Αφηρημένο

Ιστορικό

νεστίνη συνδέεται με νεοπλασματικό μετασχηματισμό, αλλά οι μηχανισμοί με την οποία νεστίνης συμβάλλει στην εισβολή και κακοήθεια του καρκίνου του πνεύμονα παραμένουν άγνωστες. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο πολλαπλασιασμός είναι απαραίτητη για την κακοήθη συμπεριφορά, ερευνήσαμε το μηχανισμό δράσης νεστίνης σε συνδυασμό με τις πολλαπλασιαστικές ιδιότητες της μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC).

Μέθοδοι

νεστίνη έκφραση εξετάστηκε σε δείγματα NSCLC και κυτταρικές σειρές. Ενώσεις με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων πρόγνωση και πολλαπλασιαστικές δείκτες, αξιολογήθηκαν. Επιδράσεις της νεστίνης νοκ ντάουν στον πολλαπλασιασμό και τα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται ερευνήθηκαν περαιτέρω.

Αποτελέσματα

νεστίνη εκφράστηκε στα περισσότερα δείγματα καρκίνου και όλες οι κυτταρικές σειρές όγκων που αναλύθηκαν. Υψηλή νεστίνης έκφραση σε κακοήθη ιστό συσχετίστηκε με υψηλό Ki-67 ή PCNA επίπεδα και η κακή έκβαση των ασθενών. Αντιστρόφως, knockdown του νεστίνης έκφρασης οδήγησε σε σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, μειωμένη ικανότητα σχηματισμού αποικιών, και G1 του κυτταρικού κύκλου σύλληψης. Επιπλέον, νεστίνης νοκ ντάουν οδήγησε σε αναστολή της ενεργοποίησης των Akt και ΟδΚ3β.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι νεστίνη έκφραση στα κύτταρα NSCLC σχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών και της οδού πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Προς τα κάτω ρύθμιση της νεστίνης ανέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα, το οποίο θα μπορούσε να είναι μέσα που επηρεάζουν τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και Akt-ΟδΚ3β-Rb μονοπατιού σηματοδότησης

Παράθεση:. Chen Ζ, Wang J, Cai L, Zhong Β, Luo Η, Hao Y, et al. (2014) Ο ρόλος των Βλαστικών Κυττάρων-Associated Ενδιάμεσο πυρακτώσεως νεστίνη σε κακοήθη πολλαπλασιασμό των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (2): e85584. doi: 10.1371 /journal.pone.0085584

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 29, 2013? Αποδεκτές: 29, Νοεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 3, Φεβρουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (Αρ 2009CB522100 και 2010CB945400), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30971675, 30900729, και 31171398), και το κλειδί επιστημονικών και τεχνολογικών σχεδίων της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ (Όχι . 2007A032100003). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι τώρα η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), η οποία αντιπροσωπεύει το 80% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα, απομακρυσμένες μεταστάσεις αναπτυχθούν μέχρι και 70% των ασθενών με πρώιμο στάδιο της νόσου [1], [2]. Παρά την εισαγωγή νέων χημειοθεραπευτικών παραγόντων και βελτιωμένες χειρουργικές τεχνικές, NSCLC παραμένει μια σημαντική θεραπευτική πρόκληση. Το ποσοστό επιβίωσης είναι σήμερα φτωχή, με μόνο το 15% επιβίωση των ασθενών στα 5 χρόνια μετά τη διάγνωση [3]. Κακοήθη χαρακτηριστικά του NSCLC περιλαμβάνει πολλά σημαντικά γεγονότα, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού και της εισβολής του πρωτοπαθούς όγκου, υπέστη την αγγειογένεση, και της φοροδιαφυγής απόπτωσης. Πολλαπλασιασμό του πρωτοπαθούς όγκου αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της μοριακής και κυτταρικής παθογένεσης, της ανάπτυξης και της μετάστασης του καρκίνου του πνεύμονα [4].

νεστίνη, μέλος του ενδιάμεσου νήματος (IF) της οικογένειας, έχει αναγνωριστεί ως πιθανή πολλαπλασιαστικών και πολυδυναμικότητα δείκτης σε διάφορα προγονικά κύτταρα [5] – [10]. Πρόσφατες αναφορές υποστηρίζουν μια σύνδεση μεταξύ νεστίνη και κακοηθών χαρακτηριστικών [11] – [19], και προτείνουν ότι η αφθονία νεστίνη έκφραση συσχετίζεται με μεγαλύτερη κακοήθεια και χειρότερη πρόγνωση σε διαφορετικές μορφές καρκίνου [11], [18] – [21]. Ωστόσο, η συγκεκριμένη λειτουργία της νεστίνης στην επεμβατική και μεταστατική συμπεριφορά του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων παραμένει ασαφής. Τα ευρήματα ότι νεστίνη knockdown μειώνει καλλιεργήθηκαν νευροβλαστώματος και την ανάπτυξη των κυττάρων αστροκύτωμα ενώ η υπερέκφραση του έχει ένα κυτταροπροστατευτικό αποτέλεσμα έναντι H

2O

2 τραυματισμό προτείνουν ένα ρόλο στην προώθηση της κυτταρικής επιβίωσης και του πολλαπλασιασμού [22] – [24]. Σε αντίθεση, μια άλλη μελέτη έδειξε ότι νεστίνη μειορρύθμιση δεν μεταβάλλει το

in vitro

ή

in vivo

χαρακτηριστικά ανάπτυξης των δύο διακριτών παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές [25]. Έτσι, νεστίνης δεν μπορεί απλώς να ενεργεί ως δομική πρωτεΐνη, αλλά μπορούν να συμμετέχουν ενεργά στον έλεγχο σημαντικών κυτταρικών διεργασιών. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί της νεστίνης δράση στον πολλαπλασιασμό απαιτούν περαιτέρω διευκρίνιση.

προηγούμενη μελέτη μας επιβεβαίωσε νεστίνη έκφραση σε δείγματα ιστών NSCLC, η οποία φάνηκε να συσχετίζεται με το νεογέννητο λεμφικού αγωγού που επάγεται από κύτταρα όγκου [21]. Από την άλλη πλευρά, Ryuge S είχε περιγράψει νεστίνη έκφρασης είναι ένα προγνωστικός δείκτης του φτωχότερα πιθανότητα επιβίωσης για τους ασθενείς με NSCLC εκτομή [26]. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ νεστίνη έκφρασης και πολλαπλασιαστική συμπεριφορά των κυττάρων NSCLC δεν έχει άμεσα ερευνηθεί μέχρι σήμερα. Με δεδομένη την περιορισμένη διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με το παθοφυσιολογικό ρόλο της νεστίνης στα κύτταρα NSCLC [21], [26], δεν έχουμε μόνο επιβεβαίωσε ότι η έκφραση της νεστίνης σε δείγματα NSCLC φάνηκε να συσχετίζεται με την κλινική μέτρα της κακοήθειας του όγκου, αλλά εξέτασε επίσης τη σύνδεση της νεστίνης έκφρασης με πολλαπλασιαστικές ιδιότητες των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και λειτουργικό ρόλο της στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων στην παρούσα μελέτη.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστών Δείγματα

Ένα σύνολο 71 δείγματα NSCLC και όγκο γειτονικούς ιστούς (απώτατο άκρο της εκτομής από τον όγκο) επιλέχθηκαν τυχαία από τη βάση δεδομένων ιστού μας. Τα δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με την Χειρουργική Κλινική Θώρακος από την Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο του Sun Yat-sen University από το Μάιο του 2003 και τον Ιούλιο του 2004. Κανένας από τους ασθενείς είχαν λάβει εισαγωγική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Οι κλινικές πληροφορίες που ελήφθησαν από την αναθεώρηση προεγχειρητική και περιεγχειρητική ιατρικά αρχεία είτε μέσω τηλεφώνου ή γραπτή αλληλογραφία. Περιπτώσεις οργανώθηκαν με βάση την ταξινόμηση των όγκων-κόμβο-μετάσταση (ΤΝΜ) της Διεθνούς Ένωσης Καρκίνου κατά, αναθεωρήθηκε το 2002 [27], [28]. Η χρήση ανθρώπινων υλικών εγκρίθηκε από την Ιατρική Επιτροπή Ηθικής του πρώτου συνδεδεμένες νοσοκομείο, η Sun Yat-sen University (Πλήρες όνομα του σκάφους /επιτροπή:. Ιατρική Επιτροπή Ηθικής του πρώτου συνδεδεμένες νοσοκομείο, η Sun Yat-sen University No. 2008-7). Επιβεβαιώνουμε ότι η γραπτή συγκατάθεση από τον δότη ή οι πλησιέστεροι συγγενείς λήφθηκε για τη χρήση αυτού του δείγματος της έρευνας. Τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Κυτταρικές Γραμμές

Μη μικροκυτταρικός κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, Α549, Η1299 και Η460, ελήφθησαν από την Τράπεζα Κυττάρων του κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με το ειδικό πρωτόκολλο τράπεζα κυττάρων.

ανοσοϊστοχημική χρώση

Η ανοσοϊστοχημική διαδικασία ήταν παρόμοια με έχουν αναφερθεί στο παρελθόν πρωτόκολλα [21], [29] . Αντι-νεστίνης (AB5922? Millipore, Temecula, CA? 1:500 αραίωση) και αντι-Ki-67 (SC-15402, Σάντα Κρουζ, CA, USA? 1:200 αραίωση). Χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενή αντισώματα

πλασμίδια

Για νοκ ντάουν της νεστίνης έκφρασης, φορείς ρετροϊού (pSM2) που κωδικοποιούν τα RNA μικρή φουρκέτα (Τα siRNAs), που ορίζεται shRNA1 (5′-TGC TGT TGA CAG TGA GCG ΑΓΓ CAG ACA TCA TTG ΟΤΟ ΤΤΑ ΑΤΑ ΟΤΟ AAG CCA CAG ATG ΤΑΤ ΤΑΑ CAC ΥΠΑ TGA TGT CTG CCC TGC CTA CTG ΚΔ CGG Α-3 ‘) και shRNA2 (5’-TGC TGT TGA CAG TGA ΟΟΟ CGG CTA GTC ΚΔ GCC TGA ΑΤΑ ΑΤΑ ΟΤΟ AAG CCA CAG ATG ΤΑΤ ΤΑΤ TCA GGC ΑΓΓ GAC TAG CCA TGC CTA CTG ΚΔ CGG Α-3 ‘), αγοράστηκαν από την Open Biosystems (Huntsville, AL, USA). Αυτές ρετροϊού ή ένα κατασκεύασμα που περιέχει ένα κωδικοποιημένο αλληλουχία shRNA (έλεγχος shRNA, Ανοιχτό Biosystems) έχουν σταθερά μεταγόμενα σε κύτταρα όγκου μέσω αντιβιοτικό επιλογής.

ανοσοφθορισμού χρώσης

Τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές αντι-νεστίνη ( AB5922? Millipore, Temecula, CA? 1:500 αραίωση), αντι-Ki-67 (Santa Cruz? 1:200 αραίωση) ή αντίσωμα αντι-ΡΟΝΑ (2586? Cell Signaling Tech, Beverly, ΜΑ? 1:2000 αραίωση). Δείγματα τοποθετήθηκαν με Vectashield περιέχουν Hoechst 33342, και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού

RT-PCR Ανάλυση

Ολικό RNA εκχυλίστηκε, και οι ακόλουθες αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιούνται:. Νεστίνη, 5-GAG GAC CAG AGT ΑΤΤ ΟΤΟ AGA C-3 και 5-CAC AGT GGT GCT TGA GTT TC-3 (368 bp) και β-ακτίνης (εσωτερικός έλεγχος), 5-ΟΤΟ GGG CGC CCC ΑΟΟ CAC CA-3 και 5-CTC CTT ΑΑΤ GTC ACG CAC GAT TTC-3 (540 bp).

Ανάλυση ανοσοαποτύπωσης

πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν, ηλεκτρομεταφέρθηκαν, μπλοκάρει με διάλυμα TBS /0,1% Tween-20, επωάστηκαν με αντι-ποντίκι νεστίνης αντίσωμα (AB5922? Millipore, Temecula, CA? 1:500 αραίωση) όλη τη νύκτα, και ανιχνεύθηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (Cell Signaling Tech, Beverly, ΜΑ, USA). GAPDH (SC-81545? Santa Cruz, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος και η εικόνα-Pro Express (MediaCybernrtics, USA) χρησιμοποιήθηκε το σύστημα

Colony Σχηματισμός και CCK-8 κυτταρικού πολλαπλασιασμού Αναλύσεις

σχηματισμός αποικιών κυττάρων καθορίστηκε χρησιμοποιώντας χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με την κυτταρική Μετρώντας Kit (CCK) -8 (Dojindo, Κουμαμότο, Ιαπωνία), και προσδιορίζεται με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm.

Αξιολόγηση της σύνθεσης DNA μέσω ΕΠΑ Καταστατικού

τα κύτταρα σημάνθηκαν με 5-αιθυνυλ-2′-δεοξυουριδίνης (edu). Πυρηνική ενσωμάτωση προσδιορίστηκε με ανίχνευση του Alexa Fluor 488 χρησιμοποιώντας το κιτ Click-iT edu Imaging (Invitrogen).

Κυτταρομετρία Ροής

Μετά την πλύση με PBS, πενήντα χιλιάδες κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FACS Calibur όργανο (BD Biosciences, San Jose, CA) εξοπλισμένο με ΟβΙΙΟυβδί 3.3 του λογισμικού. ModFit LT 3.1 δοκιμή λογισμικό ανάλυσης κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των ποσοστών των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου

Έκφραση Κύκλου Κυττάρου Πρωτεΐνες

Για ανοσοκηλίδωση, τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν:. Κουνέλι αντι-Akt (# 9272), αντι-ΟδΚ3β (# 9332), αντι-φωσφο (Ser21 /9) -GSK3β (# 9331), αντι-φωσφο (Ser780) -Rb (# 9307), αντι-φωσφο (Ser795) -Rb (# 9301), αντι-φωσφο (Ser870 /811) -Rb (# 9308), ποντικού αντι-φωσφο (Ser473) -Akt (# 4051) και αντι-ρετινοβλάστωμα (Rb) πρωτεΐνης (# 9309), καθώς και ως δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με HRP-αντι-κουνελιού. Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA). Για ποσοτικές αναλύσεις, όλα τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση GAPDH.

Στατιστική Ανάλυση

Όλοι οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS V.14.0 στατιστικού λογισμικού (Chicago, IL, USA). συντελεστής Spearman της συσχέτισης, Chi-square test, και ANOVA εφαρμόστηκαν ως ενδείκνυται. Η συνολική επιβίωση (OS) ήταν υπολογίζεται από την ημερομηνία της επέμβασης μέχρι την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης, και η ένωση της νεστίνης έκφρασης με λειτουργικό σύστημα παρουσιάζεται ως Kaplan-Meier οικόπεδα. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αναλογικών κινδύνων κατά Cox παλινδρόμησης για τον προσδιορισμό των προγνωστικών αποτελεσμάτων της νεστίνης έκφρασης και πιθανές κλινικές μεταβλητές σε OS.

Αποτελέσματα

Βασικές Κλινικές Πληροφορίες και μελέτες παρακολούθησης

Συνολικά, 51 άνδρες και 20 γυναίκες ασθενείς με NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπευτική χειρουργική εκτομή είχαν εγγραφεί στη μελέτη. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 57,6 ± 9,8 έτη (εύρος, 35 να 77 ετών). Εξετάσαμε 35 αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα, 34 πλακώδες καρκίνωμα και δύο μεγάλες περιπτώσεις καρκινώματος. Περιπτώσεις ήταν σταδίου Ι (n = 32), το στάδιο ΙΙ (n = 17), το στάδιο ΙΙΙ (n = 15) και το στάδιο IV (n = 7).

27, 28 Stage IV περιπτώσεις που περιλαμβάνονται Τ

1-2 Ν

0 και εκτομή μοναχική μετάσταση στον εγκέφαλο. δεδομένων των ασθενών αναλύθηκαν μετά από 5 χρόνια παρακολούθησης, και τις πληροφορίες που λαμβάνονται για 95,8% (68 από 71) των ασθενών. Η διάμεση συνολική επιβίωση ήταν 25,2 ± 1,9 μήνες (95% CI: 21,4 έως 29,0 μήνες) και η μέση συνολική επιβίωση ήταν 24,0 ± 2,3 μήνες (95% CI: 19,4 έως 28,6 μήνες).

Σύλλογος νεστίνη έκφρασης με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με NSCLC

Τα χαρακτηριστικά βασικής γραμμής του πληθυσμού της μελέτης όσον αφορά το φαινότυπο νεστίνης και τα αποτελέσματα των πολυμεταβλητών αναλύσεων παρουσιάζονται στους πίνακες 1 και 2, αντίστοιχα. Νεστίνη εκφράστηκε σε 88,7% (63/71) περιπτώσεις, με σχεδόν καθόλου έκφραση στα κυψελιδικά και βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα σε καρκινικά γειτονικούς ιστούς (Σχήματα 1Α, Β). Νεστίνης κατάσταση συσχετίστηκε με ελάχιστα διαφοροποιημένο φαινότυπο (

χ

2 = 17.776,

P =

0.006), ιστολογικό τύπο καρκίνου του ιστού (

χ

2 = 8.215,

P =

0,002), Ν ταξινόμηση (

χ

2 = 12.093,

P =

0.001), και ζωτικής σημασίας κατάσταση (

χ

2 = 9.003,

P =

0.003). Παρατηρήσαμε μια σημαντική διαφορά στις εκτιμήσεις επιβίωση μεταξύ των ασθενών με και χωρίς φαινότυπο νεστίνης (Εικόνα 1D). Αυξημένα νεστίνης έκφρασης (χρησιμοποιώντας μια τιμή cut-off με βάση τη μέση νεστίνης histoscore) συσχετίστηκε με μικρότερη αθροιστική επιβίωση (30.8 ± 3.3

vs

20,2 ± 1,7 μήνες? Αναλογία κινδύνου, 3.366?

P =

0.006).

Ισχυρή νηστίνη χρώση ήταν εμφανής σε NSCLC ιστό, ενώ χρώση σε όγκο παρακείμενο ιστό ήταν αδύναμη (Α, Β). Νεστίνη επιπροσθέτως ανιχνεύθηκε σε πτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα και πλακωδών κυττάρων του ιστού καρκινώματος (C). Ένα οικόπεδο Kaplan-Meier απεικονίζει τα διαφορές στην επιβίωση μεταξύ υψηλών και χαμηλών νεστίνη ομάδες έκφρασης, διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με βάση την μέση τιμή της νεστίνης έκφρασης σε αλλοιώσεις όγκου (D). Κλίμακα Bar, 100 μm? *

σ

& lt? 0,01? ANOVA.

Η

Σύλλογος νεστίνη με όγκο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Μαρκαδόροι

νεστίνη έκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με εκείνα των πολλαπλασιαστικών δεικτών, Ki-67 (r = 0.795,

P

& lt? 0,001? Σχήμα 2Α, Β, και C) και PCNA (r = 0.764,

P

& lt? 0,001? Σχήμα S1A και Β), ενδεικτική μιας ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.

Η χρώση της νεστίνης και Ki-67 σε δείγματα NSCLC. χρώση (Α) IHC της νεστίνης και Ki-67 σε ιστούς NSCLC. (Β) Σημαντική συσχέτιση της νεστίνης και τα επίπεδα Ki-67 (r = 0.795?

P

& lt? 0.001). Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει ένα δείγμα NSCLC. (C) Ki-67 histoscores ανυψώθηκε σε adnocarcinoma (αδενο) και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) με υψηλότερες νεστίνη έκφρασης. Κλίμακα Bar, 100 μm? *

σ

& lt? 0,01, με τη χρήση ANOVA

Η

νεστίνη Έκφραση σε NSCLC Γραμμές κυττάρων

Για να διευκρινιστεί το καθεστώς έκφραση νεστίνης στο NSCLC, εξετάσαμε την έκφραση του. μοτίβα στο NSCLC κυτταρικές σειρές, Α549 και Η460. Αξίζει να σημειωθεί ότι, νεστίνης mRNA και της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3). Η έκφραση της πρωτεΐνης νεστίνη μεταξύ κυττάρων όγκου και φυσιολογικών κυττάρων επίσης έδειξε χρησιμοποιώντας σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής (Εικόνα S2).

νεστίνη έκφραση ανιχνεύθηκε σε Α549, κύτταρα H1299and Η460 χρησιμοποιώντας χρώση ανοσοφθορισμού (Α), RT-PCR (Β) και ανάλυση ανοσοκηλίδας (C). β-ακτίνη ή GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Κλίμακα Bar, 100 μm.

Η

Ο ρόλος της νεστίνη σε Tumor Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον νεστίνη παίζει ένα ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα, έχουμε σταθερά επιμολυσμένα Α549 και Η460 κυττάρων με πλασμίδια κωδικοποιεί Τα siRNAs που στοχεύουν στην νηστίνη μεταγραφή ή με ομελέτα πλασμίδια ελέγχου shRNA, και μετρήθηκαν οι αλλαγές στα χαρακτηριστικά του πολλαπλασιασμού που σχετίζονται με. χρώση ανοσοφθορισμού και ανοσοκηλιδώσεως έδειξε ότι δύο αλληλουχίες νεστίνη shRNA (shRNA1 και shRNA2) μείωσε δραματικά την έκφραση του νεστίνη πρωτεΐνης (Εικόνα 4Α). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4Β, νεστίνη knockdown σε κύτταρα όγκου οδήγησε σε εμφανή μείωση στην ικανότητα σχηματισμού αποικιών (από 23% σε 11,8% και 12,3% για shRNA1 και shRNA2 σε κύτταρα Α549, και από 39,6% σε 20,9% και 22,8% για shRNA1 και shRNA2 σε κύτταρα Α549, αντίστοιχα). Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού επίσης σημαντικά μειωμένη σε κάθε νεστίνη-knockdown κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα κύτταρα, που μετράται ως μείωση στα βιώσιμα κύτταρα (Σχήμα 4C). Συνεπής με τη σχέση μεταξύ της αυξημένης νεστίνη έκφρασης και Ki-67 ή έκφραση PCNA σε δείγματα όγκων NSCLC, νεστίνη knockdown σε κύτταρα όγκου οδήγησε σε σημαντική μείωση του αριθμού των Ki-67-θετικά κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου όγκου (Εικόνα 4D). Επιπλέον, η σύνθεση του DNA σε νεστίνη knockdown κυττάρων όγκου ήταν σημαντικά ανέστειλε σε σύγκριση με εκείνη σε κύτταρα όγκου ελέγχου (Σχήμα 5Α).

(Α) Α549 ή Η460 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά shRNA έναντι νεστίνη (shRNA1, shRNA2) έχουν καθιερωθεί και νεστίνης knockdown, σε σύγκριση με Α549 ή Η460 κύτταρα επιμολυσμένα με ένα κωδικοποιημένο αλληλουχία shRNA (φορέα ελέγχου), επιβεβαίωσε με χρώση ανοσοφθορισμού (αριστερό πάνελ) και ανοσοκηλίδωση (δεξί πάνελ). Οι διαφορές μεταξύ νεστίνη knockdown και Α549 έλεγχο ή Η460 κύτταρα σε όρους σχηματισμού αποικίας κυττάρου καταδείχθηκαν σε αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες με χρώση κρυσταλλικού ιώδους (Β, αριστερό πάνελ) και ποσοτικοποίηση των κυτταρικών αποικιών (Β, δεξί πάνελ). Καταστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, ως αποτέλεσμα της νεστίνης knockdown καθορίστηκε με την δοκιμασία κιτ CCK-8 (C). χρώση ανοσοφθορισμού (D) έδειξαν θετικά ανοσοαντιδραστικότητα για το αντίσωμα Ki-67 (κόκκινο), και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με Hoechst 33342 (μπλε). Κλίμακα Bar, 100 μm? *

σ

& lt?. 0.01, χρησιμοποιώντας ANOVA

Η

Οι διαφορές στα ποσοστά της σύνθεσης του DNA μεταξύ νεστίνη νοκ ντάουν και Α549 ελέγχου ή κύτταρα Η460 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ενσωμάτωσης edu (Α). Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου σε νεστίνη knockdown και Α549 έλεγχο ή Η460 κύτταρα (Β). Κλίμακα Bar, 100 μm? *

σ

& lt?. 0.01, χρησιμοποιώντας ANOVA

Η

νεστίνη shRNA κλώνοι εμφάνισης κυτταρικού κύκλου σύλληψης στο G1 /S φάσης

Για να προσδιορίσετε αν καρκινικών κυττάρων πολλαπλασιασμού αναστολή σχετίζεται με ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, ερευνήσαμε την επίδραση του νεστίνης knockdown στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο αριθμός των κυττάρων στη φάση S του κυτταρικού κύκλου μειώνεται σημαντικά εξής νεστίνη knockdown (Σχήμα 5Β).

νεστίνη shRNA Κλώνοι Display Μειωμένη φωσφορυλίωση της Akt σε Ser 473 και GSK3α /β σε Ser 21 /9

Στη συνέχεια, προσδιορίζεται το προφίλ της σηματοδότησης της νεστίνης κλώνων shRNA. Δεδομένου ότι η μετάβαση από το G1 προς S φάση είναι ένα σημαντικό σημείο ελέγχου κατά τη διάρκεια του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, επαληθεύσαμε περαιτέρω τα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην G1 προς S εξέλιξη. Νεστίνη knockdown εμφανίζεται σχετικά μειωμένη φωσφορυλίωση βασικών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση, συμπεριλαμβανομένων Akt σε Ser 473, GSK3α /β σε Ser 21/9, και Rb σε Ser 780, 795, και 807/811 (Σχήμα 6Α). Ποσοτική ανάλυση αποκαλύπτεται περαιτέρω ότι η μείωση της φωσφο-Ακί και πρωτεΐνες /β φωσφο-GSK3α ήταν ιδιαίτερα έντονη σε κύτταρα όγκου μεταδιηγερμένα με την αλληλουχία shRNA2, ενώ φωσφο-Rb έκφραση μειώθηκε περισσότερο σημαντικά σε κύτταρα όγκου μεταδιηγερμένα με την αλληλουχία shRNA1 (Σχήμα 6Β -ΦΆ). Ως εκ τούτου, τα σημαντικά γεγονότα φωσφορυλίωσης μεταβάλλεται κατά την προς τα κάτω ρύθμιση νεστίνης είναι εκείνα από τα βασικά μεσολαβητών στην φωσφατιδυλινοσιτόλης 3-κινάσης.

(Α) πρότυπα έκφρασης μιας σειράς πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κύκλο των κυττάρων σε νεστίνη knockdown και Α549 έλεγχο κύτταρα. (Β-D) Ποσοτική ανάλυση του Rb και φωσφο-Rb, (Β) ΑΚΤ και φωσφο (Ser473) -Akt (C), και ΟδΚ3β και φωσφο-GSK3α /β (D). *

σ

& lt? 0,01? ANOVA.

Η

Συζήτηση

νεστίνη εκφράζεται σε μια ευρεία ποικιλία κυτταρικών πληθυσμών εμβρυονικών και προγονικών ενηλίκων, και θεωρείται ένα δείκτη για τη διάκριση πρόδρομα κύτταρα από άλλα διαφοροποιημένα κύτταρα [30], [ ,,,0],31]. Πρόσφατες εκθέσεις έχουν δείξει ότι η έκφραση του νεστίνης σε μαστού, του προστάτη, του παγκρέατος και του καρκίνου συσχετίζεται θετικά με κακοήθεια όγκων [16] – [18]. Αυτές οι παρατηρήσεις ώθησαν αυξημένο ενδιαφέρον για την έρευνα στα πρότυπα έκφρασης των νεστίνης σε διάφορους όγκους και τη σχέση του με πολλαπλασιαστικές και μεταστατικό χαρακτηριστικά.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι νηστίνη έκφραση συνδέεται σημαντικά με κακοήθη χαρακτηριστικά του NSCLC ιστού , συγκεκριμένα, ελάχιστα διαφοροποιημένο φαινότυπο και ταξινόμηση ιστολογία. Επιπλέον, νεστίνης mRNA και πρωτεΐνης εκφράστηκαν σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν NSCLC. Στατιστικές αναλύσεις αποκάλυψαν μια σημαντική αύξηση στην αναλογία κινδύνου (κίνδυνος θανάτου) σε ασθενείς με υψηλή νεστίνη έκφραση, σε σύγκριση με αυτές που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα νεστίνης. Υψηλή νεστίνης έκφραση σε NSCLC ιστό πιο συχνά συνδέεται με υποτροπή της νόσου και του θανάτου. Τα ευρήματά μας επιβεβαιώνουν περαιτέρω προηγούμενες εκθέσεις της θετικής σχέσης μεταξύ νεστίνη έκφρασης και κακοήθειας του όγκου [11], [18] – [21].

Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η εξουδετέρωση της νεστίνης με siRNA μειώνει αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό και αύξηση των κυττάρων C6 αστροκύτωμα [23] και προς τα κάτω ρύθμιση του ενεργοποιεί cdk5 /ρ35-εξαρτώμενη αποπτωτικών οδών [24], [32], ο ακριβής ρόλος της νεστίνης στη μετάσταση όγκου είναι ασαφής επί του παρόντος. Εδώ, παρατηρήσαμε μια θετική σχέση μεταξύ νεστίνη και Ki-67 έκφραση σε ιστούς και κύτταρα NSCLC. Η παρατήρηση ότι η πρωτεΐνη Ki-67 εκφράζεται κατά τη διάρκεια όλων των δραστικών φάσεων του κυτταρικού κύκλου (G1, S, G2, και μίτωση), αλλά απουσιάζει από κύτταρα σε ηρεμία, υποστηρίζει περαιτέρω τη θεωρία ότι νεστίνη μπορεί να σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου. Δεδομένης της σύνδεσης μεταξύ των υψηλών νεστίνη έκφρασης και αυξημένα χρώση για τους δείκτες πολλαπλασιασμού των κυττάρων, Ki-67 και PCNA, εστιάσαμε στο ρόλο των νεστίνης στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση ρετροϊών για να εισαγάγει φορείς shRNA με νεστίνη-στόχευσης (ή ελέγχου) αλληλουχιών σε NSCLC κύτταρα. Σημαντικά, πολλαπλασιαστικές ιδιότητες, όπως η ικανότητα σχηματισμού αποικιών και το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων, μειώθηκαν σε νεστίνης κλώνους shRNA. Τα ευρήματά μας παρέχουν προκαταρκτικά στοιχεία για τον ρόλο της νεστίνης στον πολλαπλασιασμό των πνευμόνων των καρκινικών κυττάρων.

Ένας πιθανός μηχανισμός για να ληφθεί υπόψη η σχέση μεταξύ νεστίνη έκφρασης και της διάδοσης προτείνεται με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης μας για ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα όγκου. Συγκεκριμένα, το μέγεθος του πληθυσμού των κυττάρων φάσης S ήταν μειωμένη δραματικά σε νεστίνη knockdown κυττάρων. Σε συμφωνία με αυτό το εύρημα, τη σύνθεση του DNA, η οποία συμβαίνει κατά τη διάρκεια της φάσης S, μειώθηκε σε νεστίνης κλώνους shRNA. Η μετάβαση από την G1 στην S φάση είναι ένα σημαντικό σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Η έρευνά μας από τα βασικά πρωτεΐνες που ρυθμίζουν αυτού του σημείου ελέγχου, όπως πρωτεΐνη Rb, παρέχεται πρόσθετη υποστήριξη για ένα ρόλο για νεστίνη στον πολλαπλασιασμό μέσω της διαφοροποίησης του κυτταρικού κύκλου. Αλληλεπιδράσεις των Rb με σύμπλοκα κυκλίνης D-CDK4 /6 και κυκλίνη E-CDK2 προώθηση Rb φωσφορυλίωσης και την έκφραση των γονιδίων που είναι απαραίτητα για να εισέλθουν στην S φάση [33], [34]. Τα πειράματά μας έδειξαν ότι νεστίνη κλώνοι shRNA εμφανίζουν μειωμένη σχετικά επίπεδα φωσφορυλίωσης σε διάφορες θέσεις του Rb. Συνεπώς, προτείνουμε ότι η προώθηση της φωσφορυλίωσης Rb είναι ένας από τους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων νεστίνη επάγει πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Εμείς επιπλέον διερευνηθεί ειδικές πρωτεΐνες του μονοπατιού σηματοδότησης Akt. Ανωμαλίες στην πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης, Akt, είναι στενά συνδεδεμένα με την πολλαπλασιαστική κατάσταση των κυττάρων και επάγει την φωσφορυλίωση του ΟδΚ3β [35], [36]. Στην ενεργοποιημένη αποφωσφορυλιωμένο μορφή της, η ΟδΚ3β προάγει την αποικοδόμηση της κυκλίνης D, και μη-φωσφορυλιωμένη ΟδΚ3β καταστέλλει φωσφορυλίωση Rb και εμποδίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου [37], [38]. Δεδομένα από την παρούσα μελέτη υποδεικνύουν ότι η καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε νεστίνη κλώνους shRNA εξαρτάται προς τα κάτω ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης Akt-ΟδΚ3β-Rb. Κατ ‘επέκταση, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα αυξημένα επίπεδα νεστίνης σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση αυξάνοντας την δραστικότητα αυτού του μονοπατιού. Ένας αριθμός ερευνητές πιστεύουν ότι νεστίνη έχει κυρίως κυτταροσκελετικές λειτουργία, παρέχοντας μια θέση αντίδρασης για μία ποικιλία οδών σηματοδότησης [39], [40], και έτσι οι αλλαγές κυτταροσκελετού αναμένεται να επηρεάσει τις κινάσες που σχετίζονται με την εισβολή και τη μετάσταση. Το πιο σημαντικό, επειδή Α549 και Η460 κυτταρικές γραμμές είναι άγριου τύπου ρ53 και ρ53-ρυθμιζόμενη MDM2 πρωτεΐνη είναι μια γνωστή ρυθμιστής της Rb λειτουργίας, ο στιχομυθία μεταξύ νεστίνη και μονοπάτι ρ53 φαίνεται να ληφθούν υπόψη, καθώς και η αναστολή της δραστικότητας του mTOR από ρ53, που με τη σειρά ρυθμίζει φωσφο-Ακί-S473 επίπεδο, μπορεί επίσης να παρέχει πιθανή σχέση μεταξύ της ρ53 και νεστίνης [41], [42]. Ως εκ τούτου, η σχέση μεταξύ νεστίνη έκφραση και ρύθμιση της Rb επίπεδο πρωτεΐνης θα πρέπει να εξεταστούν περαιτέρω.

Σε σύγκριση με τις προηγούμενες εκθέσεις σχετικά για νηστίνη έκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα [21], [26], τα ευρήματά μας, όχι μόνο επιβεβαίωσε ότι η έκφραση της νεστίνης σε δείγματα NSCLC φάνηκε να συσχετίζεται με την κλινική μέτρα της κακοήθειας του όγκου και κακή ιστολογική ταξινόμηση, αλλά επίσης πρότεινε ότι νεστίνη μπορούσαν να συμβάλουν στην πολλαπλασιαστική και διηθητική συμπεριφορά των κυττάρων NSCLC. Επιπλέον, οι εργασίες μας επίσης πρώτον μελέτησε τη βιολογική σχέση μεταξύ νεστίνη υψηλή έκφραση και κακοήθη χαρακτηριστικά του NSCLC χρησιμοποιώντας RNA knockdown τεχνικές, ανάλυση κυτταρικού κύκλου, και την αξιολόγηση μιας σειράς πρωτεϊνών κύκλου που σχετίζεται με κύτταρο για τον καρκίνο του πνεύμονα μοντέλα κυτταρικής γραμμής. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, θα παρείχε την πρώτη απόδειξη ότι φαινότυπο νεστίνης παρουσίασαν βελτιωμένες πολλαπλασιαστικές ιδιότητες, και εξήγησε επιστημονικά τα σημαντικότερα ζητήματα της πιθανός μηχανισμός νεστίνης δράσης στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Έτσι, τα φαινόμενα που τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν νεστίνη είναι σημαντικές για τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, και μετάσταση στον καρκίνο του πνεύμονα.

Ενώ τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι νεστίνη πράξεις μέσω της οδού Akt-ΟδΚ3β-Rb σηματοδότησης να συμβάλουν στην πολλαπλασιασμό σε πνεύμονα καρκινικά κύτταρα, άλλες πτυχές της κακοήθειας του όγκου, όπως η αγγειογένεση, τη λεμφαγγειογένεση και ο μεταβολισμός του όγκου, έχουν ακόμη να εξεταστεί άμεσα. Ωστόσο, εν όψει των διαπιστώσεων αυτών, ο ρόλος της νεστίνης πρέπει να ληφθεί υπόψη στην εν εξελίξει κλινική διάγνωση ή ως νέο στόχο για την θεραπεία του καρκίνου.

Συμπεράσματα

Παρατηρήσαμε νεστίνη-θετικά καρκινικά κύτταρα η πλειονότητα των δειγμάτων NSCLC και σημαντική συσχέτιση της νεστίνης έκφρασης με το υποσύνολο των ασθενών με NSCLC που εμφανίζουν κακή έκβαση και τα υψηλά επίπεδα του πολλαπλασιασμού δεικτών. Επιπλέον, νεστίνης νοκ ντάουν ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και G1 /S σύλληψης σε ανθρώπινα κύτταρα NSCLC, ενδεχομένως μέσω ρύθμιση προς τα κάτω της ΑΚΤ-GSK 3β-κυκλίνης σηματοδότησης Δ. Τα δεδομένα μας συλλογικά δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν νεστίνη την προώθηση της διάδοσης σε NSCLC, η οποία μπορεί να αποτελέσει βασικό μηχανισμό της νεστίνης μεσολάβηση κακοήθεια στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων. Στοχευμένη ρύθμιση της νεστίνης μπορεί έτσι να έχει θεραπευτικές εφαρμογές στη θεραπεία ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Χρώση νεστίνης και PCNA στα δείγματα NSCLC. χρώση (Α) IHC της νεστίνης και PCNA σε ιστούς NSCLC. (Β) histoscores PCNA ανυψώθηκε σε adnocarcinoma (αδενο) και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) με υψηλότερες νεστίνη έκφρασης. Κλίμακα Bar, 100 μm? *

P

& lt? 0,01, με τη χρήση ANOVA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085584.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

η έκφραση της νεστίνης πρωτεΐνης μεταξύ καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικά κύτταρα χρησιμοποιώντας σύλληψη λέιζερ μικροδιατομής. (Α) Laser σύλληψη μικροδιατομής των καρκινικών κυττάρων και φυσιολογικών κυττάρων. Η &? Ε-χρώση τμήμα κύτταρο που δείχνει κύτταρα όγκου (α) και φυσιολογικά κύτταρα (δ), πριν μικροδιατομή. Ίδια κύτταρα τομή που δείχνει όγκου (β) και φυσιολογικά κύτταρα (ε) μετά από μικροδιατομή. Κύτταρα όγκου (γ) και φυσιολογικά κύτταρα (στ) μετά μικροδιατομής στο καπάκι. (Β) Τα αποτελέσματα της κηλιδώσεως Western των δύο ζευγών μικροδιατομή κυττάρου όγκου και φυσιολογικών κυττάρων. Κλίμακα Bar, 100 μm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085584.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Αυτή η έρευνα έχει παρουσιαστεί στο 2

ου Ευρωπαϊκού Συνεδρίου Καρκίνο του πνεύμονα (2010, Γενεύη).