ώρες έκθεση σε MTBITC, όπως εκτιμήθηκε με TRAP-ELISA (Σχήμα 3C). Αυτό θα μπορούσε να καταργηθεί με σαφήνεια από το κλείδωμα ΜΑΡΚ. Επιπλέον, με την επιλεκτική κλείδωμα ΜΑΡΚ, θα μπορούσαμε να δείξουμε ότι η p38, καθώς και ERK1 /2, αλλά δεν JNK ήταν τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για την αναστολή του ενζύμου τελομεράση από MTBITC όπως αξιολογήθηκε μετά από 24 ώρες έκθεσης (Σχήμα 3δ).

Για ειδική αναστολή της ενεργοποίησης ρ38, 10 μΜ SB203580 ή 20 μΜ SB202190, της ενεργοποίησης ΙΝΚ, 5 μΜ SP600125 ή 20 μΜ αναστολέα JNK V χρησιμοποιήθηκαν, αντίστοιχα. 10 μΜ U0126 ή 40 μΜ PB98059 χρησιμοποιήθηκαν για ERK1 αναστολή /2. Τα κύτταρα προ-αγωγή με τους αναστολείς και στη συνέχεια εκτέθηκαν σε MTBITC ή τον έλεγχο διαλύτη (0,1% DMSO). α) ανάλυση ανοσοαποτύπωσης δείχνει αποτελεσματική αναστολή των πρωτεϊνών-στόχων. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης β) Προ-επεξεργασμένα κύτταρα αναλύθηκαν για έκφραση πλήρους μήκους hTERT mRNA μετά από έκθεση 1 ώρα έως 25 μΜ MTBITC. ΡΒϋΟ χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. έκφραση mRNA υπολογίστηκε σε σχέση με τον αντίστοιχο έλεγχο διαλύτη (n = 3). γ + δ) Προ-επεξεργασμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία για δραστικότητα ενζύμου τελομεράση μετά από 3 ώρες (δ) ή 24 ώρες (ε) MTBITC έκθεση χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό TRAP-ELISA. δραστικότητα τελομεράσης υπολογίστηκε σε σχέση με την αντίστοιχη του ελέγχου διαλύτη? ράβδοι είναι μέσες ± SEM (n = 3). Αναστολείς 3 ×:. Συνδυασμός των SB203580, SP600125 και U0126

Η

Ο ρόλος της ΜΑΡΚ σε MTBITC μεσολάβηση Ανάπτυξης Εξασθένηση

Σε ένα επόμενο βήμα, επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν ΜΑΡΚ θα μπορούσε επίσης να αντιπροσωπεύουν για MTBITC επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα HepG2. Ωστόσο, όλοι οι αναστολείς ως ενιαίο συστατικό ή σε συνδυασμό απέτυχε να προστατεύσει τα κύτταρα από MTBITC μεσολάβηση G2 /M σταματήσει (σχήμα 4α). Αυτή η παρατήρηση επιβεβαιώθηκε με τη χρήση ενός συνδυασμού του δεύτερου σετ αναστολέα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Κατά τη μελέτη της απόπτωσης από subG1 DNA ανάλυση περιεχομένου, καμία σημασία των ΜΑΡΚ για MTBITC-προκάλεσε θάνατο των κυττάρων θα μπορούσε να δει (σχήμα 4β). Ωστόσο, η ποσοτικοποίηση της απόπτωσης από την άποψη του πιο ειδική διάσπαση της κασπάσης 3/7 αποκάλυψε ότι ο αποκλεισμός των τριών ΜΑΡΚ ακύρωσε σημαντικά MTBITC-σκανδαλιζόμενο κυτταρικό θάνατο. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί σε ERK1 2 σηματοδότηση /, όπως η αναστολή της ενεργοποίησης ERK1 /2 καταργούνται ισχυρά απόπτωση (Σχήμα 4Β). Για να εδραιώσει περαιτέρω τη σύνδεση της απόπτωσης και βλάβη του DNA με ΜΑΡΚ σηματοδότηση, έχουμε υπολογίσει την επίδραση των αναστολέων ΜΑΡΚ για MTBITC που προκαλείται από τα διαλείμματα σκέλος του DNA. Καθώς και οι δύο, τα κύτταρα HCC, καθώς και υγιή ηπατικά κύτταρα ενεργοποιήθηκαν στο ΜΑΡΚ σηματοδότηση τους με MTBITC, αλλά μόνο τα καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε απόπτωση, θέσαμε το ερώτημα κατά πόσον θα μπορούσε να υπάρξει μια διαφορά στο ποσό της βλάβης του DNA μεταξύ των φυσιολογικών και κακοήθων κύτταρα. Όπως απεικονίζεται στην Εικόνα 4C, τα διαλείμματα κλώνο DNA ήταν πράγματι πολύ χαμηλότερες σε υγιείς hepatocyes σε σύγκριση με κύτταρα HepG2. Όταν τα κύτταρα στη συνέχεια προ-επεξεργασία με ένα συνδυασμό και των τριών αναστολέων, η ζημιά μειώθηκε για τον έλεγχο της στάθμης (εικόνα 4γ).

Προ-επεξεργασμένα κύτταρα HepG2 εκτέθηκαν σε 25 μΜ MTBITC ή 0,1% DMSO για 24 h και στη συνέχεια παρασκευάζονται για περιεκτικότητα DNA) και β) ανάλυση περιεχομένου subG1 DNA (δείκτης για απόπτωση) χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και χρώση ΡΙ DNA Οι εικόνες απεικονίζουν αντιπροσωπευτικές ιστογράμματα περιεχόμενο DNA των κυττάρων HepG2. γ) Η κασπάση 3/7 διάσπασης χρησιμοποιήθηκε ως συγκεκριμένης παραμέτρου για επαγωγή απόπτωσης. Caspase 3/7 δραστικότητα υπολογίστηκε σε σχέση με τον αντίστοιχο έλεγχο διαλύτη? ράβδοι είναι μέσες ± SD (η = 3). δ) βλάβη του DNA στα κύτταρα HepG2 ή πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα εκτιμήθηκε μετά από έκθεση 24 ώρες για να MTBITC χρησιμοποιώντας τον κομήτη δοκιμασία. Για να συγκρίνετε μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων, βλάβης του DNA υπολογίστηκε σε σχέση με τον έλεγχο διαλύτη (SC, 0,1% DMSO). Μπαρ είναι μέση τιμή ± SD, n = 2. Αναστολείς 3 ×:. Συνδυασμός των SB203580, SP600125 και U0126

Η

ROS δεν εμπλέκονται στην MTBITC μεσολάβηση τελομεράση διαμόρφωση ή την ανάπτυξη Απομείωση

Κάποιες άλλες φυσικές ενώσεις έχουν προταθεί πρόσφατα να μεσολαβήσει καταστολή τελομεράσης σε καρκινικά κύτταρα μέσω της παραγωγής ROS [28], [29]. Επιπλέον, όπως ανάντη γεγονός για την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ και κυτταρικό θάνατο και /ή διακοπή της ανάπτυξης [15] Ένας αριθμός μελετών διερεύνησης ITC στο πλαίσιο της καταστολής της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων που προτείνει παραγωγή ROS. Στο πλαίσιο της μελέτης μας, ως εκ τούτου, προσπάθησαν να μάθετε αν ROS εμπλέκονται στη ρύθμιση της τελομεράσης από MTBITC ή θα μπορούσαν να δράσουν ως τελεστές κυτταρικό θάνατο. Η ενδοκυτταρική ROS σε ελέγχου-και MTBITC-επεξεργασμένα κύτταρα αρχικά εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση των προσκολλημένων αναπτυσσόμενων κυττάρων HepG2 με H

2DCFDA. Μέσα σε μία ώρα από MTBITC έκθεσης, καμία αλλαγή στο επίπεδο ROS μπορούσε να ανιχνευθεί (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).