Αφηρημένο

Χημικά συντίθεται μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) είναι μια ευρέως διαδεδομένη μοριακό εργαλείο που χρησιμοποιείται για να γκρεμίσουμε τα γονίδια σε κύτταρα θηλαστικών. Ωστόσο, ο σχεδιασμός ισχυρή siRNA παραμένει πρόκληση. Μεταξύ των εργαλείων πρόβλεψης αποτελεσματικότητα siRNA, πολύ λίγα έχουν επικυρωθεί σε ενδογενείς στόχους σε ρεαλιστικές πειραματικές συνθήκες. Περιγράψαμε προηγουμένως ένα εργαλείο για να βοηθήσει αποδοτικό σχεδιασμό siRNA (DSIR, Σχεδιαστής του siRNA), η οποία επικεντρώνεται στην εγγενή χαρακτηριστικά της σειράς siRNA. Εδώ, αξιολογήσαμε την απόδοση DSIR του με τη συστηματική διερεύνηση της δραστικότητας του siRNA που σχεδιάζει να στοχεύσετε δέκα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο. mRNA knockdown μετρήθηκε με ποσοτική RT-PCR σε δοκιμασίες που βασίζονται σε κύτταρα, αποκαλύπτοντας ότι πάνω από το 60% των siRNA αλληλουχίες σχεδιάστηκε από DSIR σιγήσει γονίδια στόχους τους κατά τουλάχιστον 70%. Φίμωση αποτελεσματικότητα διατηρήθηκε ακόμα και όταν χρησιμοποιήθηκαν χαμηλές συγκεντρώσεις siRNA. Αυτή η συστηματική ανάλυση αποκάλυψε ιδίως ότι, για ένα υποσύνολο των γονιδίων, η αποτελεσματικότητα των siRNA κατασκευάσματα αυξάνει σημαντικά όταν η αλληλουχία βρίσκεται πλησιέστερα στο 5′-άκρο του γονιδίου που κωδικοποιεί αλληλουχία-στόχο, γεγονός που υποδηλώνει την απόσταση μέχρι το 5′-τέλος, όπως ένα νέο χαρακτηριστικό για την πρόβλεψη δραστικότητα siRNA. Μια νέα έκδοση του DSIR ενσωμάτωση αυτών των νέων ευρημάτων, καθώς και τον κατάλογο των επικυρωμένων siRNA έναντι των εξετασθέντων γονίδια του καρκίνου, έχει καταστήσει διαθέσιμο στην ιστοσελίδα (https://biodev.extra.cea.fr/DSIR).

Παράθεση: Filhol O, Ciais D, Lajaunie C, Charbonnier P, Foveau Ν, Vert JP, et al. (2012) DSIR: αξιολογήσεις του σχεδιασμού των εξαιρετικά ισχυρών siRNA με έλεγχο μιας ομάδος του Καρκίνου-γονίδια στόχους. PLoS ONE 7 (10): e48057. doi: 10.1371 /journal.pone.0048057

Επιμέλεια: Szabolcs Semsey, Niels Bohr Institute, Δανία

Ελήφθη: 1 Αυγούστου, 2012? Αποδεκτές: 20η Σεπτεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 Οκτώβρη 2012

Copyright: © 2012 Filhol et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο αποτελεί μέρος του εθνικού προγράμματος που ονομάζεται «Cartes ταυτότητος des Tumeurs» πρόγραμμα (CIT) χρηματοδοτήθηκε και αναπτύχθηκε από τη Ligue Nationale Καρκίνου Contre le. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παρεμβολή RNA (RNAi) είναι η διαδικασία μέσω της οποίας ένα δίκλωνο RNA (dsRNA) σιωπές γονιδιακή έκφραση, είτε επάγοντας αποικοδόμηση του ειδικής αλληλουχίας συμπληρωματικής αγγελιοφόρο RNA (mRNA) ή με καταστολή μετάφραση [1]. Η ενδογενής οδός RNAi θηλαστικών χρησιμοποιεί microRNAs μη κωδική (miRNAs) για να ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση μέσω μεταφραστικής καταστολής ή /και η διάσπαση του mRNA, στοχεύοντας το 3 ‘αμετάφραστες περιοχές (3’UTRs) του mRNA με το οποίο μοιράζονται μερική συμπληρωματικότητα [2]. Διαμορφωμένος σε αυτά τα miRNAs, συντίθενται χημικά αντιδραστήρια dsRNA μικρότερο από 30 νουκλεοτίδια βρέθηκαν να προκαλέσει μια αλληλουχία-ειδική απόκριση RNAi χωρίς να επάγουν έμφυτο ανοσοποιητικό άμυνες του κυττάρου σε συστήματα θηλαστικών [3], [4]. Duplex μικρό παρεμβαλλόμενο RNA μόρια (siRNA) έχουν θεωρητικά τη δυνατότητα να αναστέλλουν ειδικώς την έκφραση σχεδόν οποιουδήποτε γονιδίου στόχου. Ως εκ τούτου, έχουν γίνει μια ευρέως διαδεδομένη μοριακό εργαλείο που αντιπροσωπεύουν ένα ισχυρό μέσο για τη μελέτη της λειτουργίας των γονιδίων [5], [6]. Προκλινικές μελέτες και ορισμένες από τις πρώτες κλινικές μελέτες έχουν ήδη αποδείξει ότι siRNAs έχουν δυνατότητες ως νέες θεραπείες για ένα ευρύ φάσμα ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [7].

Για RNAi να είναι αξιόπιστο και siRNAs πρέπει να είναι σχεδιασμένη με προσοχή, για να εξασφαλισθεί η αποτελεσματικότητα και η ειδικότητα της επιλεγμένης αλληλουχίας για το γονίδιο-στόχο της [6], [8]. αποτελεσματικότητα siRNA είναι ένα μέτρο της εταιρικής σχέσης συνεργασίας μεταξύ του οδηγού-κλώνο και μηχανήματα RISC που οδηγεί σε διάσπαση του mRNA. Σε αντίθεση, siRNA ειδικότητα αντιστοιχεί σε ακριβή αναγνώριση των θέσεων στόχων, αποφεύγοντας ανεπιθύμητες παρενέργειες (π.χ., «off-στόχος» αποτέλεσμα). Μελέτες που βασίζονται σε δύο πειραματικά δεδομένα και υπολογιστικές προσεγγίσεις έχουν αναφέρει ότι η δευτερεύουσα δομή των στόχων και την προσβασιμότητά τους ήταν επίσης σημαντικό, αν και σε μικρότερο βαθμό, για τον καθορισμό δραστηριότητα siRNA [9], [10], [11], [12].

Πολλά προγράμματα και οι διακομιστές web έχουν αναπτυχθεί για την αυτοματοποίηση του σχεδιασμού siRNA. Αυτοί εφαρμόζουν κανόνες σχεδιασμού με βάση τις προτιμήσεις νουκλεοτιδίων σε ειδικές θέσεις, τα χαρακτηριστικά αλληλουχίας, το δυναμικό σχηματισμού φουρκέτας, προφίλ σταθερότητας, τα χαρακτηριστικά της ενέργειας, σταθμισμένη μοτίβα και δευτερεύουσα δομή του mRNA στόχου. Αυτά τα χαρακτηριστικά siRNA συνοψίζονται σε άρθρα ανασκόπησης [βλέπε [13], [14]]. χαρακτηριστικά Βέλτιστη siRNA καλύτερα προσδιορίζεται με βάση πειραματικά δεδομένα. Huesken et al. [15] δημοσίευσαν σειρά 2182 τυχαία επιλεγμένα siRNA, τα οποία αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας σύστημα γονιδίου ανταποκριτή φθορισμού υψηλής απόδοσης. Αυτό οδήγησε στην ανάπτυξη μιας νέας γενιάς αλγόριθμο βασισμένο σε τεχνικές μηχανικής μάθησης που έχει βελτιωθεί σημαντικά siRNA σχεδιασμό, με μια αναφερόμενη συντελεστή συσχέτισης Pearson των 0,66 έως 0,67 μεταξύ μετρούμενων και την προβλεπόμενη αποτελεσματικότητα. Πρόσφατα, η αξιολόγηση των διαφόρων εργαλείων siRNA-σχεδιασμό κατέληξε στο συμπέρασμα ότι

Biopredsi

[15],

Thermocomposition

[16] και

DSIR,

ένα υπολογιστικό μοντέλο που αναπτύχθηκε από εμάς, [ ,,,0],17] ήταν εξαιρετικά ακριβή και αξιόπιστα μέσα πρόβλεψης των ενεργών siRNA [18], [19]. DSIR βασίζεται σε ένα γραμμικό μοντέλο συνδυασμό συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων σε δεδομένες θέσεις και ειδικών μοτίβων πάνω στον οδηγό-κλώνο siRNA, συμπεριλαμβανομένων των προεξοχών 2-nt στο 3 ‘άκρο [17]. Αυτός ο συνδυασμός παρέχει αποτελεσματική siRNA, πιθανόν να οφείλεται σε υψηλά ποσοστά RISC δεσμευτικών ή /και ago2 μεσολάβηση διάσπαση του mRNA στόχου συμπληρωματικό κλώνο [18].

Ωστόσο, χαρακτηριστικά που είναι ζωτικής σημασίας για τη βέλτιστη πρόβλεψη αποτελεσματικών siRNA είναι ακόμη υπό συζήτηση [13], [14], [20]. Ως εκ τούτου, παρά τις βελτιώσεις αυτές, απομένει να καθοριστεί ποια αλγόριθμο και διαδικτυακό εργαλείο είναι η βέλτιστη, και πόσο καλά προέβλεψε siRNA που συμπεριφέρονται με ρεαλιστικό πειραματικές συνθήκες. Από τη μία πλευρά, κανένα από σήμερα διαθέσιμες μεθόδους σχεδιασμού siRNA καλύπτει την πλήρη διαδικασία siRNA-μηχανημάτων. Έτσι, αν και η σχετική συμβολή του χαρακτηριστικά, όπως η αποδοτικότητα siRNA, ειδικότητα ή την προσβασιμότητα στόχο έχουν ελεγχθεί ανεξάρτητα για το ρόλο τους στην προκύπτουσα τελική νοκ ντάουν, δεν έχει ακόμη πραγματοποιηθεί μια ενιαία παγκόσμια μελέτη. Από την άλλη πλευρά, έχουν πολύ ετερογενή σύνολα δεδομένων έχουν χρησιμοποιηθεί για το σχεδιασμό περισσότερα από αυτά τα υπολογιστικά μοντέλα πρόβλεψης αποτελεσματικότητα siRNA [21]. Αυτά τα σύνολα δεδομένων ελήφθησαν με τη χρήση διαφόρων μεθόδων για τη μέτρηση mRNA knockdown, διαφορετικές συγκεντρώσεις siRNA και μήκη (από 19 έως 21 nt), και χρησιμοποιούνται διάφοροι τύποι κυττάρων ή συστημάτων διαμόλυνση. Όλες αυτές οι διαφορές συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Ειδικότερα, το σύνολο δεδομένων Huesken, που χρησιμοποιείται συχνά για την ανάπτυξη αλγορίθμων σχεδιασμού siRNA [15], [16], [17], [22], παρήχθη χρησιμοποιώντας ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί τόσο για ένα εξωγενές γονίδιο ανταποκριτή φέρουν στόχος cDNA ένθετα με 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του (UTR) και ένα γονίδιο αναφοράς [15]. Αυτό το σύστημα μέτρησης μπορεί να μην είναι κατάλληλο κατά τη διερεύνηση του πώς ένα siRNA συμπεριφέρεται προς το στόχο του mRNA του στο φυσικό κυτταρικό περιβάλλον του. Ένα άλλο πρόβλημα που αντιμετωπίζουν κατά το συνδυασμό δεδομένων από ετερογενείς πηγές είναι η έλλειψη λεπτομερών πληροφοριών σχετικά με την αλληλουχία-στόχο [23].

Η

Για την αξιολόγηση της ακρίβειας των αυτοματοποιημένων εργαλείων σχεδιασμού siRNA σε ένα ρεαλιστικό πειραματικό περιβάλλον, εστιάσαμε στην το εργαλείο σχεδιασμού DSIR και συστηματικά διερευνηθεί πόσο καλά συμπεριφέρεται σε «πραγματική ζωή» με τη μέτρηση mRNA νοκ ντάουν σε τυποποιημένη δοκιμασία που βασίζεται σε κύτταρα. Για να γίνει αυτό, έχουμε δημιουργήσει μια ελεγχόμενη, κανονικοποιημένη πειραματική διαδικασία για siRNA επιμόλυνση και ποσοτική χρόνου PCR πραγματικού χρόνου μετρήσεις (qRT-PCR). Εκτιμήσαμε την αποσιώπηση δραστικότητα ενός συνόλου DSIR σχεδιασμένα, 21-nt siRNA duplex αλληλουχίες που κατευθύνεται έναντι δέκα ανθρώπινου καρκίνου που σχετίζονται με τα γονίδια-στόχους. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, έχουμε ποσοτικά τη συνολική προγνωστική δύναμη του DSIR siRNA αλγόριθμο σχεδιασμού. Επέτρεψε επίσης να μπορέσουμε να διερευνήσουμε περαιτέρω παράγοντες που δυνητικά βελτίωση της απόδοσης DSIR.

Υλικά και Μέθοδοι

1 Στόχος και siRNA Επιλογής

Εμείς αρχικά επιλεγεί οκτώ ανθρώπινα γονίδια που είναι γνωστό ότι είναι το κλειδί μοριακή συστατικά στο μετασχηματισμό των κυττάρων και τις διαδικασίες του καρκίνου (Πίνακας 2). Τα γονίδια αυτά διατηρούνται για θεραπευτική αξιολόγηση σε προκλινικές μελέτες που σχετίζονται με διάφορα μοντέλα όγκων από το «κοινοπραξία siRNA», ένα έργο που χρηματοδοτείται από την Ligue Nationale Καρκίνου Contre le. siRNA που στοχεύουν ενάντια περιοχές της πλήρους αλληλουχίας mRNA στόχου μήκους σχεδιάστηκαν με DSIR. Το μοντέλο 21-nt περιλαμβάνονται προεξοχές 2-nt 3 ‘[17]. siRNAs με περισσότερο από το 80% της προβλεπόμενης δραστηριότητας εξαφάνιση κρατήθηκαν, χωρίς απόρριψη siRNA εκτάσεις που περιέχουν πολυνουκλεοτίδιο. Μεταξύ αυτών των αλληλουχιών siRNA, siRNA που επικαλύπτονται ή ήταν υπερβολικά κλείνει απόσταση μεταξύ τους σε ιστοσελίδες στόχος δεν έγιναν δεκτές, αν είναι δυνατόν. Το τελικό σύνολο αποτελείται από 88 siRNA διπόλων. Ένα θετικό siRNA έλεγχο που στοχεύουν CSNK2B (προηγουμένως επικυρωθεί από [24]), και ένα αρνητικό siRNA ελέγχου κατά GFP επίσης περιλαμβάνονται σε αυτή την πρώτη λίστα των siRNA.

Η

Σε ένα δεύτερο γύρο των πειραμάτων, μια πρόσθετη σύνολο 40 siRNA που κατευθύνονται έναντι δύο από τα οκτώ γονίδια στοχεύουν στον πρώτο γύρο, ERCC2 και HDAC6, και δύο νέα γονίδια στόχου, PARP1 και της DNA λιγάσης 1 (LIG1) παρασκευάστηκε. Αυτό το σύνολο χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η συμβολή των εγγενών χαρακτηριστικών στόχων που προσδιορίζονται κατά τη διάρκεια του πρώτου γύρου των πειραμάτων. Τα κριτήρια για την siRNA συμπερίληψη στο δεύτερο γύρο ήταν: & gt? 80% δραστηριότητα εξαφάνιση προβλεφθεί από DSIR, μια θέση στην ακολουθία κωδικοποίησης (CDS) μέρος του στόχου, δεν εκτάσεις πολυνουκλεοτιδίου και δεν υπάρχει καμία δυνατότητα off-στόχων επιτρέπεται, μια εκτεταμένη ομάδα θέσεις στόχους με συμπληρωματικό κάλυψη της συνολικής αλληλουχίας μεταγραφής σε σχέση με την αλληλουχία siRNA σχεδιαστεί για την πρώτη σειρά. Λεπτομέρειες για τις δύο σειρές των siRNA που περιλαμβάνονται στο συμπληρωματικό πίνακα 1.

σύνθεση siRNA.

Όλα τα siRNA για την εξουδετέρωση των δέκα ανθρώπινα γονίδια συντέθηκαν ως δίπολα με SIGMA Proligo ως 21 καταναλωτές ( Συμπληρωματική Πίνακας S2).

2 Κυτταροκαλλιέργεια και διαμόλυνση

κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη, σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε 5% CO

2. Περίπου 1 χ 10

5 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 12 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Το μέσο αλλάχθηκε σε 0,4 ml ΟΡΤΙ-ΜΕΜ (Gibco) πριν την επιμόλυνση κυττάρων με 20 ηΜ siRNA χρησιμοποιώντας Oligofectamine (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν για 5 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με PBS, DMEM 10% FBS προστέθηκε, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί άλλες 72 ώρες (εκτός από BCL2L1 όπου τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες μόνο)

Δοκιμασία PCR. 3 σε πραγματικό χρόνο Μετρήσεις και

Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNA Απολύτως miniprep (Stratagene). Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη StrataScript QPCR κιτ cDNA Synthesis (Stratagene), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Gene-ειδικούς εκκινητές (εμπρός και πίσω) σχεδιάστηκαν για να είναι συμβατό με ένα μονό θερμικό προφίλ qRT-PCR, έτσι ώστε πολλαπλές μεταγραφές θα μπορούσαν να αναλυθούν ταυτοχρόνως. PrimerQuest (https://www.idtdna.com/SCITOOLS/Applications/PrimerQuest/) χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό τους. Οι αλληλουχίες εκκινητών που περιλαμβάνονται στο συμπληρωματικό πίνακα S2. Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε με FullVelocity SYBR Green QPCR Master Mix χρησιμοποιώντας τις συγκεντρώσεις εκκινητή που υποδεικνύονται στον Πίνακα 2. Οι συνθήκες PCR (συγκεντρώσεις εκκινητή, ποσότητα cDNA) έχουν βελτιστοποιηθεί και η αποτελεσματικότητα της PCR προσδιορίστηκε για κάθε γονίδιο στόχο. μίγματα αντίδρασης PCR (25 μΐ) τοποθετήθηκαν στο όργανο Mx3000P στην οποία πραγματοποιήθηκε το ακόλουθο πρόγραμμα ποδηλασίας, βελτιστοποιημένη για ένα μπλοκ 96-φρεατίων: 95 ° C για 5 λεπτά, που ακολουθείται αμέσως από 45 κύκλους των 10 sec στους 95 ° C και 30 sec στους 60 ° C. Στο τέλος, τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν με επώαση για 1 λεπτό στους 95 ° C και στη συνέχεια 30 sec στους 55 ° C, ακολουθούμενη από μια ράμπα μέχρι 95 ° C. ποιότητα και ειδικότητα της PCR επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση της καμπύλης διαχωρισμού. Για κάθε σετ εκκινητών, είχαν συμπεριληφθεί ένας έλεγχος χωρίς πρότυπο (NTC) και ένας έλεγχος χωρίς αντίστροφη-ενίσχυσης (NAC). Αντιδράσεις qRT-PCR διεξήχθησαν εις τριπλούν, και ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συγκριτικής κατώφλι κύκλου. Ποσοτικά στοιχεία της PCR συγκριτικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό MxPro (Stratagene, «Συγκριτική Ποσοτικοποίηση» εφαρμογή) είτε με το 36Β4 ή σήμα ενίσχυσης hHPRT ως εσωτερική «Normalizer» (για να διορθωθεί η συνολική περιεκτικότητα σε RNA) και πλαστή επισήμανση επιμολυσμένο δείγμα ως «βαθμονόμησης». Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως η σχετική μεταβολή στην έκφραση σε σύγκριση με τον έλεγχο. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν για κάθε δείγμα.

4 ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR Δεδομένων Κανονικοποίηση και στατιστική ανάλυση

Κάθε εκτέλεση PCR περιελάμβανε τρεις βιολογικούς επαναλήψεις για κάθε κατεργασία αναλύθηκαν. Επιπλέον, όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα, με διαφορετικά βιολογικά δείγματα. Η όλη διαδικασία εκτελέστηκε επίσης δύο φορές, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά γονίδια ομαλοποίηση. 18 εκτιμήσεις αναλογία εξαφάνιση

Q

* ελήφθησαν από αυτά τα δεδομένα, με βάση το ακόλουθο πρότυπο τύπο: όπου είναι το ποσοστό ενίσχυσης στο αρχικό στάδιο (ARES) της διαδικασίας για το μόριο-στόχο, είναι η ARES για το μόριο ομαλοποίηση, και

C

είναι ο αριθμός των κύκλων που απαιτούνται για να φτάσει ένα προκαθορισμένο επίπεδο σήματος. Θα ήταν βολικό να συνδυάσουν την ανεξαρτησία και ομοιογένεια υποθέσεις, για τον προσδιορισμό των περιφερειών της εμπιστοσύνης. Ωστόσο, εδώ η διαδικασία αυτή είναι σαφώς αμφισβητήσιμη, δεδομένου ότι ορισμένα ζεύγη των πειραμάτων μοιράζονται τις συνθήκες σχεδιασμού που οι άλλοι δεν κάνουν (για παράδειγμα, το ίδιο τρέξιμο, ή το ίδιο γονίδιο ομαλοποίηση). Για το λόγο αυτό, μια διαφορετική ανάλυση διεξήχθη, οι λεπτομέρειες του οποίου μπορούν να βρεθούν στο συμπληρωματικό υλικό. Οι τιμές απόσβεσης για κάθε μόριο siRNA που προβλέπονται στο συμπληρωματικό πίνακα S3.

5 Western Blot Δοκιμασία

Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA, κύτταρα HeLa συλλέχθηκαν για εκχύλιση πρωτεΐνης σε ρυθμιστικό RIPA (Τρις HCl pH 7.4 10 mM, NaCl 150 mM, SDS 0,1%, δεοξυχολικό 0,5%, EDTA 1 mM, Triton Χ100 1%, λευπεπτίνη 5 μg /ml, απροτινίνη 5 μg /ml). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα 12% SDS-PAGE πριν από τη μεταφορά σε μεμβράνη PVDF για 1 ώρα στους 100 V. Πρωτογενή αντισώματα: πολύκλωνο αντίσωμα CK2alpha (αCoc) [25] και μονοκλωνικού αντισώματος Hsp90 (κλώνος 16F1 από Stressgen) αραιώθηκαν 1 /500 σε PBS που περιέχει 3% άπαχο γάλα σε σκόνη. Κατσίκας αντι-κουνελιού ή -peroxidase αντι-ποντικού IgG (Interchim) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα, αραιωμένα σε PBS 1:5000. δεσμευτικό δευτερογενές αντίσωμα αποκαλύφθηκε με τη χρήση ECL συν αντιδραστηρίων (Amersham, #RPN 2105).

6 Στατιστικές Αναλύσεις

Η επιρροή των διαφόρων παραγόντων σχετικά με την αποτελεσματικότητα siRNA μετριέται αναλύθηκε με την τοποθέτηση γραμμικών μοντέλων και δοκιμές η σημασία του κάθε όρου με χρήση λογισμικού στατιστικής ανάλυσης R (https://www.r-project.org/). Η σημασία του κάθε όρου μοντέλου και των πρόσθετων ερμηνευτικών μεταβλητών ελέγχθηκε με τη χρήση στατιστικών ANOVA.

7 Δευτεροβάθμια Δομή του mRNA στόχου και Προσβασιμότητα

ιστοσελίδα Target προσβασιμότητα είχε αξιολογηθεί συστηματικά είτε με τη χρήση του web server SFold ( https://sfold.wadsworth.org), όπου το προφίλ πιθανότητα προβλέψει την προσβασιμότητα στόχου μπορεί να ελέγχεται οπτικά χρησιμοποιώντας τη μονάδα siRNA (βλέπε συμπληρωματική Εικόνα S2). Εναλλακτικά, το πρόγραμμα RNAplfold (Βιέννη απελευθέρωσης πακέτο 1.7.2) χρησιμοποιήθηκε με τα καθορισθέντα βέλτιστες παραμέτρους αναδίπλωσης (W = 80, L = 40 και υ = 16), όπως περιγράφεται στο [22]. Όσο υψηλότερη είναι η πιθανότητα RNAplfold, η πιο προσιτή η περιοχή-στόχος είναι. Οι πιθανότητες RNAplfold για κάθε αλληλουχία siRNA που περιλαμβάνονται στο συμπληρωματικό πίνακα S3.

8 Πιθανές Off-στόχο Αναζήτηση

Οι πιθανοί εκτός στόχου νοκ ντάουν γονιδίου ανιχνεύθηκε με την εφαρμογή ενός υλοποίηση in-house του Γου -Manber αλγόριθμο, μια παραλλαγή της Baeza-Yates shift-προσθέσετε μέθοδο [26]. Σε αντίθεση με την έκρηξη, το πρόγραμμα αυτό εκτελεί μια ακριβή αναζήτηση ενός συγκεκριμένου προτύπου (η σύντομη ακολουθία siRNA) σε μια βάση δεδομένων ακολουθίας (διαίρεση NCBI REFSEQ, αφήστε 32) επιτρέποντας αναντιστοιχίες. Στη μελέτη μας, η προεπιλεγμένη τιμή για τον αριθμό των αναντιστοιχίες επιτρέπεται ορίστηκε σε τρεις, όπως προτείνεται [13]. Ταυτότητα μεταξύ mRNA και siRNA σπόρων περιοχών που περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια 2-8 του αντινοηματικού κλώνου υπολογίστηκαν. Αυτό που εμπλέκονται τρέχει την εφαρμογή Wu-Manber χωρίς αναντιστοιχία επιτρέπονται, και τον έλεγχο επταμερέε σειρές σπόρων εναντίον μιας βάσης δεδομένων ακολουθίας 3’ΙΙΤΡ mRNA (που χτίστηκε από τα ανθρώπινα γονίδια που αναφέρονται στο REFSEQ, αφήστε 48). Ο αριθμός των ακολουθιών 3’UTR συμφωνημένα στην παγκόσμια μεταγραφικό, ο αριθμός των σπόρων που ταιριάζουν σε ένα 3’UTR αλληλουχία είναι ένα, δύο και τρεις ή περισσότερες φορές όλα αναφερθεί (συμπληρωματικός Πίνακας S3). Αυτά τα χαρακτηριστικά έχουν προταθεί για να συνδεθεί με RNAi off-στόχους [27], [28].

Αποτελέσματα

1 Πειραματικό Ρύθμιση

Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του siRNA αλληλουχίες σχεδιάστηκε από DSIR. Η αποτελεσματικότητα εκτιμήθηκε με μέτρηση ενδογενώς το ποσοστό της υπολειπόμενης μη διασπασμένο mRNA σε σχέση με ένα μάρτυρα, μη-στοχευόμενο mRNA. Μία τυποποιημένη διαδικασία καθιερώθηκε για να αποφευχθεί προκαταλήψεις λόγω πειραματικές συνθήκες (δηλαδή, κυτταρικό τύπο, συνθήκες επιμόλυνση, συγκέντρωση, ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR, κλπ). Σε ένα πρώτο γύρο των πειραμάτων, εστιάσαμε στην οκτώ γονιδίων-στόχων που σχετίζονται με τον καρκίνο. ERCC1 και ERCC2 είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην οδό επιδιόρθωσης νουκλεοτιδίων εκτομή (NER) και είναι απαραίτητες για την επισκευή προϊόντων προσθήκης σισπλατίνη που προκαλείται από DNA (cross-συμπλήρωση τρωκτικό ανεπάρκεια επισκευή επισκευή εκτομή) [29]. HDAC6 εμφανίζει δραστικότητα αποακετυλάσης της ιστόνης και καταστέλλει τη μεταγραφή [30]. BCL2L1 (Bcl-X

L) είναι ένα αντιαποπτωτικού Bcl-2 οικογενειακό μέλος και βασικός ρυθμιστής στην αποπτωτική διαδικασία [31]. HIF1A (HIF1α) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που επάγεται από την υποξία [32]. Σ ‘αυτά, προσθέσαμε τις τρεις υπομονάδες του CK2 πρωτεΐνης κινάσης, (i) CSNK2A1 (CK2α), (ii) CSNK2A2 (CK2α’) και (iii) CSNK2B (CK2β) [33]. Αυτά τα γονίδια στόχους mRNA περιγράφονται, τα χαρακτηριστικά τους, και ο αντίστοιχος αριθμός των αντιδραστηρίων siRNA δοκιμάστηκαν παρατίθενται στον Πίνακα 2. Όλα αυτά τα γονίδια είναι φυσικώς εκφράζεται σε ανθρώπινα κύτταρα HeLa, τα οποία είναι γνωστό ότι είναι εύκολα να επιμολυνθούν. Αυτά τα κύτταρα επιλέχθηκαν για να αποφευχθούν τυχόν επιπλέον μεταβολή λόγω της βήμα διαμόλυνσης. Για κάθε στόχο, 10 ή περισσότερα 21-nt siRNA σχεδιάστηκαν με DSIR, και επιλέγονται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Δεδομένου ότι η υψηλή συγκέντρωση siRNA μπορεί να οδηγήσει σε ανεπιθύμητες εκτός στόχου, και μια χαμηλή συγκέντρωση μπορεί να οδηγήσει σε μη ανιχνεύσιμα γονιδιακής σίγησης, έχουμε ως στόχο για συμβιβασμό με τον καθορισμό της συγκέντρωσης siRNA στα 20 ηΜ. Fold-αλλαγές στην έκφραση γονιδίων προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο ΔΔCt, με κανονικοποίηση είτε 36Β4 ή HPRT γονίδια σπίτι διατήρησης. Αυτή η στρατηγική ομαλοποίηση, βασίζεται σε δύο γονίδια αναφοράς, έχει αποδειχθεί ότι είναι πιο αξιόπιστο από εξομάλυνση με ένα μόνο γονίδιο αναφοράς [34]. HeLa αποδοτικότητα διαμόλυνσης των κυττάρων ελέγχθηκε σε όλα τα πειράματα με την ποσοτικοποίηση του αποτελέσματος ενός προηγουμένως επικυρωθεί siRNA [24] στόχευσης CSNK2B. Το πείραμα θεωρήθηκε ως επικυρωθεί όταν αυτή η θετική siRNA ελέγχου προς τα κάτω ρυθμισμένα CSNK2B κατά τουλάχιστον 80%. Έχουμε επίσης αναπτύξει ένα νέο μοντέλο που επιτρέπει την εξομάλυνση με τα δύο γονίδια καθαριότητας, 36Β4 και HPRT, μαζί. αναλυτική προσέγγιση μας που συμμετέχουν εξομάλυνση με τη χρήση πολλαπλών γονιδίων αναφοράς και βαθμονόμησης μεταξύ τρέξιμο. Αυτό βοήθησε να αποφευχθεί η διάδοση σφαλμάτων και απόκλισης μεταξύ των πλακών (βλέπε λεπτομέρειες στο συμπληρωματικό υλικό). Τέλος, δεδομένου ότι η επίδραση του siRNA τελικά απαιτείται σε επίπεδο προϊόντος, μία δοκιμασία στυπώματος Western για CSNK2A1 πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση παρατηρήσεις μας. Όλα αυτά τα αποτελέσματα και την πλήρη ανάλυση τους παρουσιάζονται Εικόνα 1 για αυτό το γονίδιο (και σε συμπληρωματικές Σχήμα S1 για άλλα γονίδια-στόχους).

κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με δέκα siRNA CSNK2A στόχευσης, και δύο ελέγχου siRNA, (GFP ως αρνητικός έλεγχος και CSNK2B ως θετικός έλεγχος) σε τελική συγκέντρωση 20 ηΜ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Oligofectamine. Ένας επιπλέον έλεγχος συνίστατο στην πλαστή επιμόλυνση των κυττάρων (χωρίς siRNA). Τρεις ημέρες αργότερα, το RNA και οι πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Α Επίδραση της θεραπείας siRNA από ένα τυπικό πείραμα. Για κάθε siRNA η σχετική ποσότητα του mRNA στόχου σε HPRT (μαύρο) ή 36Β4 (γκρι) παραστάθηκε γραφικά χρησιμοποιώντας τη μονάδα συγκριτικής ανάλυσης στο λογισμικό MxPro (Stratagene). B. Η επιμόλυνση του ελέγχου απόδοσης. Για κάθε πείραμα, οι αποτελεσματικότητες επιμόλυνσης ελέγχθηκαν μέσω ποσοτικοποίησης γονιδιακής σίγησης σε σχέση με ένα μάρτυρα siRNA γνωστής αποτελεσματικότητας. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων, όπου ο έλεγχος αυτός δεν φιμώσουν την έκφραση κατά περισσότερο από 70% είχαν εξαιρεθεί από το σύνολο δεδομένων, επειδή η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης θεωρήθηκε ότι είναι φτωχοί. Γ Box οικόπεδο εκπροσώπηση της αποτελεσματικότητας siRNA για 10 σειρές. Για κάθε siRNA, αποδοτικότητα προβλέπεται από DSIR και να μετρηθεί η αποτελεσματικότητα είναι ενδείκνυται. Μετρημένη αποδοτικότητα ήταν στατιστικώς προσδιορίστηκε από RT-τριπλούν qPCR ποσοτικοποίηση του mRNA στόχου μετά τη θεραπεία siRNA, βασίζεται σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. επίπεδα έκφρασης κανονικοποιούνται στο HPRT (μαύρο) και 36Β4 (κόκκινο) γονίδια σπίτι διατήρησης. Σύνδεση (Q) = 1 αντιπροσωπεύει καμία μείωση στο mRNA στόχου μετά τη θεραπεία και log (Q) = 1/4 ισοδυναμεί με απόδοση περίπου 75%. Βλέπε παράγραφο 2.6 για περαιτέρω λεπτομέρειες της στατιστικής ανάλυσης. Οι συνολικές τιμές απόδοσης siRNA και τη σημασία που παρέχονται στο συμπληρωματικό υλικό. Δ Western Blot ανάλυση των φίμωση αποδοτικότητα, χρησιμοποιώντας αντι-CK2alpha αντίσωμα. Φόρτωση πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε για τα επίπεδα Hsp90.

Η

2 Αξιολόγηση DSIR Design by Μέτρηση siRNA Δραστηριότητα

Το συνολικό ποσοστό αποτελεσματικότητας siRNA ανά γονίδιο στόχο συνοψίζεται στον Πίνακα 3. Για την αξιολόγηση του τρόπου με επιτυχία η μοντέλο σχεδιασμού DSIR σχεδιάζει siRNAs, έχουμε αναπτύξει ένα σύστημα βαθμολόγησης. siRNAs που απέδωσε γονίδιο στόχο τουλάχιστον το 70% νοκ ντάουν θεωρήθηκαν πολύ αποδοτικό? άλλα siRNA θεωρήθηκαν είτε μετρίως αποτελεσματική (από 50 έως 70%) ή αναποτελεσματική (& lt? 50%). Σύμφωνα με αυτή την κατάταξη, όλη η δέσμη στοιχείων siRNA περιέχει περισσότερο από 56% υψηλής απόδοσης, και το 25% μετρίως αποτελεσματική siRNA. Αυτό το συνολικό ποσοστό επιτυχίας δείχνει ότι DSIR αποδίδει καλά σε πραγματικό πειράματα.

Η

επόμενο επικεντρώθηκε σε κάθε στόχο ξεχωριστά για να προσδιοριστεί το ποσοστό επιτυχίας για την κατάσβεση μετρώντας τον αριθμό των αποδοτικών αλληλουχιών siRNA επί του συνολικού αριθμού των siRNA δοκιμάστηκαν για κάθε γονίδιο (Πίνακας 3). Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν μία εντυπωσιακή ετερογένεια του ποσοστού επιτυχίας από ένα γονίδιο-στόχο για την επόμενη, προτείνοντας διαφορετικές αντιδράσεις στο siRNA μεσολάβηση μονοπάτι σίγηση. Πράγματι, οι μετρήσεις qRT-PCR από τις ακόλουθες μεταγραφές, ERCC1, CSNK2B, CSNK2A1, CSNK2A2, αποκαλύπτουν μια ικανοποιητική κατατομή σίγηση (με 9/10, 7/10, 7/10 και 10/10 αποτελεσματική siRNA, αντιστοίχως). Σε αντίθεση, ERCC2 και HDAC6 (4/15 και 3/13 αντίστοιχα) φαίνεται να είναι αρκετά ανθεκτικά σε αποσιώπησης, με λίγα μόνο αποτελεσματικό siRNA παρά σε υψηλότερο αριθμό αντιδραστηρίων siRNA που δοκιμάστηκαν. Ενδιάμεσο επιτυχία παρατηρείται για HIF1A και BCL2L1, με την αποτελεσματική δράση siRNA σε 5/9 και 7/12 περιπτώσεις, αντίστοιχα. Αυτή η αντίθεση της εικόνας τονίζει ότι, από την άποψη της σίγασης, όλα τα γονίδια δεν είναι ίσες. Αυτό ήταν κάπως εκπληκτικό καθώς τα επίπεδα έκφρασης για όλα αυτά τα γονίδια-στόχους τεκμηριώθηκε να είναι εξίσου χαμηλά. Ως εκ τούτου, αν απορρίψετε γονιδίων στόχων που είναι η πιο ανθεκτική στην αποσιώπηση, ERCC2 και HDAC6, DSIR προβλέπει περισσότερο από το 70% υψηλής απόδοσης αλληλουχίες siRNA. Οι παρατηρήσεις αυτές υπογραμμίζουν την μη αμελητέο ρόλο που διαδραματίζει η mRNA στόχου κατά την αξιολόγηση των υπολογιστικών μοντέλων πρόβλεψης αποτελεσματικότητα siRNA.

3 Σχέση μεταξύ siRNA αποτελεσματικότητα και την πιθανή off-στόχο Επιδράσεις

Έχει αποδειχθεί ότι siRNA μπορεί να στοχεύουν μη-ειδικά άσχετα γονίδια που παρουσιάζουν μερική μόνο συμπληρωματικότητα ακολουθίας. Αυτό είναι γνωστό ως επιδράσεις εκτός στόχου (ΟΤΕ). Δύο τύποι του ΟΤΕ είναι πλέον διακρίνονται [35]. Το πρώτο από αυτά είναι ο ΟΤΕ διαμεσολαβείται από ago2 δρουν σε στόχους που είναι πολύ παρόμοια με την πραγματική τους στόχους siRNA. Αυτό φαίνεται να είναι πολύ ισχυροί, αν και αυτό το είδος της επίδρασης off-στόχος είναι σχετικά σπάνια συναντώνται. Ο δεύτερος τύπος του ΟΤΕ έχει παρατηρηθεί σε στόχους που περιέχουν παιχνίδια σπόρων στην 3’UTR περιοχή τους [36]. Αυτό συνεπάγεται ένα μηχανισμό που φαίνεται να είναι παρόμοια με εκείνη της ρύθμισης miRNA [27], [36], [37]. Δεδομένου ότι ο ΟΤΕ θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν χαμηλότερη απόδοση από ένα αποτέλεσμα αραίωσης, ερευνήσαμε την πτυχή αυτή μέσω του συστηματικού ελέγχου κάθε siRNA για πιθανές περιοχές εκτός στόχων. Πρώτον, παρατηρήσαμε ότι ούτε ο αριθμός των μερικών συμπληρωματικών off-στόχους, ούτε οι καθοριστικοί παράγοντες που σχετίζονται με την κλάση συχνότητας συμπλήρωμα σπόρων σχετίζονταν σημαντικά με την αποτελεσματικότητα siRNA (βλέπε παρακάτω 3.4). Επιπλέον, Du et al. [38] ανέφεραν ότι η θέση της αναντιστοιχίας εντός του διπλού και την ταυτότητα της βάσης που αποτελεί την αναντιστοιχία θα μπορούσε να επηρεάσει τη λειτουργικότητα siRNA. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της αναντιστοιχίας μεταξύ siRNA και του στόχου mRNA με μεγαλύτερη ακρίβεια σε σχέση με τη δραστηριότητα φίμωση RNAi, εστιάσαμε στο σταυρό-αντίδραση που θα μπορούσε να υπάρξει μεταξύ του γονιδίου στόχου CSNK2A2 και siRNA που κατευθύνεται έναντι CSNK2A1, για τις οποίες τρεις σειρές siRNA από το σύνολο δεδομένων μας ( si_031, si_034 και si_035) έχουν χαρακτηριστεί ως έχοντες το δυναμικό του ΟΤΕ (βλέπε Εικόνα 2Α). Παρά το γεγονός ότι αυτά τα τρία siRNA έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν δραστικά την έκφραση CSNK2A1, κανένας από αυτούς δεν είχε καμία επίπτωση στο επίπεδο των CSNK2A2 μεταγραφής, όπως αποκαλύπτεται από qRT-PCR (βλέπε Εικόνα 2Β). Επιπλέον, έχουμε παρατηρήσει ότι η θέση των αναντιστοιχίες για κάθε αλληλουχία siRNA οδηγό σκέλος (si_031: 6,19,21? Si_034: 3,6,12? Si_035: 2,5,8), κατά την απομαγνητοφώνηση CSNK2A2 δεν ήταν κατ ‘ανάγκην συμφωνία με τις ανεκτή θέση που εξαρτώνται από τις αναντιστοιχίες που περιγράφηκε προηγουμένως [38]. Για παράδειγμα, η θέση 12 βρέθηκε να ασθενώς ανεκτή, ενώ οι θέσεις 1, 2, 5, 7, 8, 18 και 19 βρέθηκαν να είναι καλά ανεκτή. Στην περίπτωσή μας, το ενεργό siRNA (si_035) περιέχει τρεις θέσεις υψηλής ανοχής που θα μπορούσε επίσης να προκαλέσει CSNK2A2 νοκ ντάουν. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση. Αυτό υποδηλώνει ότι αυτός ο συνδυασμός δεν είναι ανεκτή, ή ότι ο ΟΤΕ λόγω του σχεδόν τέλεια συμπληρωματικότητα είναι πολύ πιο περίπλοκη.

Α. Τρεις σειρές siRNA που στοχεύουν ενάντια CSNK2A1 ταυτοποιήθηκαν ως πιθανοί off-στόχους για CSNK2A2, με τρεις αναντιστοιχίες σε διαφορετικές θέσεις (με πεζά). κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με τρεις siRNA εναντίον CSNK2A1 (CK2α) (si_31, si_34 και si_35), ή κατά CSNK2A2 (CK2α ») (si_41) και ελέγχου GFP siRNA. Όλα τα siRNAs χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 20 ηΜ, και επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Oligofectamine. συμπεριλήφθηκαν επίσης Mock επιμολυσμένα κύτταρα (χωρίς siRNA). Τρεις ημέρες αργότερα, το RNA εκχυλίστηκε για περαιτέρω ανάλυση. B. Σχετική CSNK2A2 ποσότητα mRNA που καθορίζεται από qRT-PCR. Για κάθε siRNA, η ποσότητα του στόχου (ή off-στόχου) mRNA σε σχέση με HPRT (μαύρο) ή 36Β4 (γκρι) παραστάθηκε γραφικά.

Η

Ένας άλλος τρόπος για την ελαχιστοποίηση του ΟΤΕ είναι να μειωθεί η συγκέντρωση siRNA. επικύρωσης μας διεξήχθη με 20 nM siRNA, αλλά δοκιμάσαμε επίσης μικρότερες ποσότητες για να αξιολογήσει περαιτέρω αποτελεσματική ακολουθίες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 1 ηΜ είναι τόσο αποτελεσματική όσο 20 ηΜ για τρεις αλληλουχίες siRNA που κατευθύνεται έναντι CSNK2B και δύο αλληλουχίες siRNA που κατευθύνεται έναντι LIG1 (γονιδίου στόχου προστίθενται στο δεύτερο γύρο των δοκιμών, βλέπε παρακάτω). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το siRNA που σχεδιάστηκε από DSIR μπορεί να είναι ισχυρός ακόμη και σε «φυσιολογικές» συνθήκες, όπου οι συγκεντρώσεις μπορεί να είναι τόσο χαμηλά όσο 1 ηΜ.

Μια περιοχή συγκεντρώσεων από τρία siRNAs που κατευθύνονται έναντι CSNK2B, όλα με υψηλή συνολικής αποτελεσματικότητας (siRNA_26, _29 και si_30) (πάνελ Α), και δύο siRNA που κατευθύνεται έναντι LIG1 (siRNA_133 και _137) (πίνακας Β) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ της συνολικής απόδοσης και ποσό επιμολυνθεί. siRNA_GFP χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Το γράφημα δείχνει μέσες τιμές +/- τυπικές αποκλίσεις από το RT-qPCR ποσοτικοποίηση των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων ομαλοποιηθεί στο γονίδιο σπίτι-κρατώντας HPRT.

Η

4 Εξερευνώντας τα χαρακτηριστικά που να επηρεάζουν siRNA Ισχύς

Όλα τα siRNA σχεδιαστεί χρησιμοποιώντας DSIR είχε μια προβλεπόμενη ισχύ τουλάχιστον 80%. δεν λαμβάνονται ρητά Η συμβολή και η σημασία αρκετών προηγουμένως δημοσιευμένων κριτηρίων σχεδιασμού siRNA ή παράγοντες που πιστεύεται ότι παίζουν ένα ρόλο σε γονιδιακή σίγηση, και οι οποίες υπόψη από το μοντέλο DSIR, αναλύθηκαν. Η επίδραση ορισμένων από αυτά τα χαρακτηριστικά σχετικά με τις διαφοροποιήσεις που παρατηρούνται στις αποτελεσματικότητες των 88 siRNA δοκιμάστηκαν στον πρώτο γύρο των πειραμάτων αναλύθηκε. Για να γίνει αυτό, θα τοποθετηθεί πρώτα ένα γραμμικό μοντέλο για να εξηγήσει τις αποτελεσματικότητες siRNA μετράται ως συνάρτηση της 13ης χαρακτηριστικά: (1) η βαθμολογία DSIR, (2) το γονίδιο-στόχο, (3) η θέση στο γονίδιο-στόχο (σε bp σε σχέση στο 5 ‘άκρο), (4) η θέση στο γονίδιο-στόχο (5’ UTR, CDS ή 3 ‘UTR), (5) τον αριθμό των δυνητικών off-στόχους για την siRNA, (6) την απουσία ή παρουσία του ένα σωλήνα πολυνουκλεοτιδίου (με & gt? = 4 ταυτόσημα συνεχόμενα νουκλεοτίδια) του siRNA, (7) ο αριθμός των συμπτώσεων για το siRNA για την παγκόσμια ανθρώπινη μεταγραφικό, (8-10), ο αριθμός των αλληλουχιών mRNA που ταιριάζουν στην 3’UTR περιοχή τους (11), το μήκος του εξονίου στόχου, (12), η παρουσία ενός σύνδεση εξονίου-εξονίου στη θέση στόχο, και την προσβασιμότητα θέση (13) στόχου, υπολογίζεται όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Όλες αυτές οι πληροφορίες παρέχονται στο συμπληρωματικό πίνακα S3. τεστ ANOVA με ένα όριο σημαντικότητας 5% για τις Ρ-τιμές αποκάλυψε ότι μόνο τρία από αυτά τα δεκατρία συμεταβλητές συσχετίζεται σημαντικά με την αποτελεσματικότητα? αυτά ήταν ως εξής: η ταυτότητα του γονιδίου στόχου, η θέση στο γονίδιο-στόχο, και η θέση στο γονίδιο στόχος (όπως ορίζεται παραπάνω). Ειδικότερα, στο στενό εύρος πάνω από 80%, το σκορ DSIR δεν φαίνεται να συσχετίζεται σημαντικά με την αποτελεσματικότητα μετράται, γεγονός που υποδηλώνει ότι θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο για να επιλέξετε siRNA πάνω από ένα όριο, αλλά όχι να τα κατατάξει. Επιπλέον, καμία από τις άλλες συμμεταβλητές που έχουν προταθεί ως κριτήρια σχεδιασμού (αριθμός των off-στόχους, παρουσία ενός πολυνουκλεοτιδίου οδού, θέση στόχο την προσβασιμότητα) έδειξαν καμία απόδειξη ότι είναι σε θέση να προβλέψουμε την αποτελεσματικότητα μετράται σε σειρά μας του siRNA (δεν φαίνεται ).

Ως εκ τούτου, εκ νέου υπολογίζεται ένα γραμμικό μοντέλο μόνο με τα τρία σημαντικά συμβάλλοντας συμπαράγοντες. Πρώτον, η τοποθεσία της θέσης στόχου στο 5 ‘UTR, τα CDS ή την 3’ UTR έχει σημαντικό αντίκτυπο στην αποτελεσματικότητα μετράται (pVal & lt? 0.0003).