Abstract

Η υποξία είναι γνωστό ότι παίζουν κρίσιμους ρόλους στην κυτταρική επιβίωση, αγγειογένεση, εισβολή όγκου και μετάσταση. Η υποξία μεσολάβηση υπερέκφραση της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα (HIF) έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται με θεραπευτικές αντίσταση, και συμβάλλει στην κακή πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο. Αναδυόμενες αποδείξεις δείχνουν ότι η υποξία και HIF μονοπάτια συμβάλλει στην απόκτηση των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT), τη συντήρηση των λειτουργιών του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων (CSC), και επίσης διατηρεί το φαύλο κύκλο της φλεγμονής-όλα που οδηγούν σε θεραπευτική αντίσταση. Ωστόσο, ο ακριβής μοριακός μηχανισμός (ες) με την οποία η υποξία /HIF κινεί αυτά τα γεγονότα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Εδώ, δείχνουμε για πρώτη φορά, ότι η υποξία οδηγεί σε αυξημένη έκφραση του VEGF, IL-6, και CSC γονίδια υπογραφή Nanog, Oct4 και ΕΖΗ2 συνεπής με αυξημένη κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή και την αγγειογένεση, και ο σχηματισμός pancreatospheres, ταυτόχρονα με αυξημένη έκφραση του miR-21 και miR-210 σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος (PC). Η θεραπεία των PC κυττάρων με CDF, μία νέα συνθετική ένωση ανέστειλε την παραγωγή του VEGF και IL-6, και τα κάτω ρυθμισμένα την έκφραση του Nanog, Oct4, ΕΖΗ2 mRNAs, καθώς και miR-21 και miR-210 κάτω από την υποξία. CDF οδήγησε επίσης σε μειωμένη κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή, την αγγειογένεση και το σχηματισμό των pancreatospheres υπό υποξία. Επιπλέον, CDF μειωμένη γονιδιακή έκφραση του miR-21, miR-210, IL-6, ο HIF-1α, VEGF, και CSC υπογραφές

in vivo

σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού ανθρώπινο PC. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η αντικαρκινική δραστικότητα του CDF είναι εν μέρει προκαλούνται μέσω απελευθέρωσης του όγκου υποξικής οδών, και έτσι CDF μπορούσε να γίνει μια νέα και αποτελεσματικός παράγοντας κατά του όγκου για θεραπεία PC

Citation.: Bao Β, Ali S, Ahmad A, Azmi AS, Li Υ, Banerjee S, et al. (2012) που προκαλείται από υποξία επιθετικότητα των καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος οφείλεται στην αυξημένη έκφραση του VEGF, IL-6 και miR-21, το οποίο μπορεί να ελαττωθεί με CDF θεραπεία. PLoS ONE 7 (12): e50165. doi: 10.1371 /journal.pone.0050165

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Αυγ 2012? Αποδεκτές: 22η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13, Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Bao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί R01CA131151, R01CA132794 και R01CA154321 απονέμεται σε FHS, και το Υπουργείο άμυνας Εξερεύνηση-Υπόθεση Ανάπτυξης Βραβείο PC101482 απονέμεται σε Bin Bao. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Συν-συγγραφέας Δρ Sarkar είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PC) είναι μία από τις πιο θανατηφόρες κακοήθη νοσήματα με τις φτωχότερες κλινική έκβαση στον κόσμο. Το 2012, έχει υπολογιστεί ότι το 43, 920 άτομα θα διαγνωστούν πρόσφατα με τον υπολογιστή, και θα αντιπροσωπεύουν το 37, 390 σχετίζονται με τον καρκίνο θανάτου στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Λόγω της απουσίας συγκεκριμένων συμπτωμάτων, η έλλειψη τεχνικών έγκαιρης ανίχνευσης και άκρως επιθετική φαινοτύπων, PC συνήθως διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο-ανίατη και μεταστατικά στάδια [2], [3]. Έτσι, η διάμεση συνολική επιβίωση είναι περίπου έξι μήνες μετά την χειρουργική και χημειο-ακτινοβολία θεραπείες για τοπικά προχωρημένη και μεταστατική στάδια PC. Κατά συνέπεια, το ποσοστό συνολικής πενταετούς επιβίωσης είναι μικρότερη από πέντε τοις εκατό. Ένα τέτοιο μικρότερο ποσοστό επιβίωσης οφείλεται κυρίως στην καθυστερημένη διάγνωση και τη θεραπευτική αντίσταση, συμβάλλοντας στην επανεμφάνιση του όγκου και της μετάστασης.

Η υποξία είναι ένα από τα θεμελιώδη βιολογικά φαινόμενα που συνδέονται στενά με την ανάπτυξη και την επιθετικότητα μιας ευρείας ποικιλίας συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων PC. Υποξία επαγόμενου παράγοντες (HIF) είναι ένας κεντρικός παράγοντας μεταγραφής που μεσολαβεί υποξία γονιδίων που αποκρίνονται και έχουν γίνει ευρέως αποδεκτά για να παίξει κρίσιμο ρόλο στην εισβολή όγκου, μετάσταση, και την αντίσταση θεραπεία, λόγω της αυξημένης κυτταρικό πολλαπλασιασμό, επιβίωση, αγγειογένεση και τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή [4], [5]. Ως εκ τούτου, η υποξία όγκου με αλλαγμένη έκφραση του HIF και βιολογικών αποτέλεσμα επίδραση στις φτωχότερες κλινική έκβαση των ασθενών που διαγιγνώσκονται με συμπαγείς όγκους, με αποτέλεσμα την υψηλότερη θνησιμότητα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η κατανόηση της μοριακής σχέσης της υποξίας με άλλες μοριακό και κυτταρικό χαρακτηριστικά της επιθετικότητας του όγκου, θα είναι πολύτιμη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την θεραπεία της ανάπτυξης στερεού όγκου και της εξέλιξης. Έχει γίνει ευρέως αποδεκτό ότι καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) και επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) κύτταρα φαινοτυπική είναι ιδιαίτερα σχετίζεται με θεραπευτικές αντοχή και συμβάλλει στην επιθετική ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, και μετάσταση, και είναι κοινώς θεωρείται ότι είναι ένας από οι κύριες αιτίες της επανεμφάνισης του όγκου και υποτροπή [6]. Τα δεδομένα από την αύξηση του αριθμού των μελετών δείχνουν ότι η υποξία και HIF σηματοδότηση μονοπατιού οδηγούν σε εμπλουτισμό των ΚΕΠ και των κυττάρων EMT όπως αναθεωρήθηκε πρόσφατα [7], συμβάλλοντας στην όγκου επιθετική φαινοτύπων, που θα μπορούσε επίσης να οφείλεται στην απελευθέρωση των microRNAs (miRNAs).

Τα miRNAs είναι καλά αναγνωρισμένη να παίξει καθοριστικό ρόλο σε ένα ευρύ φάσμα των βιολογικών διεργασιών, όπως η διαφοροποίηση των κυττάρων, του πολλαπλασιασμού, θάνατος, επιβίωση, τον μεταβολισμό και την ομοιόσταση ενέργειας [8], [9]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι miRNAs θα μπορούσε να έχει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την πρόοδο της κακοήθους disaeses. Οι εναλλαγές της έκφρασης των miRNAs έχουν φέρεται να σχετίζεται με την κλινική έκβαση των ασθενών όγκου, αντίσταση θεραπεία, επανεμφάνιση του όγκου και /ή υποτροπής. Ένας μεγάλος αριθμός των miRNAs έχουν αναφερθεί να ανταποκρίνεται στην υποξία και HIF μονοπατιού σηματοδότησης σε μία ευρεία ποικιλία κυττάρων και ιστών, συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων [10] – [13]. Έχει βρεθεί ότι η υποξία μείωσε την έκφραση του miR-101, ένα δυνητικό αντι-ογκογόνο μόριο, και αυξημένη έκφραση του miR-21 και miR-210, προ-ογκογόνο μορίων σε αρκετούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του PC [14], [15]. Έτσι, υποξία μεσολάβηση ρύθμιση των miRNAs μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στον όγκο επιθετική φαινοτύπους διαμεσολαβείται μέσω της διαφοροποίησης των οδών κυτταρικής σηματοδότησης περιλαμβανομένων HIF μονοπατιού σηματοδότησης σε ένα μικροπεριβάλλον του όγκου. Ως εκ τούτου, στόχευση αυτών υποξία μεσολάβηση miRNAs μπορεί να παρέχει μία νέα και αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για την πρόληψη ή /και τη θεραπεία των συμπαγών όγκων συμπεριλαμβανομένου του PC.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την επίδραση της υποξίας στην κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και την αγγειογένεση, και την έκφραση του VEGF, IL-6, CSC γονίδια υπογραφή, miR-21 και miR-210 σε κύτταρα PC κάτω από υποξικές συνθήκες. Διερευνήσαμε επίσης τον ρόλο του miR-21 στη ρύθμιση του VEGF, IL-6, του σχηματισμού pancreatospheres, και τα γονίδια υπογραφή CSC σε κύτταρα PC. Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση ενός νέου συνθετικού παραγώγου της κουρκουμίνης (CDF) στην επιβίωση των κυττάρων, η μετανάστευση, εισβολή, την αγγειογένεση, σχηματισμός pancreatospheres, και την έκφραση του HIF-1α, VEGF, IL-6, CSC γονίδια υπογραφή, και miRNAs σε κύτταρα PC κάτω από υποξικές συνθήκες. Τέλος, εξετάσαμε την επίδραση της CDF για miR-21, miR-210, HIF-1α, VEGF, και CSC δείκτες υπογραφής

in vivo

.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Ένα μυθιστόρημα κουρκουμίνη που προέρχονται από την αναλογική CDF συντέθηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη δημοσίευσή μας [16]. Αντισώματα έναντι CD44, EpCAM, και HIF-1α ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι Ki-67 και VEGF αγοράστηκαν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Αντίσωμα έναντι ΕΖΗ2 ελήφθη από BD Biosciences (San Jose, California). Ελήφθησαν Alexa Fluor-488 κατσίκας αντι-ποντικού IgG για CD44 και EpCAM χρώσης από την Invitrogen. Η αντίστροφη μεταγραφή miRNA (RT) εκκινητές, ανιχνευτές PCR, και αντι-miR-21 αναστολέας ελήφθησαν από την Applied Biosystems (Carlsbad, CA). βιολετί κρύσταλλο και διάλυμα Matrigel ελήφθησαν από τη Sigma Chemicals (St. Louis, ΜΟ).

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνο (PC) κυτταρικές σειρές AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα διατηρήθηκαν σε η τυπική καλλιέργεια ή ορθοξικές συνθήκες (21% Ο2 και 5% CO2, 37 ° C), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Υποξική (1% O

2) και 5% CO

2 συνθήκες παρήχθησαν με τον έλεγχο των ρυθμών ροής εισόδου του αζώτου και διοξείδιο του άνθρακα, αντίστοιχα. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε 10% FBS μέσου-DMEM σε μια τυπική κατάσταση κυτταρικής καλλιέργειας. Όλες οι κυτταρικές σειρές έχουν επικυρωθεί από την Applied Genomics Technology Center στο Wayne State University στις 13 Μαρτίου 2009 και αυτές επικυρώνονται κύτταρα καταψύχονται για μετέπειτα χρήση. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για τις δοκιμές ήταν σύντομη διαδοχική επανάληψη προφίλ χρησιμοποιώντας το Σύστημα PowerPlex 16 από την Promega. Η γεμσιταβίνη

Η επιβίωση των κυττάρων δοκιμασία

ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη για να διερευνηθεί η επίδραση της CDF στην επιβίωση κυττάρου σε ανθρώπινα κύτταρα PC (AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα) κάτω από συνθήκες υποξίας. 3000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 96-φρεατίων και επωάστηκαν σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας (21% O

2 και 5% CO

2) όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές συγκεντρώσεις του CDF (0-0,5 μΜ) και επωάστηκαν για 8 ώρες κάτω από υποξικές συνθήκες (1% O

2) που ακολουθείται από 16 ώρες από ορθοξικές συνθήκες (21% O

2) κάθε ημέρα. Μετά από 3 ημέρες θεραπείας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για την πρότυπη δοκιμασία ΜΤΤ, όπως περιγράφεται σε προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [18], [19].

Κλωνογόνος

δοκιμασία

κλωνογονική δοκιμασία διεξήχθη για να εξετάσει η επίδραση του CDF στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC κάτω από υποξικές συνθήκες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. 5 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα 6-φρεατίων. Μετά από 3 ημέρες έκθεσης σε 0,5 μΜ CDF (8 ώρες συνθήκες υποξίας και 16 ώρες από ορθοξικές συνθήκες κάθε μέρα), τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και 1.000 μονά βιώσιμα κύτταρα σπάρθηκαν σε 100-mm τρυβλία Petri. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 10 έως 12 ημέρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2/5% O

2/90% N

2 θερμοκοιτίδα. Οι αποικίες βάφτηκαν με 2% κρυσταλλικό ιώδες, πλύθηκε με νερό, και μετρήθηκαν.

Εισβολή δοκιμασία

Ο

in vitro δοκιμασία

εισβολή των κυττάρων PC διεξήχθη υπό υποξικές συνθήκες με χρησιμοποιώντας Costar Transwell 24 φρεατίων πλάκες με πολυανθρακικό μεμβράνη (Corning Incorporated, Coming, ΝΥ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, 4 × 10

4 ανθρωπίνων κυττάρων PC (AsPC-1 και MiaPaCa-2) που εκτίθεται σε 3 ημέρες επώασης υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες, αντίστοιχα, σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο των προ-επικαλυμμένες πλάκες Transwell Matrigel σε FBS-free μέσα καλλιέργειας. Οι κάτω φρεάτια του συστήματος γέμισαν με 10% FBS πλήρες μέσο. Μετά από 20 ώρες επώασης είτε με την απουσία ή παρουσία του CDF (0,5 μΜ), τα εισέβαλαν καρκινικά κύτταρα βάφτηκαν με 4 μg /mL καλσεΐνης-ΑΜ (Invitrogen) σε διάλυμα PBS στους 37 ° C για 1 ώρα, μετά την κατασκευαστή εγχειρίδιο. ελήφθησαν οι φωτογραφίες χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon ECLIPSE TE2000-U) που συνδέεται με έναν υπολογιστή.

Ναρκωτικά επούλωσης της πληγής δοκιμασία

Για να εξεταστεί η επίδραση της CDF στην κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων PC κάτω από συνθήκες υποξίας , πραγματοποιήσαμε τραύματος δοκιμασία επούλωσης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, όταν τα κύτταρα AsPC-1 έφθασε το 90-95% συρρέοντα, το τραύμα που δημιουργείται από το ξύσιμο της επιφάνειας των πλακών με ένα 10-200 μι ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε απουσία και παρουσία του CDF (0,5 μΜ) και επωάστηκαν υπό συνθήκες υποξίας για 4 ώρες, που ακολουθείται από 16 ώρες από ορθοξικές συνθήκες, και έπειτα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Nikon Eclipse TS100.

σχηματίζοντας σωλήνα προσδιορισμού

για να εξεταστεί το αποτέλεσμα επί της αγγειογένεσης CDF

in vitro

χρησιμοποιώντας αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας, πραγματοποιήσαμε δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, 3 χ 10

4 κουνέλι αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο της Matrigel-προ-επικαλυμμένες 96-βοθρίων πλάκα σε 100 μι 10% μέσου FBS-DMEM, και εκτέθηκαν σε νορμοξικές ή υποξικές συνθήκες επί 4 h επώασης στους 37 ° C, που ακολουθείται από 16 ώρες από ορθοξικές συνθήκες. Η φωτογραφία τραβήχτηκε στις 4 ώρες και 20 ώρες, αντίστοιχα.

κυτοκίνες VEGF και IL-6

δοκιμασία δοκιμασία

ELISA διεξήχθη για να εκτιμηθεί η επίδραση της CDF στην υποξία που προκαλείται από παραγωγές κυτοκίνης του VEGF και IL-6 από ανθρώπινα κύτταρα PC. Το μέσο καλλιέργειας από τα κύτταρα υπό υποξικές ή ορθοξικές συνθήκες, αντίστοιχα, για 16 ώρες συλλέχθηκαν για τη μέτρηση του VEGF και IL-6 με τη χρήση κιτ προσδιορισμού ELISA (R &? D Systems)., Ακολουθώντας το εγχειρίδιο του κατασκευαστή

σφαίρα δοκιμασία σχηματισμού

Η δοκιμασία σχηματισμού σφαίρα διεξήχθη για να εκτιμηθεί η επίδραση της CDF στην ικανότητα αυτο-ανανέωσης CSC των PC κυττάρων υπό συνθήκες υποξίας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Εν συντομία, 1000 κύτταρα /φρεάτιο εναιωρήματα μονών κυττάρων σπάρθηκαν σε φρεάτια υπερχαμηλής προσκολλημένα των πλακών 6-φρεατίων (Corning, Lowell, ΜΑ) σε μέσο σχηματισμού σφαίρα (1:01 DMEM /F-12 μέσο συμπληρωμένο με Β-27 και Ν-2? Invitrogen), και εκτέθηκαν σε συνθήκες υποξίας κάθε δεύτερη μέρα. Μετά από 7 ημέρες, οι σφαίρες με διάμετρο μεγαλύτερη από 50 μmeters ονομαστεί ως «pancreatospheres» συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (300 χ g για 5 λεπτά) και μετρήθηκαν.

Η ανοσοχρώση δοκιμασίας και συνεστιακή μικροσκοπία

10.000 του απλού κυττάρου εναιωρήματα PC κύτταρα ανά φρεάτιο σπάρθηκαν και επωάστηκαν για 24 ώρες με τη χρήση εξαιρετικά χαμηλών φρεάτια προσκολλημένα του πλακιδίου 6 φρεάτων (Corning, Lowell, ΜΑ) σε μέσο σχηματισμού σφαίρα ακολούθησε καλλιέργεια υπό συνθήκες υποξίας κάθε δεύτερη ημέρα, ως περιγράφεται παραπάνω. Μετά από 7 ημέρες θεραπείας CDF, οι pancreatospheres συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (300 χ g για 5 λεπτά), πλένουμε με 1 χ PBS, και μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεϋδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα μονοκλωνικά CD44 και EpCAM αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοχρώση δοκιμασία, ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [21]. Οι CD44 ή EpCAM-επισημασμένο pancreatospheres φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο απεικόνισης (Leica TCS SP5) με 200 × μεγέθυνση στην MIRL πυρήνα εγκατάσταση, Wayne State University School of Medicine.

Η επιμόλυνση των αντι-miR-21 siRNA

2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο (γονικά κύτταρα MiaPaCa-2) ή 10000 κύτταρα (κύτταρα MiaPaCa-2 σφαίρα) ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν με αντι miR-21-siRNA ή αρνητικό siRNA μάρτυρα (Ambion, Austin, ΤΧ) σε μια τελική συγκέντρωση 20 ηΜ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο διαμόλυνσης DharmaFECT (Dharmacon), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

σε πραγματικό χρόνο αντίστροφης transcriptase- αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) των mRNA και miRNAs

για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων mRNA, δύο μικρογραμμάρια των συνολικών RNAs που εξάγονται από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για αντίδραση RT σε 20 μΐ όγκο αντίδρασης χρησιμοποιώντας ένα σύστημα αντίστροφης μεταγραφής (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. SYBR Green Δοκιμασία PCR kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για πραγματικού χρόνου PCR αντίδραση, χρησιμοποιώντας ΑΒ StepOnePlus PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ακολουθίες εκκινητές PCR που περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση C

t μέθοδος και ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση GAPDH σε κάθε δείγμα. Για να προσδιοριστεί η έκφραση των miRNAs στα κύτταρα, το κιτ TaqMan microRNA Δοκιμασία (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πέντε ng ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα όπως περιγράφηκε νωρίτερα [19]. Real-time PCR αντιδράσεις στη συνέχεια πραγματοποιούνται σε ένα συνολικό όγκο των 10 μι μίγματος της αντίδρασης χρησιμοποιώντας διάλυμα TaqMan PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση C

t μέθοδο και ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση RNU48 σε κάθε δείγμα.

Τα πειράματα σε ζώα

Το πρωτόκολλο του πειράματος σε ζώα εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Διερεύνηση, Wayne State Πανεπιστήμιο, Detroit, MI. Θηλυκά CB17 σοβαρή συνδυασμένη ανοσολογική ανεπάρκεια (SCID) ποντικούς στην ηλικία των 4 εβδομάδων αγοράστηκαν από την Taconic Farms (Germantown, ΝΥ) και τράφηκαν Lab δίαιτα 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, ΙΝ). 10 × 10

6 κύτταρα MiaPaCa-2 ορθοτοπικά εμφυτεύθηκαν σε πάγκρεας των ποντικών, όπως περιγράφεται στην παλαιότερη δημοσίευση μας [17], και έτσι τα δεδομένα αντικαρκινική δραστικότητα δεν παρουσιάζεται εδώ. Μόλις τα ποντίκια ανέπτυξαν ψηλαφητούς όγκους, τα ζώα διαιρέθηκαν τυχαία σε δύο ομάδες: (1) χωρίς θεραπεία ελέγχου? (2) CDF (5 mg /ποντίκι /ημέρα), ενδογαστρική μία φορά την ημέρα για 12 ημέρες. Οι μετρήσεις του όγκου και αλλαγές στο βάρος διεξήχθησαν. Ο ιστός του όγκου από όλες τις ομάδες των ζώων αφαιρέθηκαν, καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκαν στους -80 ° C για μεταγενέστερη χρήση για RNA και ιστολογία μελέτης παρουσιάζονται σε αυτό το χειρόγραφο.

Καθιέρωση MiaPaC-2 όγκων κύτταρα σφαίρα

για να εξεταστεί η επίδραση της CDF ή αντι-miR-21 σε VEGF, IL-6, CSC υπογραφές σε CSC-όπως υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων, αναπτύξαμε MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου στο ποντίκι μοντέλο ξενομοσχεύματος, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, περίπου 5.000 pancreatospheres κυττάρων MiaPaCa-2 εμφυτεύτηκαν στο μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού (ηλικίας 4 εβδομάδων) για τον εμπλουτισμό του πληθυσμού των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου (CSC). Ο όγκος απομακρύνθηκε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο μέσο σχηματισμού σφαίρας, όπως περιγράφεται παραπάνω, για την ανάπτυξη των δευτερογενών pancreatospheres, η οποία αναφέρεται ως «κύτταρα MiaPaCa-2 σφαίρα όγκου». MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου χαρακτηρίζεται επίσης από το προηγούμενες δημοσιεύσεις μας [17], [22].

Ανοσοϊστοχημεία

σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και τα τμήματα του ιστού του όγκου εγκλεισμένα σε παραφίνη αξιολογήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία σε ο πυρήνας εγκατάσταση του Τμήματος Παθολογίας, Karmanos Cancer Institute, Detroit, ΜΙ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, 5-15 μm τομές πάχους του ιστού κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε επικαλυμμένες με ζελατίνη ιστολογικά σλάιντ. Deparaffinizations των slides διεξήχθησαν με τη χρήση διαλύματος ξυλόλιο, που ακολουθείται από έκπλυση με διαφορετικές συγκεντρώσεις αλκοόλης και απιονισμένο νερό. Ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Ki-67 (1:400), HIF-1α (1:100), VEGF (1:100), EpCAM (1:50), και ΕΖΗ2 (1:50) πρωτογενή αντισώματα με κατάλληλες αραιώσεις και χρησιμοποιώντας φυσιολογικό ορό ξενιστή για αρνητικούς ελέγχους ακολουθούμενη από χρώση με κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας, ακολουθώντας τις οδηγίες των κατασκευαστών. Οι πλάκες αναπτύχθηκαν σε ένα διάλυμα διαμινοβενζιδίνης και αντίθετα με ένα ασθενές διάλυμα αιματοξυλίνης χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου ABC (Vector Labs), που ακολουθείται από πυρηνική χρώση χρησιμοποιώντας κιτ AEC χρώσης (Vector Labs). Οι βάφονται διαφάνειες ήταν αφυδατωμένο και τοποθετούνται σε διάλυμα Permount και εξετάζονται από έναν εξουσιοδοτημένο παθολόγο. Οι φωτογραφίες πάρθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon ESLIPSE E800 με 20 × μεγέθυνση. Η ανοσοϊστοχημική χρώση έλαβε μια συνολική βαθμολογία με βάση την ένταση της χρώσης (χωρίς χρώση ως μηδέν? Αδύναμο και 1+? Μέτρια ως 2+? Ισχυρή όσο 3+) προστίθεται μαζί με τα επί τοις εκατό θετικά κύτταρα (καμία χρώση ως μηδέν? 25% ως 1+?. 25-50% ως 2+ και μεγαλύτερη από 50% ως 3+)

Η στατιστική ανάλυση

Η μέση τιμή και τυπική απόκλιση (SD) των δεδομένων σε αυτή τη μελέτη παρασκευάσθηκαν με τη χρήση λογισμικού GraPad Prism (έκδοση 4.03). Συγκρίσεις των αποτελεσμάτων της θεραπείας ελέγχθηκαν για σημαντική διαφορά από την αντιστοιχισμένη

t

δοκιμή ή την ανάλυση ANOVA. Η στατιστική σημαντικότητα θεωρείται σε

σ

τιμή μικρότερη του 0,05.

Αποτελέσματα

CDF αυξημένη επιβίωση των κυττάρων και ικανότητας κλωνισμού των κυττάρων PC κάτω από συνθήκες υποξίας

προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της CDF στην επιβίωση των κυττάρων σε ανθρώπινα κύτταρα PC κάτω από υποξικές συνθήκες, ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ανθρώπινα κύτταρα PC (AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το CDF αξιοσημείωτα ανέστειλε κύτταρο επιβίωση των κυττάρων AsPC-1 και MiaPaCa-2 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1Α). Κλωνογονική δοκιμασία διεξήχθη για να εξετάσει την επίδραση του CDF (0,5 μmol /L) στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC κάτω από συνθήκες υποξίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία CDF μειώθηκε κλωνογονικότητας κυττάρων MiaPaCa-2 AsPC-1 και υπό υποξικές συνθήκες (Εικόνα 1Β). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι CDF αναστέλλει την κυτταρική επιβίωση και κλωνογόνο αύξηση των κυττάρων PC κάτω από συνθήκες υποξίας.

Το πάνελ Α, Β, C, και D αντιπροσωπεύουν την ανάπτυξη των κυττάρων, κλωνογονικότητας, VEGF, και IL-6, αντίστοιχα. Τα ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν από κύτταρα που αναπτύσσονται κάτω από νορμοξικές και υποξικές συνθήκες, όπως περιγράφεται στην ενότητα μεθόδων. Οι μετρήσεις του VEGF και IL-6 διεξήχθησαν με ELISA. Οι μπάρες στα διαγράμματα δείχνουν την τυπική απόκλιση (SD) τουλάχιστον n = 3. * υποδηλώνει p & lt?. 0.05

Η

Επίδραση του ΚΔΔ για τις παραγωγές του VEGF και IL-6 κυτοκινών στα κύτταρα PC κάτω υποξικές συνθήκες

επίσης εξετάσαμε την επίδραση της CDF επί υποξία προκαλούμενη VEGF και IL-6 από τα κύτταρα παραγωγές Υ χρησιμοποιώντας δοκιμασία ELISA. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα AsPC-1 και MiaPaCa-2 επωάστηκε σε συνθήκες υποξίας αύξησε τις παραγωγές του VEGF και IL-6, σε σύγκριση με τα κύτταρα επωάζονται στους ορθοξικές συνθήκες (Σχήμα 1 C). θεραπεία CDF μειωθεί αξιοσημείωτα την παραγωγή της υποξίας που επάγεται VEGF και IL-6 σε κύτταρα PC (Σχήμα 1 C), γεγονός που υποδηλώνει ένα ανασταλτικό ρόλο του CDF στις παραγωγές του που προκαλείται από υποξία VEGF και IL-6 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος.

επίδραση του ΚΔΔ την αγγειογένεση

in vitro

σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας

για να εξεταστεί η επίδραση του ΚΔΔ επί της αγγειογένεσης

in vitro

κάτω από συνθήκες υποξίας , πραγματοποιήσαμε δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα χρησιμοποιώντας αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι υποξικές συνθήκες αυξήθηκε σημαντικά το σχηματισμό σωλήνα των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων σε 4 ώρες και 20 ώρες επωάσεων, αντίστοιχα, σε σύγκριση με νορμοξικές συνθήκες (p = 0,0016 και ρ = 0,016, αντίστοιχα? Η = 3). θεραπεία CDF ανέστειλε σημαντικά την υποξία προκαλούμενη σχηματισμό αυλών των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων (ρ = 0.004? η = 3) (Σχήμα 2Α). Για να εκτιμηθεί κατά πόσον ή όχι CDF μεσολάβηση των μορίων ή η ίδια CDF συμβάλλει στην αναστολή του σχηματισμού σωλήνα, συλλέξαμε μη-CDF-αγωγή (έλεγχος) και CDF έλαβαν ρυθμισμένα μέσα από τα καρκινικά κύτταρα και να διεξαχθεί η δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα κάτω ορθοξικές συνθήκες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα επωάστηκαν με συνθήκη ελέγχου των μέσων ενημέρωσης είχαν αυξημένο σχηματισμό σωλήνα στους 4 ώρες και 20 ώρες, σε σύγκριση με τα κύτταρα που επωάστηκαν με CDF-προεπεξεργασμένα ρυθμισμένα μέσα (p = 0,029 και ρ = 0,011? N = 3). Η προσθήκη του CDF στον έλεγχο ρυθμισμένα μέσα ανέστειλε σημαντικά το σχηματισμό σωλήνα, σε σύγκριση με τα κύτταρα που επωάστηκαν σε αμφότερες τις ελέγχου προσαρμοσμένο μέσο και CDF-προ-επεξεργασμένο ρυθμισμένα μέσα (p = 0,0001? N = 3) (Σχήμα 2Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ίδια CDF συμβάλλει στην αναστολή του σχηματισμού σωλήνα των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων

Το πάνελ Α & amp?. Β, C & amp? D, και Ε παριστούν αγγειογένεση, μετανάστευση κυττάρων, και εισβολή, αντίστοιχα. Όπως περιγράφεται στο τμήμα των Μεθόδων, η αγγειογένεση

in vitro

αξιολογήθηκε με την δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα με χρήση ενδοθηλιακά κύτταρα? κυτταρική μετανάστευση αξιολογήθηκε με τραύματος δοκιμασία επούλωσης? εισβολή αξιολογήθηκε με δοκιμασία εισβολή θάλαμο.

Η

Επίδραση του CDF για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή in vitro σε κύτταρα PC κάτω από συνθήκες υποξίας

Το τραύμα δοκιμασία επούλωσης διεξήχθη για να εξετάσει την επίδραση της CDF στην κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων PC κάτω από υποξικές συνθήκες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Γ, τα υποξίας-εκτεθειμένων κυττάρων AsPC-1 είχε αυξηθεί το τραύμα ικανότητα επούλωσης, σε σύγκριση με τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (ρ = 0,0001? N = 3) (Σχήμα 2C). θεραπεία CDF ανέστειλε την ικανότητα επούλωσης πληγών στα καρκινικά κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας (ρ & lt? 0,05? η = 3) (Σχήμα 2C και D). Για να εξεταστεί η επίδραση του CDF επί της εισβολής των κυττάρων PC κάτω από υποξικές συνθήκες, πραγματοποιήσαμε

in vitro δοκιμασία

εισβολή. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, τόσο AsPC-1 και τα κύτταρα MiaPaCa-2 εκτέθηκαν σε συνθήκες υποξίας είχε αυξηθεί η ικανότητα της εισβολής, σε σύγκριση με εκείνα τα κύτταρα που εκτίθενται σε νορμοξικές συνθήκες. θεραπεία CDF ανέστειλε την ικανότητα της υποξίας που επάγεται εισβολή των κυττάρων PC. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η CDF μπορεί να αναστείλει την υποξία που προκαλείται από τη μετανάστευση κυττάρων και εισβολή ανθρώπινων κυττάρων PC.

Επίδραση του ΚΔΔ για την έκφραση γονιδίων δεικτών CSC στα κύτταρα PC κάτω από συνθήκες υποξίας

Το πραγματικό χρόνο προσδιορισμό RT-PCR διεξήχθη για να εξετάσει την επίδραση του CDF σε γονίδια υπογραφή του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων (CSC) σε κύτταρα MiaPaCa-2 AsPC-1 και υπό συνθήκες υποξίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, υποξία προκαλούμενη από τα σχετικά επίπεδα mRNA του Nanog, Oct4 και ΕΖΗ2 σε AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα ενώ CDF μείωσε τα επίπεδα του Nanog, Oct4 και ΕΖΗ2 mRNAs σε κύτταρα PC κάτω από συνθήκες υποξίας.

Real time RT-PCR χρησιμοποιήθηκε, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Οι μπάρες στα διαγράμματα δείχνουν SD της n = 3. * υποδηλώνει p & lt?. 0.05

Η

Επίδραση του ΚΔΔ για την έκφραση microRNA (miRNA) του miR-21 και miR-210 σε κύτταρα PC κάτω από υποξικές συνθήκες

για να εξεταστεί η επίδραση της CDF στην έκφραση των miRNAs σε κύτταρα PC κάτω από συνθήκες υποξίας, μετρήσαμε τα σχετικά επίπεδα του miR-21 και miR-210 κάτω από συνθήκες υποξίας με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, υποξία προκαλούμενη από τα σχετικά επίπεδα miRNA του miR-21 και miR-210 σε AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα ενώ CDF μείωσε τα επίπεδα του miR-21 και miR-210 σε κύτταρα PC κάτω από συνθήκες υποξίας, υποδηλώνοντας ότι CDF είναι ένας ισχυρός παράγοντας στην εξασθένηση που προκαλείται από υποξία έκφραση του miR-21 και miR-210 σε ανθρώπινα κύτταρα PC.

Επίδραση του CDF ή αντι-miR-21 σχετικά με την ικανότητα αυτο-ανανέωσης CSC σε ανθρώπινο PC κύτταρα κάτω από συνθήκες υποξίας

για να εκτιμηθεί η επίδραση της CDF ή αντι-miR-21 σχετικά με την ικανότητα αυτο-ανανέωσης CSC των ανθρώπινων κυττάρων PC κάτω από συνθήκες υποξίας, πραγματοποιήσαμε την δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας χρησιμοποιώντας AsPC-1 και MiaPaCa-2 κύτταρα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το αντι-miR-21 μείωσε τον σχηματισμό pancreatospheres σε κύτταρα MiaPaCa-2 (Σχήμα 4Α). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι miR-21 μπορεί να παίζει έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ικανότητας αυτο-ανανέωση των CSC-όπως τα κύτταρα PC. Ομοίως, η θεραπεία CDF μείωσε τον σχηματισμό pancreatospheres σε AsPC-1 και κύτταρα MiaPaCa-2 υπό συνθήκες υποξίας (Σχήμα 4Α).

Το πάνελ Α, Β, και Γ αντιπροσωπεύουν το σχηματισμό pancreatospheres, η έκφραση του CD44 και EpCAM, και η παραγωγή του VEGF και IL-6, αντίστοιχα. Η δοκιμασία σχηματισμού σφαίρα διεξήχθη για να εξετάσει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των ΚΕΠ σε κύτταρα PC, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Ομοεστιακό μικροσκόπιο απεικόνισης (200 × μεγέθυνση) διεξήχθη για να μετρηθεί η CSC δεικτών κυτταρικής επιφάνειας CD44 και EpCAM στα MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Οι μπάρες στα διαγράμματα δείχνουν SD της n = 3. * υποδηλώνει p & lt?. 0.05

Η

Επίδραση του CDF ή αντι-miR-21 για την έκφραση των πρωτεϊνών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας CSC CD44 και EpCAM στο PC κύτταρα που προέρχονται από κύτταρα σφαίρα κάτω από συνθήκες υποξίας

Για να εξεταστεί κατά πόσον ή όχι CDF ή αντι-miR-21 αναστέλλει την έκφραση της CSC δεικτών κυτταρικής επιφάνειας CD44 και EpCAM στην CSC-όπως κύτταρα που προέρχονται από κύτταρα PC, πραγματοποιήσαμε ομοεστιακό μικροσκοπία απεικόνισης για την αξιολόγηση της έκφρασης του CD44 και ΕρΟΑΜ στα κύτταρα MiaPaCa-2 ξεκίνησε προέρχονται από όγκους σφαίρα κυττάρων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το αντι-miR-21 μείωσε την έκφραση του CD44 και EpCAM σε MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου υπό συνθήκες υποξίας, σύμφωνο με τα αποτελέσματα από την επεξεργασία CDF (Σχήμα 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι CDF ρυθμίζει προς τα κάτω το σχηματισμό των κυττάρων σφαίρας MiaPaCa-2 όγκων συνάδει με προς τα κάτω ρύθμιση των CD44 και EpCAM έκφραση, η οποία είναι εν μέρει προκαλούνται μέσω μειωμένη έκφραση του miR-21.

Επίδραση του CDF ή αντι-miR-21 για VEGF και IL-6 παραγωγή των MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου υπό συνθήκες υποξίας

Όπως φαίνεται στο σχήμα 4C, MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου παράγεται σχετικά μεγαλύτερη ποσότητα του VEGF υπό υποξικές συνθήκες, σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα του MiaPaCa-2 (2174 pg /ml /10

4 MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου vs 3248 mL /10

6 κύτταρα pg /MiaPaCa-2? Σχήμα 1C και 4C), προτείνοντας ότι οι σφαίρες MiaPaCa-2 όγκου μπορεί να προάγουν την αγγειογένεση με up-ρύθμιση της παραγωγής VEGF. Βρήκαμε επίσης ότι η θεραπεία CDF μειώθηκε υποξία προκαλούμενη παραγωγή VEGF σε MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου. Παρομοίως, κύτταρα MiaPaCa-2 σφαίρα παράγεται σχετικώς μεγαλύτερη ποσότητα της υποξίας που επάγεται IL-6, σε σύγκριση με γονικά κύτταρα του (18 pg /ml /10

4 MiaPaCa-2 σφαίρα κυττάρων vs 164 pg /ml /10

6 γονικά κύτταρα MiaPaCa-2? Σχήμα 1D και 4C). θεραπεία CDF ή ανεπάρκεια του miR-21 από αντι miR-21-διαμόλυνση μείωσε την παραγωγή της υποξίας που επάγεται IL-6 στο CSC-σαν σφαίρα κυττάρων (Σχήμα 4C).

Επίδραση του CDF ή miR-21 ανεπάρκεια στο γονίδιο εκφράσεις του HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, και EMT σημειωτές φαινοτύπου σε κύτταρα σφαίρα MiaPaCa-2 όγκων υπό συνθήκες υποξίας

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η θεραπεία CDF μειώθηκε ο σχετικά επίπεδα mRNA του HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, και EpCAM σε MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου υπό συνθήκες υποξίας. Ομοίως, προς τα κάτω ρύθμιση του miR-21 by-miR-21 αντι διαμόλυνση μείωσε την έκφραση αυτών των γονιδίων σε MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου υπό συνθήκες υποξίας. Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον ή όχι CDF ή ανεπάρκεια miR-21 ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση των δεικτών EMT σε MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου υπό συνθήκες υποξίας. Βρήκαμε ότι η απενεργοποίηση του miR-21 έκφραση οδήγησε σε σημαντική μείωση στα σχετικά επίπεδα mRNA του ΕΜΤ δεικτών μεσεγχυματικών ZEB1 και βιμεντίνης, και αύξησε το σχετικό επίπεδο mRNA επιθηλιακών δείκτη Ε-καδερίνης στα κύτταρα σφαίρα όγκου υπό υποξικές συνθήκες (Σχήμα 5Α ). Παρομοίως, CDF μείωσε τα επίπεδα του mRNA του ZEB1, βιμεντίνη, και Twist στα κύτταρα του όγκου σφαίρα κάτω από συνθήκες υποξίας (Σχήμα 5Α).

Το πάνελ Α και Β αντιπροσωπεύουν τα mRNAs και miRNAs, αντίστοιχα. Τα κύτταρα σφαίρα επιμολύνθηκαν με anit-miR-21 με τη χρήση του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης, ακολουθώντας το εγχειρίδιο του κατασκευαστή. Πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι. Οι μπάρες στα διαγράμματα δείχνουν SD της n = 3. * υποδηλώνει p & lt?. 0.05

Η

Επίδραση του ΚΔΔ για την έκφραση των miRNAs στην MiaPaCa-2 κύτταρα σφαίρα όγκου κάτω από συνθήκες υποξίας

Πρόσφατες πειραματικές αποδείξεις έχουν δείξει ότι η υποξία μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση ενός αριθμού miRNAs, συμπεριλαμβανομένων των αντι-ογκογόνο (ας-7 και miR-101), και προ-ογκογόνο (mIR-21 και miR-210) miRNAs [10], [ ,,,0],12], [13], [15], [23], [24].