Αφηρημένο

Ιστορικό

K-RAS μετάλλαξη δημιουργεί ένα ιδιαίτερα δύσκολο πρόβλημα για τη θεραπεία του καρκίνου. Ενεργοποίηση μεταλλάξεις στο K-RAS είναι κοινά σε καρκίνους του πνεύμονα, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και τα οποία συνδέονται με κακή απόκριση σε θεραπεία. Ως εκ τούτου, στοχευμένες θεραπείες που καταργεί K-RAS-επαγόμενη ογκογένεσης θα είναι τεράστια αξία.

Μέθοδοι

Ψάξαμε για τις μικρές αναστολείς κινάσης μόριο που επηρεάζουν επιλεκτικά την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων που εκφράζουν μεταλλαγμένα K-RAS. Ο μηχανισμός δράσης ενός αναστολέα διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας χημικές και γενετικές προσεγγίσεις.

Αποτελέσματα

Εντοπίσαμε BAY61-3606 ως αναστολέας του πολλαπλασιασμού σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένες μορφές του K-RAS, αλλά όχι σε κύτταρα που εκφράζουν ισογονικών άγριου τύπου K-RAS. Εκτός από την αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της σε μεταλλαγμένα κύτταρα, BAY61-3606 εμφάνισε μια διακριτή βιολογική ιδιότητα σε κύτταρα άγριου τύπου κατά το ότι παρέχει ευαισθησία στην αναστολή της RAF. Σε αυτό το πλαίσιο, BAY61-3606 ενήργησε με αναστολή MAP4K2 (GCK), το οποίο ενεργοποιεί κανονικά ΝΡκβ σηματοδότηση σε κύτταρα άγριου τύπου σε απόκριση προς την αναστολή της RAF. Ως αποτέλεσμα της αναστολής MAP4K2, τα κύτταρα άγριου τύπου έγινε ευαίσθητα στην AZ-628, ενός αναστολέα της RAF, όταν, επίσης, αντιμετωπίζονται με BAY61-3606.

Συμπεράσματα

Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι BAY61-3606 ασκεί διακριτές βιολογικές δραστηριότητες σε διάφορους γενετικούς πλαίσια

Παράθεση:. Lau KS, Zhang Τ, Kendall KR, Lauffenburger D, Gray NS, Haigis KM (2012) BAY61-3606 επηρεάζει τη βιωσιμότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων σε ένα Γονότυπος -κατευθυνόμενης τρόπο. PLoS ONE 7 (7): e41343. doi: 10.1371 /journal.pone.0041343

Επιμέλεια: David J. Reiner, Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Φλεβάρη, 2012? Αποδεκτές: 20 Ιουν 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούλη 2012

Copyright: © 2012 Lau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (K01-CA118425 και Ρ30-CA006516) και την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία (MGO-114877) και μια δωρεά από το Merlino Οικογένεια Κληροδότημα. KSL είναι ο Robert Μαύρο συνεργάτης του Ιδρύματος Ερευνών Damon Runyon Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οικογένειας RAS GTPases ενεργεί ως δυαδικά διακόπτες που υποβάλλονται σε διαμορφωτική αλλαγή κατά τη σύνδεση με GTP, επιτρέποντάς τους να συμμετάσχουν μια σειρά από κατάντη δράστες σηματοδότησης συμπεριλαμβανομένης της RAF, PI3K, και RALGDS [1]. Η εγγενής δραστικότητα ΟΤΡάσης των RAS υδρολύει το GTP προς το ΑΕΠ, με τη βοήθεια της ΟΤΡάσης ενεργοποίηση πρωτεϊνών (GAP) συμπαράγοντες, να αδρανοποιήσει την ικανότητα σηματοδότησης της. εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12, 13, 61, ή 146 είναι κοινά στον καρκίνο και σχετίζονται με την αντίσταση στην δραστηριότητα GAP, επιτρέποντας RAS να παραμένουν στο ενεργοποιημένο, GTP-δεσμευμένη κατάσταση. Ενεργοποίηση K-RAS μεταλλάξεις συμβαίνουν σε περίπου 15% όλων των καρκίνων (καθιστώντας το ένα από τα πιο συχνά μεταλλαγμένα ογκογονίδια), αλλά είναι ιδιαίτερα συχνή σε πιο θανατηφόρες μορφές καρκίνου, όπως αυτές που προκύπτουν στη χολική οδό, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, και το πάγκρεας [2]. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου, για παράδειγμα, K-RAS είναι μεταλλαγμένο σε σχεδόν 40% των περιπτώσεων [2]. Είναι σημαντικό, οι όγκοι με μεταλλάξεις του K-RAS είναι ιδιαίτερα ανθεκτικοί σε συμβατικές και στοχευμένες θεραπείες και συνήθως συνδέεται με κακή πρόγνωση [3] – [5].

Η κύρια πρόκληση να εξουδετερώσουν τις ογκογόνο δράση των ενεργοποιημένων K-RAS είναι η ανικανότητα να αναστέλλουν άμεσα τη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη. Επειδή οι ιδιότητες σηματοδοσίας του K-RAS ενισχυμένη μέσω απενεργοποίησης του ΟΤΡάσης δραστικότητα της, απευθείας φαρμακολογική αναστολή του RAS δεν είναι μια βιώσιμη θεραπευτική στρατηγική. Μια εναλλακτική στρατηγική για την εξουδετέρωση μεταλλαγμένο K-RAS είναι η αναστολή κατάντη τελεστές της, για παράδειγμα, η RAF-ΜΕΚ-ΕΚΚ (ΜΑΡΚ). αναστολείς ΜΕΚ έχουν λάβει την προσοχή λόγω αλλοστερική τους μηχανισμό δράσης, το οποίο προσδίδει ακραία εξειδίκευση, και απέδειξαν την αποτελεσματικότητά τους σε μελανώματα και καρκίνους του παχέος εντέρου που εκφράζουν ενεργοποιημένα Β-RAF [6], [7]. αναστολέων ΜΕΚ χαμηλή απόδοση σε καρκίνους που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS, ωστόσο, ίσως λόγω της δευτερογενούς μεταλλάξεις που επηρεάζουν απόκριση ή την ύπαρξη της ΜΕΚ-ανεξάρτητης σηματοδότησης καθοδικά του RAF [8], [9]. Δεδομένης της presumptiveness από αυτά τα σενάρια, είναι σαφές ότι η καλύτερη κατανόηση του πώς το δίκτυο σηματοδότησης K-RAS λειτουργεί στον καρκίνο είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη νέων θεραπειών.

Τα τελευταία χρόνια, μεγάλης κλίμακας λειτουργική γονιδιωματική προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιείται για να ανακαλύψει κινάσης στόχοι ότι, όταν χτύπησε κάτω είναι «συνθετικό θανατηφόρο» με μεταλλαγμένο RAS. Πιθανούς θεραπευτικούς στόχους που έχουν εντοπιστεί περιλαμβάνουν TBK1 [10], STK33 [11], CDK4 [12], και PLK1 [13], αν και μένει να δούμε αν κάποιο από αυτά αντιπροσωπεύουν

καλόπιστους

θεραπευτικούς στόχους για K-RAS μεταλλαγμένων μορφών καρκίνου. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους σήματα K-RAS μέσω αυτών των στόχων είναι κεντρικής σημασίας για το σχεδιασμό αποτελεσματικών φαρμάκων, λιγότερο μελετημένο, και συχνά παραβλέπεται, ερώτημα είναι γιατί τα κύτταρα άγριου τύπου, οι οποίες εκφράζουν επίσης τους στόχους αυτούς, ανέχεται απώλεια της λειτουργίας αυτών των ένζυμα. Το ζήτημα αυτό είναι εξίσου σημαντική για το σχεδιασμό φαρμάκων, διότι το πλεονέκτημα των στοχευμένων θεραπειών (πάνω από τα συμβατικά χημειοθεραπείες) είναι το δυναμικό εκλεκτικότητα τους για κακοήθη κύτταρα.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε χαρακτηρίσει την δραστηριότητα του BAY61-3606 στο πλαίσιο της καρκίνο του παχέος εντέρου, παρέχοντας εικόνα (1) πιθανούς θεραπευτικούς στόχους για καρκίνων που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS και (2) μονοπάτια που ρυθμίζουν την απόκριση των μη μεταλλαγμένων κυττάρων σε στοχευμένες αναστολείς. BAY61-3606 αρχικά αναγνωρίστηκε σαν ένας από στόματος διαθέσιμος, ATP-ανταγωνιστικός αναστολέας της κινάσης τυροσίνης Σπλήνας (SYK) [14]. Από SYK διαδραματίζει ενεργό ρόλο στη φλεγμονώδη απόκριση, BAY61-3606 έχει κυρίως χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της λειτουργίας του ανοσοποιητικού κυττάρων. Για παράδειγμα, BAY61-3606 καταστέλλει την επαγόμενη από αντιγόνο φλεγμονής των αεραγωγών σε αρουραίους και μετανάστευση των κυττάρων Β σε ποντικούς [14], [15]. Ενώ όλες οι επιπτώσεις της BAY61-3606 σε ανοσοκύτταρα συνδέονται με την ικανότητά της να αναστέλλει SYK, είναι άγνωστο αν BAY61-3606 έχει εναλλακτική στόχους της βιολογικής ενδιαφέρον σε άλλα κυτταρικά πλαίσια. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε χαρακτηρίσει δύο SYK-ανεξάρτητες δραστηριότητες που συνδέονται με BAY61-3606 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, knockdowns και φαρμακευτικές αγωγές

Όλα κόλον καρκινικές κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml), στρεπτομυκίνη (100 μg /mL), και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Η πρωκτική καρκινική κυτταρική γραμμή (CAR1) διατηρήθηκε σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με πενικιλλίνη (100 μονάδες /mL) /στρεπτομυκίνη (50 μg /mL), και 5% FBS. Knockdowns επιτεύχθηκαν με pSICOR ή pLKO φορείς λεντοϊών [16]. Οι αλληλουχίες στόχοι για knockdowns μπορεί να βρεθεί στον Πίνακα S2. Σε πειράματα φαρμακευτική αγωγή, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες πριν από την έκθεση στο φάρμακο. AZ-628 λήφθηκε από την AstraZeneca. CI-1040 ελήφθη από την Pfizer. R406 συντέθηκε στο εργαστήριο Gray. BAY61-3606 και ΙΚΚ VII αγοράστηκαν από την EMD Biosciences. παράγωγα BAY συντέθηκαν για αυτή τη μελέτη.

δοκιμασίες

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου και η βιωσιμότητα των κυττάρων

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη μέσω FACS με βάση την ποσοτικοποίηση ιωδιούχο προπίδιο, χρησιμοποιώντας πρότυπες μεθόδους. Για τη μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων με την παρουσία ή απουσία του φαρμάκου επί 72 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη και στη συνέχεια βάφτηκαν με Syto60 (Invitrogen). Οι πλάκες απεικονίστηκαν και ποσοτικοποιείται χρησιμοποιώντας το σύστημα Οδύσσεια LiCor (LiCor).

Bio-Plex δοκιμασίες σηματοδότησης

Το σύστημα προσδιορισμού Bio-Plex χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση σηματοδότηση σε κύτταρα υποστεί αγωγή με φάρμακο. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία του φαρμάκου για διάφορες ποσότητες χρόνου και στη συνέχεια υπέστησαν λύση σε Bio-Rad ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης (Bio-Rad). Πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας BCA δοκιμασία (Pierce) και 5 μg πρωτεΐνης από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση Bio-Plex. δοκιμασίες Phospho-σηματοδότηση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας διαθέσιμο κιτ δοκιμασίας φωσφο-σηματοδότησης και ποσοτικοποιούνται σε ένα Bio-Plex 200 σύστημα (Bio-Rad): ρ-Iκβα (Ser32 /Ser36), ρ-ΙΝΚ (Thr183 /Tyr185), ρ-ΜΕΚ1 ( Ser217 /Ser221), ρ-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), ρ-p90RSK (Thr359 /Ser363), ρ-p38 (Thr180 /Tyr182), pc-Jun (Ser63), ρ-ATF2 (Thr71 ), ρ-ΑΚΤ (Ser473), ρ-S6 (Ser235 /Ser236), ρ-STAT3 (Ser727), ρ-STAT3 (Tyr705), και ρ-GSK3α /β (Ser21 /Ser9). Bio-Plex δοκιμασία για ολική ΜΕΚ1 εκτελέστηκε επίσης ως έλεγχος φόρτωσης. Όλα τα σήματα ομαλοποιήθηκαν σε κοινό έλεγχο λύμα κυτταρική γραμμή, προκειμένου για δοκιμασίες μεταξύ των πλακών να είναι συγκρίσιμα.

Βιοχημικές δοκιμασίες δραστηριότητας

Η βιοχημική δραστηριότητα των BAY61-3606 και των παραγώγων μετρήθηκαν με δύο τρόπους . Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία Πεδίο της KINOMEscan ™ να εντοπιστούν οι κινάσες που αναστέλλονται για σύνδεση με τις ενώσεις υποστρώματος, όλα αναλύθηκαν σε 1 μΜ. Δεύτερον, χρησιμοποιήσαμε SelectScreen® Βιοχημικές κινάσης Profiling Υπηρεσία Invitrogen να καθορίζει τους

in vitro

IC50s για τις ενώσεις έναντι συγκεκριμένων κινασών.

Χημική παραγωγή του BAY61-3603

Λεπτομέρειες σχετικά με η σύνθεση των παραγώγων BAY, και τις δομές αυτών των παραγώγων, μπορεί να βρεθεί στο Σχήμα S5.

Αποτελέσματα

AZ-628 και την ανάπτυξη BAY61-3606 καταστολή σε κύτταρα που εκφράζουν K-RAS

G13D

σε μια προσπάθεια να εντοπιστούν νέοι θεραπευτικοί στόχοι για παχέος εντέρου εκφράζουν μεταλλαγμένες K-RAS, πραγματοποιήσαμε μια οθόνη για μικρό μόριο αναστολείς της κινάσης που επηρεάζουν τη βιωσιμότητα σε γονότυπο-ειδικό τρόπο. Σε αυτές τις μελέτες, χρησιμοποιήσαμε ένα σύνολο ισογονικών κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου, που διαφέρουν μόνο ως προς την θέση τους μετάλλαξης K-RAS. Οι γονικές κυτταρικές σειρές, HCT-116 και DLD-1, φέρουν μια ετερόζυγη μετάλλαξη ενεργοποίησης στο K-RAS (G13D /+). Τα παράγωγα κυτταρικές σειρές, HKE-3 και DKS-8, διατηρούν το αλληλόμορφο άγριου τύπου, αλλά έχουν χάσει το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο του K-RAS δυνάμει της γονιδιακής στόχευσης [17]. Συνεπής με την προηγούμενη εργασία μας [9], βρήκαμε ότι τα μεταλλαγμένα κύτταρα K-RAS ήταν υπερευαίσθητοι σε AZ-628, μια παν-RAF αναστολέα [18], [19], σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου, αλλά επηρεάζεται από CI-1040 , ένας αναστολέας ΜΕΚ [6] (Σχ. 1α). Βρήκαμε επίσης ότι BAY61-3606, μια σπλήνα κινάσης τυροσίνης (SYK) αναστολέας, επηρεάζονται συνολική βιωσιμότητα σε HCT-116 και DLD-1 κύτταρα σε σύγκριση με HKE-3 και DKS-8 κύτταρα (Εικ. 1a, Σχ. S1a).

(α) η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίζεται ποσοτικά με Syto60 μετά από 72 ώρες από την AZ-628, CI-1040 ή θεραπεία BAY61-3606 σε HCT-116 (K-RAS

G13D /+, κόκκινο) ή HKE-3 (K-RAS

– /+, μπλε) κυτταρικές σειρές. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς έλεγχο αγωγή DMSO οχήματος για κάθε κυτταρική γραμμή. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM για 3 ανεξάρτητα πειράματα. Κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS ήταν σχετικά ευαίσθητοι σε AZ-628 και BAY61-3606, αλλά όχι CI-1040. (Β) προφίλ κυτταρικού κύκλου, όπως προσδιορίζεται με χρώση με ιωδιούχο προπίδιο, του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων με μεταλλαγμένο Β-ΡΑΡ (ΗΤ-29) κατεργάζεται με CI-1040 ή μεταλλαγμένη K-RAS (DLD-1) υποβάλλεται σε επεξεργασία με BAY61-3606. Ενώ η αναστολή της ΜΕΚ επάγει G1 σύλληψη στο ΗΤ-29 κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από την απώλεια της κορυφής 4Ν, BAY61-3606 δεν φαίνεται να μεταβάλλουν το προφίλ των κυττάρων DLD-1. (Γ) Κυτταρική βιωσιμότητα του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων που εκφράζουν μεταλλαγμένη B-RAF (V600E) μετά από 72 ώρες επεξεργασίας με BAY61-3606 και /ή CI-1040. Κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένη B-RAF (HT-29 – στερεά περίγραμμα και RKO – διάστικτο περίγραμμα) ήταν ευαίσθητα τόσο BAY61-3606 και CI-1040 και αυτές οι δύο αναστολείς συνεργάστηκαν για να παράγουν μια ενισχυμένη απάντηση. (Δ) Phospho-ΜΕΚ1 (Ser217 /Ser221) και φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187) επίπεδα σε έκθεση άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων κυττάρων μετά από 45 λεπτά με τα πόδια K-RAS σε 1 μΜ AZ-628, 1 μΜ BAY61-3606, ή τον έλεγχο του οχήματος. Σήματα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς Bio-Plex. Σχετική σήμα ομαλοποιήθηκε σε λύμα master control. επεξεργασία AZ-628 μείωσε το επίπεδο της φωσφο-ΜΕΚ και φωσφο-ΕΚΚ, αλλά BAY61-3606 δεν το έκανε.

Η

Για να προσδιορίσετε πώς BAY61-3606 πληγείσες βιωσιμότητα των κυττάρων που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS, αναλύσαμε ο κυτταρικός κύκλος των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με το φάρμακο. Βρήκαμε ότι BAY61-3606 δεν μεταβάλλουν το προφίλ κυτταρικού κύκλου των κυττάρων DLD-1, ούτε διεγείρουν απόπτωση (Σχ. 1β). Σε αντίθεση με καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS, κυτταρικές σειρές που εκφράζουν μεταλλαγμένη B-RAF ήταν ευαίσθητα σε αναστολή της ΜΕΚ και θεραπεία με επαγόμενη CI-1040 G1 σύλληψης [6] (Σχ. 1 b, c). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι το Β-RAF μεταλλαγμένα κύτταρα γραμμές ήταν επίσης ευαίσθητα σε BAY61-3606 και ότι η CI-1040 και BAY61-3606 συνεργαστεί για να παράγουν μια ενισχυμένη αρνητική επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων που εκφράζουν ενεργοποιημένων Β-RAF (Σχ. 1γ). Στο σύνολό τους, οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν (1), ότι αναστέλλει BAY61-3606 μια πρωτεΐνη που απαιτείται για τη συνολική βιωσιμότητα σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS ή Β-RAF και (2) ότι BAY61-3606 στοχεύει σε ένα μονοπάτι που είναι ανεξάρτητη των κανονικών ΜΑΡΚ /ERK σηματοδότησης.

Για να ελέγξετε το δεύτερο μέρος αυτής της υπόθεσης άμεσα, μετρήσαμε την κατάσταση ενεργοποίησης των ΜΕΚ και ERK σε κύτταρα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με BAY61-3606. Βρήκαμε ότι η αναστολή της RAF με την AZ-628 κατέστειλε ΜΕΚ και ERK φωσφορυλίωση, αλλά αυτό BAY61-3606 δεν ήταν σε θέση να το πράξει (Σχ. 1δ). Έτσι, ενώ η AZ-628 και BAY61-3606 τόσο επηρεάζουν επιλεκτικά τη βιωσιμότητα σε μεταλλαγμένα κύτταρα K-RAS, φαίνεται να το κάνουν μέσω διακριτών οδών, με BAY61-3606 στοχεύει σε μια διαδρομή που είναι ανεξάρτητη από ΜΕΚ και ERK.

SYK δεν είναι ο στόχος των BAY61-3606 σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS

Δεδομένου ότι BAY61-3606 αναπτύχθηκε αρχικά ως ΑΤΡ-ανταγωνιστικός αναστολέας της Syk [14], δεν ήταν έκπληξη το γεγονός ότι εμφανίστηκε να έχουν στόχο μια MEK /ERK-ανεξάρτητο μονοπάτι. Παρ ‘όλα αυτά, HCT-116 κύτταρα, τα οποία είναι ευαίσθητα σε BAY61-3606, δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα της Syk, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να μην είναι ο στόχος του BAY61-3606 στο πλαίσιο αυτό. Για να διερευνήσουν περαιτέρω το θέμα, χρησιμοποιήσαμε λεντοϊού shRNA να γκρεμίσουμε SYK στο DLD-1 κύτταρα (Εικ. 2α). Knockdown της Syk δεν επηρέασε το συνολικό ποσοστό αύξησης ούτε επηρεάζει σημαντικά την απόκριση των κυττάρων DLD-1 για να BAY61-3606 (Σχ. 2β). Επιπλέον, η θεραπεία των κυττάρων με R406, ένα δομικά διακριτές αναστολέας της SYK, δεν είχε ως αποτέλεσμα σε μια προνομιακή επίδραση σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS (Σχ. 2β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι η Syk δεν ήταν ο σχετικός στόχος του BAY61-3606 σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS.

(α) εξόντωση SYK πρωτεΐνης σε DLD-1 κύτταρα μέσω shRNA, όπως φαίνεται με κηλίδωση Western. Η κυτταρική σειρά Ramos (R), ένα αιμοποιητικού κυτταρική γραμμή με μια υψηλή έκφραση της Syk, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. (Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων DLD-1 κύτταρα (κόκκινο), και K-RAS άγριου τύπου (DKS-8 – μπλε) και SYK knockdown (κόκκινο σκιασμένο) παράγωγα μετά από 72 ώρες επεξεργασίας με 1 μΜ BAY61-3606 ή R406, μια ξεχωριστή αναστολέα SYK. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς έλεγχο αγωγή DMSO οχήματος για κάθε κυτταρική γραμμή. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM για 3 ανεξάρτητα πειράματα. DLD-1 κύτταρα και K-RAS παράγωγο αγρίου τύπου της δεν παρουσιάζουν ευαισθησία σε R406, ενώ χτυπήσει κάτω SYK σε DLD-1 κύτταρα επηρεάζεται μόνο ελάχιστα η ευαισθησία του σε BAY61-3606.

Η

BAY61- 3606 στόχοι ένας μικρός αριθμός κινασών

Υποθέσαμε ότι η δραστηριότητα των BAY61-3606 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου οφειλόταν σε ένα αποτέλεσμα «εκτός στόχου» του αναστολέα, ακόμη λίγα ήταν γνωστά για την ασυδοσία της συγκεκριμένης χημική ένωση. Για τον εντοπισμό άλλων πιθανών στόχων του BAY61-3606, προσδιορίσαμε πρώτα την ικανότητα του να αναστέλλει BAY61-3606 ανταγωνιστικά προσδενόμενες σε ένα πάνελ 402 κινασών δραστικής θέσης. Βρήκαμε ότι 1 μΜ BAY61-3606 παρεμπόδισε την σύνδεση κατά περισσότερο από 90% μόνο το 15 κινάσες (Εικ. 3α, Πίνακας 1, Πίνακας S1), δείχνοντας ότι είναι ένας πολύ εκλεκτικός αναστολέας, παρόμοια σε εκλεκτικότητα προς δύο κλινικές αναστολείς κινάσης, Imatinib και Gefitinib [20]. Επειδή η αναστολή της ενεργής θέσης πρόσδεσης μπορεί, ή δεν μπορεί, να συσχετίζεται άμεσα με την αναστολή της δραστηριότητας κινάσης, πραγματοποιήσαμε μια δευτερεύουσα ανάλυση στην οποία προσδιορίζεται η

in vitro

τιμές IC50 για BAY61-3606 έναντι πολλών από αυτά τα υποψήφια στόχους. Αυτή η μελέτη αποκάλυψε MAP4K2, ένα STE-20 κινάση της οικογένειας, όπως της κινάσης πιο ευαίσθητο στο BAY61-3606, με ένα

in vitro

IC50 11,3 ηΜ (Πίνακας 1).

(α) TREEspot εικόνα που αντιπροσωπεύει την ανασταλτική δράση της BAY61-3606. Οι κινάσες που αναστέλλονται για τη δέσμευση ΑΤΡ από BAY61-3606 υποδεικνύονται από κόκκινες κουκκίδες στο φυλογενετικό δέντρο των κινασών. Το μέγεθος του κόκκινη κουκίδα αντιστοιχεί στο ποσό της αναστολής από 1 μΜ BAY61-3606. Η ταυτότητα των μεμονωμένων κινάσες μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα S1. (Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίζεται ποσοτικά με Syto60 μετά shRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν των πιθανών στόχων BAY61-3606 σε DKS-8 κυτταρικές γραμμές (μπλε) DLD-1 (κόκκινο) ή. Σχετική βιωσιμότητα κυττάρου κανονικοποιούνται ως προς τις γονικές κυτταρικές γραμμές που έχουν μολυνθεί με μόνο φορέα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM για 2 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Γενετική ανάλυση των πιθανών στόχων BAY61-3606

Για να δοθεί συνέχεια στη βιοχημική μας ανάλυση BAY61-3606 δραστηριότητας, μεταχειρισμένα λεντοϊού shRNA να προσδιοριστεί αν knockdown οιασδήποτε των πιθανών στόχων ήταν σε θέση να phenocopy θεραπεία με το φάρμακο (δηλαδή να επηρεάσει εκλεκτικά βιωσιμότητα των μεταλλαγμένων κυττάρων K-RAS) (Σχ. S1c, Πίνακας S2). Για τις μελέτες αυτές, χρησιμοποιήσαμε τις DLD-1 /DKS-8 ισογονιδιακές κυτταρικές γραμμές επειδή είχαμε χρησιμοποιήσει αυτό το ζευγάρι για γενετική ανάλυση των SYK (Εικ. 2). Εξόντωση μόνο μία από τις πιθανών στόχων που δοκιμάστηκαν, HIPK2, ήταν σε θέση να επηρεάσει εκλεκτικά βιωσιμότητα των μεταλλαγμένων κυττάρων K-RAS (Σχ. 3β). Παρ ‘όλα αυτά, θα μπορούσαμε να προσδιορίσει μόνο μία ακολουθία shRNA που παρήγαγε επαρκή νοκ ντάουν αυτού του στόχου. Ως αποτέλεσμα, αυτή η μελέτη ήταν ενδεικτικά, αλλά όχι οριστική, ενός ρόλου για HIPK2 ως στόχος της BAY61-3606 σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS. Αναζητήσαμε έναν ανεξάρτητο τρόπο για τον εντοπισμό του στόχου της BAY61-3606.

Αναγνώριση των βιολογικά ενεργών παραγώγων BAY61-3606

Δευτεροβάθμια σε γενετική ανάλυση μας, πήραμε μια χημική προσέγγιση στη μελέτη BAY61-3606 . Σε αυτή τη μελέτη, δημιουργήσαμε 30 σχετίζεται δομικά με τα παράγωγα του BAY61-3606 και προσδιορίστηκαν την ικανότητά τους να επηρεάζουν επιλεκτικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS (Εικ. S2). Από αυτά τα 30 παράγωγα, μόνο ένα (παράγωγο 6) διατήρησε την επιλεκτικότητα της με δραστικότητα παρόμοια με την μητρική ένωση (Σχ. 4a, b, Σχ. S1b). Άλλοι (π.χ. παράγωγα 8) διατήρησε την επιλεκτικότητα, αλλά έχασε την ισχύ. Για να αντιμετωπιστεί η εκλεκτικότητα ΒΑΥ παραγώγου 6 ευρύτερα, αξιολογήσαμε τη δραστηριότητά της σε ένα πάνελ του ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών που ήταν είτε μεταλλαγμένη για άγριου τύπου για K-RAS. Συνεπής με την ανάλυσή μας για ισογονιδιακές ζεύγη, 4/5 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν μεταλλαξιακά ενεργοποιημένο K-RAS ανταποκρίθηκαν στην BAY παράγωγο 6, ενώ 0/3 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν άγριου τύπου K-RAS ανταποκρίθηκαν (Εικ. S3).

(α) οι τιμές GI50 για BAY61-3606 παραγώγων που εκτελούνται σε HCT-116 (κόκκινο) ή κύτταρα HKE-3 (μπλε). Παράγωγα 6 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη για αυξημένη ισχύ και ειδικότητα του για κύτταρα μεταλλαγμένο K-RAS. (Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίζεται ποσοτικά με Syto60 μετά από έκθεση 72 ωρών σε BAY παράγωγο 6 σε HCT-116 (κόκκινο) ή κύτταρα HKE-3 (μπλε). Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς έλεγχο αγωγή DMSO οχήματος για κάθε κυτταρική γραμμή. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM για 3 ανεξάρτητα πειράματα. HCT-116 κύτταρα ήταν σχετικά ευαίσθητοι σε BAY παράγωγο 6.

Η

Για να συγκρίνετε με BAY61-3606, δοκιμάσαμε την ικανότητα αρκετών παραγώγων για να αναστέλλουν ανταγωνιστικά τη δέσμευση σε μια μεγάλη ομάδα κινασών ενεργή θέση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, κάθε ένα από τα παράγωγα που ελέγχθηκαν ουσιαστικά χάσει την ικανότητά τους να αναστέλλουν ανταγωνιστικά τη δέσμευση των 402 κινασών που αναλύθηκαν, συμπεριλαμβανομένου HIPK2 (Εικ. S4) ενεργή θέση. Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση,

in vitro δοκιμές δραστικότητας

αποκάλυψε μια απώλεια της δραστικότητας αναστολής κινάσης για τα δύο παράγωγα που δοκιμάστηκαν (Σχ. S5).

BAY61-3606 στόχους MAP4K2 να επηρεάσουν την απόκριση των άγριων -τύπου κύτταρα να AZ-628

κατά την ανάλυση των σχετικών δραστηριοτήτων της AZ-628 και BAY61-3606, ελέγξαμε κατά πόσο αυτές οι δύο ενώσεις θα συνεργάζονται για να παράγει μια ενισχυμένη επίδραση σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS, παρόμοια με ο συνεταιρισμός φαινόμενο που παρατηρείται με CI-1040 και BAY61-3606 σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένη B-RAF. AZ-628 και BAY61-3606 δεν συνεργάστηκε στην HCT-116 κύτταρα (Εικ. 5α), ωστόσο, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να έχουν στόχο μια κοινή πορεία. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτές οι δύο αναστολείς δεν συνεργάζονται για να επηρεάσουν αρνητικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων που εκφράζουν άγριου τύπου K-RAS. Στην ουσία, HKE-3 κύτταρα που ήταν ανθεκτικά σε τυπικά AZ-628 έγινε ευαίσθητο όταν υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με BAY61-3606 (Σχ. 5α). BAY παραγώγου 6, η οποία διατήρησε την ικανότητά του να καταστέλλει επιλεκτικά τον πολλαπλασιασμό σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS (Εικ. 4b), χάσει την ικανότητά της να συνεργαστεί με AZ-628 σε κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου K-RAS (Σχ. 5β).

(α) Cell βιωσιμότητα ποσοτικά με Syto60 μετά από 72 ώρες από την συνδυαστική αγωγή με κυμαινόμενες συγκεντρώσεις BAY61-3606 και 1 μΜ AZ-628 σε HCT-116 (κόκκινη γραμμή) ή HKE-3 (μπλε γραμμές) κύτταρα. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς έλεγχο αγωγή DMSO οχήματος για κάθε κυτταρική γραμμή. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM για 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι δύο αναστολείς συνεργάζονται σε κύτταρα άγριου τύπου, αλλά όχι σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS. (Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 72 ώρες από την συνδυαστική αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις ΒΑΥ παραγώγου 6 και 1 μΜ AZ-628 σε HCT-116 και τα κύτταρα HKE-3. BAY παράγωγο 6 δεν παρέχει επιπλέον ευαισθησία στην AZ-628 κατά HKE-3 κύτταρα. βιωσιμότητας (γ) Cell ποσοτικά με Syto60 μετά από 72 ώρες αγωγής AZ-628 σε HCT-116 ή HKE-3 κυτταρικές γραμμές με MAP4K2 knockdown. Απώλεια MAP4K2 δεν επηρεάζει AZ-628 απόκριση σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS, αλλά ενισχύει την επίδραση της AZ-628 σε κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου K-RAS. (Δ) Κυτταρική βιωσιμότητα μετά από 72 ώρες από την συνδυαστική αγωγή με 1 μΜ BAY61-3606 και 1 μΜ AZ-628 (σκιασμένη) ή 1 μΜ ΑΖ-628 μόνο (σαφής) σε HKE-3 κύτταρα με MAP4K2 knockdown. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς 1 μΜ επεξεργασμένα δείγματα AZ-628. Σε γονικά κύτταρα HKE-3, BAY61-3606 προσδίδει ευαισθησία σε AZ-628. Μετά την απώλεια του MAP4K2, BAY61-3606 πια ευαισθητοποιεί.

Η

Με την εξαίρεση των SYK, BAY61-3606 ήταν περισσότερο από 10 φορές πιο αποτελεσματική στην αναστολή MAP4K2 από οποιοδήποτε άλλο κινάσης. Επιπλέον, ΒΑΥ παραγώγου 6 χάσει την ικανότητά της να αναστέλλει αποτελεσματικά την

in vitro

δραστικότητα κινάσης του MAP4K2 (Εικ. S5). Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, ερευνήσαμε αν MAP4K2 παίζει ένα ρόλο στην ευαισθησία των αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων κυττάρων K-RAS σε BAY61-3606. HKE-3 και DKS-8 κύτταρα που στερούνται MAP4K2 ήταν υπερευαίσθητοι σε AZ-628, ενώ MAP4K2 knockout δεν είχε καμία επίδραση στην απόκριση του HCT-116 ή DLD-1 κύτταρα (Σχ. 5c, Σχ. S6a). Εμείς αιτιολογημένη ότι αν η αναστολή της MAP4K2 από BAY61-3606 αντιπροσώπευαν το αλλαγμένη ανταπόκριση των κυττάρων άγριου τύπου σε AZ-628, τότε το K-RAS κύτταρα άγριου τύπου που στερείται MAP4K2 δεν θα ευαισθητοποιηθεί περαιτέρω AZ-628 με κατεργασία με BAY61- 3606. Όπως είχε προβλεφθεί, BAY61-3606 και AZ-628 απέτυχε να επηρεάσει συνεργατικά βιωσιμότητας HKE-3 κύτταρα που στερούνται MAP4K2 (Εικ. 5d). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι BAY61-3606 μεταβάλλει την απόκριση του κυττάρου που εκφράζει άγριου τύπου K-RAS σε AZ-628 με αναστολή της δραστικότητας της κινάσης του MAP4K2.

MAP4K2 ενεργοποιεί το μονοπάτι ΝΡκΒ για την εξουδετέρωση αναστολή ανάπτυξης εξαρτώμενη AZ628

Δεδομένου ότι MAP4K2 είναι σημαντικό για την ανταπόκριση των κυττάρων άγριου τύπου σε AZ-628, είμαστε δίπλα ρώτησε πώς λειτουργεί MAP4K2 να ρυθμίζουν την απόκριση στην αναστολή της RAF. Για να προσδιορίσετε το μονοπάτι υπεύθυνο για τη δράση MAP4K2, χρησιμοποιήσαμε Bio-Plex ανάλυση φωσφο-πρωτεΐνη για τη μέτρηση των επιπτώσεων της MAP4K2 νοκ ντάουν σε διάφορα μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης. Συνολικά, έχουμε προφίλ 13 φωσφο-πρωτεϊνών: Iκβα (Ser32 /Ser36), JNK (Thr183 /Tyr185), ΜΕΚ1 (Ser217 /Ser221), ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, Thr185 /Tyr187), ΔΠΕ (Thr359 /Ser363) , ρ38 (Thr180 /Tyr182), c-Jun (Ser63), ΑΤΡ2 (Thr71), ΑΚΤ (Ser473), S6 (Ser235 /Ser236), STAT3 (Ser727), STAT3 (Tyr705), και GSK3α /β (Ser21 /Ser9 ) (Εικ. S7). Βρήκαμε δύο διαφορές μεταξύ HKE-3 και HCT-116 που έθεσε ευθέως θα μπορούσαν να σχετίζονται με τη λειτουργία του MAP4K2. Πρώτον, βρήκαμε ότι το βασικό επίπεδο φωσφορυλίωσης Iκβα ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε HCT-116 από ό, τι σε HKE-3 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι ΝΡκβ σηματοδότηση καταστέλλεται σε κύτταρα που εκφράζουν ενεργοποιημένα K-RAS (Εικ. S7). φωσφορυλίωση Iκβα περαιτέρω επάγεται σε HKE-3 κύτταρα μετά από επεξεργασία με AZ-628 και αυτό επαγωγή εξηρτάτο από MAP4K2 (Σχ. 6α). Η παρατήρηση αυτή είναι συνεπής με προηγούμενες μελέτες που συνδέουν MAP4K2 να ΝΡκβ σηματοδότηση [21]. Δεύτερον, βρήκαμε ότι JNK έντονα ενεργοποιείται σε HKE-3 κύτταρα μετά από επεξεργασία με ΑΖ-628 (Εικ. S7). Αν και MAP4K2 έχει προηγουμένως συνδεθεί με σηματοδότηση της JNK, αυτή η ενεργοποίηση δεν φαίνεται να απαιτούν MAP4K2 (Εικ. S6b).

(α) Χρονική πορεία της φωσφο-Iκβα (Ser32 /Ser36) ενεργοποίηση μετά από 1 μΜ AZ- 628 θεραπεία σε HCT-116 (κόκκινες γραμμές) ή HKE-3 (μπλε γραμμή) κύτταρα με MAP4K2 γκρεμίζω, όπως μετράται μέσω της Bio-Plex. Σχετική σήμα ομαλοποιήθηκε σε λύμα master control. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM για 3 ανεξάρτητα πειράματα. ΝΡκβ σηματοδότηση ενισχύθηκε σε HKE-3 κύτταρα μετά από έκθεση σε AZ-628 και αυτό ήταν εξαρτάται MAP4K2. (Β) Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίζεται ποσοτικά με Syto60 μετά από 72 ώρες από την συνδυαστική θεραπεία με αναστολέα ΙΚΚ VII και 1 μΜ AZ-628. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς έλεγχο αγωγή DMSO οχήματος για κάθε κυτταρική γραμμή. Όπως BAY61-3606, αναστολέας ΙΚΚ VII ενίσχυσε την επίδραση της AZ-628 ειδικώς σε κύτταρα άγριου τύπου K-RAS. (Γ) Κυτταρική βιωσιμότητα μετά από 72 ώρες από την συνδυαστική αγωγή 1 μΜ αναστολέα ΙΚΚ VII και 1 μΜ AZ-628 (σκιασμένη) ή 1 μΜ ΑΖ-628 μόνο (σαφής) σε κύτταρα HKe3 με MAP4K2 knockdown. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων κανονικοποιήθηκε προς 1 μΜ επεξεργασμένα δείγματα AZ-628. Απώλεια MAP4K2 κατήργησε την ικανότητα του ΙΚΚ αναστολέα VII να ευαισθητοποιήσει HKE-3 κύτταρα σε AZ-628.

Η

Από ΝΡκβ είχε εμφανίστηκε σε υπερ-ενεργοποιείται σε κύτταρα άγριου τύπου σε ένα MAP4K2-εξαρτώμενο τρόπο, έχουμε συμπεράνει κανείς ότι η αναστολή του μονοπατιού ΝΡκβ θα έχει το ίδιο αποτέλεσμα όπως BAY61-3606 ή MAP4K2 νοκ ντάουν. Δηλαδή, περιμέναμε ότι η αναστολή του ΝΡκβ θα αυξήσει την ευαισθησία των κυττάρων άγριου τύπου K-RAS σε AZ-628 χωρίς να επηρεάζει την ευαισθησία των μεταλλαγμένων κυττάρων K-RAS. Όπως είχε προβλεφθεί, η αναστολή της ΝΡκβ αύξησε την ευαισθησία των HKE-3 και DKS-8 κυττάρων σε AZ-628, ουσιαστικά phenocopying MAP4K2 knockdown (Εικ. 6b, Εικ. S6c). Αντιθέτως, η αναστολή της JNK δεν μετέβαλε την ευαισθησία του HKE-3 κύτταρα στην AZ-628 (Εικ. S6d). Περαιτέρω, όπως με την θεραπεία BAY61-3606, knockdown του MAP4K2 κατάργησε την ικανότητα αναστολής ΝΡκβ να ευαισθητοποιεί κύτταρα φυσικού τύπου για ΑΖ-628 (Σχ. 6c). Από αυτά τα δεδομένα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι οι λειτουργίες MAP4K2 ανοδικά στο μονοπάτι ΝΡκβ να ρυθμίζουν την απόκριση του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων σε αναστολή της RAF.

Συζήτηση

K-RAS είναι μεταλλακτικώς ενεργοποιείται στο 40% περίπου του παχέος εντέρου [2]. Ενεργοποιημένος K-RAS πιστεύεται ότι προσδίδουν ογκογένεσης μέσω κανονικών μονοπατιών σηματοδότησης κατάντη του, για παράδειγμα, η RAF-ΜΕΚ-ΕΚΚ (ΜΑΡΚ) καταρράκτη σηματοδότησης. Συνεπής με αυτή την ιδέα, ενεργοποιώντας μεταλλάξεις σε Β-RAF συμβαίνουν στο 15% των καρκίνων του παχέος και είναι αμοιβαία αποκλειόμενα με μεταλλάξεις K-RAS [22]. Παρ ‘όλα αυτά, η αναστολή της ΜΑΡΚ σηματοδότησης, τυπικά με άμεση αναστολή της ΜΕΚ, έχει σε μεγάλο βαθμό αναποτελεσματική στη θεραπεία K-RAS μεταλλαγμένο ορθοκολικού καρκίνου [9], [23]. Η έλλειψη αποτελεσματικότητας των αναστολέων ΜΕΚ στο πλαίσιο αυτό μπορεί να οφείλεται στην πλειοτροπική λειτουργία του K-RAS, η οποία έχει δειχθεί ότι προάγει μετασχηματισμό μέσω των οδών τελεστή ΡΙ3Κ και RAL επιπροσθέτως ΜΑΡΚ [24], [25]. Ωστόσο, ΡΙ3Κ μεταλλάξεις μονοπάτι εμφανίζονται επίσης σε καρκίνους του παχέος και συχνά συμπίπτει με μεταλλάξεις K-RAS, υποδηλώνοντας ότι η ΡΙ3Κ δεν είναι μια κοινή τελεστής του K-RAS σηματοδότησης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [26]. Και ενώ οι μεταλλάξεις ΡΙ3Κ έχουν συσχετιστεί με αντίσταση σε αναστολείς ΜΕΚ σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου [27], [28], K-RAS καρκίνους μεταλλαγμένο κόλον από γενετικά ποντίκια είναι εγγενώς ανθεκτική στην αναστολή της ΜΕΚ [9]. Τα δεδομένα μας είναι συνεπείς με μια εναλλακτική εξήγηση για την έλλειψη αποτελεσματικότητας των αναστολέων ΜΕΚ σε παχέος καρκίνων που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS -. ότι υπάρχει μια εναλλακτική /παράλληλη οδός κατάντη της Β-RAF που μεσολαβεί K-RAS-επαγόμενη ογκογένεσης

στη μελέτη μας, έχουμε χαρακτηρίσει την δραστηριότητα ενός μικρού μορίου, BAY61-3606, ότι επηρεάζονται κατά προτίμηση βιωσιμότητα σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν ισογενετικών μόνο άγριου τύπου K-RAS (Σχ. 1α, Εικ. S1a). Δεδομένου BAY61-3606 είναι μια ΑΤΡ-ανταγωνιστικός αναστολέας της κινάσης, η ικανότητά της να επηρεάζει επιλεκτικά τα κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS αρχικά πρότεινε ότι στοχεύει σε κινάσης λειτουργεί προς τα κάτω του K-RAS να προάγει πολλαπλασιασμό. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι η K-RAS προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω μιας RAF-εξαρτώμενη, αλλά ΜΕΚ-ανεξάρτητη, οδού σηματοδότησης [9]. Τρία κομμάτια αποδείξεων εμπλέκουν BAY61-3606 ως αναστολέας αυτής της ΜΕΚ-ανεξάρτητο μονοπάτι καθοδικά της RAF. Κατ ‘αρχάς, BAY61-3606 δεν συνεργάστηκε με την AZ-628 στα κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS (Εικ. 5α), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτοί οι αναστολείς στοχευμένες μια κοινή πορεία. Δεύτερον, BAY61-3606 επηρεάζονται ανάπτυξης σε μεταλλαγμένα κύτταρα KRAS, αλλά, σε αντίθεση AZ-628, δεν επηρέασε την κατάσταση φωσφορυλίωσης της ΜΕΚ ή ERK (Σχ. 1 d). Τέλος, BAY61-3606 επιβράδυνε την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων που εκφράζουν μεταλλαγμένη B-RAF και συνεργαστεί με έναν αναστολέα ΜΕΚ για να παράγει μια ενισχυμένη απόκριση σε αυτά τα κύτταρα (Εικ. 1c).

Αν και BAY61-3606 χαρακτηρίστηκε αρχικά ως αναστολέα κινάσης ανταγωνιστική ΑΤΡ, εκλεκτικότητα του για τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων μεταλλαγμένο K-RAS δεν μπορούν να απαιτούν αυτή τη δραστηριότητα. Οι μελέτες μας από BAY61-3606 παραγώγων καταδεικνύουν ότι εκείνοι που δεν έχει την ικανότητα να επηρεάζει τη σύνδεση μπορούν ακόμη να διατηρήσουν την ικανότητά τους να επηρεάζουν επιλεκτικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων ενεργή θέση. Μια πιθανή εξήγηση για αυτήν την παρατήρηση είναι ότι η σχετική στόχος του BAY61-3606 και βιολογικώς δραστικά παράγωγα του είναι μία μη πρωτεϊνικής κινάσης. Εκτός από την αναστολή των κινασών, ανάλογα ΑΤΡ μπορεί να επηρεάσει τη βιολογία μέσω άλλων διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της σύνθεσης νουκλεϊκών οξέων [29], [30] και τον κινητήρα μικροσωληνίσκων μεταφορών [31]. Εναλλακτικά, η σχετική στόχος δεν μπορεί να είναι μεταξύ των 402 κινάσες που ρωτήθηκαν σε δοκιμασία ή BAY61-3606 και τα παράγωγά μας θα μπορούσε να αναστέλλουν τη δράση της κινάσης χωρίς να επηρεάζει ενεργό θέση σύνδεσης. Αν ναι, δεν θα σκοράρει στην οθόνη μας

Εκτός από τη δραστηριότητα της σε κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο K-RAS ή B-RAF, εντοπίσαμε επίσης μια δευτερεύουσα βιολογική επίδραση των BAY61-3606.? αυτό που ανατίθενται κύτταρα φυσικού τύπου, τα οποία είναι συνήθως ανθεκτικά σε AZ-628, ευαισθησία στην αναστολή της RAF (Εικ. 5α). Χρησιμοποιώντας μια ποικιλία προσεγγίσεων, εντοπίσαμε MAP4K2 ως στόχο για BAY61-3606 σε κύτταρα άγριου τύπου.