Αφηρημένο

Παραδοσιακά, GRP78 έχει θεωρηθεί ως ένα ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) του αυλού πρωτεΐνης λόγω μοτίβο KDEL κατακράτησης καρβοξυλίου του. Πρόσφατα, ένα υποκλάσμα GRP78 βρίσκεται να εντοπίσουν στην επιφάνεια ειδικών τύπων κυττάρου, που χρησιμεύουν ως συν-υποδοχείς και ρυθμιστής σηματοδότησης. Ωστόσο, η φυσιολογική σημασία της κυτταρικής επιφάνειας GRP78 (sGRP78) έκφραση σε καρκίνο και λειτουργικές αλληλεπιδράσεις του στην κυτταρική επιφάνεια είναι μόλις εμφανιζόταν. Στην έκθεση αυτή, είμαστε σε συνδυασμό βιοχημικών, απεικόνισης και μεταλλάξεων προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση των ζητημάτων αυτών. Για την ανίχνευση του sGRP78, χρησιμοποιήσαμε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού πολύ ισχυρός και ειδικός για GRP78 ή με επισύναψη επιτόπου GRP78, σε συνδυασμό με την απεικόνιση και βιοχημικές τεχνικές που επέτρεψε την ανίχνευση sGRP78 αλλά όχι ενδοκυτταρική GRP78. Οι μελέτες μας αποκάλυψαν ότι μαστού και καρκίνου του προστάτη κύτταρα ανθεκτικά σε ορμονική θεραπεία προωθήσει ενεργά GRP78 στην επιφάνεια του κυττάρου, η οποία μπορεί να ανυψωθεί περαιτέρω από μία ποικιλία συνθηκών προκαλεί στρες ER. Δείξαμε ότι sGRP78 σχηματίζει σύμπλεγμα με PI3K, και η υπερέκφραση του sGRP78 προάγει τον σχηματισμό ΡΙΡ3, ενδεικτικό της ενεργοποίησης PI3K. Έχουμε περαιτέρω ανακαλύψει ότι ένα μετάλλαγμα ένθεσης του GRP78 στο πεδίο Ν-άκρο της, ενώ διατηρεί σταθερή έκφραση και την ικανότητα να μετατοπίζονται προς την επιφάνεια του κυττάρου, όπως η πρωτεΐνη άγριου τύπου, παρουσίασαν μειωμένο σχηματισμό συμπλόκου με ρ85 και την παραγωγή του ΡΙΡ3. Έτσι, οι μελέτες μας παρέχουν μια μηχανιστική εξήγηση για τη ρύθμιση της σηματοδότησης της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ με sGRP78. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η στόχευση sGRP78 μπορεί να καταστείλει θεραπευτική αντίστασης σε καρκινικά κύτταρα και να προσφέρουν μια νέα στρατηγική για την καταστολή της δραστηριότητας PI3K

Παράθεση:. Zhang Υ, Tseng CC, Tsai YL, Fu Χ, Schiff R, Lee AS (2013 ) Τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά στη θεραπεία ευνοούν την κυτταρική Surface επανατοπικοποίηση της GRP78 τα οποία σύμπλοκα με PI3K και ενισχύει ΡΙ (3,4,5) P3 παραγωγής. PLoS ONE 8 (11): e80071. doi: 10.1371 /journal.pone.0080071

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: δεύτερης Αυγούστου, 2013? Αποδεκτές: 8 Οκτώβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) χορηγεί R01 CA027607 και P01 AG034906 να ASL? CA058183 Ρ50 (Καρκίνο του Μαστού SPORE), P01 CA030195, Το πρόγραμμα SU2C /Μαστού Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο και στην RS? CA014089 Ρ30 (USC Norris Comprehensive Cancer Center του κυττάρων και ιστών Imaging Core) και Ρ30 DK048522 (USC Κέντρο Ερευνών για Ήπαρ Ασθένειες κυττάρων και ιστών Imaging Core). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η 78 kDa που ρυθμίζεται από γλυκόζη πρωτεΐνης (GRP78), που αναφέρεται επίσης ως ΒίΡ /HSPA5, είναι μια σημαντική ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) chaperone με αντι-αποπτωτική ιδιότητες [1] και ένα κύριο ρυθμιστή της ER στρες σηματοδότησης [2], [3]. Τα κύτταρα όγκου υποβάλλονται σε ER στρες λόγω των εγγενών παραγόντων αλλοιωμένης μεταβολισμό και εξωγενών παραγόντων της υποξίας και θρεπτικά στέρηση. ER επαγωγή άγχος της GRP78 σε καρκινικά κύτταρα ευνοεί την επιβίωση των κυττάρων, την εξέλιξη του όγκου [4], [5] και προσδίδει αντοχή φαρμάκου σε τόσο πολλαπλασιαζόμενα και αδρανείς καρκινικά κύτταρα, καθώς και οι συνδεδεμένες ενδοθηλιακά κύτταρα όγκου [6] – [11]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση πώς GRP78 ασκεί πλειοτροφικές επιδράσεις της στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση είναι μείζονος σημασίας.

Παραδοσιακά GRP78 έχει θεωρηθεί ως ER αυλού πρωτεΐνη λόγω μοτίβο διατήρηση καρβοξυλική ΚϋΕΓ της [12]. Πρόσφατα, ένα υποκλάσμα GRP78 βρέθηκε να εντοπίζεται στην επιφάνεια ειδικών τύπων κυττάρων, ιδίως σε καρκινικά κύτταρα [13] – [16]. κυτταρικής επιφάνειας πρωτεώματος των χαρακτηριστικών των κυττάρων όγκου αποκάλυψε μια σχετική αφθονία του σαπερόνες θερμικού σοκ και πρωτεΐνες που ρυθμίζεται από γλυκόζη, συμπεριλαμβανομένων GRP78 [17]. Σημαντικά, προτιμησιακή έκφραση του GRP78 στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, αλλά όχι σε φυσιολογικά όργανα επιτρέπει ειδική στοχοθέτηση του όγκου, οδηγώντας σε καταστολή όγκου χωρίς επιβλαβείς συνέπειες για τους φυσιολογικούς ιστούς [18] – [21].

Υπάρχουν ενδείξεις ότι αυτό sGRP78 μπορούν να σχηματίσουν σύμπλοκα με ειδικές πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας και να ρυθμίζει τη μεταγωγή σήματος [13], [14], [16], όπως είναι ένα συν-υποδοχέας για τον αναστολέα πρωτεϊνάσης α2-μακροσφαιρίνη (α2-Μ *) που προκαλείται μεταγωγής σήματος για τον καρκίνο επιβίωση και τη μετάσταση [22], [23]. Cripto, ένας ΟΡΙ-αγκυρώνεται κλειδί πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας έως την εξέλιξη του ανθρώπινου όγκου, και sGRP78 σχηματίζουν ένα σύμπλοκο και συνεργάζονται για να αναστέλλουν σηματοδότηση ΤΟΡ-β και την ενίσχυση της ανάπτυξης των κυττάρων και την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ [24], [25]. Επιπλέον, sGRP78 απαιτείται για την επιβίωση Τ-καντερίνης-εξαρτώμενη ενδοθηλιακών κυττάρων [26], η ενεργοποίηση της απόπτωσης που διαμεσολαβείται από Kringle 5 [27], [28] και το εξωκυτταρικό Par-4 και TRAIL [29], καθώς και είσοδο του ιού σε ξενιστή κύτταρα [30], [31]. Πρόσφατα δείξαμε επιφάνεια εντοπισμό των κυττάρων των GRP78 ρυθμίζεται από μηχανήματα ανάκτησης ER και ενισχύεται από την εξάντληση των Ca

2+ από το ER [32]. Τα καρκινικά κύτταρα συχνά υποβάλλονται σε ER στρες, οι οποίες επιδεινώνονται από την κυτταροτοξική θεραπεία που οδηγεί σε αντίσταση. Ωστόσο, αν παθολογικές στρες, όπως η ανάπτυξη θεραπευτικών αντίστασης, οδηγεί σε επανατοπικοποίηση του GRP78 στην επιφάνεια του κυττάρου δεν είναι γνωστή.

Ο ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδός ενεργοποιείται σε ένα ευρύ φάσμα των καρκίνων που οδηγούν σε πολλαπλασιασμό και θεραπευτικών αντίσταση [33]. Η ΡΙ3Κ έχει δύο υπομονάδες, την ρ85 ρυθμιστική υπομονάδα ρ110 και η καταλυτική υπομονάδα. Για την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ, φωσφορυλίωση τυροσίνης του ρ85 ρυθμιστική υπομονάδα της ΡΙ3Κ ανακουφίζει ανασταλτική δράση της επί της ΡΙ3Κ, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της. Κατά τη σύνδεση στο ενεργοποιημένο υποδοχέα αυξητικού παράγοντα, ΡΙ3Κ στρατολογείται στην μεμβράνη του πλάσματος. ΡΙ (4,5) Ρ2 φωσφορυλιώνεται από ΡΙ3Κ να δώσει ΡΙ (3,4,5) Ρ3, το οποίο προωθεί τον εντοπισμό μεμβράνης της ΡϋΚ1, η οποία στη συνέχεια φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί ΑΚΤ. Μέσω knockdown του GRP78 με siRNA, απολίνωση επιφάνεια GRP78 κυττάρου με αντίσωμα και σε γενετικά μοντέλα καρκίνου, GRP78 έχει καθιερωθεί ως νέο ρυθμιστής της ΡΙ3Κ σηματοδότησης τόσο in vitro όσο και in vivo [16], [25], [34], [35]. Ενώ μπορεί να υπάρχουν πολλαπλοί μηχανισμοί σύμφωνα με την οποία GRP78 μπορούν να επηρεάσουν την ενεργοποίηση ΑΚΤ, έχει αναφερθεί ότι αντίσωμα που στοχεύει το Ν-τελικό άκρο της μιμείται GRP78 τα έντυπα υποδοχέα αναγνωρίζονται από α2-M * ως συνδέτη και οδηγεί ΡΙ3Κ-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των ΑΚΤ και την επακόλουθη διέγερση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού in vitro [21], [36]. Αντιστρόφως, ένα τερματικό πεδίο καρβοξυλ αντιδραστική αντίσωμα δρα ως ανταγωνιστής των α2-M * και καταστέλλει α2-M * επαγόμενη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ [21]. Πρόσφατα, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που στοχεύει κυτταρική επιφάνεια GRP78 δείχνεται να καταστείλει ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σηματοδότηση, την ανάπτυξη και μετάσταση όγκου σε πολλαπλά μοντέλα καρκίνου του [37]. Παρά τις εξελίξεις αυτές, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το πώς sGRP78 ρυθμίζει τη δραστηριότητα των PI3K. Στην έκθεση αυτή, αναλύσαμε την έκφραση sGRP78 στις γραμμές του μαστού και του καρκίνου του προστάτη κύτταρο ανθεκτικό σε ορμονική θεραπεία, και εξέτασε ρύθμιση της παραγωγής ΡΙΡ3. Αυτά τα αποτελέσματα επεκτείνουν τις γνώσεις μας σχετικά με sGRP78 και έχουν σημαντικές συνέπειες για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Όλα τα πρωτόκολλα για τη χρήση των ζώων εξετάστηκαν και εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των Ζώων και Χρήση Επιτροπή USC Θεσμική. Ο αριθμός διασφάλισης ζώο είναι A3518-01. Ο αριθμός πρωτοκόλλου είναι 9964.

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF) κύτταρα [38], ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, ΗΕΚ293Τ [32] και HeLa [32], καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. κυτταρικές σειρές ανθρώπινου, LNCaP (ATCC, Manassas, VA) και C4-2B (Viromed Lab, Minneapolis, ΜΝ), διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Τα γονικά κύτταρα MCF7L [39] καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη /γλουταμίνη? τα κύτταρα MCF7L-tamr ήταν στο ίδιο μέσο εκτός από την άνευ ερυθρού φαινόλης (PRF) RPMI 1640 και 10% ξυλάνθρακα δεξτράνη απογυμνωμένο (CS) -FBS. Η γονική MCF7 /HER2-18 κύτταρα [40] καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS, 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, 0.4% γενετικίνη (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) και 15 μg /ml ινσουλίνη (Sigma-Aldrich, St . Louis, ΜΟ)? τα κύτταρα MCF7 /HER2-18-tamr ήταν στο ίδιο μέσο εκτός από την PRF DMEM και 10% CS-FBS. Τα κύτταρα tamr των δύο μοντέλων MCF7L και MCF7-HER2-18 διατηρήθηκαν σε μέσο που περιείχε 100 ηΜ 4-υδροξυταμοξιφένη (Sigma-Aldrich) ως την τελική συγκέντρωση. Η κυτταρική γραμμή που εξαρτώνται από οιστρογόνα, MCF-7 /BUS, παρασχέθηκε ευγενώς από τον Α.Μ. Soto (Πανεπιστήμιο Tufts, Medford, ΜΑ) και έχει περιγραφεί [41], [42]. Οι συνθήκες απομόνωσης και του πολιτισμού για την πείνα οιστρογόνων ανθεκτικά κλώνος MCF-7 /BUS-10 έχουν περιγραφεί [43]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2, 95% αέρα. Για τη θεραπεία του στρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θαψιγαργίνη (Tg) στα 300 nm, η τουνικαμυκίνη (Τρ) σε 1,5 μg /ml για 16 ώρες, ή 2-δεοξυγλυκόζη (2DG) στα 10 mM για 24 ώρες.

Τα πλασμίδια

Η κατασκευή του FLAG-GRP78 με FLAG-ετικέτα εισάγεται μετά του πεπτιδίου σήματος ER (αα 1-18) του πλήρους μήκους ανθρώπινο GRP78 (αα 1 έως 654) έχει περιγραφεί [32]. GRP78-103F περιέχει ένα FLAG-tag εισάγεται αμέσως μετά αα 103 της ανθρώπινης GRP78 κατασκευάστηκε ως εξής: πλήρους μήκους ανθρώπινο GRP78 σε pcDNA3 (ϋίβ Technologies) ραχοκοκαλιά χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο με QuikChange τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Το πλήρους μήκους ανθρώπινο ρυθμιστική υπομονάδα της ΡΙ3Κ, cDNA ρ85 άλφα, ενισχύθηκε με RT-PCR από ανθρώπινο ΗΕΚ293 RNA και υποκλωνοποιήθηκε σε pcDNA3 σε θέσεις BamHI και XbaI.

συνθήκες διαμολύνσεως

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 60-80% συρροή και επιμολύνθηκαν με Biot (Bioland Scientific, Paramount, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται [32].

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

τα κύτταρα λύθηκαν σε ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό συμπληρωμένο με αρμόδιες αναστολέα πρωτεάσης (Thermo Scientific, Rockford, IL). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε 10% SDS γέλες και αναλύσεις στυπώματος Western όπως περιγράφεται [32]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: αντίσωμα ποντικού αντι-FLAG (Sigma-Aldrich), 1:1000? ποντίκι αντι-GRP78 αντισώματος MAb159 (δώρο από τον Ρ Gill, USC), 1:2000? αντι-ΡΙ3Κ ρ85 αντίσωμα κουνελιού (# 4292, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), 1:1000? ρ110α αντίσωμα κουνελιού αντι-ΡΙ3Κ (# 4249, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), 1:1000? αντι-EphB4 αντίσωμα ποντικού (δώρο από τον Ρ Gill, USC), 1:1000? κουνελιού αντι-ΝΚΑ α1 (Na, Κ-ΑΤΡάση α1) αντίσωμα (Cell Signaling Technology), 1:1000? ποντικού αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (Sigma-Aldrich), 1:5000. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 2-3 φορές. επίπεδα πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν είτε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) ή χρώση φθορισμού, και οπτικοποιούνται και ποσοτικοποιούνται με Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ή με LiCor Οδύσσεια.

Ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκοπία

για την ανίχνευση των ενδογενών sGRP78, τα κύτταρα C4-2B σπάρθηκαν σε 5 × 10

3 ανά φρεάτιο σε ένα 8-φρεατίων slide θάλαμο (Millipore, Billerica, ΜΑ) για 24 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με Tg για 8 ώρες . Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, πλύθηκαν με ψυχρό PBS, και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% BSA σε PBS (BSA /PBS) επί πάγου επί 30 λεπτά. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-GRP78 (MAb159) σε 1% BSA /PBS σε 10 μg /ml στους 4 ° C όλη τη νύκτα χωρίς διαπερατοποίηση. Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό PBS και βάφτηκαν με AlexaFluor-488 αντίσωμα αντι-ποντικού κατσίκας (Life Technologies) σε 1% BSA /PBS στους 4 ° C για 1 ώρα. Για τις επόμενες ανοσοϊστοχημική χρώση για τον ρ85 που είναι ενδοκυτταρικό, τα κύτταρα διαπερατά με 0,5% (w /v) σαπωνίνη σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 15 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS που περιείχε 0,01% σαπωνίνη (PBS /Sap), και στη συνέχεια δεσμεύτηκαν με 5% BSA σε PBS /Sap σε RT για 1 ώρα. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-ρ85 κουνελιού (1:50, Cell Signaling Technology) σε 1% BSA σε PBS /Sap σε RT για 2 ώρες, που ακολουθείται από χρώση με AlexaFluor-594 αντίσωμα αντι-κουνελιού κατσίκας (Life Technologies) σε 1% BSA σε PBS /Sap σε RT για 1 h.

για την ανίχνευση των εκτοπικά εκφραζόμενη FLAG-tagged GRP78 στην επιφάνεια του κυττάρου, τα κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε 5 × 10

3 ανά φρεάτιο σε 8- καλά θάλαμος διαφάνειες 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Biot. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, μη διαπερατά κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και αποκλείστηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω και μετά επωάστηκαν με αντι-FLAG αντίσωμα ποντικού (Sigma-Aldrich) σε 1% BSA /PBS στους 4 ° C για 1 ώρα που ακολουθείται από επώαση με AlexaFluor αντίσωμα αντι-ποντικού κατσίκας -488 (Life Technologies) σε 1% BSA /PBS στους 4 ° C για 30 λεπτά. Για την ανίχνευση του φωσφατιδυλινοσιτόλης 3,4,5-τριφωσφορική (ΡΙ (3,4,5) Ρ3), τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΜΟΜ ™ Mouse Ig Blocking Reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA) σε RT για 1 ώρα για να εμποδίσει ανοσοσφαιρίνης ποντικού από αντίσωμα αντι-FLAG πρωτογενούς ποντίκι. Τα κύτταρα στη συνέχεια διαπερατά όπως περιγράφεται παραπάνω και χρώση ενδοκυτταρικής ΡΙ (3,4,5) P3 διεξήχθη όπως περιγράφεται [35]. Για την ανίχνευση του ρ85 σε κύτταρα HeLa, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά και υπέστησαν χρώση με το πρωτογενές αντίσωμα στους 37 ° C για 1 ώρα και το δευτερεύον αντίσωμα σε 37 ° C για 30 λεπτά.

Όλα ανοσοχρώση κύτταρα τοποθετημένα με Vectashield μέσο αντι-fade περιέχει DAPI (Vector Laboratories), και αναλύονται από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο Zeiss LSM 510 εξοπλισμένο με λογισμικό LSM 510 Έκδοση απόκτηση 4.2 SP1 (Carl Zeiss). Εκπρόσωπος εικόνες ελήφθησαν με ένα ΕΚ Σχέδιο Neofluar 40 × /1,30 πετρελαίου στόχος ή στόχος Plan-Αχρωματικός 100 × /1.4 πετρελαίου DIC. εικόνες Z-stack ελήφθησαν με αντικειμενικό Σχέδιο Αχρωματικός 100 × /1.4 έλαιο DIC.

πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας βιοτινυλίωση και απομόνωση

Το κύτταρο πρωτεΐνες επιφάνειας βιοτινυλιώθηκαν με μη διαπερατή βιοτίνη, λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA και καθαρίζεται με σφαιρίδια αγαρόζης NeutrAvidin όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32].

συνανοσοκαθίζησης δοκιμασία

Τα επιμολυσμένα κύτταρα βιοτινυλιώθηκαν και λύθηκαν με ανοσοκαταβύθιση ρυθμιστικό (ΙΡ) (25 mM Τρις- Cl, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ40). Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε μονομερείς στήλη αβιδίνης (Thermo Scientific) και εκλούστηκε με 2 mM D-βιοτίνη σε PBS ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το έκλουσμα συμπυκνώθηκε με Vivaspin 6 συγκεντρωτές (10 kDa MWCO, Sartorius Stedim Biotech, Concord, CA), προκαταρκτική διαύγαση με 50 μΐ Dynabeads πρωτεΐνη G (Life Technologies) και υποβλήθηκε σε επώαση με αντίσωμα αντι-FLAG 1 μα ποντικού (Sigma-Aldrich) ή φυσιολογική IgG ποντικού επί μία νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με 50 μΙ Dynabeads πρωτεΐνη G για 1 ώρα στους 4 ° C. Μετά την πλύση, τα σφαιρίδια έβρασαν για 5 λεπτά σε 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε 10% SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και στύπωμα Western.

ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) δοκιμασία

Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με μη ενζυμικό διάλυμα διαστάσεως κυττάρων (Sigma-Aldrich) στους 37 ° C για 15 λεπτά και κλασματοποιούνται σε 1 × 10

6 κύτταρα /σωλήνα και επωάστηκαν με 10% κανονικό ανθρώπινο ορό σε PBS για 20 λεπτά επί πάγου για να εμποδίσει Fc υποδοχείς στην επιφάνεια των κυττάρων. Τα κύτταρα επωάστηκαν με μια ποσότητα κορεσμού του αντι-GRP78 αντίσωμα ποντικού (MAb159) (1 μg) επί 40 λεπτά σε πάγο σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος χρώσης (PBS Dulbecco, 2% ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση, 0.09% αζίδιο νατρίου) , που ακολουθείται από AlexaFluor-488-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (0,5 μg, Life Technologies) και αιωρούνται σε παγωμένο PBS που περιείχε 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, 1 μg /ml, Sigma-Aldrich) και υποβλήθηκαν σε FACS. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με ροή LSR II κυτταρόμετρο (Becton Dickinson, San Jose, CA) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo.

Αποτελέσματα

ενεργός προώθηση της έκφρασης GRP78 επιφανείας κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε ορμονικές θεραπεία

για να ελεγχθεί αν ανάπτυξη αντοχής σε θεραπευτική αγωγή μεταβάλλει την έκφραση του sGRP78 σε καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε τρία σετ καρκινικές κυτταρικές γραμμές και τα παράγωγά τους, που έχουν αποκτήσει αντίσταση στη θεραπευτική αγωγή. Ο καρκίνος των ανθρώπινων κυττάρων του μαστού γραμμή MCF7L γονική γραμμή (MCF7L-Ρ) και ένα παράγωγο ταμοξιφένη ανθεκτική γραμμή (MCF7L-tamr) δημιουργήθηκαν από μακροχρόνια καλλιέργεια του MCF7L-Ρ κύτταρα σε PRF-μέσο που περιέχει 10% CS-FBS και 100 ηΜ ταμοξιφένης (Tam), μέχρι την ανάπτυξη των κυττάρων συνεχίζεται (μετά από 4 μήνες). Σε αντίθεση με τα κύτταρα MCF7L-Ρ η οποία αυξήθηκε σε μέσο που περιέχει Ε2 αλλά όχι σε μέσο που περιέχει Tam, κύτταρα MCF7L-tamr έδειξε ισοδύναμα ποσοστά ανάπτυξης όταν υποβάλλεται σε είτε οιστρογόνα (Ε2) ή Tam (Σχήμα 1Α). Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF7 /HER2-18-Ρ που είναι ένα HER2-υπερεκφράζουν τον κλώνο και το παράγωγό της Tam-R απομονώθηκε μετά από μακροχρόνια έκθεση σε Tam για περίπου 11 mo. Το τρίτο ζεύγος των κυττάρων είναι η καθιερωμένη ανδρογόνο ευαίσθητα κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου προστάτη, LNCaP, και τα παράγωγα της, ανεξάρτητου από ανδρογόνα κυτταρική γραμμή, C4-2B.

(Α) Επικύρωση των ανθεκτικών Tam φαινοτύπου των κύτταρα MCF7L-tamr. MCF7L-γονικό (Ρ) και -TamR κύτταρα προ-πεινασμένο σε ελεύθερο ερυθρού φαινόλης (PRF) μέσο που περιέχει 5% CS-FBS για 5 ημέρες πριν υποβληθούν σε οιστρογόνα (Ε2) (1 ηΜ) ή Tam (100 ηΜ) κατεργασία για 8 d. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε τετραπλούν σε αριθμούς πλάκα και κυττάρων 96 φρεατίων μετρήθηκαν με ένα in situ κύτταρο κυτταρόμετρο. Την ημέρα 8, τα κύτταρα βάφτηκαν με κυανούν του μεθυλενίου, όπως φαίνεται στο κάτω πάνελ. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση? * Ρ & lt? 0.001, διπλής όψης t test, την ανάπτυξη των κυττάρων υπό Tam εναντίον Ε2. (Β) ανοσοστυπώματα του ΥΠΟΙΟ κύτταρα χρησιμοποιώντας MAb159, με β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. Αριστερή λωρίδα έδειξε ΥΠΟΙΟ λύματα από

Grp78 floxed /floxed

ποντίκια. Δεξιά λωρίδα έδειξε κατάργηση της μπάντας GRP78 μετά τη μόλυνση με αδενοϊό που εκφράζει την ανασυνδυάση Cre να νοκ-άουτ το

Grp78 floxed /floxed

αλληλόμορφα. (C) Αντιπρόσωπος Western blots για βελτιωμένο επίπεδο sGRP78 σε ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα. Η γονική (Ρ) και tamr παράγωγα των μοντέλων ανθρώπινου καρκίνου του μαστού κύτταρο του MCF7L και MCF7 /HER2-18, καθώς επίσης και η πατρική ανδρογόνο κυτταρική γραμμή ευαίσθητη LNCaP και τα ανδρογόνα ανεξάρτητο κύτταρα C4-2B υποβλήθηκαν σε βιοτινυλίωση και έλξη αγαρόζης NeutrAvidin καθόδου να εμπλουτίσει για πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας. κυτταρικής επιφάνειας GRP78 (sGRP78) και συνολικά ενδοκυτταρικά GRP78 (tGRP78) στο προϊόν λύσης κυττάρου ανιχνεύθηκαν με στύπωση Western. Η ποσότητα του συνολικού προϊόντος λύσης ήταν 10% της ποσότητας που χρησιμοποιείται για την αβιδίνη pull-down. β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης για tGRP78, ενώ πρωτεΐνη μεμβράνης, EphB4, ή Να, Κ-ΑΤΡάσης α1 (ΝΚΑ α1) χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης των πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου σε καρκίνο προστάτη ή μαστού κύτταρα (PCA), αντίστοιχα. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Οι ζώνες πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν και τα σχετικά επίπεδα tGRP78 σε γονικών και ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές κανονικοποιήθηκαν έναντι β-ακτίνης, και το επίπεδο sGRP78 κανονικοποιούνται κατά EphB4 ή ΝΚΑ α1, αντίστοιχα, τα οποία παρουσιάζονται με μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) σε το παρακάτω γράφημα. Τα επίπεδα σε γονικές κυτταρικές σειρές και σε ανδρογόνο ευαίσθητη κυτταρική γραμμή, LNCaP έχουν οριστεί ως 1.

Η

Για την ανίχνευση των GRP78, χρησιμοποιήσαμε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα MAb159 υψηλής συγγένειας που κατευθύνεται έναντι του ανθρώπινου GRP78 που αναγνώρισαν μόνο το GRP78 ζώνη πρωτεΐνης (Εικόνα 1Β). Κατά την νοκ-άουτ από το

Grp78

floxed αλληλόμορφα στα ΠΜΑ από μόλυνση με αδενοϊό που εκφράζει την ανασυνδυάση Cre, η μπάντα GRP78 καταργήθηκε, επιβεβαιώνοντας ότι MAb159 αναγνωρίζει ειδικά GRP78. Για την ανίχνευση του sGRP78, τα κύτταρα βιοτινυλιώθηκαν και την κυτταρική επιφάνεια πρωτεΐνες καθαρίστηκαν με NeutrAvidin αγαρόζης pull-down. Από την ανάλυση Western blot των βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών και του συνολικού προϊόντος λύσης, τα επίπεδα του sGRP78 και συνολικά ενδοκυτταρικά GRP78 προσδιορίστηκαν για κάθε κυτταρική σειρά, με EphB4 και ΝΚΑ α1 εξυπηρετούν ως έλεγχοι φόρτωσης για πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας για τον καρκίνο του μαστού και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, αντίστοιχα. β-ακτίνη, μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη, υπηρέτησε ως έλεγχος φόρτωσης για το σύνολο των κυτταρικών λυμάτων. Αντιπροσωπευτικά κηλίδα Western αναλύσεις για την ανίχνευση του sGRP78 και συνολικής GRP78 εμφανίζονται, με τα επίπεδα GRP78 μετά ποσοτικοποίηση και την κανονικοποίηση των αντίστοιχων ελέγχων φόρτωση γράφημα παρακάτω και δείχνεται με τυπικές αποκλίσεις (Σχήμα 1 C). Η απουσία β-ακτίνης στις πρωτεΐνες pull-down με NeutrAvidin επιβεβαίωσε την έλλειψη της ενδοκυτταρικής μόλυνσης πρωτεΐνης στα κλάσματα πρωτεΐνης επιφανείας κυττάρου. Για κύτταρα MCF7L-Ρ που εξέφρασαν μέτριο επίπεδο βασικό της GRP78, υπήρχε μια 3-πλάσια αύξηση στην ολική GRP78 αλλά ένα 7-πλάσια αύξηση στην sGRP78 στα κύτταρα tamr. Για /HER2-18-Ρ κύτταρα MCF7 που εξέφραζε ένα υψηλότερο βασικό επίπεδο GRP78, τα κύτταρα tamr έδειξαν μόνο ελάχιστη αύξηση στις συνολικές GRP78, αλλά μια 4-πλάσια αύξηση sGRP78. Για τα κύτταρα C4-2B ανεξάρτητου από ανδρογόνα, η συνολική αύξηση GRP78 πάνω από τα κύτταρα LNCaP ανδρογόνα ευαίσθητος ήταν ασήμαντος αλλά υπήρχε περίπου αύξηση κατά 7 φορές σε sGRP78. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αύξηση των sGRP78 σε ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές δεν απλώς παράλληλα την αύξηση του συνολικού ποσού της GRP78, μάλλον ανάπτυξη αντοχής προάγει ειδικού μηχανισμού (ων) για την ενίσχυση της GRP78 εντοπισμού στην κυτταρική επιφάνεια.

ER στρες ανεβάζει περαιτέρω το επίπεδο GRP78 επιφάνεια των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά

Προηγουμένως αναφέραμε ότι η Tg, η οποία αναστέλλει το ER ΑΤΡάσης προκαλώντας Ca

2 + εκροή από το ER, προάγει την μετατόπιση του GRP78 από το ER στην κυτταρική επιφάνεια σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα 293Τ [32]. Ωστόσο, εάν αυτό ισχύει για κυτταρικές σειρές καρκίνου οι οποίες εμφανίζουν ήδη μέτρια έως υψηλά επίπεδα GRP78 δεν είναι γνωστή. Καθώς τα καρκινικά κύτταρα είναι συνήθως εκτεθειμένα σε ER στρες στο μικροπεριβάλλον του όγκου, είναι σημαντικό να καθοριστεί εάν τα καρκινικά κύτταρα που έχουν αναπτύξει αντίσταση σε θεραπεία είναι ικανά έκφρασης περαιτέρω ανυψώσεως sGRP78 σε απόκριση σε ER στρες. Για να δοκιμαστεί αυτές, κατεργασία ανθεκτικών κυττάρων με διαφορετικές επαγωγείς του ER στρες και μετρήθηκε με FACS sGRP78 καθώς και με βιοχημικές προσεγγίσεις. Στην πρώτη προσέγγιση, οι κυτταρικές σειρές MCF7L-P και tamr υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Tg. επιφανείας κυττάρου GRP78 ανιχνεύθηκε με ανάλυση FACS (Σχήμα 2Α). Για την κυτταρική σειρά MCF7L-P, η θεραπεία με Tg οδήγησε σε αύξηση κατά 4,8 φορές σε sGRP78. Για την κυτταρική σειρά MCF7L-tamr οποία επιδεικνύει ήδη 12 φορές υψηλότερο επίπεδο sGRP78 σε σύγκριση με τα πατρικά MCF7L-Ρ κύτταρα, θεραπεία Tg περαιτέρω ανυψώνει sGRP78 έκφραση έως 20-φορές (Σχήμα 2Α).

(Α) Η γονική και tamoxifen-ανθεκτικά κύτταρα MCF7L ήταν είτε χωρίς θεραπεία (Ctrl) ή υποβάλλεται σε επεξεργασία με 300 ηΜ θαψιγαργίνη (Tg) για 16 ώρες. κυτταρικής επιφάνειας GRP78 μετρήθηκαν με FACS. Αντιπροσωπευτικά προφίλ FACS εμφανίζονται και τα ποσοστά των θετικών κυττάρων που αναγράφεται στην πάνω δεξιά γωνία. Μπλε διακεκομμένη γραμμή, έλεγχος ισοτόπου? κόκκινο σταθερή γραμμή, αντι-GRP78 Ab. λιμοκτονία ευαίσθητη ανθρώπινη κυτταρική σειρά (Β) Το οιστρογόνο καρκίνου του μαστού, MCF7 /BUS, και ανθεκτικοί παράγωγο κλώνος του, MCF7 /BUS-10, είτε χωρίς αγωγή (Ctrl) ή υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 mM 2-δεοξυγλυκόζη (2DG) για 24 ώρες. Τα κύτταρα βιοτινυλιώθηκαν και πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας καθαρίστηκαν με NeutrAvidin αγαρόζης pull-down. sGRP78 και tGRP78 ανιχνεύθηκαν με Western Blot. β-ακτίνης χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι αλλαγές φορές σε sGRP78 και tGRP78 φαίνεται παρακάτω και η κατάσταση ελέγχου στα κύτταρα /BUS MCF7 ορίστηκε ως 1. (C) Ίδιο (Β) εκτός από τα κύτταρα C4-2B αντιμετωπίζονται με Tg, Tu (τουνικαμυκίνης) ή 2DG. ΝΚΑ α1 χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης κυτταρικής επιφάνειας. Τα σχετικά επίπεδα του tGRP78 και sGRP78 κανονικοποιούνται κατά β-ακτίνη ή ΝΚΑ α1, αντίστοιχα, και εκφράζονται ως μέσος όρος ± S.D. από δύο ανεξάρτητα πειράματα σε γράφημα (δεξιά).

Η

Στη δεύτερη προσέγγιση, χρησιμοποιήσαμε το οιστρογόνο-εξαρτώμενη κυτταρική σειρά MCF-7 /BUS και παράγωγο MCF-7 του /BUS-10 κυτταρική γραμμή η οποία έχει αποκτήσει αντοχή σε οιστρογόνα λιμοκτονία [43]. Τα κύτταρα βιοτινυλιώθηκαν και πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας υποβάλλεται σε σφαιρίδια αγαρόζης NeutrAvidin pull-down. Τα επίπεδα του sGRP78 και συνολικά ενδοκυτταρικά GRP78 προσδιορίσθηκαν με Western Blot (Σχήμα 2Β). Σε συμφωνία με MCF7L και τις κυτταρικές σειρές MCF7 /HER2-18, την ανάπτυξη της αντίστασης στην /BUS 10-μοντέλο MCF-7 αυξηθεί σημαντικά το ποσό των sGRP78 (κατά 9 φορές), ενώ η συνολική ποσότητα ενδοκυτταρικής ήταν μετρίως αυξημένη (από 1,3 φορές). Και για τα δύο γονικών και ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, η θεραπεία των κυττάρων με 2DG, ενός επαγωγέα του ER στρες μέσω αναστολής της γλυκόλυσης και γλυκοζυλίωση, περαιτέρω αυξημένη έκφραση sGRP78 κατά περίπου 5,2 φορές στην γονική γραμμή και 3,5-φορές στην ανθεκτική γραμμή (Εικόνα 2Β).

στη συνέχεια εξετάσαμε το επίπεδο sGRP78 και συνολικής GRP78 στον καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή ανεξάρτητου από ανδρογόνα C4-2B, με ή χωρίς ER στρες (Σχήμα 2C). Σε αυτές τις μελέτες, εκτός από την Tg και 2DG θεραπεία, προσθέσαμε ένα άλλο επαγωγέα ER στρες, τουνικαμυκίνη (Tu), το οποίο δημιουργεί ER στρες με το φράξιμο Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση πρωτεϊνών, προκαλώντας έτσι τη συσσώρευση underglycosylated πρωτεϊνών στο ER. Στην ανάλυση της Western blot, β-ακτίνη και ΝΚΑ α1 χρησίμευσαν ως μάρτυρες φόρτωσης για τη συνολική και κυτταρικής επιφάνειας πρωτεΐνες, αντίστοιχα. Όπως και στην περίπτωση των ανθεκτικών κυττάρων καρκίνου του μαστού, ER στρες προκάλεσε μια μέτρια αύξηση των συνολικών GRP78 (κατά περίπου 2 φορές) καθώς αυτά τα κύτταρα εξέφρασαν υψηλά ήδη βασικό επίπεδο GRP78 σε σύγκριση με τα ευαίσθητα γονικά κύτταρα τους. Κάτω από όλες τις συνθήκες στρες τρία ER, επίπεδο sGRP78 αυξήθηκε κατά 5- έως 6-πλάσια σε σύγκριση με μη-τόνισε κύτταρα. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ποικίλες ER ερεθίσματα άγχους είναι ικανά να προωθούν ενεργά έκφρασης sGRP78 στις δύο ευαίσθητων και ανθεκτικών στα φάρμακα καρκινικών κυττάρων, και ότι η ανάπτυξη θεραπευτικών αντοχής σε συνδυασμό με την έκφραση του ER στρες περαιτέρω ενισχύει sGRP78.

κυτταρικής επιφάνειας GRP78 μορφές συγκρότημα με τις PI3K

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η διατάραξη της sGRP78 μεταβάλλει το μονοπάτι PI3K /AKT, ωστόσο, πώς αυτό επιτυγχάνεται δεν είναι καλά κατανοητή [14], [16]. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, προσδιορίσαμε αν sGRP78 συν-εντοπίζεται με ΡΙ3Κ στην κυτταρική επιφάνεια. C4-2B, με υψηλή ενδογενή sGRP78 και σχετική ευκολία του πολιτισμού, παρουσιάζει ένα κατάλληλο σύστημα μοντέλου κυττάρων. Για τη μεγιστοποίηση της έκφρασης sGRP78, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Tg. Σε μη διαπερατών κυττάρων, χρώση αντισώματος θα ανιχνεύσει κυρίως GRP78 στην κυτταρική επιφάνεια, παρά το εξαιρετικά άφθονη ενδοκυτταρική GRP78, η οποία εντοπίζεται majorly στην περιοχή περιπυρηνική ER. Μετά 8 ώρες της θεραπείας Tg, ενδογενή sGRP78, όπως οπτικοποιείται με χρώση ανοσοφθορισμού με το μονοκλωνικό αντίσωμα MAb159, ανιχνεύθηκε διάσπαρτα πάνω από την κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων C4-2B (Σχήμα 3Α). Για την ανίχνευση της ρ85 ρυθμιστική υπομονάδα της ΡΙ3Κ η οποία είναι ενδοκυτταρικό, τα MAb159 ανοσοβαφή κύτταρα κατέστησαν περατά ακολουθήθηκε από χρώση με αντίσωμα έναντι ρ85. Όπως φαίνεται στο αντιπροσωπευτικές εικόνες, συν-εντοπισμό της ενδογενούς sGRP78 και ρ85 σε πολλαπλές θέσεις παρατηρήθηκαν για ένα υποκλάσμα sGRP78 και ρ85 (Εικόνα 3Α, βέλη).

(Α) συνεστιακή μικροσκοπία ανίχνευσης συν-εντοπισμό του ενδογενής sGRP78 με ρ85 σε κύτταρα C4-2B σε επεξεργασία με Tg για 8 ώρες. Μη διαπερατά κύτταρα πρώτα κηλιδώθηκαν με αντι-GRP78 αντίσωμα (MAb159) για την ανίχνευση sGRP78 (

πράσινη

) (αριστερά). Τα κύτταρα στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-ρ85 (

κόκκινο

). (Β) συν-εντοπισμό της κυτταρικής επιφάνειας F-GRP78 με ρ85 σε κύτταρα HeLa. Μη διαπερατά κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με τον φορέα έκφρασης F-GRP78 πρώτα χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-FLAG για την ανίχνευση επιφάνεια F-GRP78 (

πράσινη

) (αριστερά), στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά και υπέστησαν χρώση με αντίσωμα αντι-ρ85 (

κόκκινο

). Σε αμφότερα τα (Α) και (Β), οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (

μπλε

) και τις περιοχές μέσα σε κουτιά (λευκό τετράγωνο) των συμπιεσμένων εικόνων Z-stack (αριστερά πάνελ) έχουν διευρυνθεί και φαίνεται στα δεξιά πάνελ σε ενιαίο τμήμα συνεστιακή αεροπλάνα (πάχους 0,38 μm) .Το συγχωνεύονται εικόνες έδειξαν συν-εντοπίσεις (

κίτρινο

) της κυτταρικής επιφάνειας GRP78 και p85 ανιχνεύθηκε σε πολλαπλές αντίστοιχες θέσεις (

λευκά βέλη

) . Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 2 μm. (C) Σχήμα για την ανίχνευση της αλληλεπίδρασης μεταξύ της κυτταρικής επιφάνειας F-GRP78 και p85. Βιοτινυλιωμένο πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας καθαρίστηκαν με μονομερείς στήλη αβιδίνης, που ακολουθείται από ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) και κηλίδωση Western. (D) Κύτταρα 293Τ επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης F-GRP78. Οι πρωτεΐνες επιφανείας κυττάρου που εκλούεται από τη στήλη μονομερούς αβιδίνης (εισόδου) όπως περιγράφεται στο (C) υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) είτε με αντι-FLAG αντίσωμα ή IgG ισότυπου εξυπηρετούν ως αρνητικός έλεγχος. F-GRP78, τα επίπεδα p85 και ρ110α στο άνοσο συγκρότημα μετρήθηκαν με κηλίδα Western με αντι-FLAG, αντι-ρ85 και αντι-ρ110α αντισώματα.

Η

Για να επεκτείνει τις παρατηρήσεις αυτές, μπορούμε επιμολυσμένα κύτταρα HeLa με το φορέας έκφρασης για FLAG-GRP78 (F-GRP78). Η χρήση της GRP78 που σημειώνονται με το επιτόπιο FLAG επέτρεψε τη χρήση του εξαιρετικά ειδικού αντισώματος αντι-FLAG για την ανίχνευση της έκφρασης GRP78 κυτταρική επιφάνεια σε μη διαπερατά κύτταρα. HeLa κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν επειδή προσκολλώνται ισχυρότερα με μικροσκοπικές διαφάνειες, η οποία είναι κρίσιμη για τα πολλαπλά στάδια πειραματικούς χειρισμούς των επιμολυσμένων κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν άφθονη συν-εντοπισμό της κυτταρικής επιφάνειας F-GRP78 με ρ85 (Εικόνα 3Β).

Στη συνέχεια, για να προσδιοριστεί αν βιοχημικά sGRP78 σχηματίζεται σύμπλοκο με ΡΙ3Κ, κύτταρα 293Τ επιμολύνθηκαν με F-GRP78. Κύτταρα 293Τ χρησιμοποιήθηκαν λόγω της υψηλής αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης τους. Η χρήση των F-GRP78 μας επέτρεψε να ανοσοκαθιζάνει GRP78 με υψηλή εξειδίκευση και συγγένεια. Το πειραματικό σχέδιο φαίνεται στο σχήμα 3C. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα βιοτινυλιώθηκαν και τα κυτταρολύματα επωάστηκαν με μονομερές αβιδίνη σφαιρίδια αγαρόζης που επιτρέπουν την απομόνωση βιοτινυλιωμένων κυτταρικής επιφάνειας πρωτεϊνών με ήπιες συνθήκες έκλουσης, λόγω ασθενή συγγένεια της προς βιοτινυλιωμένη πρωτεΐνη. Οι εκλουσθείσες πρωτεΐνες επιφανείας κυττάρου ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντίσωμα αντι-FLAG ή τον έλεγχο ισότυπο IgG. Τα ανοσοϊζήματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western και διερευνήθηκαν με αντισώματα έναντι ρ85 και ρ110α, καθώς και το αντίσωμα αντι-ΡΕΑΟ. Παρατηρήσαμε ότι η επιφάνεια των κυττάρων F-GRP78 σχηματίζεται σύμπλεγμα με υπομονάδες ΡΙ3Κ τόσο του κανονιστικού (ρ85) και καταλυτική (ρ110α), σε αντίθεση με τον έλεγχο IgG η οποία έδειξε καμία δέσμευση (Εικόνα 3D). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι sGRP78 αλληλεπιδρά άμεσα ή έμμεσα με την p85 και ρ110α.

επιφάνεια των κυττάρων GRP78 υπερέκφραση διεγείρει PI (3,4,5) P3 παραγωγής και συν-εντοπισμός

Ο σχηματισμός συμπλόκου μεταξύ sGRP78 και PI3K δείχνει ότι μπορεί να οδηγήσει σε διαφοροποίηση της δραστηριότητας PI3K. Κατά την ενεργοποίηση, PI3K εντοπίζεται στην επιφάνεια των κυττάρων και φωσφορυλιώνει PI οδηγούν σε PI (3,4,5) P3 (4,5) P2 (αναφέρεται κατωτέρω ως ΡΙΡ3) παραγωγής.