Αφηρημένο

Σποραδικές καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια συχνή κακοήθεια και επίσης μια από τις κύριες αιτίες των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Η ανώμαλη έκφραση του παράγοντα μεταγραφής SOX2 έχει πρόσφατα παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, αλλά ο ρόλος του στην CRC δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. Εδώ μελετήσαμε την έκφραση του SOX2 σε 441 ασθενείς CRC με ανοσοϊστοχημεία και συγγενικών την έκφραση να κλινικοπαθολογοανατομικών και μοριακές μεταβλητών και πρόγνωση του ασθενούς. SOX2 εκφράστηκε στο 11% των όγκων και συσχετίστηκε σημαντικά με

BRAF

V600E

μετάλλαξη, αλλά όχι να

KRAS

μεταλλάξεις (κωδικόνιο 12 και 13). SOX2 θετικότητα συσχετίστηκε με κακή επιβίωση των ασθενών, ιδιαίτερα σε

BRAF

V600E

μεταλλαχθεί περιπτώσεις.

In vitro

μελέτες έδειξαν ότι τα κύτταρα που εκφράζουν το μόνιμα ενεργό

BRAF

V600E

είχαν αυξημένη έκφραση SOX2, ένα μη βρίσκοντας βρέθηκαν σε κύτταρα που εκφράζουν

KRAS

G12V

. Επιπλέον, το κλείδωμα προς τα κάτω σηματοδότηση BRAF χρησιμοποιώντας ένα ΜΕΚ-αναστολέα οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του SOX2. Από SOX2 υπερέκφραση έχει συσχετιστεί με αυξημένη μετανάστευση και εισβολή, ερευνήσαμε την έκφραση SOX2 σε ανθρώπινα ηπατικά μετάσταση CRC και διαπίστωσε ότι μια SOX2 πρωτογενή CRC είχαν επίσης έκφραση SOX2 σε αντίστοιχες ηπατικές μεταστάσεις. Τέλος βρήκαμε ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν SOX2

in vitro

έδειξαν αυξημένη έκφραση του FGFR1, η οποία έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται με μετάσταση στο ήπαρ σε CRC. νέα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η έκφραση SOX2 ρυθμίζεται εν μέρει από BRAF σηματοδότησης, και μια αυξημένη έκφραση SOX2 μπορεί να προωθήσει CRC μετάσταση και να μεσολαβήσει μια κακή πρόγνωση των ασθενών

Παράθεση:. Lundberg IV, Löfgren Burström Α, Edin S, Eklöf V , Öberg Α, Stenling R, et al. (2014) Έκφραση SOX2 ρυθμίζεται από BRAF και συμβάλλει στην κακή πρόγνωση των ασθενών με Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (7): e101957. doi: 10.1371 /journal.pone.0101957

Επιμέλεια: Ανδρέας-Κλαύδιος Hoffmann, της Δυτικής Γερμανίας Κέντρο Καρκίνου, Γερμανία

Ελήφθη: 31 Γενάρη 2014? Αποδεκτές: 12, Ιούν, 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Lundberg et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Έρευνας για τον Καρκίνο στη Βόρεια Σουηδία, Ο.Ε. και Edla Johanssons ίδρυμα, Petrus και Augusta Ίδρυμα Hedlunds, Μβση Ίδρυμα Bergvall, η σουηδική Εταιρεία Καρκίνου, το σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας και το Πανεπιστήμιο Umeå. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος Σποραδικές (CRC) είναι μια κοινή κακοήθεια στο δυτικό κόσμο και μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων από καρκίνο. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας, εξαιτίας απόκρυφη ή κλινικά προσδιορίζονται διάδοση της νόσου ήδη κατά τη διάγνωση, τονίζει τη σημασία της υψηλότερης κατανόησης των βιολογικών γεγονότων που οδηγούν σε διηθητικό καρκίνο. Αυτή η γνώση είναι σημαντικό να προβλέψουμε την πρόγνωση των ασθενών και τη δημιουργία νέων, ισχυρών θεραπείες. Το αδένωμα προς αλληλουχία καρκίνωμα αποτύπωση, τα γενετικά γεγονότα που απαιτούνται για μια κανονική επιθήλια κόλον να μετατραπεί σε ένα κακοήθη φαινότυπο στις περισσότερες από τις σποραδικές περιπτώσεις CRC [1]. Δεδομένου ότι η μεταστατική διαδικασία στη CRC δεν είναι όπως πλήρως κατανοητή, είναι δύσκολο να διευκρινιστεί γιατί ορισμένοι όγκοι γίνονται πιο επιθετικά και μεταστάσεις πιο εύκολα από ό, τι άλλες. Προσδιορισμός των μοριακών δεικτών που εκφράζονται σε επεμβατικές όγκους που μπορεί να προβλέψει κακή πρόγνωση των ασθενών είναι επομένως ένα σημαντικό αντικείμενο έρευνας.

SRY (σεξ προσδιορισμό περιοχή Υ) -κουτί 2 (SOX2) είναι μέλος της μεγάλης

SOX

οικογένεια γονιδίων, που περιλαμβάνει παράγοντες μεταγραφής που είναι γνωστό ότι είναι σημαντικές στη ρύθμιση των αναπτυξιακών διαδικασιών και προδιαγραφών κυτταρικό τύπο [2]. Το κλειδί SOX2 μέλος παίζει ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής pluripotency και αυτο-ανανέωση και στις δύο εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων [3] και στην επαγόμενη από πολυδύναμα βλαστοκύτταρα [4]. Πρόσφατα έχει επίσης αναφερθεί ότι η αυτο-ανανέωση των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου διατηρείται με SOX2 [5], προτείνοντας έναν ρόλο ongogenic του SOX2. Η υπερέκφραση του SOX2 μπορεί να φανεί στον CRC [6] – [8], καθώς και σε αρκετές άλλες κακοήθειες όπως του μαστού, του παγκρέατος και γαστρικών καρκίνων [9] – [11], αποδεικνύοντας τη συμμετοχή της στην καρκινογένεση. Επιπλέον, SOX2 έχει προταθεί ότι εμπλέκεται στην CRC κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση, όπου μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης 2 (ΜΜΡ2) έχει προταθεί ως μια πιθανή μεσολαβητής για την επίδραση SOX2 [6], αλλά οι ακριβείς μηχανισμοί πρέπει ακόμα να ανακαλυφθεί .

στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκε η έκφραση SOX2 στην πρωτοβάθμια CRC, καθώς και σε δείγματα που αντιστοιχούν μετάσταση στο ήπαρ, και συσχετίζονται τα ευρήματά μας με την πρόγνωση του ασθενούς και τα χαρακτηριστικά μοριακού όγκου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση SOX2 είναι, τουλάχιστον εν μέρει, ρυθμίζονται από BRAF, και ότι η έκφραση του BRAF

V600E σε ένα στάδιο με τρόπο που εξαρτάται συσχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

στην παρούσα μελέτη, ο χειρισμός των δειγμάτων ιστού και των δεδομένων του ασθενούς εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της έρευνας στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Umea (Περιφερειακό ηθικά Διοικητικό συμβούλιο κριτική στη Umeå, Σουηδία). Αυτό περιλαμβάνει τη διαδικασία με την οποία οι ασθενείς έδωσαν προφορικά επιγνώσει συναίνεσή τους, η οποία τεκμηριώνεται σε κάθε εγγραφή του ασθενούς και θεωρείται από την Επιτροπή Δεοντολογίας να είναι επαρκής. Κάθε δείγμα ιστού καταχωρήθηκε ως αριθμός της υπόθεσης και το έτος στη βάση δεδομένων που χρησιμοποιείται για τις αναλύσεις και τα ονόματα ή την προσωπική αναγνώριση δεν αναφέρεται.

Κλινικά δείγματα

Τα δείγματα ιστών CRC που περιλαμβάνονται στη μελέτη ήταν από τον καρκίνο του παχέος εντέρου σε Umeå Μελέτη (CRUMS), η οποία αποτελείται από τους ασθενείς που έχουν χειρουργικά για την πρωτοβάθμια CRC μεταξύ του 1995 και του 2003 στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Umea της Σουηδίας. Ιστοπαθολογικών ταξινομήσεων όλων των περιπτώσεων πραγματοποιήθηκαν από έναν παθολόγο από την επανεξέταση ρουτίνας βάφονται τμήματα του όγκου. Τα κλινικά δεδομένα ελήφθησαν από την εξέταση των φακέλων των ασθενών, και τα δεδομένα επιβίωσης συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια του φθινοπώρου του 2012.

13 ασθενείς με αρχειακό ιστό τόσο από πρωτογενή ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα και το αντίστοιχο μακρινή μετάσταση στο ήπαρ που είχαν διαγνωστεί στο ίδιο χρονικό διάστημα, όπως CRUMS συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Αυτές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας την ηλεκτρονική βάση δεδομένων ιστορικό των ασθενών στο Τμήμα Κλινικής Παθολογίας, Umeå University Hospital, Σουηδία. Οι όγκοι βαθμολογήθηκαν και διαγιγνώσκεται από παθολόγους κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης ή βιοψία.

Η ανοσοϊστοχημεία

CRC δείγματα φορμόλη-σταθερές και ενσωματωμένα σε παραφίνη, σύμφωνα με ρουτίνα πρωτόκολλα στο Τμήμα Παθολογικής Κλινικής, Umeå πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Σουηδίας. Αυτοί κόπηκαν σε 4-μm και στη συνέχεια ξηραίνεται, αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν. Anti-SOX2 πολύκλωνο αντίσωμα [12] – [14] (Abcam, Cambridge, UK) χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 1:500 σε μία ημιαυτόματη μηχανή χρώση (Bench Mark Ultra, Ventana Inc) και ορατά με κιτ ανίχνευσης iVIEW DAB (Ventana Inc)). Τα πλακίδια με αιματοξυλίνη.

Για CRUMS, 449 υποθέσεις ανοσοϊστοχημικώς χρωματισμένο, αλλά λόγω έλλειψης υλικού όγκου (n = 7) ή επαναλαμβανόμενη απώλεια ιστού κατά το βήμα ανάκτησης αντιγόνου (n = 1), οκτώ από τους δεν θα μπορούσαν να αναλυθούν για χρώση SOX2. Όλοι οι 13 ασθενείς με αντίστοιχη μετάσταση επιτυχώς χρωματισμένο, και όλοι θα μπορούσαν να αναλυθούν για SOX2-θετικά κύτταρα. Τα δείγματα εξετάστηκαν κάτω από οπτικό μικροσκόπιο, και κάθε δείγμα αξιολογήθηκε δύο φορές από τον ίδιο παρατηρητή και σε περιπτώσεις με αντιφατικά βαθμολόγησης, το ένα τρίτο τελική αξιολόγηση έγινε. Πυρηνική χρώση εκτιμήθηκε ως αρνητική ή θετική. Περιστασιακή κυτταροπλασματική ή στρωματική χρώση δεν αναλύθηκε.

Στατιστικές αναλύσεις

Σύλλογοι μεταξύ της έκφρασης SOX2 και διαφορετικές κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας χ Pearson ‘s

2 δοκιμές. Για την εκτίμηση ειδική για τον καρκίνο επιβίωσης, χρησιμοποιήθηκε ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier, και οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank. Οι ασθενείς στην ομάδα CRUMS που πέθανε μέσα σε ένα μήνα από τη χειρουργική επέμβαση, λόγω μετεγχειρητικές επιπλοκές (n = 37) αποκλείστηκαν από τις αναλύσεις επιβίωσης. Cox αναλογικά μοντέλα κινδύνου χρησιμοποιήθηκαν για την πολυπαραγοντική ανάλυση. εκδηλώσεις του καρκίνου ειδικά ορίστηκαν ως ο θάνατος με γνωστό διαδίδονται ή υποτροπιάζουσα νόσο, και περιπτώσεις λογοκρισία στο τέλος της παρακολούθησης ή κατά το χρόνο του θανάτου από άλλες αιτίες. SPSS /PASW στατιστικού λογισμικού έκδοση 20 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) χρησιμοποιήθηκε για τις στατιστικές αναλύσεις. επίπεδα έκφρασης του γονιδίου συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

δοκιμή δύο ουρά του Student. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει ένα μέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραμάτων και οι ράβδοι σφάλματος απεικονίζουν την τυπική απόκλιση.

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική για όλες τις αναλύσεις

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Στην παρούσα μελέτη, ο καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά Caco2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) αναπτύχθηκε σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) με glutamax συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gibco, Life Technologies, Στοκχόλμη, Σουηδία) και διατηρήθηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2. Γενιά των σταθερών επιμολύνσεων που εκφράζουν SOX2 (Caco2-SOX2), μετάλλαξη BRAF (Caco2-BRAF

V600E) ή μεταλλαγμένου KRAS (Caco2-KRAS

G12V) πραγματοποιήθηκε με επιμόλυνση Caco2 κύτταρα με pcDNA3.3-SOX2 ( Derrick Rossi, Νοσοκομείο Παίδων της Βοστώνης, ΗΠΑ, μέσω Addgene), ρΜΟΕΡ-BRAFV

600E (ευγενική προσφορά από τον καθηγητή R. Marais) ή pcDNA3-KRAS

G12V (ευγενική προσφορά από Dr N. Ignatenko) χρησιμοποιώντας Caco-2 αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Altogen Biosystems, Las Vegas, NV, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μεταξύ 48 και 72 ώρες μετά την έκθεση στο DNA, επιμολυσμένα κύτταρα επελέγησαν με 800 μg /ml G418 (Gibco, Life Technologies, Στοκχόλμη, Σουηδία). Μέσο που περιέχει G418 άλλαξε δύο φορές την εβδομάδα.

Για να αποκλείσετε σηματοδότησης BRAF σε Caco2 και Caco2-BRAF

V600E κύτταρα, 20 μΜ αναστολέα ΜΕΚ PD98059 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ή DMSO ως έλεγχος, προστέθηκε στα κύτταρα μετά από επώαση για 24 ή 48 ώρες.

RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Duren , Γερμανία), και cDNA συνετέθη με το Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Life Technologies, Στοκχόλμη, Σουηδία) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ήταν από το DNA Technology A /S (Aarhus, Δανία) και οι αλληλουχίες τους έχουν ως εξής: GAPDH προς τα εμπρός: 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ‘, αντίστροφος: 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’. SOX2 προς τα εμπρός: 5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 ‘, αντίστροφη: 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC-3’. FGFR1 προς τα εμπρός: 5′-AGGCTACAAGGTCCGTTATGC-3 ‘, αντίστροφη: 5′-TGCCGTACTCATTCTCCACAA-3’. FGFR2 προς τα εμπρός: 5′-TTAAGCAGGAGCATCGCATTG-3 ‘, αντίστροφη: 5′-GGGACCACACTTTCCATAATGAG-3’. FGFR3 προς τα εμπρός: 5′-CCTCGGGAGATGACGAAGAC-3 ‘, αντίστροφη: 5′-CGGGCCGTGTCCAGTAAGG-3’. FGFR4 προς τα εμπρός: 5′-TGCAGAATCTCACCTTGATTACA-3 ‘, αντίστροφη: 5′-GGGGTAACTGTGCCTATTCG-3’. Κάθε PCR αντίδραση περιείχε 25 ng cDNA και κάθε δείγμα έτρεξε εις διπλούν. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Οι τυπικές αποκλίσεις υπολογίστηκαν από την μέση τιμή των τριπλών αντιδράσεων. Οι RT-PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε Taqman 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, Στοκχόλμη, Σουηδία) και ακόλουθες παραμέτρους ποδηλασία χρησιμοποιήθηκαν: 50 ° C για 2 λεπτά και στη συνέχεια μια αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά, που ακολουθείται από 40 κύκλοι 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 60 s. γονιδιακή έκφραση ομαλοποιήθηκαν σε GAPDH.

κηλίδος Western

Για να αναλυθεί η έκφραση SOX2 στο στάβλο μορφομετατροπέα Caco2-SOX2, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (100 mM NaCl, 50 mM Tris ρΗ 7,5, 1% Triton Χ-100, 1 mM EDTA ρΗ 8,0, 15 mM MgCl

2, αναστολείς της πρωτεΐνης), πριν πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (GE Healthcare, Uppsala, Σουηδία). Το στύπωμα επωάστηκε με αντίσωμα πρωτογενούς SOX2 (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA) και δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (GE Healthcare, Uppsala, Σουηδία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η κηλίδα αναπτύχθηκε με αντιδραστήριο ECL Select Western Blotting Detection (GE Healthcare, Uppsala, Sweden).

Ψηφιακές σταγονιδίων PCR

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ Tissue NucleoSpin (Macherey- Nagel, Duren, Γερμανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ψηφιακές σταγονιδίων PCR (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για να ελέγξει το Caco2 επιμολύσματα εκφράζουν μεταλλαγμένες

BRAF

V600E

(Caco2-BRAF

V600E) και

KRAS

G12V

(Caco2-KRAS

G12V). Η ddPCR-μέθοδος έχει παρουσιαστεί διεξοδικά αλλού [15], [16]. Εν συντομία, το ddPCR επιτρέπει την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό τόσο της μετάλλαξης και άγριου τύπου στην ίδια αντίδραση χρησιμοποιώντας το φθοροφόρα FAM και ΗΕΧ συζευγμένο με αλληλουχία-ειδικούς ανιχνευτές. Στη ddPCR-μέθοδο, ένα δείγμα PCR των 20 μl χωρίζεται σε 20 000 σταγονίδια νανολίτρου δίνοντας περίπου 20 000 διαβάζει.

Για να επαληθεύσετε την επιτυχή επιμόλυνση των Caco2-BRAF

V600E, οι εκκινητές και ανιχνευτές ήταν ως εξής: προς τα εμπρός: 5′-GCACAGGGCATGGATTACTTACA-3 ‘, αντίστροφη: 5′-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3′, άγριου τύπου καθετήρα: 5′-56-FAM /TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT /3BHQ_1-3 », καθετήρα μετάλλαξη: 5’-5HEX /TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT /3BHQ_1-3 ‘(DNA Technology A /S, DNA Technology A /S) [17], [18]. Η PCR διεξήχθη σε ένα T100 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα: 95 ° C για 10 λεπτά? 40χ κύκλοι των 95 ° C για 15 s και 56 ° C για 1 λεπτό (ρυθμός ράμπας 2 ° C /sec)? και 98 ° C για 10 λεπτά. 900 ηΜ εκκινητών και 250 ηΜ του αντίστοιχου ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε

Για την ανίχνευση των επιτυχών επιμόλυνση των Caco2-KRAS

G12V, χρησιμοποιήθηκαν δοκιμασίες για ddPCR PrimePCR ddPCR Δοκιμασία (μετάλλαξη:. KRAS p.G12V δοκιμασία, Ανθρώπινα? PrimePCR ddPCR Μετάλλαξη δοκιμασία: KRAS άγριου τύπου για τον προσδιορισμό p.G12V, του Ανθρώπου, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) με PCR-συνθήκες σύμφωνα με το εγχειρίδιο που παρέχεται από την εταιρεία: 95 ° C για 10 λεπτά? 40χ κύκλοι των 94 ° C για 30 s και 55 ° C για 1 λεπτό (ρυθμός ράμπας 2 ° C /sec)? και 98 ° C για 10 λεπτά.

Κάθε αντίδραση PCR περιείχε 50 ng DNA και τα σταγονίδια παρασκευάσθηκαν με γεννήτρια σταγονιδίων QX100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Το τελικό προϊόν PCR ανιχνεύθηκε σε έναν αναγνώστη σταγονίδιο QX200 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) και το αποτέλεσμα, που αναλύθηκαν με λογισμικό QuantaSoft, Έκδοση 1.4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

CpG φαινότυπο νησί methylator (CIMP) κατάσταση

Tumor κατάσταση CIMP προσδιορίστηκε με τη μέθοδο MethyLight με αλληλουχίες εκκινητή και ανιχνευτή που περιγράφονται προηγουμένως [19], [20]. Για τα οκτώ γονίδια στον πίνακα CIMP (

CDKN2A

,

MLH1

,

CACNA1G

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

IGF2

και

CRABP1

) [20], το ποσοστό των μετουσιωμένο αναφοράς (PMR) υπολογίστηκε, όπου PMR & gt? 10 θεωρήθηκε ως θετική [19]. Όγκοι ταξινομούνται ως CIMP αρνητικά (όχι υπερμεθυλίωση προαγωγού), CIMP χαμηλό (πέντε παρα ένα γονίδια μεθυλιωμένα) ή CIMP υψηλή (έξι έως οκτώ γονίδια μετουσιωμένο) [20].

μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) κατάσταση διαλογής

πρωτεΐνες επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία, όπως περιγράφεται προηγουμένως [20]. Εν συντομία, στερεωμένοι με φορμαλίνη και εμβαπτισμένο σε παραφίνη CRC ιστός εξετάστηκε για έκφραση τέσσερα αναντιστοιχία πρωτεΐνες επιδιόρθωσης (MLH1, MSH2, MSH6 και PMS2). Ένα δείγμα θεωρείται έχει μία θετική κατάσταση διαλογής MSI έλειπε πυρηνική χρώση σε κύτταρα όγκου για τουλάχιστον μία από τις πρωτεΐνες και αναφέρεται ως MSI. Μια αρνητική κατάσταση διαλογής MSI είχε έκφραση και των τεσσάρων γονιδίων και αναφέρεται ως μικροδορυφορικού σταθερή (MSS).

BRAF

V600E κατάστασης μεταλλάξεων

Ο προσδιορισμός των διακρίσεων αλληλομόρφων Taqman, περιγράφονται λεπτομερώς αλλού [17], χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του

BRAF

V600E

μετάλλαξη (αντιδραστήρια από την Applied Biosystems, Life Technologies, Στοκχόλμη, Σουηδία).

αλληλουχίας KRAS

Μεταλλακτική ανάλυση των

KRAS

έχει εξηγηθεί αλλού [21]. . Η αλληλούχιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Big Dye v 3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies, Στοκχόλμη, Σουηδία) και εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: προς τα εμπρός: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 ‘και αντίστροφος: 5′-CAGGAAACAGCTATGACCTCTGTATCAAAGAATGGTCCT-3’.

Αποτελέσματα

έκφραση SOX2 στο CRC συσχετίζεται με το βαθμό του όγκου, το στάδιο TNM και

BRAF

μετάλλαξη

έκφραση Πυρηνική SOX2 στα καρκινικά κύτταρα εκτιμήθηκε σε 441 δείγματα ασθενών CRC από ανοσοϊστοχημεία, όπου η έκφραση αξιολογήθηκε ως θετική ή αρνητική (σχήμα 1). Στις θετικές περιπτώσεις, η έκφραση SOX2 είχε δει ποτέ σε ολόκληρο τον όγκο, αλλά θετική πυρήνες βρέθηκαν σε περιορισμένες περιοχές. Περιστασιακή στρωματικών ή κυτταροπλασματική χρώση δεν αξιολογήθηκε. 47 (10,7%) των δειγμάτων CRC εμφανίζονται καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν SOX2 και την έκφραση σε σχέση με διάφορες κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Σε ομάδα μας ασθενή, η έκφραση SOX2 βρέθηκε να σχετίζονται σημαντικά με βαθμό υψηλής όγκου (

σ

= 0,004) και το στάδιο ΤΝΜ (

σ

= 0,034). έκφραση SOX2 επίσης υψηλή συσχέτιση με

BRAF

μετάλλαξη (

σ

& lt? 0.001), αλλά εκπληκτικά καμία συσχέτιση με

KRAS

μεταλλάξεις θα μπορούσαν να θεωρηθούν (

p

= 0,928).

(Α) Αρνητική χρώση των πυρηνικών SOX2 σε μετρίως διαφοροποιημένων CRC. (Β) Θετική χρώση πυρηνική SOX2 σε μια κακώς διαφοροποιημένο CRC.

Η

έκφραση SOX2 συσχετίζεται με κακή επιβίωση του ασθενούς

Καρκίνος-ειδική επιβίωση αναλύσεις αποκάλυψαν ότι οι ασθενείς με SOX2 θετικών όγκων είχε μια χειρότερη πρόγνωση από τους ασθενείς με αρνητικούς όγκους SOX2 (Σχήμα 2α). Αυτή η σχέση ήταν ακόμα ισχυρότερη, όταν μόνο το

BRAF

μεταλλαγμένο όγκους αναλύθηκε (Σχήμα 2β), ενώ καμία διαφορά έκφρασης SOX2 στην επιβίωση παρατηρήθηκε σε

BRAF

άγρια ​​όγκους τύπου (Σχήμα 3γ). έκφραση SOX2 δεν είχε καμία επίδραση στην πρόγνωση των ασθενών με

KRAS

μεταλλαγμένα όγκους (

σ

= 0.676). Σε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο αναλογικών κινδύνων Cox όπως η ηλικία, το φύλο,

BRAF

μετάλλαξη, και την έκφραση SOX2, η κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με την έκφραση SOX2 έναντι καμία έκφραση SOX2 διατηρούνται στατιστική σημαντικότητα (αναλογία κινδύνου (HR) = 1.64, 95 % CI 1,04 έως 2,58,

σ

= 0,032). Κατά την περαιτέρω προσαρμογή για το στάδιο στο πολυπαραγοντική ανάλυση, η προγνωστική επίδραση της έκφρασης SOX2 χάθηκε (HR = 1,04, 95% CI 0,65 έως 1,67,

σ

= 0,878), με έμφαση στάδιο της εξάρτησης.

Ορατή είναι Kaplan-Meier για καρκίνο ειδικών επιβίωση (Α) όλους τους ασθενείς CRC, (Β)

BRAF

V600E

μεταλλαχθεί ασθενείς CRC ή (C)

BRAF

άγριου τύπου ασθενείς CRC.

Η

(Α) κύτταρα Caco2, Caco2 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά

BRAF

μετάλλαξη (Caco2-BRAF

V600E) και τα κύτταρα Caco2 που εκφράζουν σταθερά

KRAS

μετάλλαξη (Caco2-KRAS

G12V). έκφραση SOX2 σε Caco2 ορίστηκε ως 1. (Β) Caco2 μετά από καλλιέργεια με ΜΕΚ αναστολέα, 24 ή 48 ώρες, ή DMSO για 48 ώρες ως έλεγχος. έκφραση SOX2 σε Caco2 αγωγή με DMSO ορίστηκε ως 1. (C) Caco2-BRAF

V600E μετά από καλλιέργεια με ΜΕΚ αναστολέα, 24 ή 48 ώρες, ή DMSO για 48 ώρες και ελέγχου. έκφραση SOX2 σε Caco2-BRAF

V600E αγωγή με DMSO ορίστηκε ως 1. PD: PD98059 (ΜΕΚ-αναστολέα), *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001, NS: μη σημαντική

σ

-τιμή

η

έκφραση SOX2 ρυθμίζεται από BRAF

σε. vitro

Η

Ως έκφραση SOX2 συσχετίζονται με μεταλλαγμένα

BRAF

στην ομάδα μας ασθενή, συνεχίσαμε να αναλύσουμε μοριακή σχέση τους

in vitro

. Το CRC κυτταρική σειρά Caco2, με ενδογενή BRAF και KRAS άγριου τύπου, ήταν επιμολυσμένα με είτε BRAF

V600E ή KRAS

G12V προκειμένου να διαπιστωθεί κυτταρικές σειρές που εκφράζουν σταθερά μεταλλαγμένη

BRAF

(Caco2-BRAF

V600E, Εικόνα S1a) ή μεταλλαγμένο

KRAS

(Caco2-KRAS

G12V, Εικόνα S1b). Με αναλύσεις RT-PCR βρήκαμε ότι Caco2-BRAF

V600E εκφράστηκαν σχετικά με διπλάσια SOX2-επίπεδα σε σύγκριση με Caco2 (

σ

= 0,013), αύξηση η οποία δεν παρατηρήθηκε σε Caco2-KRAS

G12V (Σχήμα 3α). Αυτά τα αποτελέσματα, σε συμφωνία με τα δεδομένα μας από τον πληθυσμό των ασθενών (Πίνακας 1), δείχνουν ότι η έκφραση του SOX2 ρυθμίζεται από μεταλλαγμένο BRAF. Η

BRAF

V600E

μετάλλαξη BRAF καθιστά σε μόνιμα ενεργή κατάσταση, την τόνωση της MEK /ERK καταρράκτη σηματοδότησης στην απουσία εξωκυττάρια ερεθίσματα [22]. Πράγματι, το κλείδωμα BRAF κατάντη σηματοδότησης σε Caco2 BRAF-

κύτταρα V600E χρησιμοποιώντας το PD98059 ΜΕΚ-αναστολέα, οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του SOX2 (Σχήμα 3γ), γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι κυρίως το καλά χαρακτηρισμένο δραστηριότητα ενεργοποίηση ΜΕΚ του BRAF που ρυθμίζει SOX2 . Επιπλέον, τα χαμηλά ενδογενή επίπεδα της SOX2 σε κύτταρα Caco2 μειώθηκαν επίσης από την ΜΕΚ αναστολέα (σχήμα 3β), υπονοώντας ότι BRAF ανταποκρίνονται σε σήματα ενδογενής ενεργοποίηση ρυθμίζει επίσης την έκφραση SOX2. Μαζί αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν το ρόλο του BRAF ως ανάντη ρυθμιστή της έκφρασης SOX2.

Πρωτοβάθμια SOX2 θετική CRC έχει SOX2 θετικό αντίστοιχο μετάσταση στο ήπαρ

Δεδομένου ότι το γεγονός ότι η έκφραση SOX2 συσχετίζεται με χειρότερη ασθενή πρόγνωση, θελήσαμε να μελετήσουμε την έκφραση SOX2 σε πρωτογενείς όγκους, καθώς και αντίστοιχες μακρινή μετάσταση. Για το σκοπό αυτό, 13 ασθενείς με αρχειακό ιστού τόσο από πρωτογενή ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα και μακρινή μετάσταση στο ήπαρ συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη έκφρασης και της πυρηνικής SOX2 αξιολογήθηκε σε επιθηλιακά κύτταρα. Δύο από τους 13 πρωτογενείς όγκους ήταν SOX2 θετικά, ενώ τα άλλα έντεκα όγκοι ήταν SOX2 αρνητικά. Είναι ενδιαφέρον, SOX2 θετική πρωτογενείς όγκους ήταν επίσης θετικές SOX2 σε αντίστοιχες ηπατικών μεταστάσεων, ενώ SOX2 αρνητική όγκοι είχαν SOX2 αρνητικά μετάσταση στο ήπαρ (Πίνακας 2). Αξιοσημείωτα, αυτά SOX2 θετική μετάστασης ήταν μορφολογικά περισσότερο όσο τα διαμερίσματα του όγκου που έχει SOX2 θετικών πυρήνων από το υπόλοιπο του πρωτογενούς όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

SOX2 ενισχύουν την έκφραση του FGFR1

Απορρύθμιση των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFRs) φαίνεται σε CRC, καθώς και σε άλλους καρκίνους [23], [24]. Δεδομένου ότι έχει προταθεί ότι SOX2 ρυθμίζουν την έκφραση της FGFR3 [7], θελήσαμε να μελετήσουμε αν SOX2 μετέβαλε την έκφραση των FGFRs στο

μας in vitro

σύστημα.

Μια γραμμή κυττάρων που υπερεκφράζουν SOX2 ιδρύθηκε από επιμόλυνση της κυτταρικής σειράς CRC Caco2 με SOX2 (Caco2-SOX2, Εικόνα S2). Η έκφραση του FGFR1-4 αναλύθηκε με RT-PCR σε κύτταρα Caco2 και τα κύτταρα Caco2-SOX2. έκφραση FGFR1 βρέθηκε να είναι διπλάσια σε Caco2-SOX2 όπως στο Caco2 (

σ

= 0,036), ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές όσον αφορά FGFR2, FGFR3 ή FGFR4 (Σχήμα 4).

Έκφραση FGFR1, FGFR2, FGFR3 και FGFR4 με ανάλυση RT-PCR σε κύτταρα Caco2 και τα κύτταρα Caco2 υπερεκφράζουν σταθερά SOX2 (Caco2-SOX2). Η έκφραση στα Caco2 ορίστηκε ως 1. *

σ

& lt? 0,05, ns:. Μη σημαντική

σ

-τιμή

Η

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε την έκφραση SOX2 στο CRC σε συσχετισμό με πολλές κλινικοπαθολογοανατομικών και μοριακών μεταβλητές και την επίδρασή της στην πρόγνωση των ασθενών. 11% των όγκων ήταν SOX2 θετικά, και η έκφραση συσχετίζεται με βαθμό του όγκου, το στάδιο TNM και

BRAF

μετάλλαξη. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκφραση SOX2 προβλέψει μια χειρότερη πρόγνωση των ασθενών σε ένα στάδιο εξαρτώμενο τρόπο, ιδίως στο

BRAF

μεταλλαχθεί περιπτώσεις. Τέλος, έχουμε εισαγάγει SOX2 όσο το δυνατόν ρυθμιστής της έκφρασης FGFR1.

Λόγω της υποστήριξε τη συμμετοχή της SOX2 στο CRC ογκογένεση [25] θέλαμε να μελετήσουμε την έκφραση SOX2 σε ασθενή CRUMS ομάδα μας. Βρήκαμε ότι το 11% των όγκων που εκφράζονται SOX2 και συγκρίνοντας την έκφραση σε διαφορετικούς κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά θα μπορούσαμε να δούμε ότι η έκφραση SOX2 συσχετίστηκε με χαμηλή διαφοροποίηση όγκων (υψηλής ποιότητας). Αυτό ταιριάζει με τη γνώση ότι SOX2 είναι ένας γνωστός δείκτης βλαστικών κυττάρων, και έχει προταθεί ότι εκφράζεται σε καρκινικά βλαστοκύτταρα [5], [26]. Όπως SOX2 συχνά εκφράζονται σε ένα περιορισμένο μέρος του όγκου, εμείς εικάζουν ότι τα κύτταρα αυτά θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν την θέση των κυττάρων του καρκίνου του στελέχους σε αυτούς τους συγκεκριμένους όγκους. Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση SOX2 συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση των ασθενών με τρόπο που εξαρτάται στάδιο, το οποίο είναι συνεπές με ορισμένες προηγούμενες μελέτες [6], [27], [28].

SOX2 έχει περιγραφεί από τους άλλους για να την ενίσχυση της μεταναστευτικής και επεμβατική δράση του CRC κυττάρων [6], [7], όπως πηγάδια και άλλων τύπων καρκινικών κυττάρων [29] – [31], πράγμα που σημαίνει ότι SOX2 κύτταρα που εκφράζουν μπορεί να φιλοξενούν μια υψηλότερη μεταστατική ικανότητα. Σε CRC έχει επίσης προταθεί ότι η έκφραση του SOX2 μπορεί να προβλέψει μετάσταση όγκου [6]. Ωστόσο, υπάρχουν μελέτες που υπάρχουν σήμερα έκφρασης SOX2 σε μεταστάσεις των όγκων. Εδώ έχουμε δείξει ότι αντιστοιχεί ηπατικές μεταστάσεις να SOX2 θετική πρωτογενών όγκων φιλοξενούν επίσης SOX2 θετικά καρκινικά κύτταρα. Αν και αυτά τα δείγματα ιστών ασθενών ήταν πολύ λίγοι, εξακολουθεί να δείχνει ότι SOX2 θετικά κύτταρα είναι πιο πιθανό να μεταναστεύσουν. Θα ήταν φυσικά να είναι τόσο ενδιαφέρουσα και αναγκαία για να μελετήσει αυτό το σε ένα μεγαλύτερο υλικού ασθενών για επαλήθευση. Το γεγονός ότι οι SOX2 θετικά κύτταρα μόνο έκανε ένα μικρό ποσοστό του όλου όγκου, υποδεικνύει ότι αυτά τα κύτταρα μπορεί να εμφανίσει μια πιο επεμβατική φαινότυπο από τα περιβάλλοντα κύτταρα του όγκου. Μια άλλη αποδεικτικά στοιχεία για μια πιο επεμβατική συμπεριφορά θετικών καρκινικών κυττάρων SOX2 είναι ότι οι μεταστάσεις ήταν μορφολογικά περισσότερο παρόμοια με τα τμήματα του όγκου με SOX2 θετικών πυρήνων. Ακόμη και αν η μορφολογική σύγκριση μεταξύ πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων θα μπορούσε να μελετηθεί μόνο σε δύο περιπτώσεις, θεωρούμε πιθανό ότι μπορεί να αντανακλούν συγκεκριμένες κύτταρα που πράγματι να απομακρυσμένες μεταστάσεις.

έκφραση SOX2 συσχετίστηκε με

BRAF

μετάλλαξη στην ομάδα των ιστών μας, αλλά κανένας συσχετισμός θα μπορούσε να θεωρηθεί μεταξύ της έκφρασης SOX2 και

KRAS

μεταλλάξεις. Μας

in vitro

εύρεση ότι μια αυξημένη έκφραση SOX2 παρατηρήθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν BRAF

V600E μετάλλαξη αλλά δεν KRAS

G12V μετάλλαξη, επιβεβαιώνει τη συσχέτιση αυτή. Ο καταρράκτης /RAF /ΜΑΡ κινάσης RAS είναι ένα μονοπάτι που εμπλέκεται σε πολλές σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες όπως την κυτταρική ανάπτυξη, διαίρεση και διαφοροποίηση [32], και περιλαμβάνονται πρωτεΐνες του είναι συχνά μεταλλάσσεται στο CRC. Όλων των ΚΕΣ 30-40% έχουν μεταλλαχθεί στο

KRAS

γονιδίων και 5-15% στο

BRAF

γονίδιο [21], [33]. Αυτές οι δύο μεταλλάξεις που πιστεύεται ότι είναι αμοιβαία αποκλειόμενες σε CRC [21], [34], και είναι και οι δύο συνδέονται με την κακή πρόγνωση των ασθενών [21], [35] – [37]. Παρόλο που εμπλέκονται στην ίδια οδό, μπορούμε να δούμε ότι

KRAS

και

BRAF

μεταλλαγμένα CRCs έχουν διαφορετικά μορφολογικά εμφανίσεις. Είναι ενδιαφέρον να προβούμε σε εικασίες ότι η σύνδεση των

BRAF

μετάλλαξη με την έκφραση SOX2 θα μπορούσε να εξηγήσει μέρος αυτής της μορφολογική διαφορά. Συνεχίσαμε να αναλύσουμε τη συσχέτιση των BRAF και της έκφρασης SOX2 σε μας

in vitro

σύστημα καλλιέργειας κυττάρων. Πράγματι, η έκφραση SOX2 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε κύτταρα που εκφράζουν το ουσιαστικά δραστική BRAF

V600E. Επιπλέον, αναστέλλοντας BRAF κατάντη σηματοδότησης, ενδογενή SOX2 καθώς και έκφραση SOX2 επάγεται από BRAF

V600E μειώθηκε, αποδεικνύοντας ότι η έκφραση SOX2 τουλάχιστον εν μέρει ρυθμίζεται από την καλά χαρακτηρισμένη BRAF /MEK οδό. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει ότι η έκφραση SOX2 ρυθμίζεται από BRAF σηματοδότησης. Ένα άλλο ενδιαφέρον εύρημα ήταν ότι η αρνητική προγνωστική επίδραση της έκφρασης SOX2 περιορίστηκε σε

BRAF

μεταλλαγμένα ασθενείς, πράγμα που δείχνει ότι είναι η έκφραση SOX2 σε συνδυασμό με

BRAF

μετάλλαξη που συμβάλλει κυρίως στην κακή πρόγνωση .

είναι γνωστό ότι ανώμαλη έκφραση των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFRs) μπορεί να κατευθύνει την εξέλιξη του όγκου [23], [24]. Η οικογένεια FGFR αποτελείται από τέσσερα γονίδια, και έχει αποδειχθεί ότι τουλάχιστον η

FGFR3

γονιδίου ρυθμίζεται από SOX2 σε CRC [7]. κυτταρική σειρά μας που υπερεκφράζουν SOX2, Caco2-SOX2, είχαν διπλάσια έκφραση FGFR1 ως κύτταρα Caco2, πράγμα που σημαίνει ότι η έκφραση FGFR1 μπορεί να ρυθμίζεται από SOX2. Άλλοι έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση του FGFR1 βρίσκεται στο CRC [38] και ότι συσχετίζεται με μετάσταση στο ήπαρ [39]. Μια πρόσφατη μελέτη έχει επίσης προτείνει ότι η αυξημένη έκφραση τόσο SOX2 και FGFR1 συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [40]. Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι SOX2 εν μέρει μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του FGFR1 θα μπορούσε να ενισχύσει μακρινό εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων στο ήπαρ, προκαλώντας έτσι μια φτωχότερη επιβίωση των ασθενών. Ωστόσο, απαιτούνται πρόσθετες μελέτες για να αποκαλύψει το ρόλο και το μηχανισμό της SOX2 και FGFR1 στο CRC.

Εν κατακλείδι, αυτή η μελέτη δείχνει ότι η έκφραση SOX2 συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με CRC και προσδιορίζει για πρώτη φορά ότι η έκφραση SOX2 εν μέρει ρυθμίζεται από BRAF. Τα ευρήματα αυτά, σε συνδυασμό με την παρατηρούμενη συσχέτιση μεταξύ SOX2 θετικότητα τόσο πρωτοπαθή όγκο και αντίστοιχη μετάσταση, δείχνουν ότι SOX2 θετικών καρκινικών κυττάρων έχουν μια ενισχυμένη ικανότητα να κάνουν μετάσταση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. .

Επιτυχής επιμόλυνση των ρΜΟΕΡ-BRAF

V600E ή pcDNA3-KRAS

G12V σε Caco2 καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή

doi: 10.1371 /journal.pone.0101957.s001

(PDF)

Εικόνα S2. κύτταρα

Caco2-SOX2 έχουν αυξημένη έκφραση SOX2 τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101957.s002

(PDF)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω την κ Kerstin Naslund, Τμήμα Ιατρικής Βιοεπιστημών, Παθολογίας, Πανεπιστήμιο της Umea, για επιδέξιος τεχνική βοήθεια της και την Άννα Dahlin για τη διεξαγωγή της κατάστασης CIMP αναλύσεις.