Αφηρημένο

Ένα ευέλικτο βιοαντιδραστήρα κατάλληλο για τη δυναμική καλλιέργεια εναιωρήματος κυττάρων κάτω από ρυθμιζόμενους συνθήκες διατμητικής τάσης έχει αναπτυχθεί και δοκιμαστεί προκαταρκτικά σφαιροειδή καρκινικών κυττάρων καλλιέργειας. Με την υιοθέτηση απλών τεχνολογικών λύσεων και την αποφυγή περιστρεφόμενα εξαρτήματα, το βιοαντιδραστήρα εκμεταλλεύεται τις στρωτή υδροδυναμική ίδρυση εντός του θαλάμου καλλιέργειας που επιτρέπει δυναμική ανάρτηση των κυττάρων σε ένα περιβάλλον ευνοϊκό για την μεταφορά μάζας, κάτω από ένα ευρύ φάσμα ρυθμιζόμενους διατμητικής συνθήκες στρες. Η φάση του σχεδιασμού της συσκευής έχει υποστηριχθεί από multiphysics μοντελοποίηση και έχει παράσχει μια ολοκληρωμένη ανάλυση των αρχών λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα. Επιπλέον, ένα επεξηγηματικό παράδειγμα στο παρόν παρουσιάζονται με multiphysics προσομοιώσεις χρησιμοποιούνται για τον καθορισμό των κατάλληλων συνθηκών λειτουργίας βιοαντιδραστήρα για προκαταρκτική

in vitro

βιολογικές δοκιμές σε μια κυτταρική γραμμή καρκινώματος ανθρώπινου πνεύμονα. Τα βιολογικά αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι η ultralow διάτμηση δυναμική αναστολή που προβλέπεται από τη συσκευή είναι ευεργετική για τον καρκίνο καλλιέργεια κυττάρων σφαιροειδή. Σε σύγκριση με το στατικό έλεγχο αναστολή, δυναμική ανάρτηση κυττάρων διατηρεί τα μορφολογικά χαρακτηριστικά, προάγει την μεσοκυττάρια σύνδεση, αυξάνει το μέγεθος σφαιροειδές (αύξηση 2,4 φορές) και τον αριθμό των κυττάρων του ποδηλάτου (1,58-φορές αύξηση), και μειώνει την διπλή ζημιά σκέλος του DNA (1,5-φορές μείωση). Προβλέπεται ότι η ευελιξία αυτού του βιοαντιδραστήρα θα μπορούσε να επιτρέψει την έρευνα και την επέκταση των διαφορετικών τύπων κυττάρων στο μέλλον

Παράθεση:. Μασάι D, Isu G, Madeddu D, Cerino G, Falco A, Frati C, et al . (2016) Ένα ευέλικτο βιοαντιδραστήρα για δυναμικές Πολιτισμού Αναστολή κυττάρων. Εφαρμογή στα σφαιροειδή Cell Culture of Cancer. PLoS ONE 11 (5): e0154610. doi: 10.1371 /journal.pone.0154610

Επιμέλεια: Maurizio Pesce, Centro Cardiologico Monzino, Ιταλία

Ελήφθη: 23 του Δεκέμβρη του 2015? Αποδεκτές: 15η Απριλίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: 4η Μαΐου, 2016

Copyright: © 2016 Μασάι et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση: το έργο έλαβε μερική χρηματοδότηση από (1) του Ευρωπαϊκού FP7 Συνεργασία – Συνεργατική έργου «Βιοδραστικών εξαιρετικά πορώδη και ενέσιμα σκαλωσιές Ελέγχου Stem Cell Πρόσληψη, Πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση. και ενεργοποίηση αγγειογένεση για την Καρδιαγγειακή Μηχανική ιστών «- BIOSCENT την περίοδο 2009-2013 (ID 214539), και (2) το 2012 Έργο Ιταλική Εθνική ΠΡΙΝ« Μια Bioprocess για τη βελτιστοποίηση των 3D Cardiosphere με βάση τα κατασκευάσματα για καρδιακή Αναγεννητικής Ιατρικής »- BEAT3DHEART, 2014 -2017 (20123E8FH4), καθώς και πρόσθετη χρηματοδότηση στο εσωτερικό Politecnico di Torino και Università degli Studi di Parma. Bioexpansys Srl παρείχε οικονομική στήριξη με τη μορφή του μισθού για συγγραφέα GFDL και την έρευνα υλικών, αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι των συγγραφέων αρθρωτά στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και τους συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά συμφέροντα: Giuseppe Falvo D’Urso Labate χρησιμεύει ως Διευθύνων Σύμβουλος για Bioexpansys Srl, του διανομέα της δυναμικής συσκευής πολιτισμό. Κανένας από τους συγγραφείς έχουν λάβει αμοιβές ή αμοιβή συμβούλων στο γράψιμο αυτού του χειρογράφου. Δεν υπάρχουν άλλες πιθανές συγκρούσεις συμφερόντων που σχετίζονται με αυτό το άρθρο έχουν αναφερθεί. Ούτε Bioexpansys Srl, ούτε οποιαδήποτε άλλη ιδιωτική εταιρεία είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συνθήκες του Δρ Falvo D’Urso Labate ή οποιοδήποτε άλλο συγγραφέων απασχόληση δεν μεταβάλλουν των συγγραφέων τήρηση PLoS ONE πολιτικές σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων ή υλικά.

Εισαγωγή

Η παραγωγή μεγάλης κλίμακας των κυττάρων είναι ένα υποχρεωτικό βήμα για τη δημιουργία οικονομικά βιώσιμων in vitro πειραματικά μοντέλα για τη βασική έρευνα, μοντελοποίηση των ασθενειών και τον έλεγχο των ναρκωτικών, και να μεταφράσει σίγουρα στρατηγικές μηχανική ιστών και την αναγεννητική ιατρική στην κλινική πρακτική για θεραπευτικές εφαρμογές. Ωστόσο, επεκτασιμότητα και την τυποποίηση σε κυτταρικές διεργασίες παραγωγής εξακολουθούν να είναι σημαντικές προκλήσεις. Ειδικότερα, όταν μεγάλοι αριθμοί κυττάρων (10

10-10

12) είναι υποχρεωτικά, τα συμβατικά δύο διαστάσεων (2D) στρατηγικές του πολιτισμού, βασίζεται κυρίως σε εγχειρίδιο, εξαιρετικά διαστημικών και υψηλής έντασης εργατικού δυναμικού παρεμβάσεις, είναι πρακτικά και οικονομικά βιώσιμο [1-5].

σε μια προοπτική κλιμάκωσης και εμπνευσμένο από τις μεθόδους παραγωγής φαρμάκων στην βιοφαρμακευτική βιομηχανία [6,7], τριών διαστάσεων (3D) καλλιέργεια εναιωρήματος έχει αποδειχθεί ότι είναι μια πλεονεκτική εναλλακτική λύση μονοστοιβάδας τεχνικές για μεγάλης κλίμακας επέκταση των κυττάρων [4,5,8,9]. Πιο αναλυτικά, οι μέθοδοι αναστολής έχουν υιοθετηθεί ευρέως: (1) για την κλιμακούμενη και ελεγχόμενη επέκταση των βλαστικών κυττάρων [10-15] και τα καρκινικά κύτταρα [16-18]? (2) για την οδήγηση διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων [13,19-22]? (3) για την παραγωγή των κυτταρικών σφαιροειδή και κατασκευάσματα ιστών που μοιάζουν [23-25]. Η πρόβλεψη ενός 3D περιβάλλον καλλιέργειας εναιωρήματος, μιμούμενη το μικροπεριβάλλον της κυτταρικής κόγχη, έχει αποδειχθεί ότι είναι ευεργετική, προωθώντας την κυτταρική επιβίωση και διατήρηση των κυττάρων λειτουργικές ιδιότητες

in vitro

[9,26,27]. Επιπλέον, όταν εναιώρημα λαμβάνεται με δυναμική ανάδευση του μέσου καλλιέργειας, (1) ο σχηματισμός των βαθμίδων σε, π.χ., θερμοκρασία, ρΗ, διαλυμένο οξυγόνο, θρεπτικές ουσίες /μεταβολιτών εμποδίζεται, (2) η μεταφορά του οξυγόνου και των θρεπτικών ουσιών είναι αυξημένη, και (3) η καθίζηση των καλλιεργημένα κύτταρα /κατασκευές αποφεύγεται, προχωρώντας έτσι πέρα ​​από τις εγγενείς περιορισμούς των συστημάτων στατική καλλιέργεια [4,7,9,28].

Σήμερα, η δυναμική καλλιέργεια εναιωρήματος για την κλιμακούμενη παραγωγή και διαφοροποίηση των κυττάρων ως επί το πλείστον πραγματοποιείται με αναδευόμενη δεξαμενή και περιστροφή βιοαντιδραστήρες [2,4]. Τέτοιες συσκευές έχουν σχεδιαστεί για την παροχή ενός 3D ομοιογενές περιβάλλον τον πολιτισμό και για τη διευκόλυνση της παρακολούθησης και του ελέγχου των παραμέτρων του πολιτισμού, οδηγώντας σε πιο επαναλήψιμη, ισχυρό και οικονομικά αποδοτικές διεργασίες [5, 29,30,31]. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές βιοαντιδραστήρες εξακολουθούν να υποφέρουν από κρίσιμα ζητήματα, περιορίζοντας την αναβάθμιση και την τυποποίηση των βιολογικών διεργασιών επέκτασης. Όσον αφορά βιοαντιδραστήρες με ανάδευση, οι επιδόσεις τους μπορεί να επηρεαστεί από (1) συγκρούσεις των κυττάρων με το στροφείο και (2) από την έναρξη της τυρβώδους ροής, ότι και οι δύο μπορούν να προκαλέσουν μη φυσιολογικές καταπονήσεις μηχανικά και υδροδυναμικά διάτμησης επί των κυττάρων και να οδηγήσει σε βλάβη των κυττάρων. Επιπλέον, αυτές οι δυσμενείς συνθήκες μπορούν να επηρεάσουν ρυθμό κυτταρικής ανάπτυξης και του μεταβολισμού, παρεμβαίνει με βλαστοκυττάρων pluripotency, και περιορίζουν την αποτελεσματικότητα και η αναπαραγωγιμότητα της διεργασίας καλλιέργειας [4,9,28,30,32,33]. Περιστροφή βιοαντιδραστήρες παράγουν ένα χαμηλής διάτμησης περιβάλλον καλλιέργειας στρες, επιτρέποντας να ξεπεραστούν εν μέρει τους περιορισμούς των συσκευών αναδεύεται δεξαμενής. Ωστόσο, η πολυπλοκότητα των τεχνολογικών λύσεων που υιοθετούνται για την περιστροφή κάνει αυτές τις συσκευές δεν είναι εύκολα επεκτάσιμη και ακατάλληλο για την αντικατάσταση του συνεχούς μέσου και παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο [4].

Σας παρουσιάζουμε ένα ευέλικτο βιοαντιδραστήρα κατάλληλο για το άγχος ρυθμιζόμενους διάτμηση δυναμική κυτταρική καλλιέργεια εναιωρήματος. Πιο αναλυτικά, υιοθετώντας απλές τεχνολογικές λύσεις και αποφεύγοντας περιστρεφόμενα εξαρτήματα, η προτεινόμενη βιοαντιδραστήρα επιτρέπει την αναστολή των κυττάρων εξασφαλίζοντας ένα καθεστώς ροής γραμμική ανάμιξη, έτσι εγγυάται οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών των μεταφορών και, τελικά, ομοιογενές περιβάλλον πολιτισμός κάτω από ένα ευρύ φάσμα της διατμητικής συνθήκες στρες.

για να πάει πέρα ​​από την προσέγγιση δοκιμής και λάθους πειραματικά και να επιτευχθεί μια βαθύτερη κατανόηση της δυναμικής των ρευστών ανάπτυξη μέσα στο περιβάλλον του πολιτισμού [34,35], η φάση του σχεδιασμού της συσκευής έχει υποστηριχθεί από το multiphysics silico μοντελοποίησης, παρέχοντας μια ολοκληρωμένη ανάλυση των αρχών λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα. Επιπλέον, τα ευρήματα από τις προσομοιώσεις multiphysics υπηρέτησε ως κριτήρια για να ορίσετε τις κατάλληλες συνθήκες λειτουργίας βιοαντιδραστήρα για προκαταρκτική

in vitro

δοκιμές. Ειδικότερα, αυτή η πρώτη μελέτη επικεντρώθηκε στην αξιολόγηση της καταλληλότητας του βιοαντιδραστήρα ως ultralow διατμητικής τάσης δυναμική διάταξη ανάρτησης για καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων σφαιροειδές. Για το σκοπό αυτό, ο ανθρώπινος πνεύμονας κυτταρική γραμμή καρκινώματος Calu-3 υποβλήθηκε σε ultralow διάτμηση δυναμική ανάρτηση που παρέχεται από τη συσκευή. Τα βιολογικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η προσέγγιση αυτή διατηρεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vitro

, συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού σφαιροειδές, και προτείνουν την καταλληλότητα του προτεινόμενου βιοαντιδραστήρα για την έρευνα σχετικά με λειτουργικές ιδιότητες των κυττάρων και για την επέκταση των διαφορετικών τύπων κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

δυναμική βιοαντιδραστήρα αναστολή

Ο σχεδιασμός της συσκευής (Σχήμα 1Α) οδηγήθηκε από δύο βασικές προϋποθέσεις: (1) να παρέχει δυναμική καλλιέργεια εναιωρήματος με την κατάλληλη ανάμειξη? (2) να εγγυηθεί συντονίσιμο ultralow έως μέτρια τάση διάτμησης περιβάλλον πολιτισμός, ρυθμιζόμενο με βάση τις απαιτήσεις του πολιτισμού με την απλή τροποποίηση συνθηκών λειτουργίας. Αυτοί οι στόχοι επιτεύχθηκαν συνδυάζοντας τα ιδιόμορφο γεωμετρικά χαρακτηριστικά του θαλάμου βιοαντιδραστήρα της καλλιέργειας με τη συνεχή ανακυκλοφορία του μέσου καλλιέργειας εξασφαλίζεται από ένα κύκλωμα επανακυκλοφορίας κλειστού βρόχου, αποφεύγοντας τη χρήση πτερωτές ή /και περιστροφική συστατικά. Αυτός ο συνδυασμός προωθεί τη δημιουργία έντονης δίνες μέσα στο θάλαμο του πολιτισμού, που διατηρούν κύτταρα /κατασκευές σε δυναμική ανάρτηση, ελαχιστοποιώντας την καθίζηση τους.

(Α) Σχηματική κλήρωση του βιοαντιδραστήρα παρουσιάζει εσωτερικά συστατικά της και αξονική συμμετρία του (κόκκινο γραμμές). (Β) Εικόνα του βιοαντιδραστήρα. (C) Σχηματική αναπαράσταση της ρύθμισης του βιοαντιδραστήρα είναι συνδεδεμένα στο κύκλωμα κλειστού βρόγχου επανακυκλοφορίας και τοποθετείται εντός του επωαστήρα.

Η

Ο βιοαντιδραστήρα (Σχήμα 1Β, εξωτερικές διαστάσεις = 95 mm x 70 mm x 70 χιλιοστά) αποτελείται από: μια βάση από ανοξείδωτο ατσάλι AISI 316L? ένα θάλαμο πολυανθρακικό πολιτισμού για τη στέγαση των κυττάρων /κατασκευές (όγκος θαλάμου = 75 mL)? ένα καπάκι πολυανθρακικό. Η καμπυλότητα και το σχήμα του εσωτερικού τοιχώματος του θαλάμου καλλιέργειας σχεδιαστεί και βελτιστοποιηθεί για την παραγωγή της έντονης δινών αναστολής δείγματος (όπως περιγράφεται λεπτομερώς στη συνέχεια). Αιωρούμενα κύτταρα /κατασκευάσματα περιορίζονται στο εσωτερικό του θαλάμου καλλιέργειας μέσω της παρουσίας του (1), ένα ανοξείδωτο χάλυβα βαλβίδα μονής κατεύθυνσης ελέγχου AISI 316L (η οποία εμποδίζει αντίστροφη ροή και εγγυάται μία είσοδο συμμετρική ροή), και (2) ένα μέσο καλλιέργειας διαπερατό φίλτρο ( Durapore

®, MerckMillipore, Γερμανία), το οποίο αποτρέπει την ακούσια εξόδους των κυττάρων. Ο βιοαντιδραστήρας είναι μέρος ενός κυκλώματος κλειστού βρόχου για την ανακυκλοφορία του οξυγονωμένου μέσου καλλιέργειας (Σχήμα 1 C). Τέτοια κύκλωμα επανακυκλοφορίας αποτελείται από ένα μέσο δεξαμενή, σωλήνωση σιλικόνης υπεροξείδιο-cured οξυγόνο διαπερατό (Masterflex L /S

®, Cole-Parmer, IL, USA) με ζεύξεις ταχείας αποσύνδεσης, και μία περισταλτική αντλία (Masterflex L /S

®, Cole Parmer-, IL, USA), για ένα συνολικό όγκο εργασίας των περίπου 200 mL. Για να εγγυηθεί την επαρκή παροχή οξυγόνου εντός του θαλάμου καλλιέργειας, το κύκλωμα επανακυκλοφορίας είχε μέγεθος χρησιμοποιώντας ένα αναλυτικό μοντέλο ισοζυγίου μάζας οξυγόνο, σύμφωνα με Orr et al. [36].

Η λειτουργία αρχή του βιοαντιδραστήρα βασίζεται στη συνεχή ανακυκλοφορία του μέσου καλλιέργειας εντός του θαλάμου καλλιέργειας υπό καθεστώς στρωτής ροής, που λαμβάνονται μέσω της διαφοροποίησης του ρυθμού ροής κύκλωμα επανακυκλοφορίας, με σκοπό την παραγωγή από ultralow έως μέτρια τάση διάτμησης δυναμικές συνθήκες αναστολή. Αναλυτικότερα, το μέσο ρέει μέσω της βαλβίδας ελέγχου, οδηγείται από την περισταλτική αντλία κατά την κλίση στατική πίεση, και διαποτίζει το θάλαμο καλλιέργειας. Διαδοχικά, το μέσο περνά μέσα από το φίλτρο και ρέει έξω από το καπάκι, κινείται πίσω στη δεξαμενή σε μια συνεχή διαδικασία κλειστού βρόχου. Ο σχηματισμός της έντονης δινών στο εσωτερικό του θαλάμου καλλιέργειας επιτρέπει τη δυναμική αναστολή των καλλιεργημένων κυττάρων /κατασκευές (S1 Ταινία).

Υπολογιστικά μοντέλα

Μια υπολογιστική προσέγγιση multiphysics υποστήριξε το σχεδιασμό και τις φάσεις βελτιστοποίηση της η συσκευή, που επιτρέπει την αναγνώριση της (1) η βέλτιστη γεωμετρία του θαλάμου καλλιέργειας, και (2) οι συνθήκες λειτουργίας για τον πολιτισμό δυναμική ανάρτηση κυττάρων υπό καθορισμένες διάτμηση αξίες στρες. Μια τεράστια σειρά προσομοιώσεων διεξήχθη ποικίλλουν, τόσο κύτταρο /κατασκεύασμα διαστάσεις (σε όρους διαμέτρου τους) και υψηλής αραιό κυτταρικές πυκνότητες εμβολιασμό, προκειμένου να μελετηθεί η ευαισθησία της ροής ρευστού σε αυτές τις παραμέτρους καλλιέργειας εντός του όγκου του θαλάμου.

Τεχνικά, εκμεταλλευόμενοι την αξονική συμμετρία της συσκευής (Σχήμα 1Α), ένα σύνολο αξονοσυμμετρικά χρόνο που εξαρτάται από αριθμητικές προσομοιώσεις πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη πεπερασμένο όγκο τεχνική που βασίζεται σε εμπορικό λογισμικό (FLUENT, ANSYS Inc., ΡΑ, ΗΠΑ). Ο τομέας υγρό επιλύονται με την χρήση του λογισμικού ICEM CFD (ANSYS Inc., PA, USA). Μια πληθάριθμο ματιών ίσο 6.5×10

3 κύτταρα τετράπλευρο θεωρήθηκε. Όπως και σε προηγούμενες μελέτες [21,37], η ταυτόχρονη παρουσία του μέσου καλλιέργειας και τα κύτταρα μοντελοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Eulerian-Eulerian Multiphase μοντέλο, το οποίο επιτρέπει μίγματα πολλαπλών διαχωριστούν ακόμα αλληλεπιδρούν φάσεις ενός συνεχούς να περιγραφεί. Για κάθε φάση, οι εξισώσεις της κίνησης, οι εξισώσεις Navier-Stokes, λύθηκαν με την αριθμητική λύτης. Το μέσο καλλιέργειας, η οποία θεωρείται ως η κύρια φάση, υποτέθηκε ότι είναι νευτώνεια με φυσικές ιδιότητες των μέσων καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται συνήθως σε εφαρμογές κυτταρικής καλλιέργειας (δυναμικό ιξώδες = 1×10

-3 Pa · s, πυκνότητα = 1,000 kg /m

3) [21]. Αιωρούμενα κύτταρα, θεωρείται ως η δευτερεύουσα βυθίζεται φάση, μοντελοποιήθηκαν ως μη παραμορφώσιμο σφαιρικές χάντρες. Στο επεξηγηματικό παράδειγμα που αναφέρθηκαν σε αυτό το έργο, μία πυκνότητα ίση με 1.070 kg /m

3 [38] και με μέση διάμετρο ίση με 20 μm (δηλαδή η μετρούμενη διάμετρος του καρκίνου Calu-3 κύτταρα) θεωρήθηκαν. Η παρουσία του φίλτρου διαμορφώθηκε ως ένα πορώδες μέσο χαρακτηρίζεται από μια τιμή του Darcy υδραυλική αντίσταση ίση με 96×10

4 m

-2 για το μέσο καλλιέργειας και τον καθορισμό της μέγιστης υδραυλικής αντίστασης έγιναν δεκτές από την λύτης (1×10

20 m

-2) για τα κύτταρα, που έχουν το φίλτρο ένα μέσο μέγεθος πόρων από 5 μm, έτσι είναι αδιαπέραστο από αυτούς. Κυττάρων εμβολιασμό ήταν υποτίθεται ότι είναι ομοιογενής ως προς την κατώτερη περιοχή του θαλάμου καλλιέργειας. Η υπόθεση αυτή μεταφράζεται στην υπολογιστική συνταγογράφηση πλαισίου, ως αρχική προϋπόθεση, ένα κλάσμα ομοιόμορφη όγκος (VF) που καταλαμβάνεται από τα κύτταρα (η δευτερεύουσα φάση) στην κάτω περιοχή του δοχείου (10 mL, στο επεξηγηματικό παράδειγμα χρησιμοποιώντας Calu-3 κυτταρική γραμμή) . Προσομοιώσεις διεξήχθησαν θεωρώντας πάντοτε εξαιρετικά αραιό καλλιέργειες εναιωρήματος (αριθμοί Stokes σημαντικά μικρότερη από 1, η τιμή VF μικρότερη από 1%), για τις οποίες παραλλαγές στην αρχική VF δεν επηρεάζουν σημαντικά το πεδίο ροής του πρωτεύοντος φάσης. Ως ενδεικτική οριακή τιμή για καθίζηση, μια τιμή VF υψηλότερο από το 20% θεωρήθηκε, που αντιστοιχεί σε περίπου το ένα τρίτο του μέγιστου ορίου συσκευασίας 63%, δηλαδή το όριο συσκευασίας για μη παραμορφώσιμο σφαιρικές χάντρες συσκευάζονται τακτικά [21]. Προσομοιώσεις επεκτάθηκαν πάνω τιμές ρυθμού ροής στο εύρος 5-120 mL /min, με προσομοιωμένη χρόνο πολιτισμό ίση με 60 λεπτά, τα οποία θεωρήθηκαν επαρκή για να περιγράψει πλήρως τη δυναμική του μέσου στο εσωτερικό του θαλάμου καλλιέργειας. Το απλό σύστημα σταδιακής συζευγμένο χρησιμοποιήθηκε για την σύζευξη πίεση ταχύτητας. Η Δεύτερη Σειρά ανοδικής και η ΓΡΗΓΟΡΗ διαμόρφωση χρησιμοποιήθηκαν για τη χωρική διακριτοποίηση της ορμής και της μεταφοράς δευτερογενή φάση, αντίστοιχα. Οι λεπτομέρειες που σχετίζονται με το μοντέλο εξισώσεις και οριακές συνθήκες που αναφέρονται στο S1 Κείμενο.

Επιπλέον, προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της δυναμικής ανάμιξης για την ίδρυση εντός του θαλάμου καλλιέργειας για την εξέλιξη της φυσικής και περιβαλλοντικής ποσότητες, η μεταφορά ενός βαθμωτή ποσότητα εντός του θαλάμου καλλιέργειας πρότυπο. Πιο αναλυτικά, η μεταφορά του οξυγόνου που διαλύεται στο μέσο που ρέει μέσα στον θάλαμο καλλιέργειας προσομοιώνεται με την επίλυση της εξίσωσης μεταφοράς μεταγωγή /διάχυσης, σε συνδυασμό με Navier-Stokes εξισώσεις. Ένα πλήρως ανοξική μέσο καλλιέργειας εντός του θαλάμου καλλιέργειας θεωρήθηκε ως αρχική συνθήκη (χειρότερη περίπτωση). Αυτό το υπολογιστικό μοντέλο μπορεί να γενικευθεί σε όλα τα διαλυμένα είδη που χαρακτηρίζεται από παρόμοιους αριθμούς Peclet (δηλαδή η αναλογία μεταξύ μεταθετική και διάχυσης ποσοστά μεταφοράς). Οι λεπτομέρειες σχετικά με το μοντέλο των παραδοχών και εξισώσεις που αναφέρθηκαν σε S2 Κείμενο.

In vitro

κυτταρικής καλλιέργειας

Η απόδοση του βιοαντιδραστήρα ήταν επεξηγηματική δοκιμαστεί στο ultralow διατμητικής τάσης καρέ δυναμική του πολιτισμού (επιβολή ρυθμό ροής 5 mL /min), όπως προσδιορίζονται από την in silico αναλόγου του πειράματος in vitro (βλέπε αποτελέσματα). Η μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) κυτταρική γραμμή Calu-3 (American Type Culture Collection, ATCC, VA, USA) επιλέχθηκε και τα αποτελέσματα της δυναμικής καλλιέργειας σε σύγκριση με ένα στατικό έλεγχο καλλιέργεια εναιωρήματος. Λεπτομερώς, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma Aldrich, ΜΟ, USA) προστέθηκε με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (P /S) και 1% μη απαραίτητα αμινοξέα (ΝΕΑΑ, Sigma Aldrich, ΜΟ, USA), και διατηρήθηκαν κάτω από πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων σε 37 ° C σε νερό-κορεσμένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα. Μετά την επέκταση σε φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας, 9×10

6 Calu-3 κύτταρα (1.92×10

5 κυττάρων /mL) εμβολιάσθηκαν εντός του θαλάμου βιοαντιδραστήρα καλλιέργειας και καλλιεργήθηκαν για 5 ημέρες σε δυναμική ανάρτηση με πλήρες μέσο ανάπτυξης. Ο βιοαντιδραστήρας λειτουργούσε σε ένα ρυθμό ροής 5 mL /min. Παράλληλα, Calu-3 κύτταρα σπάρθηκαν στην ίδια πυκνότητα για φιάλες καλλιέργειας χαμηλής προσκόλλησης (Corning Inc., ΝΥ, USA) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος, που αντιπροσωπεύουν ένα πρότυπο στατική καλλιέργεια εναιωρήματος. Μετά από 5 ημέρες, δυναμική και στατική αιωρούμενα καλλιεργημένα κύτταρα διασώθηκαν από τον βιοαντιδραστήρα και από την φιάλη καλλιέργειας χαμηλής προσκόλλησης, αντίστοιχα, και επανα-αιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης για περαιτέρω ανάλυση. Τρεις ανεξάρτητες στατικές και δυναμικές καλλιέργειες αναστολή πραγματοποιήθηκαν.

Εκτιμήσεις

in vitro

καλλιέργεια κυττάρων

κύτταρα που συλλέγονται από το βιοαντιδραστήρα και από τη φιάλη καλλιέργειας χαμηλής προσκόλλησης

3 Calu- και επανα-αιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο ανάπτυξης ερευνήθηκαν με ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus CK40, Ιαπωνία). Μικροφωτογραφίες συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με ένα λογισμικό ανάλυσης εικόνας (Image Pro-plus 4.0, Media Cybernetics, USA) σε σειρά (1) για να υπολογίσουμε τον αριθμό των μεμονωμένων κυττάρων Calu-3 και τον αριθμό των Calu-3 κύτταρα που σχηματίζουν τα σφαιροειδή, και (2) για τον προσδιορισμό των μεγεθών σφαιροειδές.

Επιπλέον, Calu-3 κύτταρα από δυναμικές και στατικές ανασταλεί καλλιέργεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για Ηλεκτρονική Μικροσκοπία ανάλυση (ΤΕΜ) και για ανοσοκυτταροχημεία. Για την ανάλυση ΤΕΜ, Calu-3 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα Karnovsky (4% φορμαλδεΰδη, 5% γλουταραλδεΰδη). Τα δείγματα σταθεροποιούνται στη συνέχεια εις 1% τετροξείδιο του οσμίου και αφυδατώνονται με την αύξηση της συγκέντρωσης του αλκοόλ. Στη συνέχεια, τα δείγματα πλύθηκαν με οξείδιο του προπυλενίου και ενσωματωμένα σε εποξική ρητίνη. Τμήματα πάχους 0,5 μm βάφτηκαν με μπλε του μεθυλενίου και σαφρανίνη να επιλέξετε μορφολογικά το πεδίο ενδιαφέροντος. Στη συνέχεια, υπέρλεπτων τομές συλλέχθηκαν σε ένα πλέγμα χαλκού 300-mesh και, μετά από χρώση με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο, εξετάστηκαν ποιοτικά υπό ΤΕΜ (Philips ΕΜ 208S, The Netherlands). Για να αξιολογηθεί το κλάσμα των κυττάρων σε ενεργά κυτταρικού κύκλου, η παρουσία αναστρέψιμη DNA διπλής διαλείμματα σκέλος, και ο αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και cytocentrifuged σε μια γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα για να ληφθεί μια πυκνότητα 10

5 κυττάρων ανά σημείο. κηλίδες κυττάρων χρωματίστηκαν με αντισώματα αντι-Κί67 (Ki67, μονοκλωνικό ποντικού, ϋΑΚΟ, Ιταλία) και αντι-γάμμα ιστόνης Η2ΑΧ (γH2AX, κουνελιού πολυκλωνικό, Bethyl Laboratories, ΤΧ, USA) και αποκαλύφθηκε από DAB (3,3′-διαμινοβενζιδίνη) υπεροξειδάση (HRP) αντίδραση Kit Υπόστρωμα (ϋΑΚΟ, Ιταλία). Η ποσοτική εκτίμηση του κλάσματος του Κί67 και θετικών κυττάρων γH2AX διεξήχθη με τον υπολογισμό του αριθμού των θετικών πυρήνων επί συνόλου 900-2000 οι πυρήνες μετρήθηκαν σε κάθε δείγμα αναλύθηκε. Το αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στο επίπεδο του ενός κυττάρου διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας την In Situ κυτταρικού θανάτου Detection Kit, Φλουορεσκεΐνη δοκιμασίας (Enzyme Solution TdT, Label Solution φλουορεσκεΐνη-dUTP, Roche). Πράσινο θετικότητα πυρηνική φθορισμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Olympus ΒΧ60. Πυρήνες αναγνωρίστηκαν από το μπλε φθορισμό του 4 ‘, 6-diamidine-2-phenyndole (DAPI, Sigma, Ιταλία). Το κλάσμα των νεκρών κυττάρων εκτιμήθηκε με μέτρηση του αριθμού των αποπτωτικών πυρήνων πάνω από ένα σύνολο περίπου 1000 κύτταρα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση της μονόδρομης ANOVA τεστ. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν ρ & lt? 0,05. Προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή τυχαία προσκόλλησης των κυττάρων /σφαιροειδή επί του φίλτρου μετά από 5 ημέρες δυναμικής καλλιέργειας εντός του βιοαντιδραστήρα, το φίλτρο σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη και επωάστηκαν με ϋΑΡΙ για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και διαδοχικά διερευνήθηκαν από μικροσκόπιο φθορισμού να εκτιμηθεί η παρουσία των πυρήνων στην επιφάνειά του. Τέλος, προκειμένου να εκτιμηθεί η παρουσία του προσκολλάται Calu-3 κύτταρα και καθίζηση στην κάτω περιοχή του θαλάμου καλλιέργειας, μετά από κυτταρική διάσωση του εσωτερικού τοιχώματος του θαλάμου καλλιέργειας rasped από ένα ξέστρο κυττάρων και πλένεται με Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) . Ως εκ τούτου, το PBS συλλέχθηκε μέσα σε ένα τρυβλίο Petri και παρατηρήθηκε με ανεστραμμένο μικροσκόπιο για την ανίχνευση της παρουσίας των Calu-3 κύτταρα.

Αποτελέσματα

δυναμικής ροής εντός του θαλάμου βιοαντιδραστήρα πολιτισμού

multiphysics αριθμητικές προσομοιώσεις επιτρέπεται να χαρακτηρίσει το πεδίο ροής στο εσωτερικό του θαλάμου βιοαντιδραστήρα πολιτισμό. Το σχήμα 2 απεικονίζει διαγραμματικές αναπαραστάσεις των τυπικών δομών μέσο ροής για την ίδρυση εσωτερικό του θαλάμου καλλιέργειας, που προκύπτει από την αμοιβαία αλληλεπίδραση μεταξύ του μέσου (πρωτογενής φάση) και τα κύτταρα /κατασκευάσματα (διεσπαρμένη φάση), ανάλογα με τον ρυθμό ροής που επιβάλλεται. Αναλυτικά, στην περίπτωση τιμών ρυθμού ροής μικρότερη από 20 ml /min (σχήμα 2Α και 2Α1), το μέσο συνεχούς ροής μέσα στο θάλαμο καλλιέργειας μέσω της βαλβίδας δεν έχει αρκετή ενέργεια για να αλληλεπιδρούν σημαντικά με το πλευρικό τοίχωμα του θαλάμου καλλιέργειας. Η ισορροπία μεταξύ υδροδυναμικών και βαρυτικών δυνάμεων οδηγεί στο σχηματισμό μιας δυναμικής μεγάλη επιπλέουσα δίνης βρίσκεται μακριά από το τοίχωμα του θαλάμου (Εικ 2Α1). Αυτή η έντονη δίνη περιβάλλεται από μικρότερες δομές στροβιλοειδή που βρίσκεται πιο κοντά στον τοίχο, που εξασφαλίζουν την αναστολή των καλλιεργημένων κυττάρων και την αύξηση της ανάμειξης και μεταφοράς (Σχήμα 2Α1). Ως παράδειγμα, το Σχήμα 3 δείχνει τη χρονική εξέλιξη της VF που καταλαμβάνεται από αιωρούμενα κύτταρα στο εσωτερικό του θαλάμου καλλιέργειας, που λαμβάνεται προσομοιώνοντας την παρουσία 9×10

6 εμβολιασμένα κύτταρα (αρχική VF = 0,48%) και την επιβολή αξία ρυθμό ροής 5 κ.εκ. /min (ultralow κατάσταση διατμητική τάση, ομοίως με την πειραματική δοκιμή σε χημικό περιβάλλον). Μπορεί να παρατηρηθεί ότι τα καλλιεργημένα κύτταρα διατηρούνται ως επί το πλείστον ομοιόμορφα κατανεμημένα στην κάτω περιοχή του θαλάμου καλλιέργειας. Λεπτομερώς, μετά από μια παροδική περίπου 5 λεπτά, το 95,3% των εμβολιασθέντων κυττάρων αιωρούνται σε μια μέση τιμή VF περίπου 0,33%, η οποία είναι κοντά στην αρχική τιμή VF (0,48%), με την κορυφή του συνάρτησης πυκνότητας πιθανότητας (PDF) τιμή ίση με 2,5, που αντιστοιχούν σε τιμές VF μεταξύ 0 και 0,5% (Σχήμα 4Α). Στο κάτω μέρος του θαλάμου καλλιέργειας, ένας μικρός όγκος περίπου 194 μL χαρακτηρίζεται από μία τιμή VF περίπου 6%, η οποία περιλαμβάνει δυναμικά μόνο το 2% των εμβολιασθέντων κυττάρων (Σχήμα 3). Αυτή η τιμή συσκευασίας είναι περισσότερο από τρεις φορές χαμηλότερη από την τιμή κατωφλίου καθίζησης που ορίστηκε (20%) και περίπου δέκα φορές χαμηλότερο από το μέγιστο όριο συσκευασίας του 63%. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όταν υιοθετείται μια ταχύτητα ροής μικρότερη από 20 ml /min, η κατανομή των διατμητικών αξιών στρες που βιώνουν τα κύτταρα εντός του θαλάμου καλλιέργειας αποκαλύπτει ότι τα υψηλότερα επίπεδα διατμητικής τάσης είναι μικρότερη από 1 MPa (Σχήμα 4Β), με μέση και διάμεση τιμές κοντά στο 1×10

-2 mPA (η λεγόμενη ultralow διάτμηση κατάσταση στρες).

Ροή τομέα οπτικοποίηση της αμοιβαίας αλληλεπίδρασης μεταξύ του μέσου (πρωτογενή φάση) και τα κύτταρα /κατασκευές (διασκορπισμένα φάση) μέσα ο θάλαμος καλλιέργειας για ultralow (Α και Α1) και η χαμηλή έως μέτρια (Β και Β1) συνθήκες διατμητικής τάσης. πεδίο ροής απεικονίζεται χρησιμοποιώντας τόσο γραμμική αναπόσπαστο γραμμές συνέλιξη (Α και Β), και μια κλασική αναπαράσταση Streamline (Α1 και Β1). Κίτρινα βέλη δείχνουν την είσοδο και την έξοδο της ροής. Μπλε βέλη δείχνουν τις πρωτογενείς έντονη δίνες. Κόκκινα βέλη δείχνουν τις δευτερογενείς δίνες.

Η

οικόπεδα περιγράμματος της χρονικής εξέλιξης της VF καταλαμβάνεται από τα αιωρούμενα κύτταρα στο εσωτερικό του θαλάμου βιοαντιδραστήρα πολιτισμό 0-60 λεπτά προσομοίωση χρόνο, με επιβεβλημένο ρυθμό ροής 5 mL /min (ultralow κατάσταση διατμητική τάση, ομοίως με την πειραματική δοκιμή vitro) και 9×10

6 εμβολιασμένα κύτταρα (αρχική VF = 0,48%). Μετά από μια παροδική περίπου 5 λεπτά, το 95,3% των εμβολιασθέντων κυττάρων αιωρούνται σε μια μέση τιμή VF περίπου 0,33%, πολύ κοντά στην αρχική τιμή VF. Στο κάτω μέρος του θαλάμου καλλιέργειας, ένας μικρός όγκος περίπου 194 μL χαρακτηρίζεται από μία τιμή VF περίπου 6%, περισσότερο από τρεις φορές χαμηλότερη από την οριακή τιμή του καθίζησης (20%), η οποία περιλαμβάνει δυναμικά μόνο το 2% του τα ενοφθαλμισμένα κύτταρα.

η

συναρτήσεις πυκνότητας πιθανότητας (PDF) του κυττάρου VF (Α) και διατμητικών τάσεων (Β) τιμές που αντιμετώπισε η κυτταρική φάση εντός του θαλάμου βιοαντιδραστήρα καλλιέργειας μετά από 60 λεπτά, με μια ροή που επιβάλλεται ποσοστό 5 mL /min και 9×10

6 εμβολιασμένα κύτταρα

η

η αύξηση του ποσοστού ροής πέραν των 20 mL /min προωθεί η εμφάνιση της Coanda αποτελέσματος [39] μέσα στο θάλαμο βιοαντιδραστήρα πολιτισμό:. πίδακα εισέρχεται στον θάλαμο καλλιέργειας έλκονται από το κοντινό τοίχο και, λόγω της ιδιόμορφο καμπυλότητα τοίχο, μια περιοχή διαχωρισμός λαμβάνει χώρα μακριά από το τοίχωμα πυθμένα του θαλάμου (Σχ 2Β και 2Β1). Ως αποτέλεσμα, ένας μεγάλος δεξιόστροφα επιπλέουσα δίνη, η οποία αντισταθμίζει την βαρυτική δύναμη και έτσι διατηρεί κύτταρα /κατασκευάσματα σε εναιώρημα, δημιουργείται (Εικ 2Β1). Κοντά στον εξωτερικό τοίχο, ένα ακόμη μικρότερο δίνη αναπτύσσεται, η οποία μπορεί να παίξει το ευεργετικό ρόλο της ενίσχυσης της ανάμιξης και την αναστολή των πλωτών κατασκευές (Εικ 2Β1). Η υιοθέτηση μιας τέτοιας σειράς ρυθμό ροής (30-120 mL /min), λοξή δεξιά διάτμηση κατανομές άγχος ελήφθησαν, με μέσες τιμές που κυμαίνονται από 2 έως περίπου 7 MPa, με τιμές μέγιστης διατμητικής τάση εντός του θαλάμου καλλιέργειας κάτω από 50 MPa (χαμηλής έως μέτρια κατάσταση διατμητικής τάσης, δείτε λεπτομέρειες στο S3 κειμένου).

Όσον αφορά τη μεταφορά του διαλυμένου οξυγόνου εντός του θαλάμου καλλιέργειας για την επιβολή πλήρως ανοξικές αρχική συνθήκη για το μέσο, ​​η αριθμητική προσομοίωση δείχνει ξεκάθαρα ότι εντός 840 s ( 14 λεπτά) η μερική πίεση του διαλυμένου οξυγόνου είναι αναπληρώνονται σε περισσότερο από το 90% του όγκου του θαλάμου καλλιέργειας (S2 Ταινία, S2 κειμένου). Τα λαμβανόμενα αποτελέσματα μπορούν να γενικευτούν για τη μεταφορά άλλων ειδών διαλύεται στο μέσο καλλιέργειας, επειδή η μεταφορά τους χαρακτηρίζεται από τους αριθμούς Peclet δύο με τρεις τάξεις μεγέθους υψηλότερη από την ενότητα, επιβεβαιώνοντας ότι το ρευστό δομές για την ίδρυση εσωτερικό του θαλάμου προώθηση των μεταφορών του διαλυμένου οξυγόνου και θρεπτικά συστατικά μέσω ανάμειξης, έτσι ομογενοποίηση συγκέντρωσή τους.

In vitro

έκβαση του πολιτισμού

Μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας εναιωρήματος, τα κύτταρα διασώθηκαν από τη φιάλη χαμηλή κουλτούρα συνημμένο (στατική αναστολή ) και από το θάλαμο βιοαντιδραστήρα πολιτισμού (δυναμική ανάρτηση). Πρώτον, ήταν μορφολογικά αναλύθηκαν: παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, Calu-3 καλλιεργήθηκαν υπό στατικές εναιώρημα δείχνουν μεμονωμένα κύτταρα ή πολύ μικρών συστάδων (Σχήμα 5Α), ενώ τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν εντός του βιοαντιδραστήρα υπό δυναμική ανάρτηση δείχνουν σαφώς τον σχηματισμό σφαιροειδών (Σχήμα 5Β ). Ειδικότερα, η αναλογία μεταξύ 3 Calu-κύτταρα που σχηματίζουν τα σφαιροειδή και απλά κύτταρα Calu-3 είναι 59.7 για Calu-3 κύτταρα που συλλέγονται από την φιάλη καλλιέργειας χαμηλής προσκόλλησης και 76,0 για Calu-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν εντός του βιοαντιδραστήρα.

Μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας εναιωρήματος, (Α) Calu-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε στατικό αιώρημα δείχνουν μεμονωμένα κύτταρα ή πολύ μικρών συστάδων, (Β) Calu-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό δυναμική ανάρτηση δείχνουν το σχηματισμό σφαιροειδών. Ράβδοι κλίμακας 200 μm.

Η

Επιπλέον, λεπτήν ανάλυση με ΤΕΜ επιτρέπει να παρατηρήσουμε ότι Calu-3 από στατική αναστολή συνδέονται εν μέρει από την αδυναμία και μικροσκοπικά κόμβους προσκόλληση (Σχήμα 6Α και 6Α1), με μορφολογικές αλλοιώσεις ( S1 σχήμα). Αντίθετα, τα σφαιροειδή που συλλέγονται από το θάλαμο βιοαντιδραστήρα κουλτούρα είναι 2,4 φορές (p & lt? 0.001) μεγαλύτερα (μέση έκταση = 23699 ± 5645 μm

2) από συστάδες διασώθηκε από τη φιάλη χαμηλή κουλτούρα συνημμένο (μέση έκταση = 9787 ± 2202 μm

2), και αποτελούνται από κύτταρα που χαρακτηρίζεται από τα τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της Calu-3, όπως εξέχοντα πυρήνια και μεμβράνες μικρολάχνες (Σχήμα 6Β), με καλά ανεπτυγμένες κόμβους προσκόλληση (Εικ 6Β1).

Οι εικόνες ΤΕΜ δείχνουν (Α) μία μικρή συστάδα (3 κύτταρα) του Calu-3 κύτταρα που αναπτύσσονται σε στατική εναιώρημα, και (Β) ένα μεγαλύτερο σφαιροειδές (9 κύτταρα) του Calu-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν εντός του βιοαντιδραστήρα, που συγκομίζονται και τα δύο μετά από 5 ημέρες καλλιέργειας αναστολής. Εξέχοντα πυρήνια (N: πυρήνες), κυτταροπλασματική δομές και κατά μήκος και εγκάρσια προσανατολισμένες μικρολάχνες είναι χαρακτηριστικά γνωρίσματα της κυτταρικής γραμμής NSCLC Calu-3. Υψηλή απόψεις μεγέθυνση των περιοχών που περιλαμβάνονται στο μαύρα ορθογώνια σε πίνακες Α και Β που δείχνονται, αντίστοιχα, (Α1) ένα ενιαίο μικροσκοπικό διασταύρωση προσκόλληση (κεφαλή βέλους) μεταξύ των κυττάρων που καλλιεργήθηκαν υπό στατικές εναιώρημα, και (Β1) διάφορα καλά αναπτυγμένη κόμβους προσκόλληση (βέλη) αναπτύσσονται με Calu-3 καλλιεργήθηκαν εντός του βιοαντιδραστήρα. Ράβδοι κλίμακας: Α και Β = 5 μm? Α1 και Β1 = 1 μm.

Η

Οι παρατηρήσεις αυτές υποστηρίζονται από την αξιολόγηση του Ki67 ανοσοχρώση, γεγονός που δείχνει ότι το κλάσμα της ποδηλασίας κύτταρα Calu-3 είναι σημαντικά υψηλότερη (1,58-φορές αύξηση), όταν καλλιεργούνται σε δυναμική και όχι σε στατικές συνθήκες εναιώρημα (Σχήμα 7Α). Επιπλέον, από την ποσοτικοποίηση των διαλειμμάτων διπλού κλώνου DNA, είναι δυνατό να σημειωθεί πτωτική τάση (1,5 φορές μείωση, ακόμη και αν δεν είναι στατιστικά σημαντική) στο κλάσμα του γH2AX

pos Calu-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν εντός του βιοαντιδραστήρα συγκριτικά στα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν υπό στατικές εναιώρημα (Σχήμα 7Β). Αυτό επιβεβαιώνεται από την δοκιμασία αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, πράγματι το κλάσμα των αποπτωτικών κυττάρων Calu-3 συλλέγεται από το στατικό έλεγχο ανάρτησης (46,5 ± 4,5%) ήταν 16,9 φορές υψηλότερη από ό, τι τα κύτταρα που συλλέγονται από τον βιοαντιδραστήρα (2,7 ± 0,2%), ( p & lt? 0,05)

(Α) Μπαρ γράφημα της μέτρησης των Ki67 θετικών κυττάρων, που δείχνει το κλάσμα του ποδηλάτου κύτταρα Calu-3 μετά από στατική και δυναμική καλλιέργεια εναιωρήματος (*: ρ. & lt? 0,05 vs στατική αναστολή).