Αφηρημένο

Η σισπλατίνη ανθεκτικό καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική σειρά IGROVCDDP είναι επίσης ανθεκτικά στην πακλιταξέλη και τα μοντέλα ο φαινότυπος αντίστασης των ασθενών με υποτροπιάζοντα καρκίνο των ωοθηκών μετά την πρώτη γραμμή πλατίνα /ταξάνη χημειοθεραπεία. Ένα TaqMan συστοιχία χαμηλής πυκνότητας (TLDA) χρησιμοποιήθηκε για να χαρακτηρίσει την έκφραση του 380 γονιδίων που σχετίζονται με την αντίσταση χημειοθεραπεία σε κύτταρα IGROVCDDP. αντίσταση πακλιταξέλη σε IGROVCDDP διαμεσολαβείται από γονίδιο και πρωτεΐνη υπερέκφραση της Ρ-γλυκοπρωτεΐνη και η πρωτεΐνη είναι λειτουργικά ενεργό. αντίσταση Cisplatin δεν αντιστράφηκε από elacridar, επιβεβαιώνοντας ότι η σισπλατίνη δεν είναι ένα υπόστρωμα της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης. αντίσταση Cisplatin σε IGROVCDDP είναι πολυπαραγοντική και διαμεσολαβείται εν μέρει από το μονοπάτι της γλουταθειόνης και μειωμένη συσσώρευση του φαρμάκου. Ολικό κυτταρικό γλουταθειόνης δεν αυξήθηκε. Ωστόσο, η ενζυμική δραστικότητα του GSR και GGT1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω. Το κυτταρικό εντοπισμό του μεταφορέα χαλκού CTR1 άλλαξε από μεμβράνη συνδέεται σε IGROV-1 για να κυτταροπλασματική σε IGROVCDDP. Αυτό μπορεί να μεσολαβήσει στην προηγουμένως αναφερόμενη συσσώρευση ελάττωμα. Υπήρχε μειωμένη έκφραση της αντλίας νατρίου-καλίου (ATP1A), MRP1 και FBP τα οποία όλα έχουν προηγουμένως σχετίζονται με ελαττώματα συσσώρευση λευκοχρύσου σε πλατίνα ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Κυτταρική εντόπιση της MRP1 επίσης μεταβληθεί σε IGROVCDDP μετατόπιση βασεοπλευρικά, σε σύγκριση με IGROV-1. BRCA1 επίσης up-ρυθμίζονται σε επίπεδο γονιδίου και της πρωτεΐνης. Η υπερέκφραση της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης σε ένα ανθεκτικό μοντέλο που αναπτύχθηκε με σισπλατίνη είναι ασυνήθιστη. Αυτό αποδεικνύει ότι η Ρ-γλυκοπρωτεΐνη μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω ως μια γενικευμένη αντίδραση στο στρες και όχι ως ειδική απόκριση σε ένα υπόστρωμα. Μηχανισμοί που χαρακτηρίζεται από κύτταρα IGROVCDDP μπορεί να εφαρμόζεται σε ασθενείς με υποτροπιάζοντα καρκίνο των ωοθηκών που έλαβαν θεραπεία με πρώτης γραμμής χημειοθεραπεία πλατίνα /ταξάνη

Παράθεση:. Stordal Β, Hamon Μ, McEneaney V, Roche S, Gillet JP, O’Leary JJ, et al. (2012) Η αντίσταση στην πακλιταξέλη σε Cisplatin-Resistant ωοθηκών Γραμμή Cancer Cell διαμεσολαβείται από την Ρ-γλυκοπρωτεΐνη. PLoS ONE 7 (7): e40717. doi: 10.1371 /journal.pone.0040717

Επιμέλεια: Αλέξανδρος James Roy Επίσκοπος, το Πανεπιστήμιο του Τέξας Επιστήμη Κέντρο Υγείας στο San Antonio, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Φεβρουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 12, Ιούν 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 Ιουλίου, 2012

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από την Marie Curie Διεθνής Εισερχόμενη υποτροφία από το πρόγραμμα της Ευρωπαϊκής Ένωσης του 7ου ΠΠ, καθώς και ένα Καρκίνου Irish Society μεταδιδακτορικής έρευνας (BS) . Η συνεργασία μεταξύ Britta Stordal και το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου υποστηρίχθηκε από μια Travel υποτροφία από την Ευρωπαϊκή Ένωση Cancer Research. Η έρευνα αυτή υποστηρίζεται επίσης από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο (JPG, MG). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και την ΑΝΑΛΥΣΗ, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

Η πρόγνωση για τις γυναίκες με καρκίνο των ωοθηκών είναι πολύ κακή. Η πλειοψηφία των ασθενών με προχωρημένη νόσο και την μακροπρόθεσμη επιβίωση σε αυτούς τους ασθενείς είναι 10-30% [1]. Η τρέχουσα θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών είναι η χειρουργική επέμβαση που ακολουθείται από συνδυασμό πλατίνας /ταξάνιο χημειοθεραπεία [1]. Η χημειοθεραπευτικά φάρμακα σισπλατίνη και πακλιταξέλη χρησιμοποιούνται στη θεραπεία πολλών στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών καρκίνωμα. Η σισπλατίνη προσδένεται στο κλώνο DNA, εμποδίζοντας τόσο την αντιγραφή του DNA και τη μετάφραση του RNA και τελικά την ενεργοποίηση της απόπτωσης. Η πακλιταξέλη προκαλεί κυτταροτοξικότητα με σύνδεση προς και σταθεροποιώντας πολυμερισμένο μικροσωληνίσκων. Λόγω των διαφορετικών τους μηχανισμούς δράσης, πλατίνας και ταξάνες συχνά συνδυάζονται στη θεραπεία του καρκίνου. Οι αρχικές ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία στον καρκίνο των ωοθηκών είναι υψηλή, αλλά έως και 80% των ασθενών τελικά θα υποτροπιάσουν και να γίνει ανθεκτικός πλατίνα /ταξάνιο.

Η σισπλατίνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή ωοθηκών IGROVCDDP είναι ένα ασυνήθιστο σισπλατίνη ανθεκτικό μοντέλο, όπως είναι επίσης διασταυρούμενη αντίσταση στο paclitaxel. Όταν επίκτητη αντοχή σισπλατίνη παράγεται σε κυτταρικές σειρές, μόνο το 17% είναι επίσης ανθεκτικά στο paclitaxel [2]. 41% των μοντέλων σισπλατίνη ανθεκτικών στα φάρμακα δεν είναι ανθεκτικά στην πακλιταξέλη και 28% των μοντέλων των κυττάρων γίνει υπερευαισθησία στην πακλιταξέλη [2]. Αυτό υποδηλώνει ότι η πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο θα ωφελούνταν από λαμβάνουν χημειοθεραπεία οποίο εναλλάσσεται μεταξύ σισπλατίνη και πακλιταξέλη, η ανάπτυξη αντοχή σε ένα φάρμακο είναι λιγότερο πιθανό να οδηγήσει σε αντίσταση στην άλλη. Η πρόκληση είναι πώς να προσδιορίσει ποιοι ασθενείς θα ανταποκρίνονται καλά σε εναλλασσόμενο θεραπεία μεταξύ σισπλατίνη και πακλιταξέλη. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι ενώ η πλειοψηφία των ασθενών με καρκίνο μπορεί να ανταποκριθεί καλά σε αυτή τη θεραπευτική στρατηγική, την ανθεκτική σταυρό ομάδα, θα ανταποκριθούν ανεπαρκώς και πρέπει να αντιμετωπίζονται με εναλλακτική θεραπεία.

μοντέλα IGROVCDDP το φαινότυπο αντίστασης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών που έχουν αποτύχει πρότυπο πρώτης γραμμής συνδυασμό πλατίνας /ταξάνιο χημειοθεραπεία. Χημειοθεραπευτικά φάρμακα, τα οποία IGROVCDDP είναι ευαίσθητη στην μπορεί να είναι κατάλληλη για τη θεραπεία του ανθεκτικού πλατίνας /ταξάνιο καρκίνο των ωοθηκών. Μελετώντας το μοντέλο IGROVCDDP ανθεκτικών στα φάρμακα θα μας επιτρέψει να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς της διασταυρούμενης αντίστασης μεταξύ πλατίνας και ταξάνες. Στόχος μας είναι να μεταφράσει μοριακών δεικτών αυτής της διασταύρωσης φαινοτύπων αντοχής στην κλινική θεραπεία της υποτροπιάζουσα καρκινώματος των ωοθηκών ανθεκτικών στα φάρμακα.

Μέθοδοι

Cell Culture και κυτταροτοξικότητα Αναλύσεις

Η ανθρώπινο IGROV-1 ωοθηκών κυτταρική γραμμή και σισπλατίνη ανθεκτική παραλλαγή της IGROVCDDP ελήφθησαν από τον καθηγητή Jan Schellens [3], [4]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε αντιβιοτικά και χημειοθεραπεία χωρίς RPMI (Sigma # R8758) με 10% FCS (Lonza, Βέλγιο). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO2 στους 37 ° C, και ήταν

μυκοπλάσματος

δωρεάν. Για τον προσδιορισμό των κυττάρων κυτταροτοξικότητα (1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες επίπεδου πυθμένα 96 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Wells υποβλήθηκαν σε επεξεργασία εις τριπλούν με σειριακές αραιώσεις του φαρμάκου σε τελικό όγκο 200 μL. Στεγνά έλεγχοι περιλήφθηκαν σε κάθε δοκιμασία. Οι πλάκες επωάστηκαν για περαιτέρω 5 ημέρες και κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία όξινης φωσφατάσης [5].

TaqMan χαμηλής πυκνότητας Array (TLDA)

Τα κύτταρα (1,25 χ 10

6 κύτταρα /10 cm τρυβλίου) απλώθηκαν και αφέθηκαν να προσκολληθούν και να αναπτυχθούν για 3 ημέρες για να φθάσουν 70-80% συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια τρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν σε 10 mL PBS, φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Τα σφαιρίδια του κυττάρου φυλάχθηκαν στους -80 ° C πριν από την ανάλυση. Ολικό RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, UK). Η συστοιχία TLDA διεξήχθη σε δείγματα βιολογικών τριπλούν όπως περιγράφεται στο Gillet

κ.ά.

. 2011 [6]. Η διάμεση έκφραση εκάστου δείγματος αφαιρέθηκε από όλες τις γονιδιακή έκφραση για το δείγμα αυτό. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

ArrayTools BRB

, ένα εργαλείο στατιστικής ανάλυσης μικροσυστοιχιών-δεδομένων (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) [7]. Γονιδίων που εκφράζονται κατά λιγότερο από 50% των δειγμάτων φιλτραρίστηκαν και ένα μονομεταβλητών δύο δειγμάτων Τ-τεστ εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί γονίδια που ήταν σημαντικά διαφορετικά μεταξύ IGROV-1 και IGROVCDDP βασίζονται σε ρ & lt?. 0.01 αποκοπής

Epirubicin συσσώρευση Δοκιμασία

τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 2.5 χ 10

5 σε ένα μη-εξαερίζεται φιάλη Τ25. Την επόμενη ημέρα το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μΜ epirubicin για 2 ώρες παρουσία ή απουσία του 0,25 μΜ elacridar, 0.67 μΜ, 3.33 μΜ ή 33,3 μΜ cisplatin. Τα κύτταρα πλύθηκαν με 4 ml ψυχρού PBS και τρυψινοποιήθηκαν. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 1 mL PBS και ένας αριθμός κυττάρων πραγματοποιείται (9 μί). Τα υπόλοιπα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το σφαιρίδιο αποθηκεύτηκε στους -20 ° C πριν από την ανάλυση. Σύνολο epirubicin κατόπιν ποσοτικά με LC-MS μετά από την προετοιμασία του δείγματος εκχύλιση υγρού-υγρού, σύμφωνα με την μέθοδο του τείχους

κ.ά.

. 2007 [8].

ολικό κυτταρικό Δοκιμασία γλουταθειόνη

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1.25 χ 10

6 κύτταρα σε ένα πιάτο διαμέτρου 10 cm και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. Τα κύτταρα φάρμακο σε θεραπεία για 24 ώρες, στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και ένας αριθμός κυττάρων που εκτελούνται. Τα κύτταρα πλύθηκαν σε 10 mL PBS, φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Τα σφαιρίδια του κυττάρου φυλάχθηκαν στους -20 ° C πριν από την ανάλυση. Σύνολο γλουταθειόνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση της Suzakake

et al

. [9]. Οι σβώλοι κυττάρων λύθηκαν σε 150 μL νερό και επεξεργασία με υπερήχους, προστέθηκε 12.5 μί 30% sulfosalicyclic οξύ και τα δείγματα στροβιλίστηκαν. Μετά από 30 λεπτά σε πάγο, τα υπερκείμενα χωρίς πρωτεΐνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (12.000

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C). συγκέντρωση γλουταθειόνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα μίγμα αντίδρασης που περιέχει 20 μί κυτταρολύματος ή προτύπου, 90 μL ρυθμιστικού τριαιθανολαμίνης, ρΗ 8.0 (0.2 Μ), 30 μι NADPH (4 mM) και 20 μι DTNB (6 mM). Μετά από 2 λεπτά στους 30 ° C, η αντίδραση ξεκίνησε με την προσθήκη 0,3 μονάδων αναγωγάσης γλουταθειόνης ανά φρεάτιο. Οι πλάκες αναγνώστηκαν στα 405 ηΜ (προθέρμανση στους 30 ° C) με κινητική μέτρησης με ένα συνεργία ΗΤ αναγνώστη πλάκας, Bio-Tek® (Mason Technology). Ο ρυθμός μεταβολής της κινητικής ανάλυσης στη συνέχεια υπολογίστηκε από το λογισμικό KC4

αναγωγάσης της γλουταθειόνης (GSR) και Γάμμα Γλουταμυλτρανσφεράση τρανσπεπτιδάσης (GGT1) Ένζυμο Αναλύσεις

Κυτταρική καλλιέργεια -. Κύτταρα (6,25 × 10

5 κύτταρα /10 cm τρυβλίου) απλώθηκαν και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0,67 μΜ σισπλατίνη. κύτταρα αγωγής με φάρμακο και τους ελέγχους τους τρυψινοποιήθηκαν και ένας αριθμός κυττάρων που εκτελούνται. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν σε 10 mL PBS, φυγοκεντρήθηκαν και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 400 μL ρυθμιστικού κρύο ένζυμο προσδιορισμού (100 mM μονοβασικό φωσφορικό κάλιο, 100 mM EDTA? ΡΗ 7.5). 16 μL από 25 × Complete Protease Inhibitor (Roche, UK) προστέθηκε, και το δείγμα υποβλήθηκε σε υπερήχους. Μετά από φυγοκέντρηση (13,000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C) το υπερκείμενο συλλέχθηκε και καταψύχθηκε στους -80 ° C πριν από την ανάλυση

GSR -. GSR (Sigma) πρότυπα έγιναν σε ρυθμιστικό αραίωσης γλουταθειόνη αναγωγάση ( 100 mM φωσφορικό κάλιο μονοβασικό? 100 mM EDTA? 1 mg /mL BSA? ρΗ 7,5) που κυμαίνονται από 0.3-0.0037 μονάδες /mL. 40 μL από κάθε δείγμα και πρότυπο αναλύθηκαν εις διπλούν σε πλάκες των 96 φρεατίων. Το μίγμα της αντίδρασης στη συνέχεια προστέθηκαν 160 μL συνολικός όγκος (2 mM οξειδωμένη γλουταθειόνη (100 μL)? 3 mM DNTB (50 μL)? 2 mM NADPH (10 μL)).

GGT1- Η μέθοδος προσαρμόστηκε από η μέθοδος της Silber

et al

. [10]. GGT1 πρότυπα (Patricell, UK) έγιναν σε νερό που κυμαίνεται από 1000-1.6 μονάδες /L. 30 μL από κάθε δείγμα και πρότυπο αναλύθηκε εις διπλούν σε πλάκες των 96 φρεατίων. Στη συνέχεια προστέθηκε 100 μL μίγματος αντίδρασης (60 mM γ-γλουταμυλο-π-nitroalinine (10 μL)? 55.5 mM glyclglycine σε 133,33 mM Tris Base ρΗ 8.5 (90 μL)).

Ανάλυση – Οι πλάκες αναγνώστηκαν στα 412 ηΜ (προθέρμανση στους 30 ° C) και 405 ηΜ (προθέρμανση στους 37 ° C) για GSR και GGT1 αντίστοιχα, με κινητικές μετρήσεις με αναγνώστη πλάκας όπως περιγράφεται για την δοκιμασία γλουταθειόνης.

Western Blots

τα κύτταρα (1,25 χ 10

6 κύτταρα /10 cm τρυβλίου) απλώθηκαν και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια αγωγής με φάρμακο με σισπλατίνη και αναπτύχθηκαν για 3 ημέρες. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μι ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (0.01 Μ Tris /HCl, ρΗ 7,4) και υφίσταται κατεργασία με υπερήχους. 20 μα πρωτεΐνης αραιώθηκε σε Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος, βράζεται για 3 λεπτά, ψύχθηκε επί πάγου και φορτώθηκαν σε 12% πήγματα Τπδ /γλυκίνης με ένα ζελέ στοίβαξης 4%. Δείγματα και δείκτες μοριακού βάρους στη συνέχεια electrophoresised για 90 λεπτά στους 100 V. Τα πήγματα ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε 0,45 μm μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Biorad) για 90 λεπτά σε 100 V χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υγρής μεταφοράς (Biorad). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο αποβουτυρωμένο γάλα (Biorad) σε PBS για 2 ώρες, στη συνέχεια επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα που παρασκευάζεται στο 3% αποβουτυρωμένο γάλα /0.1% Tween /PBS (Πίνακας 1) όλη τη νύκτα στους 4 ° C [11 ]. Οι μεμβράνες πλύθηκαν σε 0,3% Tween /PBS 3 χ 10 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα με συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα (Πίνακας 1). Οι μεμβράνες πλύθηκαν και πάλι και εκτίθενται σε αντιδραστήριο λουμινόλης (Santa Cruz) ή ECL advanced κηλίδωση Western αντιδραστήριο (GE Healthcare). Οι μεμβράνες εκτέθηκαν σε φιλμ αυτοραδιογραφίας. β-ακτίνης κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα με αλκαλική φωσφατάση (Πίνακας 1) και Sigma αντιδραστήριο Fast BICP. Πυκνομετρία σε ένα ελάχιστο η = 3 βιολογική επαναλήψεις διεξήχθη χρησιμοποιώντας Ποσότητα Ένα λογισμικό (Biorad), με τη χρήση τοπικών διόρθωση υποβάθρου. Αφθονία πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε με Ponceau για κάθε δείγμα και στη συνέχεια κάθε βιολογική σειρά ομαλοποιήθηκε με IGROV-1.

Η

Ομοεστιακή Μικροσκοπίας

Τα κύτταρα (1,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες θαλάμου 8 βοθρίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Όλες οι πλύσεις έγιναν με PBS και όλες οι επωάσεις έγιναν σε θερμοκρασία δωματίου εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές, και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (Sigma) σε PBS για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα permabilised με 0,5% Triton-X-100 (Sigma) για 10 λεπτά και πλύθηκαν δύο φορές. Τα κύτταρα βάφτηκαν με ένα /mL διάλυμα TRITC φθορισμού 50 μg σε PBS για 40 λεπτά και στη συνέχεια πλένεται δύο φορές. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού (0.02% BSA σε PBS) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (Πίνακας 1) για 2 ώρες σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές για 5 λεπτά και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα (Πίνακας 1) για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές για 5 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλύφθηκαν με χρήση μέσων στερέωσης που περιείχε ϋΑΡΙ (Sigma) και αποθηκεύθηκαν στους 4 ° C πριν από μικροσκόπιο. Εικόνες συνελήφθησαν σε Χ63 μεγέθυνση και × 1 ζουμ. Σαρώνει έγιναν στο 1 μm διάστημα βάθη μέσω των σταθερών κυττάρων, και ενιαίο ή συγχωνευμένο εικόνες που παρουσιάζονται είτε ως XY μόνο τα αεροπλάνα μέσα από το μεσαίο τμήμα των κυττάρων ή ορθογώνια προβολή.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ελάχιστο εις τριπλούν. Δύο δείγμα, χρησιμοποιήθηκαν δύο t-τεστ ουρά μαθητή για να καθορίσει σημαντικές διαφορές χρησιμοποιώντας p & lt?. 0.05 ως κόψει

Αποτελέσματα

Ταξάνης Αντίσταση στην IGROVCDDP είναι διαμεσολαβείται από την P-γλυκοπρωτεΐνη

Ο IGROV-1 και IGROVCDDP κύτταρα αναλύθηκαν για 380 γονιδίων που σχετίζονται με χημειοαντίσταση με συστοιχία TLDA για το χαρακτηρισμό των μηχανισμών της πλατίνας και αντίσταση ταξάνης. 145 γονίδια βρέθηκαν να είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ IGROV-1 και IGROVCDDP βασίζονται σε ρ & lt? 0,01 αποκοπής. Γονίδια που επιλέχθηκαν για περαιτέρω αναλύσεις με βάση την πιο σημαντική από p-value, καθώς και εκείνες τις πορείες προηγουμένως συνδέονται με πλατίνα και αντίσταση ταξάνης (Πίνακας 2). Όλα τα γονίδια που παρατίθενται στον πίνακα δύο ήταν επικυρώνονται σε επίπεδο πρωτεΐνης με στύπωμα Western.

Η έκφραση του γονιδίου της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) είναι αυξημένη σε IGROVCDDP (Πίνακας 2), και υπάρχει μία αντίστοιχη αύξηση σε έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα 1Α). Μια θεραπεία 3-ημερών με χαμηλή δόση σισπλατίνης έτειναν να αυξάνουν την έκφραση Ρ-σρ σε αμφότερα IGROV-1 και IGROVCDDP, αλλά αυτό δεν ήταν σημαντική (Σχήμα 1Α). P-gp Επιβεβαιώθηκε επίσης ότι είναι λειτουργικά ενεργός σε IGROVCDDP με μία μέθοδο προσδιορισμού epirubicin συσσώρευση (Σχήμα 1Β). Τα κύτταρα IGROVCDDP έχουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα του P-gp epirubicin υπόστρωμα μετά από έκθεση 2 ωρών σε σύγκριση με IGROV-1. Όταν IGROVCDDP υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,25 μΜ του αναστολέα elacridar P-gp, η οποία εμποδίζει τη δράση της αντλίας φαρμάκου [12], η συσσωρευμένη μάζα της epirubicin αυξήθηκε και ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των μητρικών κυττάρων IGROV-1. Η αύξηση πάνω από το επίπεδο της IGROV-1 είναι μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση, και μπορεί να οφείλεται στα κύτταρα IGROVCDDP είναι τόσο εξαρτημένη από την P-γλυκοπρωτεΐνη για αποβολής του φαρμάκου? υποφέρουν περισσότερο συσσώρευση του φαρμάκου όταν αναστέλλεται.

Α) Western στύπωμα της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης, IGROV-1 (ανοιχτές ράβδοι) και IGROVCDDP (γκρι ράβδοι) με και χωρίς αγωγή με 0,67 μΜ cisplatin για 72 ώρες (ριγέ μπαρ). Αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του n = 6 βιολογική επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. * Δηλώνει σημαντική διαφορά από IGROV-1 p & lt? T-test 0,05 μαθητή. Β) Συσσώρευση epirubicin προσδιορίζεται με LC-MS. IGROV-1 (ανοιχτό μπαρ) και IGROVCDDP (σκιασμένες στήλες). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ epirubicin για 2 ώρες, 0,25 μΜ elacridar, 0.67 μΜ, 3.33 μΜ ή 33,3 μΜ cisplatin ερευνήθηκαν ως ρυθμιστές της συσσώρευσης epirubicin. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του η = 3 βιολογική επαναλήψεις κανονικοποιούνται προς τον αριθμό των κυττάρων. * Υποδεικνύει μιά σημαντική διαφορά μεταξύ IGROV-1 και IGROV-CDDP, # Υποδεικνύει μια σημαντική διαφορά για την προσθήκη ενός ρυθμιστή (ρ & lt? 0,05 φοιτητές t-test). C) Η κυτταροτοξικότητα του IGROV-1 και IGROVCDDP προς Ρ-γλυκοπρωτεΐνη και μη Ρ-γλυκοπρωτεΐνη υποστρώματα.

Η

κύτταρα IGROVCDDP υποβλήθηκαν σε διαλογή για την ανταπόκρισή τους σε μια ποικιλία χημειοθεραπευτικών (Σχήμα 1 C). κύτταρα IGROVCDDP είναι σημαντικά ανθεκτικές σε υποστρώματα μη-Ρ-§ρ σισπλατίνη και η καρβοπλατίνη [13]. IGROVCDDP είναι επίσης σημαντικά ανθεκτικό σε υποστρώματα της P-gp [14]? ταξάνες, πακλιταξέλη και ταξοτέρη, η ανθρακυκλίνη epirubicin και βίνκα αλκαλοειδές βινβλαστίνη. Σε αντίθεση, IGROVCDDP είναι υπερευαίσθητος σε θεραπεία με υπόστρωμα μη-Ρ-§ρ 5-FU [15]. IGROVCDDP είναι ανθεκτικά σε μεθοτρεξάτη υπόστρωμα MRP1 [14], αλλά όχι ανθεκτικό σε υπόστρωμα BCRP SN-38 (Σχήμα 1 C) [16]. Η θεραπεία με 0.25 μΜ elacridar αντιστρέφει σημαντικά την αντίσταση των κυττάρων IGROVCDDP σε όλα τα υποστρώματα της P-gp, αλλά όχι η αντίσταση στην σισπλατίνη, καρβοπλατίνη και μεθοτρεξάτη. κύτταρα IGROVCDDP είναι επίσης πιο ευαίσθητα σε elacridar μεταχείριση από IGROV-1 (Πίνακας 3). κύτταρα IGROVCDDP έχουν μειωθεί mRNA έκφραση του BCRP (Πίνακας 2) και δεν είναι ανιχνεύσιμη με western blot (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό υποδηλώνει ότι τα αποτελέσματα αντιστροφή παρατηρηθεί με τη θεραπεία elacridar είναι ειδικά για P-gp και όχι BCRP, που elacridar αναστέλλει επίσης.

Η

Ο αντίκτυπος της συνεργασίας ή προ-θεραπεία με σισπλατίνη σε πακλιταξέλη κυτταροτοξικότητα διερευνήθηκε και καμία σημαντική αλλαγή δεν παρατηρήθηκε (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Παρομοίως, συν- ή προ-θεραπεία με πακλιταξέλη δεν ανέστρεψε σισπλατίνη αντίσταση (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

αντίσταση λευκόχρυσου συνδυάζεται με ένα ενδοκυτταρικό μετατόπιση της πρόσληψης πλατίνα μεταφορέα CTR1 δεν αντίσταση που προκαλείται από MRP2.

Α) Η κυτταροτοξικότητα του IGROV-1 και IGROVCDDP να CuSO

4. Β) ATP7A κηλίδα western. Ανοίξτε το μπαρ είναι IGROV-1, σκιασμένες στήλες είναι IGROVCDDP και ριγέ μπάρες δείχνουν θεραπεία με 0.67 μΜ σισπλατίνη για 72 ώρες. Αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του n = 4 βιολογικές επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Γ) CTR1 κηλίδα western. Αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του η = 3 βιολογική επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. * Δηλώνει σημαντική διαφορά από IGROV-1 p & lt? T-test 0,05 μαθητή. CTR1 συνεστιακή μικροσκοπία στο D) IGROV-1 και Ε) κύτταρα IGROVCDDP. Οι XY αεροπλάνα εμφανίζονται για DAPI (μπλε), Golgi (κόκκινο) και CTR1 (πράσινο), μια συγχωνευμένη εικόνα παρουσιάζεται επίσης.

Η

MRP2, ένας μεταφορέας που μπορεί να εκρέει συζυγών σισπλατίνη, είχε μειωμένη έκφραση του γονιδίου σε IGROVCDDP (Πίνακας 2), αλλά δεν ήταν ανιχνεύσιμη με western blot σε οποιαδήποτε κυτταρική σειρά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό υποδηλώνει ότι δεν υπάρχει ρόλος του εκροής πλατίνας μεταφορέα MRP2 στην αντίσταση λευκόχρυσου του IGROVCDDP. μεταφορείς χαλκού μπορεί επίσης να διαδραματίσει ένα ρόλο στην πρόσληψη του λευκόχρυσου (CTR1) και εκροής (ATP7A και ATP7B) [17]. Μια μείωση στην έκφραση CTR1 ή αύξηση ATP7A ή ATP7B θα μπορούσαν δυνητικά να μεσολαβήσει αντίστασης πλατίνας. Τα κύτταρα IGROVCDDP είναι 2,26 φορές πιο ανθεκτικό στο CuSO

4 (Εικόνα 2Α), υποδεικνύοντας ότι ο μεταβολισμός του χαλκού μπορεί να παίζει κάποιο ρόλο στον μηχανισμό αντίστασης. Δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στην έκφραση του mRNA CTR1, ATP7A και ATP7B στη συστοιχία TLDA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). έκφραση πρωτεΐνης ATP7A έτειναν να αυξάνονται σε IGROVCDDP σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη, αλλά η αλλαγή αυτή δεν είναι σημαντική (Σχήμα 2Β). Ωστόσο, υπήρξε μια σημαντική μείωση της έκφρασης CTR1, σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη θεραπεία φαρμάκου στα κύτταρα IGROVCDDP (Σχήμα 2C). CTR1 είναι παρόν στην κυτταρική μεμβράνη σε IGROV-1 και μετατοπίζει ενδοκυτταρικά στο κυτταρόπλασμα σε IGROVCDDP (Σχήμα 2D, E). Υπάρχει κάποια σύνδεση των CTR1 με τη Golgi σε IGROVCDDP αλλά η χρώση είναι συνεπής σε όλο το κυτταρόπλασμα.

Μεταφορικές ως βιοδείκτες της Platinum Συσσώρευσης Ελάττωμα

Ένα από τα πιο σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε IGROVCDDP ήταν μια μείωση στην έκφραση του Na

+ /K

+ αντλία (ATP1A1) (Πίνακας 2), η οποία έχει προηγουμένως συσχετιστεί με ελαττώματα συσσώρευση λευκοχρύσου [18]. Η σισπλατίνη δεν μεταφέρεται από ATP1A1 και να μεταβληθεί το δυναμικό της μεμβράνης μπορεί να παίζει ρόλο στην παθητική συσσώρευση του φαρμάκου. Υπήρχε μια αντίστοιχη μείωση στην πρωτεΐνη έκφραση του ATP1A1 (Σχήμα 3Α) και επίσης μια ευαισθησία στην θεραπεία με τον αναστολέα ουαμπαϊνη ATP1A1 [19] (Πίνακας 3). Ωστόσο, όταν 0.01 ηΜ ουαμπαϊνη ήταν συν-επωάστηκαν σε μια δοκιμασία σισπλατίνη κυτταροτοξικότητας παρά την αντιστροφή της αντίστασης σε IGROVCDDP μειώθηκε το IC

50 και των δύο κυττάρων IGROV-1 και IGROVCDDP εξίσου, η πτυχή αντίσταση μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών παρέμειναν σταθερά (Πίνακας 3). IGROVCDDP δεν ήταν ανθεκτική σε NaCl ή KCl σαν απλούς παράγοντες και την προσθήκη 40 mM των αλάτων αυτών δεν μετέβαλε σημαντικά την κυτταροτοξικότητα της σισπλατίνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Άνοιγμα ράβδοι είναι IGROV-1, σκιασμένες ράβδοι είναι IGROVCDDP και ριγέ ράβδοι υποδεικνύουν αντιμετώπιση με 0,67 μΜ σισπλατίνης για 72 ώρες. Α) ATP1A1 κηλίδα western. Αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του n = 4 βιολογικές επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Β) MRP1 κηλίδα western. Αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του η = 3 βιολογική επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. * Δηλώνει σημαντική διαφορά από IGROV-1 p & lt? T-test 0,05 μαθητή. MRP1 ομοεστιακό μικροσκόπιο σε C) IGROV-1 και D) κύτταρα IGROVCDDP. Οι ορθογώνιες εικόνες εμφανίζονται για μια νέα εικόνα DAPI (μπλε) και MRP 1 (πράσινο), τα βέλη στα μπαρ πλευρά δείχνουν την κορυφαία (IGROV-1) και πλαγιοβασική θέση της MRP1 (IGROVCDDP). FBP ομοεστιακό μικροσκόπιο σε Ε) IGROV-1 και F) IGROVCDDP κύτταρα. Οι XY αεροπλάνα εμφανίζονται για DAPI (μπλε), ακτίνη (κόκκινο) και FBP (πράσινο), μια συγχωνευμένη εικόνα παρουσιάζεται επίσης.

Η

Προηγούμενη έρευνα έχει δείξει μειωμένη έκφραση και ενδοκυτταρική μετατόπιση των πρωτεϊνών μεμβράνης MRP1 και FBP να συνδέεται με ένα ελάττωμα σε συσσώρευση λευκοχρύσου σε σισπλατίνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές [20]. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε MRP1 και FBP ως πιθανούς βιοδείκτες ενός ελαττώματος στην συσσώρευση της πλατίνας σε IGROVCDDP. Τα κύτταρα IGROVCDDP έχουν μια μείωση της έκφρασης του mRNA του MRP1 (Πίνακας 2), καθώς και μια μικρή μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης MRP1 σε απόκριση σε θεραπεία cisplatin (Σχήμα 3Β). διανομή MRP1 εξετάστηκε με συνεστιακή μικροσκοπία (Σχήμα 3C, D). Χρώση στις δύο κυτταρικές σειρές IGROV-1 και IGROVCDDP είναι εμφανής στο κυτταρόπλασμα και περιπυρηνική περιοχή με κάποιες συσσωρεύσεις MRP1 εμφανής. Σε IGROV-1 υπάρχει περισσότερο MRP1 παραπάνω και σε όλη την μπλε γραμμή στο ορθογώνια παρατήρηση δείχνει ότι είναι στο κορυφαίο και μεσαίο τμήμα στα κύτταρα. Η πλειοψηφία της χρώσης σε IGROVCDDP είναι κάτω από την μπλε γραμμή είναι βασεοπλευρικά βρίσκεται. FBP είναι εντοπισμένη κυρίως πλησίον του πυρήνα εντός διακριτών υποκυτταρικών κυστίδια? λίγο κυτταροπλασματική χρώση είναι εμφανής (Σχήμα 3Ε, F). Δεν υπάρχει καμία αλλαγή στην κυτταρική κατανομή των FBP μεταξύ IGROV-1 και IGROVCDDP, αλλά μια μείωση στην έκφραση της FBP σε IGROVCDDP προκύπτει από τις συνεστιακή εικόνες.

Άνοιγμα μπαρ είναι IGROV-1, σκιασμένες στήλες είναι IGROVCDDP και ριγέ μπάρες δείχνουν θεραπεία με 0.67 μΜ σισπλατίνη. Α) Σύνολο ενδοκυτταρικής γλουταθειόνης. Γράφημα δείχνει n = 3 βιολογική επαναλήψεις ρυθμίζεται σύμφωνα με τον αριθμό των κυττάρων. Β) γGCS κηλίδα western. Αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του n = 4 βιολογικές επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Γ) GSR ​​κηλίδα western. Αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του η = 3 βιολογική επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Δ) GSR ​​δοκιμασία ενζύμου. Γράφημα δείχνει n = 4 βιολογικών επαναλήψεις ρυθμίζεται σύμφωνα με τον αριθμό των κυττάρων. Ε) GGT1 κηλίδα western. Αντιπροσωπευτικά εικόνα που φαίνεται γραφική παράσταση δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του η = 3 βιολογική επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. Ε) GGT1 δοκιμασία ενζύμου. Γράφημα δείχνει n = 4 βιολογικών επαναλήψεις ρυθμίζεται σύμφωνα με τον αριθμό των κυττάρων. * Δηλώνει σημαντική διαφορά από IGROV-1 p & lt? T-test 0,05 μαθητή. # Υποδηλώνει σημαντική διαφορά από IGROVCDDP σχετικά με την προσθήκη σισπλατίνης. Ζ) Διαμόρφωση της σισπλατίνης κυτταροτοξικότητα της IGROV-1 και IGROVCDDP με BSO.

Η

Platinum Αντίσταση στην IGROVCDDP συνδέεται με μια αύξηση της γλουταθειόνης Ανακύκλωση δεν Αυξημένη de novo σύνθεση

Η έκφραση του mRNA αναγωγάσης γλουταθειόνης (GSR) και τρανσπεπτιδάσης γάμα γλουταμυλίου (GGT1) έχουν και οι δύο αυξήθηκαν σημαντικά σε IGROVCDDP (Πίνακας 2). GSR λειτουργίες για να ανακυκλώνουν οξειδωμένη γλουταθειόνη εντός του κυττάρου [21], [22] και GGT1 ανακυκλώνει γλουταθειόνης έξω από την κυτταρική μεμβράνη [21], [22]. Η έκφραση της πρωτεΐνης του GSR και GGT1 δεν αυξήθηκαν στα κύτταρα IGROVCDDP, GSR μειώθηκε σημαντικά σε IGROVCDDP και δεν υπήρχε μεταβολή στην GGT1. (Σχήμα 4Α και 4Β). Ωστόσο, η ενζυμική δραστικότητα και των δύο GSR και GGT1 αυξήθηκαν σημαντικά (Σχήμα 4C και Εικόνα 4D)? γεγονός που υποδηλώνει ότι η γλουταθειόνη είναι να ανακυκλώνονται πιο μέσα και έξω από το κύτταρο.

Άνοιγμα μπαρ είναι IGROV-1, σκιασμένες στήλες είναι IGROVCDDP και ριγέ μπάρες δείχνουν θεραπεία με 0.67 μΜ σισπλατίνη για 72 ώρες. Α) BRCA1 κηλίδα western. Αντιπροσωπευτική εικόνα εμφανίζεται. Γράφημα δείχνει ποσοτικό προσδιορισμό του n = 4 βιολογικές επαναλήψεις ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη. * Δηλώνει σημαντική διαφορά από IGROV-1 p & lt?. T-test 0,05 μαθητή

Η

κύτταρα IGROVCDDP δεν έχουν υψηλότερα επίπεδα της γλουταθειόνης, και τα επίπεδα δεν έχουν αυξηθεί με τη θεραπεία με σισπλατίνη χαμηλού επιπέδου (Σχήμα 4Ε) . Τα επίπεδα της γλουταθειόνης ήταν επίσης πιο μεταβλητή στα κύτταρα IGROVCDDP. Η θεραπεία με 12,5 μΜ butathione σουλφοξιμίνη (BSO), ενός αναστολέα της γGCS [23] μειώθηκε σημαντικά κυτταρικά γλουταθειόνης τόσο στην κύτταρα IGROVCDDP IGROV-1 και (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). IGROV-1 και IGROVCDDP έχουν επίσης παρόμοια πρωτεΐνη έκφραση γGCS και δεν ρυθμίζεται αυξητικά σε απόκριση χαμηλού επιπέδου θεραπεία cisplatin (Σχήμα 4F). θεραπεία BSO επίσης ευαισθητοποιημένα σημαντικά αμφότερες τις κυτταρικές σειρές σε σισπλατίνη (Εικόνα 4G). Ωστόσο, η επίδραση ήταν ισοδύναμο και η αντίσταση σισπλατίνη δίπλωσης παρέμεινε σταθερό (18,76 φορές). Τα κύτταρα IGROVCDDP έτειναν να είναι πιο ευαίσθητα στη θεραπεία BSO μόνο σε μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας, ωστόσο αυτό δεν ήταν σημαντική (Σχήμα 4G).

Η

IGROVCDDP έχει αυξημένη έκφραση γονιδίων BRCA1

Η αυξημένη έκφραση της το γονίδιο BRCA1 επιδιόρθωσης του DNA έχει προηγουμένως σχετίζονται με την αντίσταση σισπλατίνη [24]. κύτταρα IGROVCDDP έχουν αυξηθεί mRNA (Πίνακας 2) και πρωτεΐνη έκφρασης των γονιδίων BRCA1 (Εικόνα 5Α).

Συζήτηση

P-gp Η υπερέκφραση είναι ασυνήθιστο σε ένα μοντέλο της Επίκτητης Cisplatin Αντίστασης

Αντοχή σε paclitaxel σε κύτταρα IGROVCDDP διαμεσολαβείται από μια υπερέκφραση της Ρ-gp στο γονίδιο (Πίνακας 2) και στο επίπεδο πρωτεΐνης (Εικόνα 1Α). P-gp έχει δειχθεί ότι είναι λειτουργικώς δραστικό με δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας (Σχήμα 1 C) και δοκιμασίες συσσώρευσης epirubicin (Σχήμα 1Β). Σε αντίθεση με άλλες μελέτες [25], η βραχυπρόθεσμη θεραπεία σισπλατίνη δεν διαμορφώνουν την έκφραση Ρ-gp πρωτεΐνη, τη δραστηριότητα ή ταξανίου κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα IGROVCDDP (Σχήμα 1Α, 1Β, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ασυνήθιστο, αλλά όχι πρωτοφανές για να δείτε ένα μοντέλο της επίκτητης αντοχής σισπλατίνη υπερεκφράζουν Ρ-gp (Πίνακας 4) [26] – [30]. Αυτό πιθανότατα αντιπροσωπεύει μία γενικευμένη αντίδραση άγχους σε μακροχρόνια θεραπεία σισπλατίνη ως σισπλατίνη δεν είναι ένα υπόστρωμα της P-gp [13]. P-gp μπορεί να είναι up-ρυθμίζονται ως μέρος μιας απάντησης στην αύξηση της αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μέσα σε ένα κύτταρο [31]. Αυτό μπορεί να είναι ο λόγος P-gp έκφραση προκλήθηκε σε IGROVCDDP ως ROS παράγονται επίσης σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη [32]. Ωστόσο, καθώς τα κύτταρα IGROVCDDP καλλιεργούνται χωρίς σισπλατίνη στα μέσα μαζικής ενημέρωσης, φαίνεται να υπάρχει ούτε ένα άλλο ερέθισμα που ευνοούν την έκφραση της P-gp ή P-gp παρέχει επιλεκτικό πλεονέκτημα στην IGROVCDDP κύτταρα.

Πολλά μοντέλα της επίκτητη αντοχή φάρμακο θα έχει η υπερέκφραση ενός μεταφορέα που εκροές το φάρμακο που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη του μοντέλου. Η κολχικίνη, ένα υπόστρωμα P-gp [33] που έχουν επιλεγεί για P-gp υπερέκφραση σε ΚΒ-8-5-11 κύτταρα [34] και επιρουβικίνη, ένα υπόστρωμα MRP1 [35] επαγόμενη έκφραση MRP1 σε CCRF-CEM /E1000 [36]. Ωστόσο, μεθοτρεξάτη, φθοροουρακίλη, χλωραμβουκίλη, σισπλατίνη, και υδροξυουρία όλα έχουν δειχθεί ότι επάγουν παροδικά την έκφραση της P-gp σε κύτταρα λευχαιμίας Κ562 όταν αυτά τα φάρμακα δεν είναι υποστρώματα της P-gp [15]. Είναι τότε μέχρι και φυσική επιλογή εάν τα κύτταρα που εκφράζουν παροδικά P-gp έχει οποιοδήποτε άλλο πλεονέκτημα επιβίωσης και να γίνει μέρος της κυτταρικής σειράς ανθεκτικών στα φάρμακα. Σε ορισμένες σισπλατίνη ανθεκτικά μοντέλα τα οποία υπερεκφράζουν P-gp, η P-gp δεν έχει κανένα πλεονέκτημα επιβίωσης καθώς δεν είναι λειτουργικά ενεργός (SNU-601 /Cis10 – Πίνακας 4) [29]. Εντός cisplatin ανθεκτικά P-gp υπερεκφράζουν κυτταρικές σειρές μπορούν επίσης να υπάρχει ανομοιογένεια? σε SKOV3 /CIS P-gp θετικών και αρνητικών πληθυσμοί διατηρήθηκαν μετά την θεραπεία με σισπλατίνη, υποδεικνύοντας ότι η Ρ-gp δεν έχει πλεονέκτημα επιβίωσης για τη θεραπεία της σισπλατίνης [27]. Ωστόσο, P-gp μπορεί να έχουν αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα διαφέρουν από εκείνες που συνδέονται με τη μεταφορά των κυτταροτοξικών φαρμάκων, και μερικοί μπορεί να διαμεσολαβείται μέσω εκροής των προ-αποπτωτικών γλυκοσυλκεραμιδίου [37], [38]. Είναι επίσης δυνατόν ότι μερικές ξενοβιοτικών που υπάρχουν στο FCS χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια των κυττάρων θα μπορούσε να βοηθήσει στην διατήρηση της P-gp έκφραση σε IGROVCDDP.

IGROVCDDP είναι το μόνο σισπλατίνη ανθεκτικό μοντέλο που αναπτύχθηκε από IGROV-1 είναι γνωστό ότι υπερεκφράζουν P-gp και συνεπώς έχουν ένα πλατίνας /ταξάνιο ανθεκτικό φαινότυπο. Η σισπλατίνη ανθεκτικά μοντέλα IGROV-1 /Pt0.5 και IGROV-1 /Pt1 [39] έχουν το αντίστροφο πλατίνας /ταξάνιο ανθεκτικό φαινότυπο. Άλλα μοντέλα σισπλατίνη ανθεκτικά IGROV-1 έχουν αναπτυχθεί (IGROV-R10, IGROV-1 /CP), αλλά δεν φαίνεται να έχουν εξεταστεί για ανθεκτικότητα σε υποστρώματα της P-gp ή έκφραση P-gp. Ωστόσο, P-gp δεν έχει ταυτοποιηθεί ως διαφορικά εκφράζεται με γονιδιωματική ή πρωτεομική προφίλ [40] – [44].

Platinum Αντίσταση είναι πολυπαραγοντική

αντίστασης λευκόχρυσου στα κύτταρα IGROVCDDP είναι πολυπαραγοντική και περιλαμβάνει την οδό γλουταθειόνη και μειωμένη συσσώρευση του φαρμάκου. Αυτό θα μπορούσε να οδηγήσει είτε από ένα συγκρότημα ρυθμιστικής οδού που ελέγχει πολλές διαφορετικούς μηχανισμούς για να προσδίδει αντίσταση σισπλατίνη, ή θα μπορούσε να αντανακλά το γεγονός ότι τα κύτταρα επιλέχθηκαν σε πολλαπλά στάδια και ως εκ τούτου θα μπορούσαν να έχουν συσσωρευτεί διαφορετικούς μηχανισμούς σε κάθε βήμα.

κύτταρα IGROVCDDP είναι χαμηλού επιπέδου ανθεκτικά σε CuSO

4 υποδεικνύοντας έναν ρόλο της μεταφοράς του χαλκού σε αντίσταση λευκόχρυσου (Σχήμα 2Α).