Αφηρημένο

Μοριακή στοχευμένη θεραπεία έχει δείξει υπόσχεση ως θεραπεία για προχωρημένο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) . Sorafenib, ένας αναστολέας πολλαπλών κινασών, έλαβε πρόσφατα έγκριση του FDA για τη θεραπεία του προχωρημένου ΗΚΚ. Ωστόσο, αν και το sorafenib είναι καλά ανεκτή, η ανησυχία για την ασφάλεια του έχει εκφραστεί. Celecoxib (Celebrex®) είναι ένας επιλεκτικός την κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2) αναστολέα η οποία επιδεικνύει αντικαρκινική δράση στα ανθρώπινα κύτταρα HCC. Η παρούσα μελέτη εξέτασε την αλληλεπίδραση μεταξύ celecoxib και sorafenib σε δύο κυτταρικές γραμμές όγκου ανθρώπινου ήπατος HepG2 και Huh7. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι κάθε αναστολέα μόνο μείωσε την ανάπτυξη των κυττάρων και τον συνδυασμό της celecoxib με sorafenib συνεργιστικά ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και αυξημένη απόπτωση. Για την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την συνεργιστική αντικαρκινική δράση του συνδυασμού, ερευνήσαμε το προφίλ έκφρασης του συνδυασμού επεξεργασμένου καρκινικές κυτταρικές σειρές του ήπατος χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών. Η θεραπεία συνδυασμού μεταβάλλονται σημαντικά επίπεδα έκφρασης των 1986 και 2483 αντιγράφων σε κύτταρα HepG2 και Huh7, αντίστοιχα. Γονίδια λειτουργικά εμπλέκονται σε κυτταρικό θάνατο, μεταγωγή σήματος και ρύθμιση της μεταγραφής ήταν κυρίως πάνω ρυθμισμένα, ενώ γονίδια που εμπλέκονται στο μεταβολισμό, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και την αντιγραφή του DNA και επιδιόρθωση ήταν κυρίως κάτω-ρυθμίζονται κατά την κατεργασία. Ωστόσο, ο συνδυασμός επεξεργασμένου κυτταρικές σειρές HCC εμφανίζεται ειδικότητα στην έκφραση και τη δραστηριότητα των κρίσιμους παράγοντες που εμπλέκονται στην ηπατοκαρκινογένεσης. Η αλλαγμένη έκφραση μερικών από αυτά τα γονίδια επιβεβαιώθηκε με ημι-ποσοτικό και ποσοτικό RT-PCR και με κηλίδωση Western. Πολλά νέα γονίδια προέκυψαν από transcriptomic αναλύσεις μας, και την περαιτέρω λειτουργική ανάλυση μπορεί να προσδιορίσει αν αυτά τα γονίδια μπορεί να χρησιμεύσει ως πιθανούς μοριακούς στόχους για πιο αποτελεσματικές στρατηγικές αντι-HCC

Παράθεση:. Cervello Μ, Μπατσβάροφ D, Lampiasi Ν, Κουζιμάνο Α, Azzolina Α, McCubrey JA, et al. (2013) Μυθιστόρημα Συνδυασμός Sorafenib και Celecoxib Παρέχει συνεργική αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του ήπατος. PLoS ONE 8 (6): e65569. doi: 10.1371 /journal.pone.0065569

Επιμέλεια: Manlio Vinciguerra, University College London, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 11η Φεβρουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Cervello et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το ιταλικό «Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (Υπουργείο Παιδείας, Πανεπιστημίων και Έρευνας) – MIUR FIRB427 MERIT n.RBNE08YYBM στο MC και G. Μ .; D.B. είναι ο επικεφαλής του Μηχανισμού Πυρήνα Γονιδιωματική στο Κέντρο Ερευνών CHUQ-Cancer, που υποστηρίζεται από τον καρκίνο FRSQ-RR. Όλα τα πειράματα και γονιδιωματικά δεδομένα αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε αυτή τη δυνατότητα? Μ.Ο. Έχει επίσης υποστηριχθεί εν μέρει από την καταβολή επιχορήγησης στο CNR από το Υπουργείο Οικονομίας και Οικονομικών της Ιταλίας για το Έργο FaReBio di Qualità. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) αντιπροσωπεύει την πέμπτη συχνότερη μορφή καρκίνου και η τρίτη συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο [1], [2]. Αν και η κλινική διάγνωση και τη διαχείριση του πρώιμου σταδίου HCC έχει βελτιωθεί σημαντικά, HCC πρόγνωση εξακολουθεί να είναι εξαιρετικά φτωχή. Επιπλέον, η προηγμένη HCC είναι μια ιδιαίτερα επιθετική όγκου με χαμηλή ή καθόλου απάντηση σε κοινή θεραπείες. Ως εκ τούτου, νέα αποτελεσματική και καλά ανεκτή στρατηγικές θεραπείας χρειάζονται επειγόντως.

Το sorafenib, ένας αναστολέας πολλαπλών κινασών που στοχεύει Raf κινάσες, καθώς και VEGFR-2 /-3, PDGFR-β, Flt-3 και c-Kit , έλαβε πρόσφατα την έγκριση FDA και ΕΜΕΑ για τη θεραπεία ασθενών με προχωρημένο ΗΚΚ. Ωστόσο, τα χαμηλά ποσοστά ανταπόκρισης του όγκου και οι παρενέργειες που σχετίζονται με αυτό το μονοθεραπεία υποδεικνύουν την ανάγκη να διερευνηθούν άλλες νέες θεραπευτικές επιλογές για την HCC.

Στοχευμένες θεραπείες έχουν εισέλθει στο χώρο των αντι-νεοπλασματική θεραπεία και χρησιμοποιούνται είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με συμβατικά φάρμακα χημειοθεραπείας. Μοριακή στοχευμένη θεραπεία υπόσχεται πολλά για HCC [3]. Ωστόσο, όπως και στην πλειονότητα των καρκίνων, η χρήση ενός μόνον μοριακού παράγοντα στόχο θα επιτύχει απίθανο μακράς διάρκειας υποχώρηση ή ίαση σε HCC, ιδιαίτερα για την καθυστέρηση στάδιο της νόσου. Η συνδυασμένη θεραπεία θα επομένως απαιτείται, και φαίνεται λογικό να υποθέσουμε ότι ο συνδυασμός δύο ή περισσότερων παραγόντων θα αυξήσει τελικά το θεραπευτικό όφελος.

HCC είναι συνήθως το αποτέλεσμα της συνεχούς τραυματισμού και χρόνια φλεγμονή. Ένας σημαντικός μεσολαβητής της φλεγμονής είναι η επαγώγιμη γονίδιο της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX-2). Είναι πλέον καθιερωμένο ότι η COX-2 είναι ένας σημαντικός μοριακός στόχος για αντικαρκινικές θεραπείες. COX-2 είναι χρονίως υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων HCC [4] – [8]. Στο HCC, εμείς και άλλοι ερευνητές έχουν καταδείξει ότι οι αναστολείς COX-2 μπορεί να έχει δυνητικές θεραπευτικές επιδράσεις [9] – [13]

Η λογική για το συνδυασμό sorafenib με COX-2 αναστολέων σε HCC προέρχεται από στοιχεία που δημοσίευσε. άλλοι συγγραφείς [14] αλλά και από τη δική δημοσιευμένα δεδομένα μας [12]. Δείξαμε ότι η αγωγή των ανθρώπινων κυττάρων HCC με έναν αναστολέα της COX-2 συνδέεται με την ενεργοποίηση του ERK1 /2, και ότι η αναστολή της οδού σηματοδότησης MEK /ERK από ΜΕΚ αναστολέα ενισχύει την αντικαρκινική δράση του αναστολέα. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η οδός MEK /ERK δεν διαμεσολαβεί κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από τους αναστολείς COX-2, αλλά μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από το θάνατο, το οποίο υποστηρίζει έμμεσα το ρόλο του μονοπατιού /ERK ΜΕΚ στη σηματοδότηση επιβίωση των κυττάρων HCC [12].

Ως εκ τούτου, με βάση τα ευρήματα αυτά εξετάσαμε τις επιδράσεις ενός συνδυασμού των εκλεκτικών αναστολέων COX-2 αναστολέας celecoxib με sorafenib. Synergistic αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα ελήφθησαν κατά τη χρήση του συνδυασμού του sorafenib με celecoxib. Για να κατανοήσουμε καλύτερα τις λεπτομερείς μηχανισμοί των κυτταροτοξικών επιδράσεων της celecoxib και sorafenib, μπορούμε επίσης να διερευνηθεί και σε σύγκριση με τη συνολική έκφραση γονιδίων των κυττάρων HCC αγωγή είτε με celecoxib ή σοραφενίμπη ή δύο φαρμάκων που εφαρμόζονται σε συνδυασμό.

υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια, Cell Culture, Cell Βιωσιμότητα, κλωνογόνος και διάδοσης Αναλύσεις

η celecoxib (CLX) ήταν ένα δώρο της Pfizer Corporation Inc. (Νέα Υόρκη, ΗΠΑ), sorafenib (SOR) αγοράστηκε από την Alexis Biochemical (Lausen, CH), και αμφότερα τα φάρμακα διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυτταρικών γραμμών HepG2 ανθρώπου (μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή ηπατοκαρκινώματος? ATCC ΗΒ-8065) ​​και Huh7 [15] (ένα δώρο από τον καθηγητή Massimo Levrero, Sapienza Πανεπιστήμιο της Ρώμης, Ρώμη, Ιταλία) που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν από μια χαμηλή στενό πέρασμα αριθμός και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 και 37 ° C και συνήθως σε διαλογή έναντι μόλυνσης από μυκόπλασμα. δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων διεξήχθησαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [17]. Ο συντελεστής της αλληλεπίδρασης φαρμάκου (CDI) χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα αποτελέσματα των συνδυασμών φαρμάκων [18]. CDI υπολογίζεται ως εξής: CDI = AB /(Α χ Β). Σύμφωνα με την απορρόφηση της κάθε ομάδας, ΑΒ είναι η αναλογία των ομάδων συνδυασμού για τον έλεγχο ομάδα? Α ή Β είναι ο λόγος της ομάδας μοναδικός παράγοντας για τον έλεγχο της ομάδας. Έτσι, CDI τιμές μικρότερη, ίση ή μεγαλύτερη από 1 δείχνουν ότι τα φάρμακα είναι συνεργιστική, πρόσθετο ή ανταγωνιστικό, αντίστοιχα. CDI μικρότερη από 0,7 υποδεικνύει ότι τα φάρμακα είναι σημαντικά συνεργιστική. Επιπλέον, η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της δοκιμής Τ του Student (two-tailed). Τα κριτήρια για τη στατιστική σημαντικότητα ήταν

ρ

& lt?. 0.05

Η επίδραση των διαφορετικών συγκεντρώσεων αναστολέα στην κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας μία κλωνογονική δοκιμασία. Για την ανάλυση αυτή, 1,0-1,5 × 10

3 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε μέσο αύξησης, και μετά από ολονύκτια κύτταρα προσάρτηση εκτέθηκαν είτε σε CLX και SOR μόνες ή συνδυασμούς τους ή όχημα για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται με μέσο χωρίς ναρκωτικά και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 14 ημέρες σε συνθήκες χωρίς ναρκωτικά. Αποικίες που περιέχουν περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν. σχηματισμός Σχετική αποικία καθορίζεται από την αναλογία του μέσου αριθμού των αποικιών σε κατεργασμένα κύτταρα με το μέσο αριθμό των αποικιών σε κύτταρα κατεργασμένα με διαλύτη (DMSO). Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με υπολογισμό του ποσού του βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU) ενσωμάτωση στο DNA από μία χρωματομετρική ανοσοδοκιμή (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Εν συντομία, 5 χ 10

3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων στα διαφορετικές συγκεντρώσεις CLX και SOR μόνες ή συνδυασμούς τους ή όχημα για 24 ώρες. BrdU συνέχεια προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 10 μΜ. Τα κύτταρα περαιτέρω επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες και στη συνέχεια σταθερά και θεραπεία με αντι-BrdU υπεροξειδάσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Χρώμα αναπτύχθηκε με την προσθήκη του υποστρώματος τετραμεθυλοβενζιδίνης και μετρήθηκε στα 490 nm. ένταση του χρώματος και τιμές απορρόφησης συσχετίζεται άμεσα με την ποσότητα του BrdU ενσωματώθηκε στο DNA. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό αναστολής της ενσωμάτωσης BrdU έναντι του ελέγχου. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι ± SD τριών ξεχωριστών πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν.

TUNEL Δοκιμασίες

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλακίδια 8 φρεατίων θαλάμου όλη τη νύκτα. Μετά την κατεργασία για 24 ώρες με διάφορες συγκεντρώσεις CLX και SOR είτε μόνα τους ή σε συνδυασμό, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης 4% επί 25 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλ τρανσφεράση δοκιμασίας μεσολάβηση dUTP nick άκρο-επισήμανση (TUNEL) με τη χρήση του κιτ αδιέξοδο ™ Χρωματομετρική TUNEL συστήματος από την Promega (Madison, WI), ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση του ποσοστού των καστανού χρώματος θετικά κύτταρα. Τουλάχιστον 500 κύτταρα από δύο διαφορετικά σκευάσματα κυττάρων μετρήθηκαν για κάθε κατάσταση. Τα κύτταρα έγιναν ορατά με μικροσκόπιο Axioskop (Zeiss, Germany).

Western Blotting Αναλύσεις

Για την ανάλυση στυπώματος Western, λύματα ολόκληρων κυττάρων ελήφθησαν με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος RIPA (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, ΜΑ) και κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19], με πρωτεύοντα αντισώματα που εγείρονται έναντι survivin και TRIB3 /TRB3 (Abcam Limited, Cambridge, UK), DDIT3 /CHOP (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, ΜΑ), β- ακτίνη, YAP1 και DKK1 (Sigma-Aldrich Srl, Μιλάνο, Ιταλία).

γονιδιακής έκφρασης και αναλύσεις δεδομένων

ανάλυση της έκφρασης γονιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Agilent 44 Κ Ανθρωπίνων ολόκληρο το γονιδίωμα μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων ( που περιέχουν ~44,000 γονίδια), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20] – [23]. Όλα τα πειράματα μικροσυστοιχιών διεξήχθησαν εις διπλούν, με τη χρήση χρωστικής-ανταλλαγής κατά τη διάρκεια της επισήμανσης. Το λογισμικό GeneSpring (Agilent, Palo Alto, CA) χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσετε λίστες των επιλεγμένων γονιδίων για διαφορετικές στατιστικές και οπτικοποίηση μεθόδους. Δικτύου και της οδού αναλύσεις των δεδομένων μικροσυστοιχιών ολοκληρώθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Ingenuity Pathway Ανάλυση (IPA) (https://www.Ingenuity.com). Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχει κατατεθεί στη βάση δεδομένων GEO με αριθμό ένταξης GSE45340.

Ημι-ποσοτική RT-PCR (sqrt-PCR) Αναλύσεις

δεδομένα μικροσυστοιχιών επικυρώθηκαν για επιλεγμένες διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων από sqRT- PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], [23]. Το γονίδιο β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Οι παρακάτω και αντιπληροφοριακοί εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν, αντίστοιχα, για να ενισχύσουν την ανθρώπινη BIRC5 (5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3 ‘και 5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′), DDIT3 (CHOP) (5’-ATGGCAGCTGAGTCATTGCC-3 ‘και 5’-TCATGCTTGGTGCAGATTC -3 ‘), FABP1 (5′-CTCTATTGCCACCATGAGTTTC-3′ και 5’-GCTGATTCTCTTGAAGACAAT-3 ‘), HRK (5′-CTGTGTCCTTGGAGAAAGCTG-3′ και 5’-GTGTTTCTACGATCGCTCCAG-3 ‘), LARP6 (5’-GGAACAAGCTGGGATATGTGA- 3 ‘και 5′-GGTGGTCCTCATTCAACTCAA-3′), MT2A (5’-AAGAAAAGCTGCTGCTCCTG-3 ‘και 5′-TGGAAGTCGCGTTCTTTACAT-3′), YAP1 (5’-GGCAAAGACATCTTCTGGTCA-3 ‘και 5′-CATCATATTCTGCTGCACTGG-3′) και β-ακτίνη (5’-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3 ‘και 5′-AGTACAGCTACGAGCAGTTCTTGTT-3’). PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους: 95 ° C για 5 λεπτά, 94 ° C για 30 sec, 62 ° C για HRK, LARP6, 60 ° C για BIRC5, β-ακτίνη, FABP1, MT2A, YAP1, 58 ° C για DDIT3, και 72 ° C για 1 λεπτό που ακολουθείται από ένα τελικό στάδιο επέκτασης των 72 ° C για 8 λεπτά. Ο αριθμός των κύκλων ρυθμίστηκε για να επιτρέψει την ανίχνευση στη γραμμική περιοχή. Τέλος, τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, φωτογραφήθηκαν και ποσοτικοποιείται με πυκνομετρική σάρωση.

Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) Οι αναλύσεις

Η έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων ποσοτικοποιήθηκε με ποσοτική πραγματικού Time PCR (qPCR) χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο φθορισμό (Qiagen, Μιλάνο, Ιταλία) για StepOnePlus (Applied Biosystem). QuantiTect Primer Δοκιμασίες για CCND1 (QT00495285), DDIT3 (CHOP) (QT00082278), DKK1 (QT00009093), FGF19 (QT02452289), FNDC3B (QT01882748), KLB (QT02454977), TRIB3 (QT00088543), LARP6 (QT00221445) αγοράστηκαν από την QIAGEN (Μιλάνο, Ιταλία) και ενισχύθηκαν όπως συνιστάται. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική C

t μέθοδο. Η έκφραση του γονιδίου ενδιαφέροντος υπολογίστηκε ως φορές επαγωγής σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO) και διορθώθηκε με την ποσοτικοποιημένη επίπεδο έκφρασης της β-ακτίνης (QT00095431).

Αποτελέσματα

Συνδυασμός celecoxib με sorafenib συνεργιστικά Μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων, του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αποικίας Σχηματισμός και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα HCC

Χρησιμοποιώντας την δοκιμασία MTS θα αξιολογούνται πρώτα τα αποτελέσματα του sorafenib (SOR) και celecoxib (CLX) σχετικά με τη βιωσιμότητα των δύο ανθρώπινων κυττάρων HCC γραμμές, HepG2 και Huh7, τα οποία εμφανίζουν διαφορετικά χαρακτηριστικά όπως η διαφοροποίηση, βιολογική συμπεριφορά και γενετικές ανωμαλίες, COX-2 τα επίπεδα έκφρασης [21], καθώς και δραστηριότητες Raf /MEK /ERK μονοπάτι [23]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, η θεραπεία με CLX και SOR για 48 ώρες μείωσε αποτελεσματικά βιωσιμότητα στις δύο κυτταρικές σειρές. Μετά από 72 ώρες έκθεσης στο φάρμακο, το IC

’50 του CLX ήταν 76 ± 9,9 και 72,5 ± 0,7 μΜ σε κύτταρα HepG2 και Huh7, αντίστοιχα? το IC

’50 του SOR ήταν 10,3 ± 1,1 και 10,1 ± 1,8 μΜ στα ίδια κύτταρα. Επειδή έκφραση COX-2 mRNA είναι μη ανιχνεύσιμο σε κύτταρα HepG2 [10], [21], η ανάπτυξη-ανασταλτική δράση των CLX φαίνεται να είναι σε μεγάλο βαθμό COX-2 ανεξάρτητες σε αυτά τα κύτταρα [21]. Επιπλέον, η ανασταλτική της ανάπτυξης ενεργότητα SOR μεσολάβηση φαίνεται να είναι ανεξάρτητη από ΜΕΚ /ΕΚΚ μονοπάτι αδρανοποίησης σε κύτταρα HepG2, δεδομένου ότι, όπως έχει ήδη αναφερθεί, η έκφραση φωσφο-ΜΕΚ και φωσφο-ERK1 /2 είναι μόλις ανιχνεύσιμη σε αυτό το κελί HCC γραμμής [23].

ζωτικότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία MTS. HepG2 και Huh7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 48 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις CLX και SOR είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό των κυττάρων ελέγχου και τα μέσα ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα, καθένα από τα οποία εκτελέστηκε εις τριπλούν. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01 έναντι sorafenib μόνο, # p & lt? 0,05? ## P & lt?. 0,01 έναντι μόνο του celecoxib

Η

Στη συνέχεια ερευνήσαμε τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του συνδυασμού SOR + CLX στις δύο κυτταρικές σειρές HCC χρησιμοποιώντας MTS αναλύσεις (Εικόνα 1). Ο συνδυασμός SOR + CLX επέδειξαν αυξημένη σημαντικά κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με τους απλούς παράγοντες. CDI χρησιμοποιήθηκε για να καθορίσει τον τύπο της αλληλεπίδρασης μεταξύ των παραγόντων (Πίνακας 1). Σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές συνέβη ισχυρή συνέργεια όταν CLX εφαρμόστηκε σε συνδυασμό με SOR (Πίνακας 1).

Η

Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της θεραπείας συνδυασμού περαιτέρω επιβεβαιωμένη χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασία (Σχήμα 2). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 2 ημέρες με ή χωρίς τις ενώσεις, το μέσο αναρροφήθηκε και στη συνέχεια πλύθηκαν με αναστολέα μέσο ελεύθερο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν επί άλλες 14 ημέρες. Υπήρξε μια δοσο-εξαρτώμενη μείωση στην ικανότητα σχηματισμού αποικίας λόγω συνδυασμένες θεραπείες SOR + CLX στις δύο κυτταρικές σειρές. Πράγματι, ο συνδυασμός SOR + CLX σε αναλογία σταθερής δόσης οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην θανάτωση των καρκινικών κυττάρων όπως μετράται με προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας σε σύγκριση με τους απλούς παράγοντες (Σχήμα 2).

Η κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων HepG2 και Huh7 προσδιορίστηκε με κλωνογόνο προσδιορισμό μετά από θεραπεία με CLX και SOR είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν όλη τη νύκτα και εκτέθηκαν σε CLX και SOR μόνα τους ή σε συνδυασμό στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. Μετά τη θεραπεία κάθε φρεάτιο πλύθηκε και το πείραμα συνεχίστηκε για 14 ημέρες σε απουσία φαρμάκων. Επιβίωσαν αποικίες βάφτηκαν (αριστερό πάνελ) και μετρήθηκαν (δεξί πάνελ). Τα δεδομένα εκφράζονται ως ποσοστό των αποικιών σε κύτταρα ελέγχου και τα μέσα ± SD από δύο ξεχωριστά πειράματα, καθένα από τα οποία εκτελέστηκε εις διπλούν. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0,01 έναντι κάθε παράγοντα μόνο

Η

Από τα αποτελέσματα αντι-ανάπτυξη του ατόμου ή συνδυασμό θεραπειών μπορεί να οφείλεται σε αυξημένο κυτταρικό θάνατο ή /και μειωμένη κυτταρική πολλαπλασιασμός, εξετάσαμε χωριστά επιδράσεις του φαρμάκου επί της διέγερσης απόπτωσης και τη σύνθεση του DNA. Όσον αφορά την απόπτωση, η θεραπεία των κυττάρων HepG2 και Huh7 με έως 50 μΜ CLX έχει αμελητέα αποτελέσματα επί της διέγερσης απόπτωσης, όπως αξιολογήθηκε με δοκιμασία TUNEL (Σχήμα 3Α). Η θεραπεία με 7.5 ή 10 μΜ SOR αύξησε την ποσότητα των αποπτωτικών κυττάρων HepG2 σε 3,4 ± 0,85% και 5,5 ± 1,4%, αντίστοιχα. Ωστόσο, ο συνδυασμός SOR + CLX αυξήθηκε σημαντικά απόπτωση σε κύτταρα HepG2 σε σύγκριση με την αγωγή με τον κάθε παράγοντα που χρησιμοποιείται μόνο του (

ρ

& lt? 0,05), ενώ στα κύτταρα Huh7 δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση (Σχήμα 3Β). Η δοκιμασία BrdU χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη των αποτελεσμάτων της θεραπείας συνδυασμού επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, ο συνδυασμός SOR + CLX είχε μια ισχυρή συνεργιστική δράση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και στις δύο κυτταρικές σειρές, εμφανίζοντας τιμές CDI λιγότερο από 0.5 και 0.6 σε όλους τους συνδυασμούς φαρμάκων SOR + CLX σε κύτταρα HepG2 και τα κύτταρα Huh7, αντίστοιχα.

(Α) Ανίχνευση απόπτωσης με δοκιμασία TUNEL. Μικροφωτογραφίες των κυττάρων HepG2 θεραπεία για 24 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις CLX και SOR είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Τα αποπτωτικά κύτταρα έγιναν ορατά με χρώση TUNEL όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Ποσοτική ανάλυση του TUNEL-θετικών κυττάρων HepG2 και Huh7. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SD από δύο ξεχωριστά πειράματα. *

σ

& lt? 0,05, έναντι κάθε παράγοντα ξεχωριστά. (Γ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία BrdU. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή για 48 ώρες με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις CLX και SOR είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το ποσοστό των κυττάρων ελέγχου και τα μέσα ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0,01 έναντι κάθε παράγοντα μόνο

Η

Transcriptomic ανάλυση εντοπίζει γονιδιακής έκφρασης αλλάζει κοινά για τις δύο και μοναδικά σε HepG2 και Huh7 κύτταρα μετά από Θεραπεία Συνδυασμού

για τον εντοπισμό νέων πιθανών μηχανισμών της συνδυασμένης δράσης της celecoxib και sorafenib, τις επιπτώσεις τους στην παγκόσμια γονιδιακής έκφρασης σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν και σε σύγκριση με τη χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών DNA. Agilent 44 K Human Genome Σύνολο μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων (που περιέχουν ~44,000 γονίδια) χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό παγκόσμιες αλλαγές γονιδιακής έκφρασης στις κυτταρικές σειρές HCC, κατόπιν ταυτόχρονης θεραπείας με 50 μΜ CLX και 7,5 μΜ SOR για 48 ώρες. Αυτές οι συγκεντρώσεις εμπειρικά εκτιμάται ως η μέγιστες συγκεντρώσεις του φαρμάκου οι οποίες δεν προκαλούν σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων (λιγότερο από 20-30%) και /ή αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όλα τα πειράματα μικροσυστοιχιών έγιναν εις διπλούν την εφαρμογή βαφής-swaps για την αποφυγή μεροληψίας επισήμανση. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, ένα σύνολο 1986 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων με τα επίπεδα έκφρασης ≥2 φορές ταυτοποιήθηκαν σε κύτταρα HepG2, και 2,483 γονίδια εμφανίζονται ≥2 φορές την έκφραση σε κύτταρα Huh7. Μεταξύ αυτών, 975 γονίδια ή 1.382 γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και 1.011 ή 1.111 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω σε κύτταρα HepG2 και Huh7, αντίστοιχα. Θα πρέπει να τονιστεί ότι και στις δύο κυτταρικές σειρές HCC η συνδυασμένη θεραπεία SOR + CLX παρήγαγε μια κυρίαρχη μείωση σε γονίδια που σχετίζονται με τον μεταβολισμό, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και την αντιγραφή του DNA και την επισκευή, όπως πολλά γονίδια που εμπλέκονται στην αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA ήταν ιδιαίτερα ρυθμισμένα προς τα κάτω σε κύτταρα HepG2 (βλέπε πίνακα 2Α και 2C). Γονίδια λειτουργικά συνδεδεμένα σε κυτταρικό θάνατο, μεταγωγή σήματος και ρύθμιση της μεταγραφής ήταν ως επί το πλείστον ρυθμίζονται τόσο HepG2 και τα κύτταρα Huh7 (Πίνακας 2Β και 2D). Γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό και τη μεταφορά ήταν αναλογικά πάνω και κάτω διαμορφωμένου σε κύτταρα HepG2, ενώ προκλήθηκαν κυρίως σε κύτταρα Huh7 (Πίνακας 2). Πίνακες S1 και S2 οθόνη πλήρεις καταλόγους των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (≥2 φορές) στα SOR + CLX-θεραπεία HepG2 και Huh7 κύτταρα, αντίστοιχα.

Η

transcriptomic μας αναλύσεις έντονα επιβεβαιώνεται η παρατηρούμενη συνεργική αποτελέσματα της συνδυασμένης θεραπείας σε κύτταρα HCC. Έχουμε προηγουμένως ερευνηθεί των μοριακών μηχανισμών (συμπεριλαμβανομένων των προφίλ γονιδιακής έκφρασης) του celecoxib [21] και sorafenib [23] κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα HepG2 και Huh7. ανάλυση διάγραμμα Venn με βάση την προηγουμένως δημοσιευθεί και οι ανωτέρω κατάλογοι γονίδιο ήταν ενδεικτική ενός σημαντικού αριθμού διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που διαμορφώνεται αποκλειστικά στις δύο κυτταρικές σειρές HCC μόνο με την συνδυασμένη θεραπεία SOR + CLX (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, η πλειοψηφία αυτών των μοναδικά διαμορφωμένων γονίδια εμφανίζονται εμφανής ειδικότητα κυττάρου HepG2 ή Huh7 κατά την κατεργασία SOR + CLX (βλέπε σχήμα 4Β). Τα στοιχεία αυτά είναι σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματά μας σχετικά με τους διαφορετικούς μοριακούς μηχανισμούς κυτταροτοξική δράση της celecoxib ή sorafenib σε κύτταρα HepG2 και Huh7 [21], [23]. Η παραπάνω αναλύσεις επίσης μας ώθησε να αξιολογήσει εάν SOR + CLX-κατεργασμένα κύτταρα HepG2 και Huh7 θα μπορούσε να διακριθεί με βάση τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης τους. Μετά το φιλτράρισμα στις 2-φορές ένταση του σήματος, χρησιμοποιήσαμε ένα one-way ANOVA παραμετρικό τεστ (Welch

t-test

? Δεν διακυμάνσεις υποτίθεται ίση) για να επιλέξετε γονίδια διακρίσεις. Πράγματι,

t

δοκιμή με ένα

σ

-τιμή αποκοπής των 0.005 επιλεγμένων 174 γονίδια των οποίων η έκφραση διαφέρει σε κύτταρα HepG2 και Huh7. ανάλυση ομαδοποίησης με βάση τον κατάλογο 174 γονιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το τυποποιημένο αλγόριθμο κατάστασης των δένδρων που προβλέπονται στο GeneSpring, αποκαλύπτοντας το σχηματισμό των δύο μεγάλων ομάδων σύμπλεγμα που διακρίνουν σαφώς κύτταρα HepG2 και Huh7 κατά την αγωγή (Σχήμα 4C). Ενενήντα εννέα γονίδια από τον κατάλογο 174-γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα HepG2-θεραπεία, σε σύγκριση με τα κύτταρα Huh7. Σημαντικές ταξινομήσεις αυτών των γονιδίων που περιλαμβάνονται πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μεταγωγή σήματος, το μεταβολισμό και τη μεταφορά. Γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε Huh7-κατεργασμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα HepG2 (75 γονίδια) εμπλέκονται κυρίως στο μεταβολισμό, μεταγωγής σήματος, ρύθμιση της μεταγραφής, ανοσολογική απόκριση και την αντιγραφή του DNA και την επισκευή. Ο κατάλογος 174 γονίδια παρουσιάζεται στον Πίνακα S3.

(Α) διάγραμμα Venn αναλύσεις των γονιδίων, που εκφράζονται διαφορικά (≥2 φορές) σε κυτταρικές γραμμές HepG2 και Huh7 κατόπιν CLX (50 μΜ) αγωγή, SOR (7,5 μΜ) θεραπεία, και συνδυασμένη θεραπεία SOR + CLX. (Β) Venn διάγραμμα σύγκριση των κοινών και διακριτά γονίδια μοναδικά διαμορφωμένο (≥2 φορές) σε HepG2 και Huh7 κυττάρων μόνο μετά συνδυασμένη αγωγή SOR + CLX. (C) Ιεραρχική ομαδοποίηση με βάση τον κατάλογο 174 γονίδια (2-φορές διαφορά στην έκφραση γονιδίων?

σ

-τιμή αποκοπής 0,05), η οποία εισάγει διακρίσεις HepG2 και Huh7 κύτταρα σύμφωνα με την απάντησή τους στην συνδυασμένη θεραπεία SOR + CLX. Κόκκινο σημαίνει up-ρύθμιση και πράσινο υποδηλώνει ρύθμιση προς τα κάτω.

Η

Διαδρομή και το δίκτυο των αναλύσεων που παράγεται μέσω της χρήσης των Ingenuity Pathways Ανάλυση (ΜΠΒ), το λογισμικό επιβεβαίωσε τα κοινά και διακριτές τις μεγάλες ομάδες γονιδίων λειτουργικά συνδέονται, η οποία βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε SOR + CLX-αγωγή HepG2 και Huh7 κύτταρα (Σχήμα 5). Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι κορυφαίες λειτουργικές πορείες κάτω-ρυθμίζονται σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές εκείνες που σχετίζονται με τον κύκλο σε κύτταρα, αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμό και επισκευή, το μεταβολισμό των λιπιδίων και μικρού μορίου βιοχημεία (Σχήμα 5Β και 5D), ενώ πορείες που σχετίζονται με την ανάπτυξη των κυττάρων και την έκφραση του γονιδίου βρέθηκαν να κοινώς επάγεται (Σχήμα 5Α και 5Β). Πορείες που σχετίζονται με κυτταρικό θάνατο και την ανάπτυξη των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό και οι δύο επάγονται και κατέστειλε στις δύο κυτταρικές σειρές, αν και, όπως αναμένεται, σε κάθε HCC κυτταρική γραμμή οδούς κυτταρικού θανάτου ήταν πιο έντονα επαγόμενη από καταστέλλεται (Σχήμα 5Α-5D). Οι δύο κυτταρικές σειρές HCC εμφανίζεται επίσης ορισμένες διαφορές κατά την αγωγή SOR + CLX? Έτσι, μονοπάτια που σχετίζονται με τη συναρμολόγηση και την οργάνωση των κυττάρων ήταν κυρίως κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 5Β), ενώ πορείες σχετίζονται λειτουργικά βιταμίνες, μέταλλα και το μεταβολισμό αμινοξέων ως επί το πλείστον κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα Huh7 (Σχήμα 5D). Κατά συνέπεια, οι οδοί συνδέονται με την κυτταρική κίνηση, μορφολογία κυττάρων, κυτταρική λειτουργία και τη συντήρηση και τον κυτταρικό κύκλο ήταν πιο έντονα πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα HepG2 (σχήμα 5Α), ενώ τα κύτταρα Huh7 εμφανίζεται ειδικό πάνω ρύθμιση μονοπατιών που σχετίζονται με μεταβολισμό των υδατανθράκων, μοριακή μεταφορά, μικρές βιοχημεία μορίου και την αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμός και επιδιόρθωση (Σχήμα 5C).

Η

μια ανάλυση του δικτύου εντοπίστηκαν πολυάριθμα εξαιρετικά σημαντική δίκτυα με βαθμολογία ≥3 που ήταν μεταγενέστερος ή up-ρυθμίζονται σε κύτταρα HepG2 και Huh7 μετά από συνδυασμένη θεραπεία SOR + CLX. Όπως ήταν αναμενόμενο, και για τις δύο κυτταρικές σειρές HCC οι πέντε top-σκοράροντας πάνω ρυθμισμένα δίκτυα που συνδέονται κυρίως με τις λειτουργίες που συνδέονται με τον κυτταρικό θάνατο και την έκφραση του γονιδίου, ενώ οι κορυφαίες-βαθμολόγησης κάτω-ρυθμίζονται δίκτυα ως επί το πλείστον συνδέονται με τον κυτταρικό κύκλο και το μεταβολισμό (Πίνακας S4 ). Εδώ πάλι, κάθε μία από τις δύο κυτταρικές σειρές HCC εμφανίζεται κάποια εξειδίκευση στην διαμόρφωση του δικτύου: έτσι για τα κύτταρα HepG2, οι πέντε top-σκοράροντας πάνω ρυθμισμένα δίκτυα ως επί το πλείστον σχετίζονται με τη βιοσύνθεση πρωτεϊνών και μοριακής μεταφοράς (Πίνακας S4A), ενώ για τα κύτταρα Huh7, το top-βαθμολόγησης πάνω ρυθμισμένα δίκτυα επιπλέον συνδέονται με τη συναρμολόγηση των κυττάρων και την οργάνωση, τη λειτουργία των κυττάρων και συντήρησης και του κυτταρικού κύκλου (Πίνακας S4B). Λειτουργική δικτύων συνδέεται με την αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμό και επισκευή ήταν ειδικά καταστέλλονται σε κύτταρα HepG2 (Πίνακας S4C), ενώ τα κύτταρα Huh7 εμφανίζεται κάτω ρύθμιση των δικτύων που συνδέονται με την κυτταρική λειτουργία και συντήρηση, RNA μετα-μεταγραφική τροποποίηση, κυτταρική συναρμολόγηση και την οργάνωση, μοριακή μεταφορά και ανοσολογική απόκριση (Πίνακας S4D).

κοινή δίκτυα, που δημιουργείται από τη συγχώνευση των τεσσάρων δικτύων top-βαθμολόγησης που περιλάμβανε δύο κατάντη και up-ρυθμιζόμενα γονίδια (≤2 φορές), αναγνωρίζονται κάποια λειτουργικά σχετίζονται με κόμβους γονίδιο που ήταν ειδικά διαμορφωμένο στις δύο κυτταρικές σειρές HCC κατά την κατεργασία SOR + CLX (Σχήμα 6 και 7). Ειδικότερα, στα κύτταρα HepG2 ένα αριθμό κόμβων γονίδιο εμπλέκεται στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και την αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμό και επισκευή (συμπεριλαμβανομένων erbB2, ΕΡΟ, CCNE1, cdc25A, CCNB1, BIRC5, NDC80, BUB1, ΡΧΝ, KPNB1, KITLG, CDCA5, CDCA8 , TCF3, Cdh1, CDKN3) ήταν κάτω-ρυθμίζονται, ενώ οι κόμβοι γονίδιο που συνδέεται με τον κυτταρικό θάνατο (συμπεριλαμβανομένων Εθνικές Λέσχες, SOX4, EPAS1, S100P, IRS2, LCN2, IGFBP1, TRIB3, PHLDA2, AURKB) έχουν ως επί το πλείστον που προκαλείται, με την εξαίρεση του κόμβος γονίδιο AURKB (Σχήμα 6). κόμβων γονίδιο ειδικά κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα Huh7 περιελάμβανε μια σειρά από κυτταρικού κύκλου και της μεταγραφής ρυθμιστικές αρχές (CCND1, CCNE1, TCF3, FANCA, CENPF, FGFR3, ID1, ID 2, ID3, MSX1 και τα μέλη του συγκροτήματος NF-κΒ), καθώς και όπως γονίδια που εμπλέκονται στην RNA μετα-μεταγραφική τροποποίηση (CDKN2A, SREK, SRSF1), ενώ επάνω ρυθμισμένη κόμβους (συμπεριλαμβανομένων SP1, ATF3, SRSF1, ΒΜΡ4, MSX1, KLF4, JMJD6) έχουν ως επί το πλείστον συνδέονται με τον έλεγχο του κυτταρικού θανάτου (εικόνα 7) .

τα τέσσερα δίκτυα top-βαθμολόγησης συγχωνεύθηκαν και εμφανίζονται γραφικά ως κόμβοι (γονίδια /προϊόντα γονιδίων) και τα άκρα (οι βιολογικές σχέσεις μεταξύ των κόμβων). Ένταση του χρώματος κόμβου δείχνει το βαθμό της ανάντη (κόκκινο) ή κάτω (πράσινο) -τον κανονισμό. Οι κόμβοι εμφανίζονται με διάφορα σχήματα που αντιπροσωπεύουν την λειτουργική κατηγορία του γονιδιακού προϊόντος (τετράγωνο = κυτοκίνη? κάθετη οβάλ = διαμεμβρανικό υποδοχέα? ορθογώνιο = πυρηνικών υποδοχέων? διαμάντι = ένζυμο? ρομβοειδή = μεταφορέα? εξάγωνο = συντελεστής μετάφραση? οριζόντια οβάλ = μεταγραφικού παράγοντα? κύκλος = άλλο). Τα άκρα εμφανίζονται με διάφορες ετικέτες που περιγράφουν τη φύση της σχέσης μεταξύ των κόμβων: –

δεσμευτική μόνο

, →

ενεργεί για την πώληση. Το μήκος μιας ακμής αντανακλά τα δικαιολογητικά που αποδεικνύουν ότι κόμβο σε κόμβο σχέση και άκρες που υποστηρίζονται από τα άρθρα από τη βιβλιογραφία είναι μικρότερη. Διακεκομμένες ακμές αντιπροσωπεύουν έμμεση αλληλεπίδραση.

Η

Τα τέσσερα δίκτυα top-βαθμολόγησης συγχωνεύθηκαν και εμφανίζονται γραφικά ως κόμβοι (γονίδια /προϊόντα γονιδίων) και τα άκρα (οι βιολογικές σχέσεις μεταξύ των κόμβων). Εικόνα θρύλους είναι όπως περιγράφεται στο Σχήμα 6.

Η

Επικύρωση Ευρήματα μικροσυστοιχιών με ημι-ποσοτική RT-PCR (sqrt-PCR) και ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR)

Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών μας, αυθαίρετα επιλεγμένων 13 διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μετά από θεραπεία συνδυασμού. Μερικά από αυτά τα γονίδια έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να επηρεαστούν από sorafenib και από celecoxib και εμπλέκονται στη ρύθμιση της απόπτωσης, ER αντίδραση στο στρες, απόκριση βλάβη του DNA, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και εισβολή. Αυτά τα γονίδια που περιλαμβάνονται BIRC5 (survivin), κυκλίνη D1 (CCND1), χαρακίρι (HRK), βλάβη του DNA που επάγεται από παράγοντα μεταγραφής 3 (DDIT3, επίσης γνωστή ως GADD153 ή CHOP), Tribbles πρωτεΐνη που σχετίζεται με 3 (TRIB3, επίσης γνωστή ως TRB3 ), μεταλλοθειονεΐνη 2Α (MT2A), La μέλος της οικογένειας του τομέα ριβονουκλεοπρωτεΐνης 6 (LARP6), Yes σχετιζόμενη πρωτεΐνη 1 (YAP1), λιπαρό οξύ πρωτεΐνης δέσμευσης 1 (FABP1, επίσης γνωστή ως πρωτεΐνη λιπαρού οξέος δέσμευσης ήπατος τύπου, L- FABP), και Dickkopf 1 (DKK1). Επιπλέον, η έκφραση ορισμένων άλλων γονιδίων που αναφέρθηκε πρόσφατα ότι εμπλέκεται σε ηπατοκαρκινογένεσης, όπως Klotho-βήτα (KLB), αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών 19 (FGF19), περιοχή ινωδονεκτίνης τύπου III που περιέχει 3Β (FNDC3B), αναλύθηκε επίσης. Η γονιδιακή έκφραση ποσοτικοποιήθηκε με sqrt-PCR και σε ορισμένες περιπτώσεις με qRT-PCR σε έλεγχο και σε επεξεργασμένα κύτταρα. sqrt-PCR και qRT-PCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως για τα πειράματα μικροσυστοιχιών συνέχεια επαναλαμβάνεται χρησιμοποιώντας RNA εκχυλισμένο από δύο άλλα διαφορετικά πειράματα. Ο Πίνακας 3 δείχνει τις μετρήσεις γονιδιακής έκφρασης όλων των επικυρωμένων γονιδίων.

Η

Επικύρωση Ευρήματα μικροσυστοιχιών με Western Blotting

δεδομένα μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί για survivin (BIRC5) σημαντικά ήταν τα κάτω -regulated σε κύτταρα HepG2 κατά την κατεργασία με συνδυασμό σε σύγκριση με το μόνο παράγοντα.