Abstract

Δυναμική αλληλοπαρεμβολές μεταξύ των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα, μόρια προσκόλλησης κυττάρου και εξωκυτταρική μήτρα είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή. Οι ιντεγκρίνες είναι διαμεμβρανικών υποδοχέων που δεσμεύουν πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας και επιτρέπουν την κυτταρική προσκόλληση και την οργάνωση του κυτταροσκελετού. Μπορούν επίσης μεσολαβούν μεταγωγή σήματος για να ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Ο υποδοχέας αυξητικού παράγοντα τύπου 1 που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF-IR) μεσολαβεί ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, την προσκόλληση και η αναστολή της απόπτωσης σε διάφορους τύπους καρκίνου. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι β

1 ιντεγκρίνες ρυθμίζουν ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του προστάτη (PRCA) με τη ρύθμιση της έκφρασης του IGF-IR και ανδρογόνων μεταγραφική λειτουργίες με τη μεσολάβηση υποδοχέων. Επιπλέον, έχουμε αναφερθεί πρόσφατα ότι ο IGF-IR ρυθμίζει την έκφραση του β

1 ιντεγκρινών σε κύτταρα PRCA. Έχουμε αποσυντίθενται τον μηχανισμό μέσω του οποίου IGF-IR ρυθμίζει β

έκφραση 1 ιντεγκρίνης σε PRCA. Εδώ αναφέρουμε ότι IGF-IR είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη PRCA κυττάρων και ότι β

1 ιντεγκρινών συμβάλλουν στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού από τον IGF-IR. Έχουμε αποδείξει ότι η β

1 Ο κανονισμός ιντεγκρίνης από τον IGF-IR δεν συμβαίνει σε επίπεδο mRNA. Η εξωγενής έκφραση ενός CD4 – β

1 ιντεγκρίνης χίμαιρα κυτταροπλασματική περιοχή δεν παρεμβαίνει με τέτοια ρύθμιση και αποτυγχάνει να σταθεροποιήσει β

1 έκφραση ιντεγκρίνης απουσία του IGF-IR. Αυτό φαίνεται να οφείλεται στην έλλειψη αλληλεπίδρασης μεταξύ του β

1 κυτταροπλασματική περιοχή και IGF-IR. Έχουμε αποδείξει ότι η IGF-IR σταθεροποιεί το β

1 υπομονάδα προστατεύοντάς το από την υποβάθμιση του πρωτεασώματος. Η α

5 υπομονάδα, ένας από τους συνεργάτες συνδέσεως του β

1, είναι επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω μαζί με το β

1 κατόπιν knockdown IGF-IR, ενώ καμία μεταβολή παρατηρείται στην έκφραση της α

2 , α

3, α

4, α

6 και α

7 υπομονάδες. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ένα κρίσιμο μηχανιστική ρόλο για το α

5β

1 ιντεγκρίνης, κατάντη του IGF-IR, στη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου

Παράθεση:. Sayeed Α, Fedele C, Trerotola Μ, Ganguly ΚΚ , Languino LR (2013) IGF-IR Προωθεί προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου με τη σταθεροποίηση α

5β

1 Ιντεγκρίνης επίπεδα πρωτεΐνης. PLoS ONE 8 (10): e76513. doi: 10.1371 /journal.pone.0076513

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 του Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 23 Αύγ. 2013? Δημοσιεύθηκε: 9, Οκτώβρη του 2013

Copyright: © 2013 Sayeed et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Επιχορήγηση Συμβόλαιο χορηγός: ΝΙΗ? αριθμός επιχορήγηση σύμβασης: R01 CA-89720 και CA-109874 (για να LRL), P01 CA-140043 (για LRL)? Αμερικανική Εταιρεία Καρκίνου (ACS) -IRG-08-060-04 (για AS)? Συμβόλαιο χορηγός επιχορήγησης: Πενσυλβάνια Υπουργείο Υγείας. Το έργο αυτό χρηματοδοτείται επίσης, εν μέρει, στο πλαίσιο επιχορήγησης Πανεπιστήμιο Commonwealth Ερευνητικό πρόγραμμα αυξήσεων με την Πενσυλβάνια Υπουργείο Υγείας (H.R.). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Δρ. Languino, η αντίστοιχη συγγραφέας, είναι μια συντακτική μέλος του διοικητικού συμβουλίου για PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Η προσκόλληση των κυττάρων στην εξωκυττάρια μήτρα (ECM) είναι κατά κύριο λόγο διαμεσολαβείται από ιντεγκρίνες και είναι ζωτικής σημασίας για την κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση. Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιμερείς υποδοχείς διαμεμβράνης, που αποτελείται από α και β υπομονάδες, που είναι μη-ομοιοπολικά συνδεδεμένες? αυτοί φυσικώς συνδέουν την ECM με την ενδοκυτταρική ακτίνης του κυτταροσκελετού, αλλά είναι επίσης σε θέση να μετάγουν σήματα αμφίδρομα κατά μήκος της μεμβράνης του πλάσματος [1]. Με τη δέσμευση προς τους συνδετήρες της ECM, οι ιντεγκρίνες ενεργοποιούνται και είναι σε θέση να ρυθμίζουν κυτταρικές λειτουργίες από την έναρξη της ενδοκυτταρικής καταρράκτες της σηματοδότησης. Μέχρι στιγμής, 24 ιντεγκρίνης ετεροδιμερή, 18 α και 8 β υπομονάδες και πέντε β

1variantsubunits β

1Aβ

1Bβ

1Cβ

1C-2 και β

1D, που δημιουργούνται με εναλλακτικό μάτισμα , έχουν περιγραφεί [2], [3]. Οι ιντεγκρίνες είναι κρίσιμα ρυθμιστές της ανάπτυξης, της διαφοροποίησης, την επιβίωση, τη μετανάστευση και την εισβολή [4], [5]. Έχει αναφερθεί ότι εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη (PRCA) για προχωρημένα στάδια σχετίζεται με αλλαγές στην ιντεγκρίνη προφίλ έκφρασης [6], [7], [8].

Οι οδοί της ιντεγκρίνης και αυξητικού παράγοντα σηματοδότηση είναι πιστεύεται ότι συνδέεται μηχανιστικά επειδή κυττάρων πρόσφυση στο ECM είναι ζωτικής σημασίας για τα κύτταρα να ανταποκρίνονται σε ορισμένους παράγοντες ανάπτυξης [9]. σηματοδότηση παράγοντα ανάπτυξης μπορεί να διαταράξει εστιακές συμφύσεις, οι αναμενόμενες θέσεις ιντεγκρίνης μεσολάβηση σηματοδότηση [9] και κατά συνέπεια ρυθμίζουν διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη προσκόλλησης κυττάρου και κινητικότητα. οι φυσικές και λειτουργικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ ιντεγκρινών και συστατικά οδών σηματοδότησης αυξητικού παράγοντα, συμπεριλαμβανομένης της ινσουλίνης αυξητικός παράγοντας 1 (IGF-1) ή προς τα κάτω πρωτεΐνες σηματοδότησης του [10], [11], έχουν αναφερθεί. Το εργαστήριο μας έχει αποδείξει ότι β

1 ιντεγκρινών επιλεκτικά ρυθμίζουν τύπου 1 υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα που μοιάζει με ινσουλίνη (IGF-IR) μεσολάβηση σηματοδότησης και λειτουργίες σε PRCA [10], [12]. IGF-1 έχει επίσης αναφερθεί ότι επάγει την προσκόλληση και τη μετανάστευση σε ανθρώπινα κύτταρα πολλαπλού μυελώματος, εν μέρει μέσω ενεργοποίησης του β

1 ιντεγκρινών [13]. Επιπλέον, ουσιαστικά δραστική β

1 ιντεγκρινών προάγουν κακοήθη φαινότυπο σε κύτταρα PRCA και η στόχευση τους αναφέρθηκε ότι αναστέλλει PRCA μετάσταση [14].

IGF-1 είναι ένα πολυπεπτίδιο μονής αλυσίδας ότι εκτός από την πιο κλασική της ενδοκρινικό ρόλο, μεσολαβεί αυτοκρινή ή παρακρινή ανάπτυξη και έτσι δρα ως ισχυρός παράγοντας ανάπτυξης και επιβίωσης. IGF-1 εκμαιεύει τις δράσεις της επί των κυττάρων με σύνδεση προς τον υποδοχέα, IGF-IR της. Το IGF-IR είναι ετεροτετραμερείς διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη με δράση κινάσης τυροσίνης [15]. Το υπόστρωμα υποδοχέα ινσουλίνης (IRS) πρωτεΐνες λειτουργούν ως ειδικές πρωτεΐνες σύνδεσης για IGF-IR και ινσουλίνη υποδοχέα (IR) [16]. IRS1 και IRS2 δεν περιέχουν ενδογενή δραστικότητα κινάσης, αλλά μάλλον λειτουργία με την πρόσληψη πρωτεϊνών στην επιφάνεια υποδοχείς, όπου συγκεντρώνουν συγκροτήματα σηματοδότησης. Σηματοδότηση από το IRS πρωτεΐνες έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των οδών συμπεριλαμβανομένων φωσφατιδυλο ινοσιτόλη-3 κινάση (ΡΙ3Κ) και ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) [17], [18]. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο μονοπάτια είναι επίσης γνωστό ότι ενεργοποιείται από ιντεγκρίνης εμπλοκής [19], [20]. Η συσχέτιση μεταξύ ιντεγκρινών και IRS1 έχει προταθεί ως πιθανός μηχανισμός για συνεργιστική δράση του αυξητικού παράγοντα και εξωκυτταρικών υποδοχέων μήτρας [21]. IGF-1 σηματοδότηση έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζεται από ένα μηχανισμό αρνητικής ανάδρασης μέσω ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση του IRS2, όπου το μέγεθος και τη διάρκεια της απόκρισης στην ινσουλίνη ή IGF-1 ρυθμίζεται [22]. Το εργαστήριο μας απέδειξε πρόσφατα ότι β

1 ιντεγκρίνες ρυθμίζουν την έκφραση του IGF-IR και είναι κρίσιμες για IGF-1 με τη μεσολάβηση ενίσχυση της υποδοχέα ανδρογόνου (AR) δραστηριότητα [23]. Έχουμε, επίσης, ανέφερε ότι η IGF-IR ρυθμίζει σφιχτά β έκφραση

1 ιντεγκρίνης στα κύτταρα PRCA [24], αλλά ο μηχανισμός στηρίζεται ο κανονισμός αυτός δεν έχει ακόμη χαρακτηριστεί.

Παρά την περιορισμένη συναίνεση σχετικά με τα επίπεδα του IGF- έκφραση IR σε καλοήθεις και κακοήθεις επιθήλιο προστάτη, αρκετές κλινικές μελέτες που στοχεύουν στην IGF-IR σε διαφορετικούς όγκους, συμπεριλαμβανομένων PRCA, βρίσκονται σε εξέλιξη. Ο εντοπισμός και η κατανόηση των κατάντη δράστες του IGF-IR θα βοηθήσει στον καλύτερο προσδιορισμό του λειτουργικού ρόλου του άξονα IGF-1 στο PRCA. Με δεδομένη την αναφερόμενη ένδειξη ισχυρή φυσική και λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ β

1 ιντεγκρίνες και IGF-IR, αυτή η μελέτη διερεύνησε την μηχανισμός μέσω του οποίου IGF-IR ρυθμίζει β

1 ιντεγκρίνες. Αναφέρουμε μία νέα οδό στιχομυθία μεταξύ IGF-IR και β

1 ιντεγκρίνες, η οποία προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, και αποδεικνύουν ότι ο IGF-IR σταθεροποιεί α

5β

1 ιντεγκρίνης προστατεύοντάς το από την υποβάθμιση του πρωτεασώματος.

Υλικά και Μέθοδοι

αντιδραστήρια και αντισώματα

χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντιδραστήρια. Opti-ΜΕΜ και Oligofectamine (όλα από την Invitrogen, CA), συνθετικό ανδρογόνο R1881 (Perkin-Elmer, CA), αναστολείς πρωτεϊνάσης (Sigma, ΜΟ), ανασυνδυασμένη IGF-1 (R &? D Systems, ΜΝ), MG132 και epoxomicin (Sigma , ΜΟ). Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού (mAbs): προς β

1 ιντεγκρινών (BD Transduction Laboratories, CA), σε IGF-IR για κυτταρομετρία ροής (Αir-3, EMD, NJ)? με α

2 ιντεγκρίνης (Abcam, Cambridge, UK)? με α

7 ιντεγκρίνη (8G2, EMD, NJ). Rat mAb σε CD4 αγοράστηκε από Santa Cruz, CA. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού (pAbs): σε IGF-IR (IGF-IR-β sc713), να ΑΚΤ και να ERK1 /2 (από την Santa Cruz, CA)? για survivin (Novus Biologicals, CO). pAbs Κουνέλι προς α

3, α

4, και α

5 ειδικό για την περιοχή C-τελικό άκρο της κάθε υπομονάδας, ήταν ένα είδος δώρου από τον Dr. Ε Ruoslahti, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας Santa Barbara, Sanford -Burnham Ιατρικό Ινστιτούτο Έρευνας, CA. Η α

6 Ab (AA6A) ειδικό για το Ο-τερματικό πεδίο της ανθρώπινης α

6 ιντεγκρίνης ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. Anne Cress, Πανεπιστήμιο της Αριζόνα, AZ. έχουν siRNA ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιούνται στην παρούσα έκθεση έχουν περιγραφεί πριν [24].

Cells

LNCaP και C4-2B κύτταρα αγοράστηκαν από την ATCC. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 5% FBS και 1% κάθε ένα από πυροσταφυλικό νάτριο, HEPES και μη ουσιώδη αμινοξέα. Για να αξιολογηθεί η επίδραση των αγωνιστών, μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής με 2% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα ορό (CSS) μέσο για 24 ώρες και ακολούθησε διέγερση με συνδέτη για επιπλέον 24 ώρες περιέχουν. PC3 κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. PC3-CH1, PC3-CH2 και PC3-Ch β

1C κύτταρα που χρησιμοποιούνται για επαγώγιμη έκφραση έχει περιγραφεί χιμαιρικά μορφώματα νωρίτερα [25], [26]. Τα κύτταρα τον ορό επί 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 75 μΜ ZnSO

4 για 6 ώρες. Η Ch1 χιμαιρικό κατασκεύασμα περιέχει την εξωκυτταρική περιοχή του ποντικού CD4 και τις διαμεμβρανικές και κυτταροπλασματικές περιοχές του β

1Α ιντεγκρίνη? Ch β

κατασκεύασμα 1C (που χρησιμοποιείται ως έλεγχος) είναι ίδιο με το Ch1 εκτός του ότι β

περιοχή ιντεγκρίνης κωδικοποίησης 1A αντικαθίσταται από β

κωδικοποιητική 1C περιοχής. Ch2 κατασκεύασμα αντιπροσωπεύει άλλο ελέγχου και φέρει τον εξωκυτταρικό τομέα του CD4 ποντικού συνδέεται με τον τομέα διαμεμβράνης του β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδας. Όλα τα κατασκευάσματα που εκφράζεται υπό τον έλεγχο του μεταλλοθειονεΐνης-1 προαγωγέα ποντικού και την έκφραση των χιμαιρικών παραλλαγών επάγεται με την προσθήκη ZnSO

4 στο μέσο ανάπτυξης.

Παροδική διαμόλυνση siRNA

παροδική επιμόλυνση των κυττάρων με siRNA ολιγονουκλεοτίδια διεξήχθη όπως περιγράφεται [23]. Ανεστραμμένη IGF-IR siRNA που έχει αντίστροφη αλληλουχία στόχο του IGF-IR siRNA χρησίμευσαν ως έλεγχος.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

LNCaP και C4-2B κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με έλεγχο ή IGF-IR siRNA . Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και αναλύθηκαν για την αποτελεσματικότητα του IGF-IR και β

1 ιντεγκρίνης μειορρύθμιση. Τα επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν και επανα-επιστρώθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες των 6-φρεατίων σε 3 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε 2% μέσο που περιέχει CSS-σε παρουσία 1 ηΜ R1881. Ζωντανά κύτταρα μετρήθηκαν για την επόμενη τρεις συνεχόμενες ημέρες με αιματοκυτταρόμετρο. Εικόνες από ζώντα κύτταρα ελήφθησαν την ημέρα 2 και 3 πριν τη συγκομιδή για μέτρηση.

Anchorage-ανεξάρτητη δοκιμασία ανάπτυξης

κύτταρα LNCaP απλώθηκαν και επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο ή IGF-IR siRNA σε συνδυασμό με είτε φορέα μόνο, pBJ1, ή ένα pBJ1-β

1 κατασκεύασμα [27]. Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε μαλακό άγαρ σε δίσκους 6-φρεατίων σε 5000 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για δύο εβδομάδες και οι αποικίες μετρήθηκαν. Το μέγεθος της αποικίας μετρήθηκε με τη χρήση ενός προσοφθάλμιου φακού εξοπλισμένο με σταυρόνημα μέτρησης και αποικίες με μέγεθος 0.1 χιλ μετρήθηκαν σε διαφορετικά δείγματα. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και οι εικόνες των αποικιών είχαν συλληφθεί από στερεομικροσκόπιο.

Ανοσοκαταβύθιση και ανοσοκηλίδωση

Ανοσοκαταβύθιση κυττάρων PC3 διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Τα κυτταρολύματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοκηλίδωση όπως περιγράφεται [12]. Για την ανάλυση κυτταρολύματα PC3 διαμολύνθηκαν με χιμαιρικά κατασκευάσματα, PC3-CH1 και PC3-Ch2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή IGF-IR siRNA και 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με 75 μΜ ZnSO

4 για 6 ώρες και στη συνέχεια, συλλέχθηκαν για ανοσοκηλίδωση. Η ένταση της κάθε ζώνης αξιολογήθηκε με ανάλυση ImageJ και ομαλοποιήθηκε με έλεγχο φόρτωσης.

FACS ανάλυση

PC3-CH1 και PC3-Ch2 κύτταρα κατεργάστηκαν όπως παραπάνω και συλλέχθηκαν για ανάλυση FACS. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 1 μg /ml Ab προς CD4 ή IgG αρουραίου ως αρνητικός έλεγχος, που ακολουθείται από χρώση με FITC-συζευγμένο δευτερεύον Ab. προφίλ έκφρασης αποκτήθηκαν με τη χρήση μέσου FACS Calibur (BD) και τα δεδομένα αναλύθηκαν από το λογισμικό FlowJo (Δέντρο Αστέρι Inc., OR).

πρωτεασώματος δοκιμασία αναστολής

LNCaP κύτταρα επιμολύνονται με έλεγχο ή IGF -IR siRNA και 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής εντός 2% μέσο που περιέχει CSS-για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 ηΜ R1881 με ή χωρίς 10 μΜ MG132 για 6 ώρες. PC3-2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον ίδιο τρόπο όπως τα κύτταρα LNCaP και 24 ώρες μετά την επιμόλυνση σε επεξεργασία με 10 μΜ MG132 είτε 6 ή 24 ώρες και αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση. Για συγκεκριμένες αναστολή της λειτουργίας πρωτεασώματος χρησιμοποιώντας epoxomicin, κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν όπως παραπάνω, πεινασμένο με 2% μέσο που περιέχει CSS-για 24 ώρες, ακολουθούμενη από κατεργασία με 1 ηΜ R1881 μαζί με 0, 100, 250 ή 500 ηΜ epoxomicin για 18 ώρες και η συγκομιδή. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Σχετικές εντάσεις ζώνης β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδες

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Κάθε αντίδραση διεξήχθη τουλάχιστον εις τριπλούν? τυπικές αποκλίσεις και η σημασία υπολογίστηκαν με τη χρήση του Excel (Microsoft) λογισμικού. Οι αλληλουχίες των oligos που χρησιμοποιούνται είναι οι εξής: β

1 ιντεγκρίνη, (έννοια: CTCAAGCCAGAGGATATTAC, αντινόημα: TCATTGAGTAAGACAGGTCC), IGF-IR, έννοια: AATGAGTGCTGCCACCCCGA, αντινόημα: ACACAGCGCCAGCCCTCAAA), GAPDH, (έννοια: GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT, αντινόημα: GTTCTCAGCCTTGACGGTGC) , β-ακτίνη, (έννοια: TCCATCATGAAGTGTGACGT, αντίθετης φοράς: GGAGGAGCAATGATCTTGAT).

η στατιστική ανάλυση

η στατιστική σημαντικότητα (τιμή P και t-test) μεταξύ συνόλων δεδομένων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Excel (Microsoft) λογισμικού. Ένα δύο όψεων τιμή Ρ ≤0.02 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται σε ένα γράφημα χρησιμοποιώντας DeltaGraph 4.5 (RockWare) λογισμικού.

Αποτελέσματα

Απώλεια του IGF-IR και β

1 ιντεγκρινών αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PRCA

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι β

1 ιντεγκρίνες είναι ζωτικής σημασίας για την IGF-IR με τη μεσολάβηση c ancer κυτταρικού πολλαπλασιασμού [10]. Από IGF-IR ρυθμίζει σφιχτά β

έκφραση 1 ιντεγκρίνης, αξιολογήσαμε το άμεσο αποτέλεσμα της εξάντλησης του IGF-IR στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. LNCaP και C4-2B κύτταρα παροδικά εξαντλούνται του IGF-IR και επανα-επιστρώθηκαν σε 2% μέσο που περιέχει CSS-παρουσία 1 ηΜ συνθετικό ανδρογόνο (R1881). Απώλεια του IGF-IR αναστέλλει εντυπωσιακά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (

* Ρ & lt? 0,02) (Εικ 1Α, κορυφή πάνελ.). Μειωμένη έκφραση του IGF-IR και β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδες και για τις δύο κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση (Εικ. 1Α, κάτω πάνελ). R1881 χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει τα επίπεδα έκφρασης του IGF-IR και β

1 και για να αυξήσουν τα αποτελέσματα αυτών των υποδοχέων επί του πολλαπλασιασμού. Σημαντικά αποτελέσματα στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρατηρήθηκαν επίσης σε απουσία R1881 σε LNCaP και C4-2B κυττάρων μετά την εξάντληση του IGF-IR (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μειωμένη πυκνότητα των κυττάρων σε συνθήκες καλλιέργειας είναι σαφώς παρατηρείται κατά την ανάλυση των κυττάρων C4-2B με μειωμένη IGF-IR και β

1 επίπεδα σε σύγκριση με κύτταρα με ενδογενή έκφραση αμφότερων των υποδοχέων (Εικ. 1Β). Αντιπροσωπευτικές εικόνες πυκνότητα των κυττάρων των δοκιμασιών ημέρα 2 και την ημέρα 3 πολλαπλασιασμό δείξει. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ο IGF-IR και β

1 ιντεγκρίνες είναι απαραίτητα για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PRCA.

(Α) LNCaP και C4-2B κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με τον έλεγχο siRNA ή IGF-IR siRNA και 24 h αργότερα, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν. Τα κύτταρα απλώνονται εκ νέου εις τριπλούν στα 3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων με 2% μέσο που περιέχει CSS-παρουσία 1 ηΜ R1881, συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν κατά την ημέρα 1, 2 και 3 μετά την εκ νέου επίστρωση . Κάθε πειραματική δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση από τρείς ανεξάρτητες τιμές (

* Ρ & lt? 0,01), σε σχέση με τις αντίστοιχες θεραπείες siRNA ελέγχου. Μια παράλληλη σειρά των κυτταρολυμάτων LNCaP και C4-2B αναλύθηκε για απόδοση του IGF-IR και β μειορύθμιση υπομονάδα

1 ιντεγκρίνης με ανοσοστύπωση (κάτω πάνελ). (Β) Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες σχετικές πυκνότητες C4-2B κύτταρο την ημέρα 2 και την ημέρα 3 δείχνονται.

Η

Εξωγενείς έκφραση της β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα αποκαθιστά την εξασθενημένη ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη του PRCA κυττάρων μετά από ρύθμιση προς τα κάτω IGF-IR

Τα ευρήματα ότι η IGF-IR ρυθμίζει β

1 έκφρασης ιντεγκρίνης και ότι η κατάργηση του IGF-IR σε κίνδυνο την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, μας ώθησε να διερευνήσει κατά πόσον β

1 ιντεγκρίνες παίζουν ένα ρόλο στην IGF-IR με τη μεσολάβηση ρύθμιση της ανάπτυξης. Για να προσδιοριστεί εάν β έκφραση

1 ιντεγκρίνης θα αντιστρέψει την αναστολή της αγκύρωσης ανάπτυξη ανεξάρτητη επάγεται από εξάντληση IGF-IR, τα κύτταρα LNCaP μορφομετατράπηκαν με IGF-IR siRNA, με ή χωρίς β cDNA

1 ιντεγκρίνης, και αφήνεται να αναπτυχθεί και να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ για δύο εβδομάδες. εξάντληση IGF-IR ελαττώνει σημαντικά την ανάπτυξη των αποικιών σε μαλακό άγαρ (

** Ρ & lt? 0,01) (Εικ. 2). Εξωγενείς έκφραση της β

1 υπομονάδας ωστόσο, ανακουφίζει μερικώς την καταστολή της ανάπτυξης που προκαλείται από knockdown IGF-IR, όπως μετράται με τον αριθμό των αποικιών με μέγεθος ≥100 μm (

* Ρ & lt? 0,02). Αντιπροσωπευτικές εικόνες των ζωντανών αποικιών συνελήφθησαν σε ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο και φαίνονται στο κάτω πάνελ (Εικ. 2). Αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν το ρόλο της β

1 ιντεγκρινών στην IGF-IR με τη μεσολάβηση ρύθμιση της ανάπτυξης σε κύτταρα PRCA.

LNCaP κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με είτε τον έλεγχο ή IGF-IR siRNA και με είτε το pBJ1 -β

1 κατασκεύασμα ή ο φορέας ελέγχου pBJ1. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε μαλακό άγαρ και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 2 εβδομάδες. Το μέγεθος των αποικιών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με προσοφθάλμιο σταυρόνημα που περιέχει 25 mm και συνολικό αποικίες με το μέγεθος ≥100 μm μετρήθηκαν. Οι αριθμοί που εμφανίζονται στο γράφημα αντιπροσωπεύουν τις μέσες μετρήσεις από τρία ανεξάρτητα δείγματα (

* P & lt? 0,02?

** P & lt? 0.001). Αντιπροσωπευτικές εικόνες των ζωντανών αποικιών που αντικατοπτρίζει μεταβολή του μεγέθους της αποικίας, με ή χωρίς εξωγενή β

1 δείχνονται στα κάτω πάνελ. Οι ράβδοι μέτρησης αντιπροσωπεύουν μεγέθους 100 μm.

Η

ρύθμιση του IGF-IR της β

1 έκφρασης ιντεγκρίνης δεν συμβαίνει σε επίπεδο mRNA

Συνεταιρισμός επίδραση αυτών των υποδοχέων σε ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων μας οδήγησε στην διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο IGF-IR ρυθμίζει β

1 έκφρασης. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι IGF-IR ρυθμίζει την έκφραση της β

1 υπομονάδες ιντεγκρίνης στα κύτταρα PRCA [24]. Ο κανονισμός αυτός μπορεί να συμβεί στο μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό, μεταφραστικό ή μετα-μεταφραστική επίπεδα. ρύθμιση του mRNA του β

1 ιντεγκρίνες με IGF-IR αναλύθηκε σε κύτταρα LNCaP με τη μείωση της έκφρασης του IGF-IR με παρεμβολή RNA, ακολουθούμενη από κατεργασία με R1881 ή /και IGF-1. Σε πραγματικό χρόνο αναλύσεις μεταγραφών mRNA δείχνουν ότι ο IGF-IR mRNA διεγείρεται 8-πλάσιο κατά R1881 και 2,5 φορές κατά την IGF-1 θεραπείας (Εικ. 3). Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές αλλαγές στις β είναι

1 mRNA επίπεδα ιντεγκρίνης ανιχνευθεί μετά τις δύο θεραπείες. Η εξάντληση του IGF-IR αποτελέσματα έκφρασης σε τετραπλάσια μείωση του IGF-IR mRNA μετά τις θεραπείες συνδετήρα. Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα επίπεδα β μεταγραφής

1 ιντεγκρίνης δεν αλλάζουν σημαντικά κατά knockdown IGF-IR. Ανάλυση των προφίλ έκφρασης GAPDH σε αυτό το πείραμα χρησιμοποιήθηκε ως επιπρόσθετος έλεγχος αναφοράς. Τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι ο IGF-IR δεν ρυθμίζει β

1 υπομονάδες ιντεγκρίνης στο επίπεδο του mRNA.

LNCaP κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο ή IGF-IR siRNA. Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιείχε 2% CSS για επιπλέον 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 1 ηΜ R1881 ή 100 ng /ml IGF-1 για επιπλέον 24 ώρες. RNA που απομονώνεται από αυτά τα κύτταρα αξιολογήθηκε για τα επίπεδα μεταγραφής του IGF-IR, β

1 ιντεγκρίνης και GAPDH χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. Οι τιμές έκφρασης κανονικοποιήθηκαν για τα επίπεδα μεταγραφής του β-ακτίνης και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως σχετική έκφραση. Κάθε αντίδραση διεξήχθη εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση (

* Ρ & lt? 0,01) σε σχέση με μη επεξεργασμένα δείγματα

Η

επαγώγιμη έκφραση του CD4-β

1Α ιντεγκρίνης χίμαιρα κυτταροπλασματική περιοχή κάνει. δεν προστατεύουν το ενδογενές β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδας από την αποδόμηση που προκαλείται από IGF-IR εξάντληση

Για να διερευνηθεί κατά πόσον η εξωγενής έκφραση της κυτταροπλασματικής περιοχής του β

1Α μεταβάλλει IGF-IR με τη μεσολάβηση ρύθμιση της ενδογενούς β υπομονάδες ιντεγκρίνης, χιμαιρικά μορφώματα που αποτελούνται από διαμεμβρανική και κυτταροπλασματική περιοχή του β

χρησιμοποιήθηκαν

1 1Α ιντεγκρίνης με CD4 εξωκυτταρική περιοχή (CH1). Η κυτταροπλασματική περιοχή της β

1 υπομονάδα υπάρχει σε πέντε διαφορετικές ματισμένες μορφές? η πιο ευρέως εκφραζόμενη μορφή στον καρκίνο, β

1Α, ρυθμίζει β

1 localization, κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μετανάστευση [2]. Έχουμε σκεφτεί ότι η σύνδεση της κυτταροπλασματικής περιοχής του β

1 ιντεγκρινών στην IGF-IR θα οδηγούσε σε κάποιο ανταγωνισμό για την πρόσδεση του IGF-IR σε διάφορες μορφές β

1 και να οδηγήσει σε β

1 προστατευτική ισχύ σύμφωνα με το απεμπλουτισμένο συνθήκες IGF-IR. Η έκφραση του Ch1 χίμαιρα (κύτταρα Ch1), ή CH2 χίμαιρα, η οποία αντιστοιχεί στην διαμεμβρανική περιοχή της β

1 συν τον εξωκυτταρικό τομέα CD4 (κύτταρα CH2), σε κύτταρα PC3 προκλήθηκε με ZnSO

4 θεραπεία. εξάντληση IGF-IR σε σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα ανάλυση (Σχ. 4Α, πάνω αριστερό πλαίσιο). Επαγωγή της κυτταροπλασματικής β

παραλλαγή 1 επιβεβαιώθηκε με FACS (Σχ. 4Α, κάτω πάνελ). Κατά την επαγωγή, IGF-IR αναμένεται να αναδιανέμει και συνδέονται τόσο με την ενδογενή β

1 και εξωγενή κυτταροπλασματική παραλλαγή. Εξωγενείς επαγωγή της β

1 κυτταροπλασματική περιοχή, όμως, δεν αλλοιώνει την IGF-IR με τη μεσολάβηση ρύθμιση της ενδογενούς β

1 επίπεδα ιντεγκρίνης (Σχήμα 4Α, πάνω δεξιά πάνελ). Προκειμένου να διερευνηθεί εάν το β

1Α κυτοπλασμική παραλλαγή αλληλεπιδρά φυσικά με τον IGF-IR, ανοσοκαταβύθιση CD4 σε PC3-CH1 και PC3-Ch β

1C κύτταρα (σταθερά επιμολυσμένα με κυτταροπλασματική περιοχή του β

1C ιντεγκρίνη συν το εξωκυτταρικό πεδίο CD4 [29]) πραγματοποιήθηκε μετά την επώαση των κυττάρων με ZnSO

4. Οι παραστάσεις ανοσοστύπωμα (άνω πάνελ) η παρουσία του IGF-IR στο προϊόν λύσης κυττάρου, αλλά όχι σε CD4 ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα. Το κάτω πίνακας δείχνει ότι CD4 ήταν αποτελεσματικά ανοσοκαταβυθίστηκε? ένα άσχετο ζώνη ανιχνεύθηκε επίσης στα IgG ανοσοκαταβυθίστηκαν δείγματα. Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η κυτταροπλασματική περιοχή της β

παραλλαγή 1Α ιντεγκρίνη δεν αλληλεπιδρά με ενδογενή IGF-IR (Εικ. 4Β).

(Α) PC3-Ch1 (που εκφράζει εξωκυτταρικό τομέα του ποντικού CD4 και η διαμεμβρανική και κυτταροπλασματική περιοχή του β

1) και τον έλεγχο των κυττάρων PC3-CH2 (που εκφράζουν τον εξωκυτταρικό τομέα του ποντικού CD4 συνδεδεμένο με το διαμεμβρανικό τομέα του β

1) διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο ή IGF-IR siRNA. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του IGF-IR knockdown (επάνω αριστερά πάνελ). PC3-CH1 και PC3-Ch2 κύτταρα στερήθηκαν τροφής εντός μέσου χωρίς ορό επί 24 ώρες και όπου υποδεικνύεται, επάγεται με 75 μΜ ZnSO

4 για επιπλέον 6 ώρες για την προώθηση της έκφρασης των χιμαιρικών πρωτεϊνών. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση

έκφραση 1 υπομονάδας (πάνω δεξιά πάνελ) β. Μια παράλληλη σειρά δειγμάτων υποβλήθηκε σε επεξεργασία για να επιβεβαιωθεί η επαγώγιμη έκφραση των χιμαιρών με ανάλυση FACS χρησιμοποιώντας ένα Ab προς CD4 (κάτω πάνελ). 10.000 κύτταρα σε κάθε δείγμα αποκτήθηκαν και τα δεδομένα φαίνεται στο ιστογράμματα με τον άξονα χ αντιπροσωπεύουν μέση σχετική έκφραση CD4 και τον άξονα y αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυττάρων. (Β) PC3-CH1 και PC3-Chβ

1C (συγκριτικά κύτταρα που εκφράζουν εξωκυτταρικό τομέα του ποντικού CD4 και τη διαμεμβρανική και κυτταροπλασματική περιοχή της β

1C) επωάστηκαν με 75 μΜ ZnSO

4 για να επάγει την έκφραση της κυτταροπλασματικής περιοχής του β

1Α ή β

1C ιντεγκρίνες, αντιστοίχως. Κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν είτε με IgG ελέγχου ή Ab έναντι χιμαιρικών domains CD4. Ανοσοσύμπλοκα αναλύθηκαν για έκφραση του IGF-IR με ανοσοκηλίδωση. λύματα εισόδου διεξήχθησαν οι έλεγχοι.

Η

Ενισχυμένη πρωτεασώματος υποβάθμιση της β

1 υπομονάδες ιντεγκρίνης σε περίπτωση απουσίας του IGF-IR

Μετά αποδεικνύοντας ότι η IGF-IR δεν ρυθμίζει β μεταγραφές

1 ιντεγκρίνης, επιδιώξαμε να καθοριστεί αν IGF-IR με τη μεσολάβηση ρύθμιση της β

1 επίπεδα ιντεγκρίνης θα συμβεί σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο. Παροδική εξάντληση του IGF-IR σε κύτταρα LNCaP ακολουθήθηκε από κατεργασία R1881 μόνο του ή σε συνδυασμό με έναν αναστολέα πρωτεασώματος, MG132, για 6 ώρες. R1881 χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει τα βασικά επίπεδα έκφρασης του IGF-IR και β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα όπως αναφέρθηκε από την ομάδα μας νωρίτερα [23] και τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν. Η μείωση των επιπέδων β

1 ιντεγκρίνης που προκαλείται από την εξάντληση IGF-IR καταργήθηκε κατά την κατεργασία των κυττάρων με αυτού του αναστολέα πρωτεασώματος (Εικ. 5Α). Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος επιβεβαιώθηκαν σε κύτταρα PC3 μετά από επιμόλυνση με είτε ελέγχου siRNA ή IGF-IR siRNA που ακολουθείται από κατεργασία με MG132 είτε 6 ή 24 ώρες (Σχ. 5Β). Εμείς επιπλέον επιβεβαιώνεται αυτά τα αποτελέσματα με τη χρησιμοποίηση διαφορετικών δόσεων epoxomicin, ένα άλλο πολύ εξειδικευμένος αναστολέας πρωτεασώματος [30]. LNCaP κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο ή IGF-IR siRNA όπως παραπάνω και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις epoxomicin. β

1 υπομονάδες ιντεγκρίνης είναι παρόντα σε είτε προδρόμου ή ώριμες μορφές (110 και 130 kD αντίστοιχα) και οι δύο είναι μειωτικά κατά την απώλεια του IGF-IR. Τα δεδομένα δείχνουν ότι epoxomicin δεσμεύει την αποικοδόμηση της ώριμης μορφής της β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα (Σχ. 5C). Το ώριμο β

1 υποδοχέα και μόνο φαίνεται να ακολουθεί την υποβάθμιση του πρωτεασώματος μετά την εσωτερίκευση. Ο πρόδρομος μορφή του β

1 (110 κϋ) το οποίο χρειάζεται περαιτέρω μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις να υποβάλλονται σε ωρίμανση δεν ανακτάται με αναστολή του πρωτεασώματος. Τα δεδομένα δείχνουν ότι ο IGF-IR σταθεροποιεί έκφραση υπομονάδας β

1 ιντεγκρίνης με αναστολή του πρωτεασώματος αποικοδόμηση της.

(Α) LNCaP κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο ή IGF-IR siRNA. Είκοσι τέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιείχε 2% CSS για επιπλέον 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα, 1 ηΜ R1881 και /ή 10 μΜ MG132 για 6 ώρες. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν για την έκφραση του β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα και IGF-IR με ανοσοκηλίδωση. ΑΚΤ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι εντάσεις ζώνη του β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση ImageJ και ομαλοποιήθηκε με εκείνες της ΑΚΤ ως έλεγχος φόρτωσης. Οι σχετικές τιμές έντασης που εκφράζεται ως επί τοις εκατό του δείγματος ελέγχου επιμολυσμένα μόνο με siRNA ελέγχου. (Β) κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο ή IGF-IR siRNA. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ MG132 για 6 ή 24 ώρες σε μέσο RPMI που περιείχε 10% ορό. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν για την έκφραση του β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα και IGF-IR με ανοσοκηλίδωση. ΑΚΤ χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β

1 υπομονάδες ιντεγκρίνης μετρήθηκαν με ImageJ όπως παραπάνω και τιμές κανονικοποιούνται με εκείνες της ΑΚΤ ελέγχου φόρτωσης. Σχετική τιμές έντασης του β

1 εκφράζονται ως επί τοις εκατό του δείγματος ελέγχου επιμολυσμένα μόνο με siRNA ελέγχου. (C) κύτταρα LNCaP διαμολύνθηκαν όπως παραπάνω και 24 ώρες αργότερα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε 2% CSS για επιπλέον 24 ώρες ακολουθούμενη από επεξεργασία με 0, 100, 250 ή 500 ηΜ epoxomicin σε συνδυασμό με 1 ηΜ R1881 για 18 ώρες. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν για ώριμες και πρόδρομες μορφές του β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα και IGF-IR με ανοσοκηλίδωση. ΑΚΤ χρησιμεύει ως μάρτυρας φόρτωσης. Σχετικές εντάσεις ζώνης των ώριμων β

1 ιντεγκρίνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση ImageJ όπως παραπάνω.

Η

Ανάλυση του α ιντεγκρίνης υπομονάδων κατόπιν προς τα κάτω ρύθμιση του IGF-IR

Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιμερή που αποτελούνται από α και β υπομονάδες. Υπάρχουν 24 πιθανές ετεροδιμερή με την ικανότητα να ενεργοποιεί συγκεκριμένες οδούς σηματοδότησης [19]. β

1 ιντεγκρίνες, μεταξύ άλλων υπομονάδων, είναι γνωστό ότι ετεροδιμερίζονται με α2, α3, α4, α5, α6 και α7 ιντεγκρίνης υπομονάδες, οι οποίες εκφράζονται σε κύτταρα LNCaP. Δεδομένου ότι η μείωση των επιπέδων έκφρασης του IGF-IR οδηγεί στην αρνητική ρύθμιση της β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα, αποφασίσαμε να καθοριστεί ποια α ιντεγκρίνης υπομονάδα επηρεάστηκε από προς τα κάτω ρύθμιση του IGF-IR. Έχουμε αποδείξει μία σημαντική μείωση της υπομονάδας α5 ιντεγκρίνης σε συνδυασμό με μειωμένη IGF-IR και β

1 επίπεδα (Εικ. 6). Καμία αλλαγή ανιχνεύθηκε στα επίπεδα έκφρασης άλλων α ιντεγκρίνης ετεροδιμερών συνεργάτες (Εικ. 6 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις μας σε κύτταρα PC3 όπου κατάργηση των β

1 ιντεγκρινών με shRNA οδήγησε σε σημαντική μείωση της επιφανειακής έκφρασης της α5 ιντεγκρίνης υπομονάδας [3]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το μείζον σύμπλεγμα ρυθμίζεται από IGF-IR είναι α5β

1 ιντεγκρίνης.

LNCaP κύτταρα διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο ή IGF-IR siRNA και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2% μέσο που περιέχει CSS-για 24 ώρες που ακολουθείται από κατεργασία με 1 ηΜ R1881 για 24 ώρες. IGF-IR και β1 ιντεγκρίνης προς τα κάτω ρύθμιση αξιολογήθηκε με ανοσοστυπώματα. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια αναλύθηκαν για την έκφραση των διαφόρων α ιντεγκρίνης υπομονάδες. Ειδικά Abs έναντι α

2, α

4, α

5, α

6 και α

7 υπομονάδες ιντεγκρίνης χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση του εταίρου α ιντεγκρίνης της β

1 ιντεγκρίνης υπομονάδα, η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από εξάντληση του IGF-IR.

η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη περιγράφει μια νέα παρατήρηση ότι ο IGF-IR σε κύτταρα λειτουργίες PRCA μερικώς διαμεσολαβούνται από β

1 ιντεγκρίνες. Για να αναλύσουμε το μηχανισμό με τον οποίο IGF-IR ρυθμίζει β

έκφραση 1 ιντεγκρίνης, έχουμε αποδείξει ότι IGF-IR ενισχύει β

1 σταθερότητας ιντεγκρίνης με τη μείωση της υποβάθμισης του πρωτεασώματος του. Έχουμε, επίσης, δείχνουν ότι η α

5 ιντεγκρίνης υπομονάδα συνδέεται με β

1 επιλεκτικά ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά την απώλεια του IGF-IR.

Ουσιαστική επιδημιολογικά και προκλινικά δεδομένα έχουν εντοπίσει το μονοπάτι του IGF-IR ως σημαντικός ρυθμιστής της βιολογίας των καρκινικών κυττάρων. Τα απογοητευτικά αποτελέσματα, ωστόσο, από διάφορες κλινικές δοκιμές που αποσκοπούν να αναστέλλουν IGF-IR, οι προτρέποντας ερευνητές να αναπτύξουν προγνωστική βιοδείκτες για να βελτιωθεί η επιλογή των ασθενών που θα επωφεληθούν από θεραπείες που στοχεύουν IGF-IR. Επιπλέον, μια σαφέστερη κατανόηση της σχετικές αναλογίες των συμπλοκών IGF-IR και IR σε όγκους είναι απαραίτητη.