Αφηρημένο

χημειοκινών CXCL12 και τον υποδοχέα CXCR4 έχουν αναδειχθεί ως πολλά υποσχόμενη θεραπευτικών στόχων για καρκίνο των ωοθηκών, μια ασθένεια που συνεχίζει να έχει μια μελαγχολική πρόγνωση. CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης drives πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, οδηγώντας σε ανάπτυξη και μετάσταση όγκου. Πλειοτροπικές επιδράσεις των CXCR4 σε πολλαπλά στάδια κλειδιά στον καρκίνο των ωοθηκών υποδεικνύουν ότι η παρεμπόδιση αυτή την οδό θα επιτευχθούν καλύτερα αποτελέσματα για τους ασθενείς με την ασθένεια αυτή. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης σε δοκιμασίες που βασίζονται σε κύτταρα και ζουν μοντέλα ποντικών του καρκίνου των ωοθηκών, έχουμε αναπτύξει ένα κλικ σκαθάρι κόκκινου λουσιφεράσης συμπληρώσεως ρεπόρτερ που ανιχνεύει την ενεργοποίηση του CXCR4 βασίζεται στην πρόσληψη του κυτταροπλασματική πρωτεΐνη προσαρμογέα β-αρρεστίνης 2. Και σε δίκυκλα διαστάσεων και τριών διαστάσεων κυτταρικές καλλιέργειες, διαπιστώσαμε ότι βιοφωταύγεια από αυτό το ρεπόρτερ μετρά CXCL12-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των CXCR4 και αναστολή αυτής της οδού με AMD3100, κλινικά εγκεκριμένο μικρό μόριο που δεσμεύει σύνδεση CXCL12-CXCR4. Χρησιμοποιήσαμε αυτό το σύστημα απεικόνισης για την ποσοτικοποίηση CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης σε ένα μοντέλο ποντικού του μεταστατικού καρκίνου των ωοθηκών και έδειξε ότι η θεραπεία με AMD3100 διακοπεί αυτή την οδό

in vivo

. Η θεραπεία συνδυασμού με AMD3100 και σισπλατίνη μειώθηκε σημαντικά φορτίο όγκου σε ποντικούς, αν και οι διαφορές στη συνολική επιβίωση δεν ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από ό, τι η θεραπεία με κάθε παράγοντα ως μονοθεραπεία. Οι μελέτες αυτές καθιερώνουν σύστημα μοριακή απεικόνιση ρεπόρτερ για την ανάλυση των CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης στον καρκίνο των ωοθηκών, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της βιολογίας και της θεραπευτικής στόχευσης αυτής της οδού σε δοκιμασίες που βασίζονται σε κύτταρα και ζώντων ποντικών

Παράθεση:. Salomonnson E , Stacer AC, Ehrlich Α, Luker ΚΕ, Luker GD (2013) Imaging CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης σε καρκίνο των ωοθηκών θεραπεία. PLoS ONE 8 (1): e51500. doi: 10.1371 /journal.pone.0051500

Επιμέλεια: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23, Αυγούστου του 2012? Δεκτές: 1 Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιαν 2013

Copyright: © 2013 Salomonnson et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα ήταν χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH R01CA136553, R01CA136829, και P50CA093990) και το Υπουργείο άμυνας (W81XWH-09-1-0128). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

χημειοκινών CXCL12 (SDF-1) και CXCR4 υποδοχέα της εμπλέκονται έντονα ως αποφασιστικούς παράγοντες για την έναρξη του όγκου και ενδοπεριτοναϊκή μετάσταση του καρκίνου [1] των ωοθηκών. CXCL12 εκκρίνεται από ≈70-90% των ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων, καθώς και μεσοθηλιακών κυττάρων εντός του περιτοναίου από ανθρώπους και ποντίκια [2] [3] [4] [5]. Οι ασθενείς με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης CXCL12 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών έχουν μια σημαντικά χειρότερη πρόγνωση, υπογραμμίζοντας τη βιολογική σημασία αυτού του μορίου σηματοδότησης σε εξέλιξη της νόσου [6]. Επιδράσεις της CXCL12 για τον καρκίνο των ωοθηκών φαίνεται να μεσολαβείται από CXCR4, ένας από τους δύο γνωστούς υποδοχείς για αυτήν την χημειοκίνη. Ενίσχυση του CXCR4 είναι ένα πρώιμο γεγονός στην κακοήθη μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών, προτείνοντας ότι CXCL12-CXCR4 είναι κρίσιμη για την παθογένεση της νόσου αυτής [7]. Περίπου το 60% των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών έχουν CXCR4 σε κακοήθη κύτταρα, και αυτοί οι ασθενείς έχουν μειώσει σημαντικά τη συνολική επιβίωση [4]. CXCL12 σηματοδότηση μέσω CXCR4 προάγει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, τα οποία συμβάλλουν στην πιο επιθετική ασθένεια. Δυσμενείς επιπτώσεις της CXCL12 για τον καρκίνο των ωοθηκών, επίσης, μπορεί να οφείλεται σε επιδράσεις στο στρωματικό διαμέρισμα του μικροπεριβάλλον του όγκου, συμπεριλαμβανομένης της ενισχυμένης αγγειογένεση και την πρόσληψη των ανοσοκατασταλτικών κυττάρων [8] [9] [10] [11].

Κεντρική λειτουργίες του CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης σε κακοήθη κύτταρα και τη θέση μικροπεριβάλλον του όγκου αυτού του άξονα σηματοδότησης ως βασικό στόχο να βελτιώσει τη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Σε μοντέλα ποντικού, εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι μπλοκάρισμα CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης με παρεμβολή RNA κατά CXCL12 ή ένα μικρό αναστολέα μόριο του CXCL12-CXCR4 πρόσδεσης (AMD3100) περιορίζει την ανάπτυξη των εμφυτευμάτων ωοθηκών κυττάρου [12], [13], [14 ]. Η αναστολή της σηματοδότησης CXCL12-CXCR4 εκτείνεται επίσης την επιβίωση ποντικών με καρκίνο των ωοθηκών. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της θεραπείας και μόνο παράγοντας είναι μέτρια, γεγονός που υποδηλώνει ότι η στόχευση CXCL12-CXCR4 σε συνδυασμό με έναν άλλο παράγοντα μπορεί να είναι πιο επωφελής.

Δημιουργία ότι μια ένωση χτυπά αποτελεσματικά τον επιδιωκόμενο στόχο του είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη φαρμάκων σε προ-κλινικές μοντέλα και κλινικές δοκιμές. Να αναλύσει τη φαρμακοδυναμική των παραγόντων που στοχεύουν CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο των ωοθηκών, έχουμε αναπτύξει ένα κλικ σκαθάρι συμπλήρωση λουσιφεράσης για την εικόνα και την ποσοτικοποίηση ενεργοποίηση και αναστολή αυτής της οδού

in vivo

. Σε αυτό το σύστημα, CXCR4 και ο κυτοσολική πρωτεΐνη προσαρμογέας β-αρρεστίνης 2 συντήκονται προς τους ανενεργούς αμινο (ΧΒΡΠ) και καρβοξυ (CBC) τερματικά θραύσματα του κλικ σκαθαριού κόκκινο λουσιφεράσης. Ο δημοσιογράφος μέτρα ενεργοποίησης CXCL12 της CXCR4 σηματοδότησης που βασίζεται στην πρόσληψη του κυτταροπλασματική πρωτεΐνη προσαρμογέα β-αρρεστίνης 2 σε αυτόν τον υποδοχέα. Πρόσληψη β-αρρεστίνης 2 είναι μια κοινή, πρώιμο συμβάν στην ενεργοποίηση των υποδοχέων χημειοκινών και το μεγαλύτερο οικογένεια των επτά διαμεμβρανικών υποδοχέων [15]. Με το σύστημα συμπλήρωσης λουσιφεράσης, αλληλεπιδράσεις μεταξύ CXCR4 και β-αρρεστίνης 2 Ανασυστήνετε ενεργό κλικ λουσιφεράσης σκαθαριού για την παραγωγή φωτός, παρέχοντας ένα μετρικό απεικόνισης για CXCR4 σηματοδότησης σε ανέπαφα κύτταρα, τρισδιάστατες καλλιέργειες σφαιροειδές, και ζουν ποντίκια. Τα σφαιροειδή είναι ένα σημαντικό ενδιάμεσο μεταξύ πρότυπο δύο διαστάσεων προσδιορισμούς κυτταρικής καλλιέργειας και ξενομοσχεύματα όγκων αφού σφαιροειδή όγκου αναπαράγουν περιορισμένη διάχυση των ενώσεων σε όγκους και το σχηματισμό των ωοθηκών σφαιροειδή καρκίνου σε ασκιτικό υγρό από ασθενείς. Δεδομένου συμπληρώσεως λουσιφεράσης είναι αναστρέψιμη, αυτό απεικόνισης ρεπόρτερ μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση των αποτελεσμάτων ενώσεων που δεσμεύουν CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης

in vitro

και

in vivo

.

Χρησιμοποιήσαμε αυτό ρεπόρτερ απεικόνισης για την ανάλυση CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης στον καρκίνο των ωοθηκών και αποδειχθεί η ύπαρξη AMD3100, ένα μικρό μόριο αναστολέα του CXCR4, την ενεργοποίηση του υποδοχέα μπλοκ στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα απεικόνισης, διαπιστώσαμε ότι η συνδυαστική θεραπεία με σισπλατίνη AMD3100 και μειώθηκαν σημαντικά τη συνολική επιβάρυνση του όγκου σε ένα μοντέλο ποντικού ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών με ενδοπεριτοναϊκή μεταστάσεις. Τα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν μία νέα μέθοδο μοριακής απεικόνισης για την ανάλυση CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης στον καρκίνο των ωοθηκών και προτείνει πιθανές θεραπευτικό όφελος του συνδυασμού επιλεκτικής αναστολής αυτής της οδού του υποδοχέα χημειοκίνης με τυπικά χημειοθεραπευτικά φάρμακα.

Υλικά και Μέθοδοι

πλασμίδια

Για να δημιουργήσετε συγχωνεύσεις των CXCR4 με το Ν-τερματικό θραύσμα κλικ σκαθαριού κόκκινο λουσιφεράσης (ΧΒΡΠ) (Promega), που ενισχύεται CXCR4 με PCR και κλωνοποιήθηκε το προϊόν εντός των θέσεων XhoI και ΑαβΙ της EGFP-N1 (Clontech). Χρησιμοποιήσαμε PCR για την ενίσχυση της αλληλουχίας DNA για τα αμινοξέα 2-413 του κλικ σκαθαριού κόκκινο λουσιφεράσης (ΧΒΡΠ) και κλωνοποιήθηκε αυτό το προϊόν σε AgeI και NotI θέσεις EGFP-N1 [16]. Αυτή η στρατηγική κλωνοποίησης αφαιρεί EGFP από τον φορέα. Εμείς επέτεινε την αλληλουχία για τα αμινοξέα 395-542 του λουσιφεράσης σκαθαριού κλικ (CBC) με PCR και κλωνοποιήθηκε το προϊόν στις θέσεις AgeI και NotI του ΕΟΡΡ- N1 να δημιουργήσει μια σύντηξη στο C-τελικό άκρο της β-αρρεστίνης 2 (δώρο του Robert Lefkowitz). Για να μεταφέρετε κατασκευάσματα από τον EGFP-Ν1 σπονδυλική στήλη για τον φορέα λεντοϊού FUW, χρησιμοποιήσαμε PCR για να ενισχυθεί η αλληλουχία DNA στόχου και προσθέτουν θέσεις XbaI για κλωνοποίηση. Τα κατασκευάσματα που χρησιμοποιούνται για αυτή τη μελέτη συνοψίζονται στο Σχήμα 1 (Σχ. 1Α), και οι PCR εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Α) πάνελ δείχνει φορείς λεντοϊών και σταθερά μεταχθέντα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για μελέτες απεικόνισης. Β) Σχηματικό διάγραμμα κλικ σκαθάρι συστήματος κόκκινο συμπλήρωση. Τα Ν- και Ο-τερματικά θραύσματα του κλικ σκαθαριού κόκκινο λουσιφεράσης συντηγμένο με το Ο-άκρα CXCR4 και β-αρρεστίνης 2, αντίστοιχα. σύνδεση με το CXCR4 CXCL12 προκαλεί πρόσληψη β-αρρεστίνης 2 στο ενεργοποιημένο υποδοχέα, ανασύσταση κλικ σκαθάρι κόκκινο λουσιφεράσης για την παραγωγή φωτός.

Η

Cells

HeyA8 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (με την προϋπόθεση από τον Gordon Mills, MD Anderson Cancer Κέντρο) ήταν σταθερά μετάγονται με ανασυνδυασμένο φακοϊούς για CXCR4-ΧΒΡΠ και Ar-CBC (HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC) [17]. Χρησιμοποιήσαμε λεντοϊού μεταγωγής για τη δημιουργία πληθυσμούς κυττάρων HeyA8 σταθερά εκφράζουν CXCL12 συγχωνευμένο με

Gaussia

λουσιφεράσης (HeyA8-CXCL12-GL), μη συνενωμένο

Gaussia

λουσιφεράσης (Hey-GL), και λουσιφεράση πυγολαμπίδας και πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) (HeyA8-FL /GFP) [18], [19]. Μπορούμε επίσης να μετάγονται HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC και HeyA8-CXCL12-GL κύτταρα με φθορίζουσα πρωτεΐνη eqFP650 [20]. Το Σχήμα 1 δείχνει μια λίστα με σταθερά μεταγόμενα κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη (Εικ. 1Α). Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 1% γλουταμίνη, και 0,1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη.

Η κυτταρομετρία ροής

Ακέραια κύτταρα χρωματίστηκαν με ένα αντίσωμα προς CXCR4 (κλώνος 12G5 , R &? D Systems) ή έλεγχο ταιριασμένου ισοτύπου, όπως περιγράφηκε προηγουμένως για να αποκαλύψει τα επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας αυτού του υποδοχέα [21]. Μη βαμμένα κύτταρα από κάθε πληθυσμό κυττάρου χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες αποζημίωση για κυτταρομετρία ροής.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε 1% ορό όλη την νύκτα και στη συνέχεια διεγέρθηκαν για 10 λεπτά με διάφορες συγκεντρώσεις ανασυνδυασμένου CXCL12-α (R &? D Systems) για την ενεργοποίηση του ΑΚΤ. Για τον προσδιορισμό CXCL12-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του ERK1 /2, μπορούμε κατεργασμένα κύτταρα στερούνται ορού με 100 ng /ml CXCL12-α για 0, 5, 15, ή 30 λεπτά παρουσία του ελέγχου του οχήματος ή 1 μΜ AMD3100, ένα μικρό αναστολέα μόριο του CXCR4 (Tocris). Τα κυτταρολύματα στυπώθηκαν για φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ ή φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 (Cell Signaling) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και την εκ νέου ανιχνεύτηκαν για ολική Akt ή ολική ERK1 /2 ως έλεγχος φόρτωσης. Χρησιμοποιήσαμε επίσης κηλίδωση Western για να προσδιοριστεί η έκφραση του ενδογενούς β-αρρεστίνης 2 και β-αρρεστίνης 2-CBC στα κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC (Cell Signaling). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν ένα πρόσθετο χρόνο και εκ νέου ανιχνεύτηκαν για αφυδρογονάση φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) σαν ένας περαιτέρω έλεγχος φόρτωσης. Μετρήσαμε εντάσεις ζωνών με ImageJ και διαιρείται τιμές για φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ από το συνολικό ΑΚΤ και GAPDH. Πραγματοποιήσαμε παρόμοιοι υπολογισμοί για φωσφορυλιωμένη ERK σε σχέση με το σύνολο των ERK και GAPDH. Τόσο για φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ και ERK, θα ομαλοποιηθεί όλες τις τιμές για τα κύτταρα που δεν αντιμετωπίζονται με CXCL12.

Δύο πειράματα διαστάσεων καλλιέργειας κυττάρων

επιχρυσωμένο 1,5 × 10

4 HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC κύτταρα ανά φρεάτιο σε μαύρες πλάκες τοίχου 96 φρεατίων μία ημέρα πριν από δοκιμασίες. Αλλάξαμε μέσο από το πρότυπο μέσο καλλιέργειας με DMEM με ορό 1% για πειράματα. Επωάσαμε τα κύτταρα για την αύξηση χρονικές περιόδους με 100 ng /ml CXCL12-α (R &? D Systems) ή για 60 λεπτά με αυξανόμενες συγκεντρώσεις των χημειοκινών. Σε επιλεγμένα πειράματα, τα κύτταρα επωάστηκαν με AMD3100 να αναστέλλουν σύνδεση προς CXCR4 ή ελέγχου του οχήματος σε συγκεντρώσεις που αναφέρονται στο σχήμα θρύλους CXCL12. Προσθέσαμε 150 μg /ml λουσιφερίνη (Promega) σε φρεάτια και στη συνέχεια ποσοτικοποιούνται βιοφωταύγεια από ζωντανά κύτταρα με χρήση IVIS 100 (Perkin Elmer). Η βιοφωταύγεια από λουσιφεράση σκαθαριού κλικ ποσοτικοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως και κανονικοποιήθηκε σε ολική πρωτεΐνη ανά φρεάτιο ποσοτικά με χρώση σουλφοροδαμίνης Β [19]. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές ± SEM για φωταύγειας σε σχέση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους.

σφαιροειδή

Τα σφαιροειδή σχηματίστηκαν σε 384-φρεατίων πλάκες κρέμεται σταγόνα με σπορά συνολικά 2 × 10

4 HeyA8 κύτταρα ανά φρεάτιο [22]. Χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικούς τύπους σφαιροειδή: 1) κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC αναμειγνύεται με ίσο αριθμό κυττάρων HeyA8-CXCL12-GL για να προσδιοριστεί η ενεργοποίηση και αναστολή της CXCR4 σηματοδότησης? ή 2) τα κύτταρα HeyA8-FL /GFP σε συνδυασμό με ίσους αριθμούς είτε HeyA8-CXCL12-GL ή HeyA8-GL κύτταρα, αντίστοιχα, για δοκιμασίες βιωσιμότητας κυττάρου σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη. Για πειράματα με AMD3100, αυξανόμενες συγκεντρώσεις ένωσης προστέθηκαν σε σφαιροειδή μία ημέρα μετά τη σπορά σε πλάκες κρέμονται σταγόνα. Επωάσαμε σφαιροειδή με AMD3100 ή όχημα για μία ή δύο ημέρες πριν την ποσοτικοποίηση βιοφωταύγεια. HeyA8-FL /GFP κύτταρα σε σφαιροειδή είτε με HeyA8-CXCL12-GL ή HeyA8-GL κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για μία ή δύο ημέρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης. Εμείς ποσοτικά φθορισμού από eqFP650 σε IVIS Spectrum πριν από την ποσοτικοποίηση βιοφωταύγεια μετά την προσθήκη 6 μg /ml λουσιφεράσης σε κάθε σφαιροειδές. Εμείς ομαλοποιηθεί βιοφωταύγεια ροή φωτονίων φθορισμού για λάμψη να λογοδοτήσουν για τις διαφορές στους αριθμούς των κυττάρων.

Μελέτες σε ζώα

Όλες οι διαδικασίες ζώων εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο του Michigan Επιτροπής για τη χρήση και τη φροντίδα των ζώων. Τα ζώα μεταφέρθηκαν σε χλωροφύλλη χωρίς τροφή (Έρευνα Δίαιτες) για όλες τις μελέτες για την ελαχιστοποίηση φθορισμό υποβάθρου σε απεικονιστικές μελέτες. 2.5 × 10

5 κύτταρα καθένα από τα κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC και HeyA8-CXCL12-GL ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε 100 μl NaCl 0,9% σε 5-7 εβδομάδες παλιά γυναικεία NOD /SCID

IL2rγ

– /- θηλυκά ποντίκια (Taconic). Για να αναστέλλουν την σύνδεση με το CXCR4 CXCL12, χρησιμοποιήσαμε 5-ημερών, οσμωτικές αντλίες 1.0 μΙ /ώρα (για το πείραμα που παρουσιάζεται στο Σχ. 5) ή 14-ημερών, 0.5 μΐ /ώρα οσμωτικές αντλίες (για το πείραμα που παρουσιάζεται στο Σχ. 6) (Alzet) φορτώθηκε με 25 mg /ml AMD3100 ή 0,9% NaCl ελέγχου του οχήματος. Αυτές οι αντλίες παρέχουν 1.25 ή 0.625 μg AMD3100 /g /ώρα σε κάθε ποντικό. Οι αντλίες εμφυτεύτηκαν σε χρόνους που αναφέρονται στο κείμενο για κάθε σχήμα. Για μελέτες θεραπείας φαίνεται στο σχήμα 6, έχουμε ποντίκια που είχαν ενεθεί με 4 mg /kg σισπλατίνης ή συμφωνημένα i.p. όχημα κάθε 5 ημέρες. Σισπλατίνη ή PBS όχημα ενέσεις συνεχίστηκαν καθ ‘όλη τη διάρκεια της περιόδου των δύο εβδομάδων που οσμωτική αντλίες έγχυσης ήταν στη θέση του. Όλοι οι ποντικοί έλαβαν δραστική ένωση (AMD3100 και /ή σισπλατίνη) ή συμφωνημένα όχημα και για τις δύο οδούς χορήγησης (οσμωτική αντλία έγχυσης και ενδοπεριτοναϊκή ένεση). Ως παραδείγματα, οι ποντικοί ελέγχου οχήματος έλαβαν αντλίες οσμωτική με 0,9% NaCl και ε.π. ενέσεις PBS, ενώ τα ποντίκια στην ομάδα θεραπείας είχαν AMD3100 οσμωτικές αντλίες με AMD3100 και ε.π. PBS.

Ποντίκι απεικόνισης

απεικόνισης βιοφωταύγεια διεξήχθη σε IVIS Spectrum (Perkin Elmer). Ο φθορισμός απεικόνισης και απεικόνισης λουσιφεράση σκαθαριού με λουσιφερίνη διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. δεδομένων απεικόνισης ήταν ποσοτικά ως ακτινοβολία φθορισμού ή ροή φωτονίων, αντίστοιχα. Τα στοιχεία για κλικ σκαθαριού συμπλήρωση κόκκινο λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκαν σε συνολικό φορτίο του όγκου εκτιμήθηκε με φθορισμό από eqFP650.

Στατιστικά

Γραφήματα και οι στατιστικές αναλύσεις που παρασκευάζονται με GraphPad Prism. Μελέτες κυτταρικής καλλιέργειας διεξήχθησαν 3-5 φορές, ενώ οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν δύο φορές. Τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς ως μέσες τιμές με τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). Ζεύγη δεδομένα αναλύθηκαν με Mann-Whitney U test για να προσδιοριστεί στατιστικώς σημαντικές διαφορές. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier αναλύθηκαν από Gehan-Breslow-Wilcoxon Test.

Αποτελέσματα

Κάντε κλικ σκαθάρι συμπλήρωση δημοσιογράφος για την αλληλεπίδραση των CXCR4 και β-αρρεστίνης 2

CXCL12 δέσμευση υποδοχέα CXCR4 σαν αποτέλεσμα την πρόσληψη του κυτταροπλασματική πρωτεΐνη προσαρμογέα β-αρρεστίνης 2 στο ενεργοποιημένο υποδοχέα. Για την εικόνα και την ποσοτικοποίηση αυτό το βασικό βήμα στη μεταγωγή σήματος, χρησιμοποιήσαμε ένα περιέγραψε πρόσφατα δοκιμασία συμπληρωματικότητας θραύσματος πρωτεΐνης βασίζεται κλικ σκαθαριού κόκκινο λουσιφεράσης [16]. Σε αυτό το σύστημα, CXCR4 συγχωνεύεται στο Ν-τερματικό θραύσμα της λουσιφεράσης σκαθαριού κλικ (CXCR4-CBRN) και β-αρρεστίνης 2 στο C-τερματικό θραύσμα του ενζύμου αυτού (Ar-CBC) (Σχ. 1Β). Πρόσληψη β-αρρεστίνης 2 έως CXCR4 επίσης φέρνει μαζί θραύσματα λουσιφεράσης να παράγει βιοφωταύγεια ως ποσοτικό μέτρο της πρωτεΐνης αυτής της αλληλεπίδρασης σε CXCR4 σηματοδότησης.

μετάγονται HeyA8 καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων με φορείς λεντοϊού για CXCR4-ΧΒΡΠ και Αγ CBC. κύτταρα HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ σε απόκριση σε επώαση με CXCL12 όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western, δείχνει ότι αυτά τα κύτταρα ενεργοποιούνται ένα γνωστό καθοδικός τελεστής του CXCL12-CXCR4 (Εικ. 2Α). Σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HeyA8, κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC έδειξε μεγαλύτερη ενεργοποίηση της ΑΚΤ σε απάντηση CXCL12, σύμφωνα με τη μεταγωγή πρόσθετες λειτουργικές CXCR4 στα κύτταρα δημοσιογράφος απεικόνισης. Δείξαμε επίσης ότι τα κύτταρα HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC δείχνουν χρονο-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των κινασών ERK1 /2, η οποία αναστέλλεται από μια συγκέντρωση κορεσμού (1 μΜ) της AMD3100 CXCR4 αναστολέας (Σχ. 2Β). κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC υπερεκφράζουν β-αρρεστίνης 2-CBC σε σχέση με την ενδογενή πρωτεΐνη όπως προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western.

Α) HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC και τη γονική HeyA8 κύτταρα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του CXCL12 για 10 λεπτά. Western blot του συνολικού κυτταρολύματα δείχνει φωσφορυλιωμένη και συνολική ΑΚΤ, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήσαμε GAPDH ως έλεγχος φόρτωσης. Γράφημα δείχνει τις σχετικές εντάσεις ζώνης για φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ σε κάθε κυτταρική σειρά ομαλοποιήθηκε με το σύνολο των ΑΚΤ και GAPDH. Β) κύτταρα HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml CXCL12-α για 0, 5, 15, ή 30 λεπτά απουσία ή παρουσία 1 μΜ AMD3100. Σύνολο κυτταρολύματα ανιχνεύθηκαν για φωσφορυλιωμένη ERK1 και το συνολικό /2, αντίστοιχα. Τα προϊόντα λύσης επίσης αναλύθηκαν με κηλίδα Western για έκφραση β-αρρεστίνης 2-CBC και ενδογενή β-αρρεστίνη 1 και 2. GAPDH εμφανίζεται ως έλεγχος φόρτωσης. Γ) Η κυτταρομετρία ροής της έκφρασης CXCR4 σε διάφορες HeyA8 κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Σκοτεινή γραμμή και διακεκομμένες γραμμές σε οικόπεδα ιστόγραμμα δηλώνουν έλεγχο ισοτόπου και χρώση με CXCR4 αντίσωμα.

Η

χρησιμοποιείται κυτταρομετρία ροής για την εκτίμηση της κυτταρικής επιφάνειας έκφραση των CXCR4 στα κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC, όπως καθώς και γονικών κυττάρων HeyA8 και κύτταρα σταθερά μεταγωγή με

Gaussia

λουσιφεράσης (HeyA8-GL), CXCL12 συγχωνευμένο με Gaussia λουσιφεράσης (HeyA8-CXCL12-GL), ή λουσιφεράση πυγολαμπίδας και GFP (HeyA8-FL-GFP). Όλα τα κύτταρα εξέφρασαν παρόμοια επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας CXCR4 (Σχ. 2C). Αν και μεταγωγή με CXCR4-ΧΒΡΠ, HeyA8-CXCR4-CBRN /κυττάρων Ar-CBC είχαν επίπεδα κυτταρικής επιφάνειας CXCR4 που ήταν συγκρίσιμα με τα γονικά κύτταρα HeyA8, πιθανόν επειδή η υπερέκφραση της β-αρρεστίνης 2 αιτίες εσωτερικοποίηση αυτού του υποδοχέα από την κυτταρική επιφάνεια. [24], [25].

δίσκους CXCL12 συμπληρωματικότητα μεταξύ CXCR4 και β-αρρεστίνης 2

Για να αποδείξει ότι η βιοφωταύγεια από HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC κύτταρα μέτρα ενεργοποίησης της CXCR4 σηματοδότησης , υποβάλλαμε σε αγωγή καλλιέργειες μονοστοιβάδας των κυττάρων αυτών με αυξανόμενες συγκεντρώσεις CXCL12 για 60 λεπτά. Εμείς αγωγή παράλληλες καλλιέργειες κυττάρων με μία ανασταλτική συγκέντρωση (1 μΜ) της AMD3100 CXCR4 αναστολέας ή ελέγχου του οχήματος κατά τη διάρκεια της περιόδου επώασης [26] [27]. Η θεραπεία με CXCL12 παρήγαγε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αύξηση της βιοφωτισμός από τη σύνδεση του CXCR4-ΧΒΡΠ και Ar-CBC, φθάνοντας μέγιστη επαγωγή 3 φορές σε 1 μg /ml CXCL12 (Εικ. 3Α). Συγκριτικά, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με AMD3100 έδειξε μόνο βασική βιοφωταύγεια χωρίς απάντηση CXCL12.

Α) κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC απλώθηκαν ως δύο διαστάσεων καλλιέργειες σε πλάκες των 96 φρεατίων και επωάστηκαν με αυξανόμενες Οι συγκεντρώσεις του CXCL12-α υπό την παρουσία 1 μΜ AMD3100 ή ελέγχου του οχήματος. Τα δεδομένα απεικονίστηκαν γραφικά ως μέσες τιμές για φωταύγεια σχέση με τα κύτταρα που δεν αντιμετωπίζονται με CXCL12 (η = 4 ανά συνθήκη). Οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν SEM. Β) κύτταρα HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml για την αύξηση CXCL12 χρονικές περιόδους παρουσία 1 μΜ AMD3100 ή ελέγχου του οχήματος. Τα δεδομένα απεικονίστηκαν γραφικά ως μέσες τιμές ± SEM για φωταύγειας σε σχέση με κύτταρα μη επωασμένα με CXCL12 (η = 4 ανά συνθήκη). *, P & lt? 0,05? **, P & lt?. 0.01

Η

επωάζονται επίσης κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC με 100 ng /ml CXCL12 και 1 μΜ AMD3100 ή όχημα ελέγχου για την αύξηση χρονικά διαστήματα μέσω 4 ώρες πριν από τη μέτρηση δραστικότητα λουσιφεράσης. Σχετική με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, κύτταρα επωάστηκαν με 100 ng /ml CXCL12 και ελέγχου του οχήματος έδειξε χρονο-εξαρτώμενη αυξήσεις βιοφωταύγεια, κορυφώθηκε σε περίπου 2-πλάσια επαγωγή στις 2 ώρες και στη συνέχεια μειώνεται συγκρατημένα (Σχ. 3Β). AMD3100 μπλοκαριστεί εντελώς επιπτώσεις της CXCL12 για βιοφωταύγεια συμπληρωματικότητα μεταξύ CXCR4-ΧΒΡΠ και Ar-CBC. Συλλογικά, οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι η βιοφωταύγεια από τα κύτταρα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC ανταποκρίνεται σε CXCL12 και να αποδείξει ότι το σύστημα αυτό ρεπόρτερ μπορεί να ποσοτικοποιηθεί η αναστολή της CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης.

Τα αποτελέσματα του φαρμάκου στο σφαιροειδές πολιτισμό

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα σφαιροειδή και παρόμοια συστήματα τρισδιάστατης καλλιέργειας κυττάρων είναι πιο φυσιολογική μοντέλα των ναρκωτικών στόχευση και αποτελεσματικότητα, οφείλεται σε παράγοντες συμπεριλαμβανομένων των άμεσων ενδοκυτταρικές αλληλεπιδράσεις και περιορισμένη διάχυση των ενώσεων [28], [29]. Επιπλέον, ωοθηκών καρκινικά κύτταρα σε ασθενείς σχηματίζουν σφαιροειδή σε ασκίτη, παρουσιάζουν δυνητικό εμπόδιο στην παροχή φαρμάκου [30]. Να διαμορφώσει το μικροπεριβάλλον του όγκου του καρκίνου των ωοθηκών

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε σφαιροειδή HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC κύτταρα σε συνδυασμό με ίσο αριθμό κυττάρων HeyA8-CXCL12-GL, αναπαράγοντας ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών στις οποίες όγκου κύτταρα εκκρίνουν CXCL12 και /ή εκφράζουν CXCR4. Ενώ τα γονικά κύτταρα HeyA8 δεν εκφράζουν CXCL12 όπως προσδιορίζεται με QRT-PCR (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), κύτταρα HeyA8-CXCL12-GL εκκρίνουν περίπου 12 ng /ml CXCL12 σε μία περίοδο 24 ωρών, η οποία είναι συγκρίσιμη με τις τιμές που αναφέρθηκαν για άλλες ωοθηκών καρκινικά κύτταρα ότι εκκρίνουν αυτό χημειοκίνης ενδογενώς [19] [31]. Εμείς αγωγή σφαιροειδή με αυξανόμενες συγκεντρώσεις AMD3100 για 24 ώρες πριν την ποσοτικοποίηση βιοφωταύγεια. Σε σχέση με σφαιροειδή αντιμετωπίζονται με τον έλεγχο του οχήματος, AMD3100 αναστέλλεται βιοφωτισμός από την ένωση του CXCR4-ΧΒΡΠ και Ar-CBC. Η δραστικότητα λουσιφεράσης από τον ανταποκριτή συμπληρωματικότητας μειώθηκε κατά ≈50% σε σφαιροειδή που έλαβαν θεραπεία με 1 μΜ AMD3100 (ρ & lt? 0,05) (Σχ 4Α.). Παρατηρήσαμε παρόμοια αποτελέσματα όταν επεκτείναμε επωάσεις με δύο ημέρες με AMD3100 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αναστολή της CXCR4, όπως μετράται από τη δοκιμασία συμπληρωματικότητας, ήταν λιγότερο αποτελεσματικό σε σφαιροειδή, σε σύγκριση με μονοστρωματική καλλιέργεια, υποδηλώνοντας ότι τα τρισδιάστατα όρια αρχιτεκτονική διείσδυση του AMD3100 σε όλα τα κύτταρα. Ωστόσο, οφείλουμε να παρατηρήσουμε ότι σφαιροειδές πολιτισμών δοκιμάσει επιπτώσεις της χρόνιας έκθεσης σε CXCL12 παρά την οξεία προσθήκη χημειοκινών όπως γίνεται σε δύο διαστάσεις του πολιτισμού, η οποία μπορεί επίσης να συμβάλει σε διαφορές στην αποτελεσματικότητα των AMD3100.

Α) σφαιροειδές καλλιέργειες HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC και HeyA8-CXCL12-GL κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις AMD3100. Τα δεδομένα απεικονίστηκαν γραφικά ως μέσες τιμές ± SEM για φωταύγειας για κλικ σκαθάρι συμπληρωματικότητα σε σχέση με σφαιροειδή αγωγή μόνο με έκδοχο ελέγχου (n = 10 σφαιροειδή ανά συνθήκη). Β) κύτταρα HeyA8-FL-GFP καλλιεργήθηκαν ως σφαιροειδή με κύτταρα HeyA8-CXCL12-GL ή HeyA8-GL και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 24 ώρες. Τα δεδομένα απεικονίστηκαν γραφικά ως μέσες τιμές ± SEM για λουσιφεράση πυγολαμπίδας φωταύγεια σε σχέση με σφαιροειδή που δεν αντιμετωπίζονται με σισπλατίνη (n = 10 σφαιροειδή ανά συνθήκη). *, P & lt?. 0.05

Η

Δοκιμάσαμε προστατευτικές επιδράσεις του CXCL12 κατά κυτταροτοξικότητα από σισπλατίνη, ένα πρότυπο χημειοθεραπευτικό φάρμακο για τον καρκίνο των ωοθηκών. Για αυτές τις δοκιμασίες, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα HeyA8-FL-GFP, η οποία εκφράζουν ενδογενώς CXCR4 (βλέπε Σχ. 2C). δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly είναι ευθέως ανάλογη προς τον αριθμό των κυττάρων όγκου, παρέχοντας ένα εύκολο δοκιμασία για την κυτταρική βιωσιμότητα σε άθικτα σφαιροειδή [32]. Δημιουργήσαμε σφαιροειδή συνδυάζοντας κύτταρα HeyA8-FL-GFP με κύτταρα HeyA8-CXCL12-GL ή HeyA8-GL, αντίστοιχα, και στη συνέχεια κατεργάζεται σφαιροειδή με αυξανόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης για 24 ώρες. Σε σφαιροειδή που περιέχουν κύτταρα HeyA8-CXCL12-GL, κύτταρα HeyA8-FL-GFP προστατεύονταν συγκρατημένα κατά κυτταροτοξικές επιδράσεις της σισπλατίνης, αν και μόνο σε 10 μΜ φτάσαμε εντοπίσει σημαντικές διαφορές στην κυτταροτοξικότητα σε σχέση με σφαιροειδή που περιέχουν κύτταρα HeyA8-GL (ρ & lt? 0,05) (Εικ. 4Β). Η έκταση της κυτταροτοξικότητας ήταν συγκρίσιμη ακόλουθες επεξεργασίες φάρμακο για 48 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι CXCL12 προσδίδει πολύ μέτρια προστασία έναντι σισπλατίνης σε σφαιροειδή αποτελούνται αποκλειστικά από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

In vivo

απεικόνιση των CXCR4 και β-αρρεστίνης 2 συμπληρώσεως στον καρκίνο των ωοθηκών

Χρησιμοποιήσαμε ένα ανθρώπινο μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου του μεταστατικού καρκίνου των ωοθηκών ενδοπεριτοναϊκή να προσδιοριστεί σε ποιο βαθμό συμπληρωματικότητας μεταξύ CXCR4 και β-αρρεστίνης 2 εντοπίζει την ενεργοποίηση CXCR4 και αναστολή

in vivo

. Είμαστε συν-ένεση ίσο αριθμό κυττάρων HeyA8-CXCL12-GL HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC και ενδοπεριτοναϊκά σε ποντίκια και χρησιμοποιήθηκαν απεικόνισης βιοφωταύγεια για την ποσοτικοποίηση πρόσληψη β-αρρεστίνης 2 έως CXCR4. Σύμφωνα με αρχικές συνθήκες, παρατηρήσαμε εύκολα βιοφωτισμός από συμπληρωματικότητας μεταξύ HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ και Ar-CBC (Εικ. 5Α), υποδεικνύοντας ενεργό σηματοδότησης CXCR4 σε κακοήθη κύτταρα. Στη συνέχεια τυχαία χωρίζονται σε ομάδες ποντικών που έλαβαν για πέντε ημέρες με είτε AMD3100 ή ελέγχου του οχήματος που παραδίδονται από οσμωτικές αντλίες έγχυσης. Δεν υπήρχε φαινοτυπική στοιχεία τοξικότητας σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με AMD3100. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με AMD3100 είχαν σχετικά λιγότερη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών από τα ζώα που έλαβαν μόνο τον έλεγχο του οχήματος, όπως ποσοτικοποιείται με φθορισμό από μακριά κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη eqFP650 εκφράζεται σε κακοήθη κύτταρα (Σχήμα 5Β). (Ρ & lt? 0,05). Χρησιμοποιώντας φθορισμός από eqFP650 να εξομαλύνει τις διαφορές σε συνολικούς αριθμούς των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, βιοφωτισμός από την αλληλεπίδραση του CXCR4-CBRN με Ar-CBC ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ποντικούς που έλαβαν AMD3100 για πέντε ημέρες, σε σύγκριση με τον έλεγχο του οχήματος. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν τη χρησιμότητα αυτού του συστήματος απεικόνισης για τη μέτρηση φαρμακολογική στόχευση του CXCL12-CXCR4 σηματοδότησης και την προκύπτουσα επιδράσεις της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

(Σχήμα 5C). (Ρ & lt? 0,05).

Α) Εκπρόσωπος εικόνες των ποντικών με ενδοπεριτοναϊκή εμφυτεύματα HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC και τα κύτταρα HeyA8-CXCL12-GL. Εικόνες ελήφθησαν πριν και μετά από 5 ημέρες θεραπείας με οσμωτικές αντλίες που περιέχουν AMD3100 ή ελέγχου του οχήματος. μπαρ κλίμακα απεικονίζει περιοχές τιμών ροή φωτονίων που εμφανίζονται στις εικόνες ψευδοχρωμάτων. Β) Ο φθορισμός από τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μετρήθηκε σε ζωντανά ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με AMD3100 ή ελέγχου του οχήματος. Γράφημα δείχνει μέσες τιμές + SEM για φθορισμό σε σχέση με τιμές που μετρήθηκαν κατά την ημέρα 0 πριν από την έναρξη της θεραπείας. Τα βέλη δείχνουν την περίοδο κατά την οσμωτικές αντλίες ήταν στη θέση του. C) ποσοτικά δεδομένα ροής φωτονίων για κλικ σκαθάρι κόκκινο συμπληρωματικότητα σε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με AMD3100 ή τον έλεγχο του οχήματος, αντίστοιχα. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε φθορισμό όγκου για κάθε ποντικό και γραφικά ως μέσες τιμές + SEM (n = 7 ποντίκια ανά ομάδα). *, P & lt?. 0.05

Η

Η θεραπεία συνδυασμού με AMD3100 και σισπλατίνη μειώνει το φορτίο του όγκου

Δείξαμε προηγουμένως ότι μόνο η θεραπεία παράγοντα με AMD3100 βελτιώνει και μόνο μέτρια την επιβίωση των ποντικών με ενδοπεριτοναϊκή διαδίδονται καρκίνο των ωοθηκών [14]. Υποθέσαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία με AMD3100 και ένα πρότυπο χημειοθεραπευτικό φάρμακο θα βελτιώσει σημαντικά τον έλεγχο του όγκου και της επιβίωσης, με βάση μελέτες σε λευχαιμία που δείχνουν ότι CXCL12 στο μικροπεριβάλλον του όγκου προσδίδει αντοχή στην αποκοπή κυτταροτοξικά φάρμακα [33]. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, που εμφυτεύεται ποντίκια με κύτταρα HeyA8-CXCL12-GL HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC και. Μία εβδομάδα μετά την εμφύτευση των όγκων που τυχαιοποιήθηκαν ποντίκια σε τέσσερις ομάδες θεραπείας: 1) τον έλεγχο του οχήματος? 2) AMD3100 παραδίδονται από αντλίες έγχυσης οσμωτικής δύο εβδομάδων? 3) σισπλατίνη χορηγείται ως 4 mg /kg ε.π. κάθε 5 ημέρες? και 4) σε συνδυασμό AMD3100 και σισπλατίνη. Συνεχίσαμε ενέσεις σισπλατίνης μέσα από την περίοδο παράδοσης δύο εβδομάδων AMD3100 αντλίες και στη συνέχεια διακόπηκαν όλα θεραπείας.

Χρησιμοποιήσαμε βιοφωτισμός από HeyA8-CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC να αναλύσει CXCR4 σηματοδότησης

in vivo

και φθορισμός απεικόνισης για eqFP650 να ποσοτικοποιηθεί φορτίο όγκου συναρτήσει του χρόνου. Υπολογίσαμε περιοχή κάτω από την καμπύλη για βιοφωταύγεια και φθορισμού και χρησιμοποιούνται αναλογίες αυτών των παραμέτρων για την αξιολόγηση της αναστολής των CXCR4 την πάροδο του χρόνου (Σχ. 6Α). Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με AMD3100 ή το συνδυασμό AMD3100 και σισπλατίνη είχαν σημαντικά χαμηλότερη βιοφωτισμός από CXCR4-ΧΒΡΠ και Ar-CBC συμπλήρωση σε σχέση με τη συνολική επιβάρυνση του όγκου, που δείχνουν ότι το φάρμακο αυτό μπλοκάρει με επιτυχία CXCR4 σηματοδότησης στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

in vivo

(p & lt? 0,01)

Α) η περιοχή κάτω από την ανάλυση της καμπύλης των δεδομένων απεικόνισης για αναλογίες της συμπληρώσεως κλικ σκαθαριού κόκκινο λουσιφεράσης για CXCR4 και β-αρρεστίνης 2 κανονικοποιημένη σε φθορισμό eqFP650 (φορτίο όγκου) σε ποντίκια εμφυτεύεται με HeyA8. -CXCR4-ΧΒΡΠ /Ar-CBC και HeyA8-CXCL12-GL κύτταρα. Τα δεδομένα δείχνονται για τις ομάδες που έλαβαν θεραπεία με έκδοχο ελέγχου, AMD3100, σισπλατίνη, ή και τα δύο AMD3100 και σισπλατίνη για δύο εβδομάδες αρχίζοντας μία εβδομάδα μετά την εμφύτευση των κυττάρων. Γράφημα δείχνει μέσες τιμές + SEM (n = 7 ποντίκια ανά ομάδα). *, P & lt? 0,05. Β) περιοχή κάτω από την καμπύλη ανάλυση του φθορισμού από eqFP650 παράγεται από εμφυτευμένα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών κατά τη διάρκεια του πειράματος. Γράφημα δείχνει μέσες τιμές + SEM. *, P & lt? 0,05, **, p & lt? 0,01. Καμπύλες C) Kaplan-Meier για την επιβίωση των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με όχημα, AMD3100, σισπλατίνη, ή AMD3100 και σισπλατίνη. Όλες οι ομάδες θεραπείας διαφέρει από τον έλεγχο του οχήματος (ρ & lt? 0,05). Αλλά όχι από το άλλο

Η

Ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με μοναδικό παράγοντα AMD3100 ή σισπλατίνη είχαν μέτρια, αλλά σημαντική, μείωση της επιβάρυνσης του όγκου μετρήθηκε με απεικόνιση φθορισμού πάνω η πορεία του πειράματος (ρ & lt? 0,05) (Σχ 6Β.). Συγκριτικά, η συνδυασμένη θεραπεία με αμφότερα AMD3100 και σισπλατίνη μείωσε σημαντικά το συνολικό αριθμό των κυττάρων HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος ή κάθε φάρμακο μόνο του (ρ & lt? 0,01 και ρ & lt? 0,05, αντίστοιχα). Αυτές οι διαφορές ήταν εμφανείς ακόμη και αν τα ποντίκια έλαβαν μόνο δύο εβδομάδες θεραπείας με αυτά τα φάρμακα. Ποντίκια εμφυτεύθηκαν με HeyA8 καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα αναπτύχθηκαν ασκίτη, αλλά δεν υπήρξε καμία διαφορά στην συνολική σωματικών βαρών μεταξύ διαφόρων ομάδων αγωγής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Υπήρχε μια τάση προς βελτιωμένη επιβίωση σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με αμφότερα AMD3100 και σισπλατίνη (Εικ. 6C). Ωστόσο, οι διαφορές μεταξύ των AMD3100, σισπλατίνη, και σε συνδυασμό AMD3100 και σισπλατίνη δεν ήταν σημαντικές, αν και όλες οι θεραπείες αυξημένη επιβίωση σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος (ρ & lt? 0,05).

Συζήτηση

Ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένει ο κορυφαίος αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες, με συνολική επιβίωση των πέντε ετών της ≈50%. Κακή πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών οφείλεται εν μέρει στο γεγονός ότι οι περισσότεροι ασθενείς παρουσιάζουν με προχωρημένη νόσο που σχετίζεται με ενδοπεριτοναϊκή, το ήπαρ, ή συστημική μεταστάσεων [34]. Ο καρκίνος των ωοθηκών αρχικά είναι ευαίσθητο σε χημειοθεραπεία με φάρμακα με βάση την πλατίνα, αν και οι περισσότεροι ασθενείς υποτροπιάζουν με καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο εντός περίπου ενός έτους.