Αφηρημένο

Ιστορικό

καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) υπόθεση ισχυρίζεται ότι μόνο ένα μικρό υποσύνολο των κυττάρων εντός ενός όγκου είναι ικανό τόσο στην έναρξη του όγκου και της στήριξης. Η μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) είναι ένα εμβρυϊκό αναπτυξιακό πρόγραμμα που συχνά ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να ρίξει φως στη σχέση μεταξύ EMT και ΚΕΠ με τη χρήση LC31 καρκίνο του πνεύμονα πρωτογενούς κυτταρικής σειράς.

Υλικά και Μέθοδοι

Α549 και κυτταρικές σειρές LC31 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2 ng /ml ΤΟΡβ-1 για 30 ημέρες και 80 ημέρες, αντίστοιχα. Για την αξιολόγηση της EMT, μορφολογικές αλλαγές αξιολογήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο, ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία για ακόλουθοι δείκτες: κερατίνες, e-cadherin, CD326 (επιθηλιακά δείκτες) και CD90, και βιμεντίνη (δείκτες μεσεγχυματικά). Επιπλέον, RT-PCR για Slug, Twist και τα γονίδια β-κατενίνης διεξήχθησαν. Την επεξεργασία και μη κυτταρικές σειρές LC31 TGFβ-1, πραγματοποιήσαμε δοκιμές βλαστική ικανότητα, όπως η ανάπτυξη pneumospheres και το στέλεχος δείκτες έκφρασης όπως Oct4, Nanog, Sox2, c-kit και CD133. Western Blot για CD133 και αναλύσεις ογκογενετικότητας χρησιμοποιώντας NOD /διεξήχθησαν ποντίκια SCID.

Αποτελέσματα

TGFβ-1 θεραπεία LC31 κυτταρική σειρά έχασε επιθηλιακά μορφολογία του υποθέτοντας μια εμφάνιση που μοιάζουν με ινοβλάστες. Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν για το Α549 κυτταρική γραμμή (ως έλεγχος). Ανοσοφθορισμός και κυτταρομετρία παρουσίασαν αυξορρύθμιση της βιμεντίνης και CD90 και προς τα κάτω ρύθμιση cytocheratin, Ε-καδερίνης και CD326 σε κατεργασμένα LC31 και Α549 κυτταρικές γραμμές ΤΟΡβ-1. Slug, Twist και β-κατενίνης m-RNA μεταγραφήματα ήσαν πάνω ρυθμισμένα σε αγωγή LC31 κυτταρική γραμμή ΤΟΡβ-1 επιβεβαιώνοντας EMT. Αυτή η κυτταρική γραμμή επίσης έδειξε υπερ-έκφραση του Oct4, Nanog, Sox2 και CD133, όλα τα γονίδια του βλαστική ικανότητα. Επιπλέον, στην αγωγή LC31 κυτταρική γραμμή ΤΟΡβ-1, μία αυξημένη ικανότητα pneumosphere σχηματισμού όγκων και σχηματισμού ικανότητες σε NOD ποντίκια /SCID ήταν ανιχνεύσιμα.

Συμπεράσματα

Η επαγωγή της ΕΜΤ με TGFβ -1 έκθεση, στην πρωτοβάθμια πνεύμονα αποτελέσματα κυτταρική σειρά καρκίνου στην απόκτηση του προφίλ μεσεγχυματικών και στην έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων

Παράθεση:. Pirozzi G, Tirino V, Camerlingo R, Franco R, La Rocca Α, Liguori Ε, et al. (2011) Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβαση από TGFβ-1 επαγωγή Αυξάνει Χαρακτηριστικά βλαστική ικανότητα στην Πρωτοβάθμια μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα γραμμή κυττάρων. PLoS ONE 6 (6): e21548. doi: 10.1371 /journal.pone.0021548

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5η του Απριλίου 2011? Δεκτές: 1 Ιούν 2011? Δημοσιεύθηκε: 30, Ιουν 2011

Copyright: © 2011 Pirozzi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ερευνητικά 2009/10 του Τμήματος Ιταλικής Υγείας για Γ Pirozzi και Γ Rocco. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Δύο σημαντικά υπόθεση έχουν ως αίτημα στη γένεση, διαμόρφωση, την ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου επιθηλιακών: ο ρόλος του καρκίνου βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) ή όγκου Έναρξη κύτταρα (ΤΠΕ στο ολιγοθέσιο σχολείο) και τη συμμετοχή της λεγόμενης Επιθηλιακός -Mesenchymal μετάβασης (EMT).

Καρκίνος έχουν βλαστικά κύτταρα έχουν οριστεί ως «ένα κύτταρο εντός του όγκου που έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και να προκαλέσει τα ετερογενή καταγωγές των καρκινικών κυττάρων που αποτελούν τον όγκο» [1 ]. Αυτές οι δύο οριστικά βιολογικές ιδιότητες είναι αυτό που κάνει το ΚΕΠ ο κύριος υποψήφιος για την έναρξη της υποτροπής.

ΚΕΠ υπόθεση ισχυρίζεται ότι μόνο ένα μικρό υποσύνολο των κυττάρων εντός ενός όγκου είναι σε θέση του τόσο στην έναρξη του όγκου και της στήριξης [2], [ ,,,0],3]. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν βλαστική ικανότητα σημειωτές, είναι ικανά να σχηματίσουν κυμαινόμενο σφαίρες σε μέσο απαλλαγμένο από ορό, μια ιδιότητα που σχετίζεται με τα βλαστικά κύτταρα, και είναι επίσης σε θέση να διαφοροποιήσουν σε μια παρεκκλίνουσα κυτταρικό φαινότυπο που συνιστούν την ετερογένεια καρκινικών [4]. Πειραματικά, αυτός ο πληθυσμός ταυτοποιείται από την ικανότητά του να σχηματίζει νέων όγκων μέσω σειριακών μεταμοσχεύσεις σε ανοσοανεπαρκείς μη παχύσαρκο διαβητικό (NOD) /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID), αποκαταστάσεως ετερογένεια καρκινικών [5].

Υπάρχουν είναι δύο βασικά θέματα που υπογραμμίζουν την υπόθεση ότι η ΚΕΠ προέρχονται από φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα ιστού. Πρώτα απ ‘όλα, τα ΚΕΠ έχουν φυσιολογική ιδιότητες βλαστικών κυττάρων όπως η αυτο-ανανέωση, διαφοροποίηση, αντοχή φαρμάκου και την ικανότητα μετανάστευσης. Στη συνέχεια, η μακροζωία των βλαστικών κυττάρων τα καθιστούν ευπαθή σε συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών ζημιές έτσι ώστε να τα καταστήσει καλοί υποψήφιοι για την εμφάνιση νεοπλαστικού μετασχηματισμού [6], [7]. Τα ΚΕΠ είναι τα μόνα κύτταρα τα οποία είναι ικανά να παράγουν όγκους παρόμοια με τα αρχικά δείγματα ασθενών όταν μεταμοσχεύονται σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς όπως NOD /SCID ποντικούς [8].

υπάρχουσες θεραπείες έχουν ενισχύσει το μήκος της επιβίωσης μετά τη διάγνωση του καρκίνο, αλλά απέτυχε πλήρως την άποψη της ανάκαμψης. αποτυχίες της θεραπείας του καρκίνου μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή αποτελέσματα της τρέχουσας θεραπείας μετά δυνητικά ηρεμίας ΚΕΠ, τα οποία παραμένουν ζωτικής σημασίας και να διατηρούν την ικανότητα να αναγεννούν τον όγκο [9]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι τρέχουσες θεραπευτικές στρατηγικές έχουν αναπτυχθεί για το μεγαλύτερο μέρος του καρκίνου και πιθανόν δεν εξαλειφθεί τελείως ΚΕΠ. ΚΕΠ είναι πιο ανθεκτικά σε θεραπείες, λόγω πλεονέκτημα επιβίωσης με αυξημένη αντι-αποπτωτική δραστηριότητα και αντοχή φαρμάκου λόγω των αυξημένων επιπέδων των αντλιών εκροής φαρμάκου όπως BCRP (μαστού πρωτεΐνη αντοχής στον καρκίνο) και MDR (αντίσταση σε πολλά φάρμακα) σύμπλοκα [10], [11].

Οι CSCs έχουν ταυτοποιηθεί σε μία ποικιλία στερεών όγκων συμπεριλαμβανομένων γλοιοβλαστώματα [12], του μαστού [13], και του καρκίνου του πνεύμονα [14], [15]. Υπάρχουν τρία διακριτά κύρια μεθοδολογίες για την απομόνωση ΚΕΠ από συμπαγείς όγκους: i) απομόνωση των ΚΕΠ με κυτταρομετρία ροής συμφώνως προς CSC-ειδικούς δείκτες κυτταρικής επιφάνειας όπως CD44 ή CD133? ii) την ανίχνευση του φαινοτύπου πληθυσμού δίπλα Hoechst33342 αποκλεισμό? iii) ο σχηματισμός σφαίρα κάτω από την καλλιέργεια των καθορισμένων ελεύθερο ορού μέσο με αυξητικούς παράγοντες που διατηρεί η ΚΕΠ αδιαφοροποίητα.

Ο μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) είναι ένα εμβρυϊκό κλειδί αναπτυξιακό πρόγραμμα που συχνά ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια εισβολής του καρκίνου και μετάσταση [16], [17]. Είναι μια διαδικασία με την οποία κύτταρα υφίστανται μια μορφολογική μετάβαση από το επιθηλιακό πολωμένο φαινότυπο στο μεσεγχυματικά ινοβλαστοειδούς φαινότυπο. Ως αποτέλεσμα της ΕΜΤ, επιθηλιακά κύτταρα χάνουν ορίζεται επαφές κυττάρου-κυττάρου /κυττάρου-υπόστρωμα τους και διαρθρωτικά /λειτουργικά πολικότητα τους, και γίνονται σε σχήμα ατράκτου και μορφολογικά παρόμοια με ενεργοποιημένων ινοβλαστών [18]. Στο μοριακό επίπεδο, ΕΜΤ ορίζεται από την απώλεια των μορίων προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (π.χ., Ε-καδερίνης και ΖΟ-1), ρύθμιση προς τα κάτω των επιθηλιακών δεικτών διαφοροποίησης συμπεριλαμβανομένων κυτοκερατίνες και Ε-καδερίνη και μεταγραφική επαγωγή των δεικτών μεσεγχυματικών όπως βιμεντίνη, ινονεκτίνη και Ν-καδερίνης με ένα πυρηνικό εντοπισμό των β-κατενίνης [19]. Πυρηνική βήτα-κατενίνης επάγει ένα πρότυπο έκφρασης γονιδίου που ευνοούν την εισβολή όγκου, και αυξανόμενες ενδείξεις δείχνουν πολλαπλές αμοιβαίες αλληλεπιδράσεις Ε-καδερίνης και βήτα-κατενίνης με ΕΜΤ-επαγωγής μεταγραφικοί καταστολείς για τη σταθεροποίηση ενός επεμβατική μεσεγχυματικά φαινότυπος των επιθηλιακών κυττάρων του όγκου [20], [21 ]. Άλλα γονίδια που εμπλέκονται στην EMT είναι Σαλιγκάρι, Twist e SIP-1 /Zeb-2, όλοι οι καταστολείς του γονιδίου Cdh1 που κωδικοποιεί για το E-cadherin [16]. Αρκετές διακριτές γνωρίσματα έχουν μεταφέρεται από EMT, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής κινητικότητας, διεισδυτικότητα, αντοχή σε απόπτωση, και ορισμένες ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων. Πολλά μονοπάτια σηματοδότησης έχουν συμβάλει στην επαγωγή του ΕΜΤ, συμπεριλαμβανομένων αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού-βήτα (ΤΟΡβ-1), Wnt, Hedgehog, Notch, και πυρηνικό παράγοντα-κάπα Β (ΝΡκΒ) [22]. Kyoung-Ok Hong et al. [23] έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του άξονα ΡΙ3Κ /Akt είναι ένας από τους κύριους μηχανισμούς στη διαδικασία της ΕΜΤ και φαίνεται ότι η αναστολή της από θεραπεία με ανάλογα φωσφατιδυλινοσιτόλη αιθερολιπίδιο (ΡΙΑ) μπορούν να ρυθμίζουν η αντίστροφη διαδικασία μεσεγχυματικά Επιθηλιακά αντίστροφη μετάβαση (Mert ) που οδηγεί στην εκ νέου έκφραση τόσο Ε-καδερίνης και β-κατενίνης, καθώς και τη μείωση της έκφρασης του βιμεντίνης, μεσεγχυματικών δείκτη, σε στοματική πλακώδες καρκίνωμα γραμμές σταθεροποιηθεί. Κατά τη διαδικασία της μετάστασης του όγκου, η οποία συχνά ενεργοποιημένη από EMTs, διαδίδονται καρκινικά κύτταρα φαίνεται να απαιτεί την ικανότητα αυτο-ανανέωση, παρόμοια με αυτή που παρουσιάζεται από τα βλαστικά κύτταρα, προκειμένου να διαδοθεί μακροσκοπικές μεταστάσεις [24]. Αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι η διαδικασία EMT, η οποία επιτρέπει τη διάδοση των κυττάρων του καρκίνου, μπορεί επίσης να μεταδώσει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης για τη διάδοση των καρκινικών κυττάρων. Πράγματι, η μεταστατική διαδικασία είναι τουλάχιστον επιφανειακά παρόμοια με τις διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την επισκευή των ιστών και την αναγέννηση και να επιτρέψει ενήλικα βλαστικά κύτταρα για έξοδο ταμιευτήρες ιστού όπως ο μυελός των οστών, εισάγετε και να επιβιώσουν στην κυκλοφορία, και να μπει σε δευτερογενείς θέσεις ιστού, όπου πολλαπλασιάζονται, διαφοροποιούνται και να συμμετέχουν σε ιστό ανασυγκρότηση [25]. Μαζί, αυτές οι διαφορετικές γραμμές των αποδεικτικών στοιχείων υποδηλώνουν μια πιθανή σχέση μεταξύ καρκινικά βλαστικά κύτταρα και τα μεσεγχυματικά κύτταρα-εμφάνιση που δημιουργείται από EMTs και η αντίστροφη διαδικασία ονομάζεται αντίστροφη μετάβαση μεσεγχυματικά Επιθηλιακός (Mert). Μάνη et συναδέλφους [26] ήταν ο πρώτος για να αποδείξει τέτοια συσχέτιση σε απαθανάτισε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού (HMLEs).

Σε αυτό το πλαίσιο, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν οι παράγοντες που θα μπορούσαν να προκαλέσουν EMT και πώς τα κύτταρα EMT θα μπορούσε να γίνει ένας πόρος για καρκινικά βλαστικά κύτταρα όμοια, την ανάπτυξη νέων και στοχευμένες θεραπείες για τον καρκίνο του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να ρίξει φως σχετικά με την πιθανή σχέση μεταξύ EMT και ΚΕΠ με τη χρήση LC31 πρωτογενή κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από το δείγμα ιστού μετά από χειρουργική επέμβαση σε ασθενή που επηρεάζονται από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC).

Αποτελέσματα

ΤΟΡβ-1 θεραπεία επάγει μορφολογικές μεταβολές σε κυτταρικές σειρές NSCLC

προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση του ΤΟΡβ-1 επί LC31 και κυτταρικές γραμμές Α549, τους επεξεργασία με 2 ng /ml ΤΟΡβ-1. Όπως ήδη έχει καταδειχθεί και από Ju Hee Kim [27], Α549 κύτταρα κατεργασμένα με ΤΟΡβ-1 έχασαν επιθηλιακή μορφολογία τους παρατηρήσιμο μετά από 48 ώρες επεξεργασίας? αυτοί διασκορπίσθηκαν αναλαμβάνοντας μία ινοβλάστη εμφάνιση που μοιάζει με το σχήμα και λαχταρούσε κεντρικό πυρήνα.

LC31 κύτταρα επεξεργασμένα με ΤΟΡβ-1 έχασαν επιθηλιακή μορφολογία τους και απέκτησαν μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά ξεκινώντας από 21 ημέρες θεραπείας. Τα κύτταρα έγιναν λαχταρούσε, ινοβλαστών όπως και με κεντρικό πυρήνα και άρχισε να αυξάνεται ως δέσμες. Αυτή η μορφολογία διατηρήθηκε για όλο το χρόνο της θεραπείας (Σχήμα 1Α-D.)

Α:. Ανεπεξέργαστων Α549, OM 200 ×? Β: επεξεργασία Α549, στις 2 ημέρες ΤΘΡβ-1 θεραπεία, OM 400 ×? C: χωρίς θεραπεία LC31, OM 400 ×? D: αντιμετωπίζονται LC31, σε 30 ημέρες ΤΟΡβ-1 θεραπεία, OM 400 ×? Ε: καμπύλες ανάπτυξης των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων Α549? F:. Καμπύλες ανάπτυξης των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων LC31

Η

ΤΟΡβ-1 θεραπεία επάγει την αναστολή της ανάπτυξης σε κυτταρικές σειρές NSCLC

Σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ΤGFβ-1 που προκαλείται από αναστολή της ανάπτυξης. Στο Α549, καμπύλες ανάπτυξης αναλύσεις έδειξαν ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης κατά τη διάρκεια του πολιτισμού με την DT 28 ώρες για την επεξεργασία Α549 αφορά την DT 18 h από την αντίστοιχη χωρίς θεραπεία κυτταρικής σειράς. Σε κύτταρα LC31, η DT ήταν 72 h για τα επεξεργασμένα κύτταρα, ενώ η DT ήταν 36 h για μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 1 Ε-F).

TGFβ-1 θεραπεία προωθεί τη στροφή από επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά φαινότυπο

Η μορφολογική επίδραση των TGFβ-1 για Α549 και κυτταρικές σειρές LC31 πρότεινε ότι TGFβ-1 προωθείται μια EMT. Οι μορφολογικές αλλαγές χαρακτηριστικές κυττάρων που υφίστανται ΕΜΤ συνοδεύεται από μια μετατόπιση στην έκφραση από ένα επιθηλιακό σε μεσεγχυματικά ρεπερτόριο. Για να καθοριστεί εάν ΤΟΡβ-1 που προκαλείται από τέτοια στροφή, χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία, ανοσοφθορισμό και RT-PCR για να εξεταστεί η έκφραση και τη διανομή των CD90, CD326, βιμεντίνη, e-cadherin και cytockeratins δείκτες και β-κατενίνης, Slug και γονίδια Twist.

Σύμφωνα με κυτταρομετρική ανάλυση, σε μη επεξεργασμένα κυτταρικές γραμμές, CD90 ήταν ασθενώς εκφράζεται επί Α549 (μέση εκατοστιαία 10%) και LC31 (μέση εκατοστιαία 4%). CD326 και τα επίπεδα έκφρασης κερατίνες ήταν χαμηλά τόσο σε Α549 (μέση εκατοστιαία 10% και 1,1% αντίστοιχα) και LC31 (μέση εκατοστιαία 1% και 18,6% αντίστοιχα). Βιμεντίνης ήταν ασθενώς θετικά στο Α549 (μέση εκατοστιαία 22%) και LC31 (μέση εκατοστιαία 17%). Μετά TGFβ-1 θεραπεία, CD90 (μέση εκατοστιαία 93%) και βιμεντίνης (μέση εκατοστιαία 91%) επίπεδα αυξήθηκαν, ενώ CD326 και κερατίνες μειώθηκαν σε Α549 και LC31 (Σχήμα 2Α, Β.)

Α:. Κυτταρομετρίας ανάλυση για CD90, CD326, βιμεντίνη και Cytokeratin σε μη επεξεργασμένα (κόκκινη γραμμή) και TGFβ-1 θεραπεία [πράσινη γραμμή] στην Α549 κυτταρική γραμμή μετά από 20 ημέρες θεραπείας? Β: Ανάλυση κυτταρομετρίας για CD90, CD326, βιμεντίνη και Cytokeratin σε ανεπεξέργαστα [κόκκινη γραμμή] και TGFβ-1 θεραπεία (πράσινη γραμμή) στο LC31 κυτταρική γραμμή μετά από 30 ημέρες θεραπείας. έλεγχοι ισοτόπου είναι σε μαύρο χρώμα.

Η

Σε δοκιμασία ανοσοφθορισμού, στα μη επεξεργασμένα κυτταρικές σειρές, vimentin εκφράστηκε τόσο στο Α549 και LC31, αλλά ήταν που περιέχονται στην περιπυρηνική κυστίδια. Κυτοκερατίνες και Ε-καδερίνης ήταν ασθενώς εκφράζεται σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Μετά TGFβ-1 θεραπεία, η vimentin ήταν έντονα και κατανέμεται ομοιόμορφα σε όλα τα κύτταρα Α549 και LC31, ενώ κερατίνες και E-cadherin παρέμεινε ασθενώς εκφράζεται και εντοπίζεται σε περιπυρηνική περιοχές των κυττάρων, μέχρι να καταργηθεί μετά από 30 ημέρες για το Α549 και 40 ημέρες για την LC31 (Σχήμα 3 Α-L.)

ανοσοφθορισμού για βιμεντίνη (Α), κυτοκερατίνης (Β) και ε-καδερίνης (C) για τα μη επεξεργασμένα Α549 κυτταρική γραμμή.? βιμεντίνη (D), κυτοκερατίνης (Ε) και Ε-καδερίνης (F) επί αντιμετωπίζονται Α549 κυτταρική γραμμή μετά από 20 ημέρες από ΤΟΡβ-1 θεραπεία? βιμεντίνη (G), κυτοκερατίνης (H) και Ε-καδερίνης (Ι) σε μη κατεργασμένα LC31 κυτταρική γραμμή? βιμεντίνη (J), κυτοκερατίνης (Κ) και Ε-καδερίνης (L) στην επιφάνεια των κατεργασμένων σε LC31 κυτταρική γραμμή μετά από 30 ημέρες από ΤΟΡβ-1 θεραπεία. Όλες οι εικόνες ανοσοφθορισμού έχουν OM 200 ×? M: ανάλυση RT-PCR και την αξιολόγηση πυκνομετρία για Slug, Twist και β-κατενίνης σε μη κατεργασμένα και ΤGFβ-1 αντιμετωπίζονται με κυτταρική γραμμή LC31 μετά από 0, 20, 50 και 80 ημέρες θεραπείας. *, P & lt? 0001, **, p & lt?. 0,0001 σε σύγκριση με γονική κυτταρική σειρά (0 ημέρα θεραπείας)

Η

Τα δεδομένα RT-PCR έδειξε ότι υπήρχε μαζική μετατόπιση της γονιδιακής έκφρασης από ένα χαρακτηριστικό πρότυπο των επιθηλιακών κυττάρων με εκείνη των μεσεγχυματικών κυττάρων σε κυτταρική γραμμή LC31 με σημαντική αύξηση στην έκφραση του ΕΜΤ-επαγωγής παραγόντων μεταγραφής, ειδικά βήτα-κατενίνης (~1,5 φορές), Twist (~1,5 φορές), και γυμνοσάλιαγκα (~2,7 φορές) δείχνει φαινότυπο EMT τους. Αυξορρύθμιση αυτών των γονιδίων που αναφέρθηκαν ανωτέρω, ήταν ΤΟΡβ-1 εξαρτάται από το χρόνο εκτός από βήτα-κατενίνης για τα οποία υπήρξε αύξηση σε 20 έως 80 ημερών σεβασμού θεραπείας για μη επεξεργασμένα κυτταρική γραμμή και ένα ασθενές μείωση στις 50 ημέρες respect 20 και 80 ημέρες θεραπείας, αλλά πάντα αυξηθεί σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κυτταρική σειρά (Σχ. 3Μ).

προφίλ

η γονιδιακή έκφραση των βλαστική ικανότητα δεικτών σε EMT-LC31 κυτταρική σειρά

για να διερευνήσουν τα γονίδια που ρυθμίζουν και τη διατήρηση του φαινοτύπου των βλαστικών κυττάρων κυττάρων LC31 έχουν υπογραφές EMT (ονομάζεται κυτταρική σειρά EMT-LC31), που πραγματοποιήθηκε RT-PCR για Oct4, Nanog και Sox2. Είναι ενδιαφέρον, μεταγραφικοί παράγοντες Oct4, Nanog, Sox2, είναι γνωστό ότι είναι επαρκής για να επαναπρογραμματίσει ποντικού ή ανθρώπινων σωματικών κυττάρων σε αδιαφοροποίητα, πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, βρέθηκαν να αυξηθεί σημαντικά σε κυτταρική γραμμή ΕΜΤ-LC31 με αύξηση 3,5 φορές, 3 , 0 φορές, και 1,4 φορές για Oct4, Nanog και SOx-2, αντίστοιχα πάνω από γονική κυτταρική γραμμή που υποδεικνύει φαινότυπο βλαστική ικανότητα τους (Εικ. 4Α)

Α:. RT-PCR και την αξιολόγηση πυκνομετρία για Oct4 , Sox2 και Nanog γονιδίων σε κυτταρικές σειρές LC31 και LC31 ΕΜΤ-μετά από 0, 20, 50 και 80 ημέρες θεραπείας? Β: RT-PCR και την αξιολόγηση πυκνομετρία για CD133 και c-kit γονιδίων σε κυτταρικές σειρές LC31 και LC31 ΕΜΤ-μετά από 0, 20, 50 και 80 ημέρες θεραπείας? C: Western Blot για CD133 LC31 και κυτταρικές γραμμές ΕΜΤ-LC31 μετά από 0, 20, 50 και 80 ημέρες θεραπείας. *, P & lt? 0001, **, p & lt? 0,0001 σε σύγκριση με κυτταρική σειρά LC31 (0 ημέρα της θεραπείας). α-τουμπουλίνης χρησιμοποιείται ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

CD133 και c-kit δείκτες αυξήθηκαν σε κυτταρική σειρά EMT-LC31

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω κατά πόσο τα κύτταρα με φαινότυπο EMT θα μπορούσε να δείξει στέλεχος του καρκίνου όπως χαρακτηριστικά των κυττάρων, αξιολογούμε την έκφραση του CD133, κύριος δείκτης για τον εντοπισμό του καρκίνου βλαστικών κυττάρων σε NSCLC [14], [15] και c-kit [28], τα μεσεγχυματικά βλαστικά δείκτη.

αναλύσεις κυτταρομετρίας έδειξε ότι σε LC31 γονική κυτταρική γραμμή, το ποσοστό των CD133 ήταν 3% του συνολικού πληθυσμού των κυττάρων. Μετά ΤΟΡβ-1 θεραπεία, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι δεν διαπιστώθηκαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης CD133 μεταξύ των γονικών και ΕΜΤ-κυττάρων ήταν ανιχνεύσιμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα είναι διαφορετικό σε σχέση με εκείνα που λαμβάνονται με RT-PCR και κηλίδωση Western για CD133. Τόσο RT-PCR και κηλίδωση Western έδειξαν αύξηση του CD133 (~2,3 φορές για RT-PCR) μετά από διαφορετικούς χρόνους της ΤΟΡβ-1 θεραπεία. Όσον αφορά γονίδιο c-Kit, ο τελευταίος είχε ως αποτέλεσμα πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα ΕΜΤ-LC31 με αύξηση ~2,3 φορές περισσότερο από ό, τι γονική κυτταρική γραμμή (Σχ. 4Β, C).

Pneumospheres ικανότητα σχηματισμού αυξήθηκε σε EMT-LC31 κυτταρική σειρά

Liu et al. [29] και άλλοι [30] έχουν αποδείξει ότι η ικανότητα να σχηματίζει mammospheres

in vitro

εξαρτάται από την παρουσία της αυτο-ανανέωσης. Δοκιμάσαμε pneumophere-ικανότητα σχηματισμού EMT-LC31 κυττάρων σε σύγκριση με γονική κυτταρική σειρά.

Αξίζει να σημειωθεί, αφού προκάλεσε μια EMT στα κύτταρα LC31 με την έκθεσή τους σε TGF-β1, βρήκαμε ότι τα κύτταρα EMT-LC31 έδειξαν σημαντικά αυξημένη ικανότητα να σχηματίζουν pneumopheres σε σύγκριση με γονική κυτταρική γραμμή που σχηματίζει τουλάχιστον & gt? 40 φορές περισσότερο από ό, τι pneumospheres γονικών κυττάρων. Η αναλογία pneumospheres μέγεθος και την ανάπτυξή τους ήταν σημαντικά μεγαλύτερες από εκείνες των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Επιπλέον, οι pneumospheres ΕΜΤ ήταν περισσότερο από 50 μm σε διάμετρο μετά από 5 ημέρες, ενώ η γονική pneumospheres ήταν 20 μm (Σχ. 5Α, Β). Επιπλέον, όλα τα pneumospheres EMT ήταν θετικά για CD133 (Εικ. 5C). Με βάση αυτή τη λειτουργική δοκιμασία, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα κύτταρα που παράγονται από μια EMT αποκτήσει ένα ακόμη χαρακτηριστικό του καρκίνου του πνεύμονα βλαστοκύτταρα

Α:. Pneumospheres LC31? pneumospheres EMT-LC31? C:. Έκφραση CD133 σε pneumospheres EMT-LC31

Η

αποτελεσματικότητα αποικιών

Μία από τις μεθόδους της ανάλυσης της ογκογόνο δυναμικό είναι η δοκιμασία μαλακού άγαρ που μετρά αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη, η οποία είναι ένας δείκτης για μετασχηματισμό των κυττάρων. Όπως περιγράφεται στον Πίνακα 1, η αξιολόγηση της κινητικής ανάπτυξης αποκάλυψε σημαντικές αποδοτικότητα αποικία κυτταρικής γραμμής ΕΜΤ-LC31 σε σχέση με τη γονική κυτταρική σειρά με 18 και 3 φορές αύξηση για 1000 και 10000, αντίστοιχα, του σπαρμένων κυττάρων ΕΜΤ σέβονται τη γονική κυτταρική γραμμή (Σχ. 6A-C)

Α:. φωτογραφίες των αποικιών από LC31 κυτταρική γραμμή και [Β] EMT-LC31 κυτταρική γραμμή? C:. Ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως CFU (%) ως προς τον αριθμό των κυττάρων σπάρθηκε

Η

ΕΜΤ-LC31 παράγει όγκους μεγαλύτερη από αντίστοιχη γονική κυτταρική σειρά

σε προηγούμενες μελέτες μας [15], δείξαμε ότι οι όγκοι από κύτταρα LC31 καλλιεργούνται ως pneumopsheres αυξήθηκαν πολύ γρηγορότερα σε σύγκριση με εκείνη από τα αντίστοιχα κύτταρα που αναπτύσσονται σε προσκολλημένα συνθήκη καλλιέργειας. Για να δοκιμαστεί εάν ΤGFβ-1 θεραπεία πέτυχε την αλλαγή της συχνότητας ογκογενή των μετασχηματισμένων κυττάρων, μπορούμε εγχέονται κύτταρα ΕΜΤ-LC31 και αντίστοιχη κυτταρική γραμμή σε ξενιστές με ανοσοανεπάρκεια. Όπως αναφέρεται στον Πίνακα S1, βρήκαμε ότι ο όγκος του όγκου που προκαλείται από κύτταρα ΕΜΤ-LC31 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των γονικών κυττάρων (Εικ. S1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα με EMT υπογραφή προωθούνται ογκογενετικότητας

in vivo

.

Συζήτηση

Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) είναι μια θεμελιώδης φυσιολογική διαδικασία κατά την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν τους πολικότητα και υφίστανται μια μετάβαση σε ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά. Χαρακτηριστικά της EMT περιλαμβάνουν απώλεια προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και την απόκτηση των αυξημένων μεταναστευτικών χαρακτηριστικών [31], [32].

EMT είναι ένα κρίσιμο γεγονός στην εξέλιξη της νόσου, αρκετές μελέτες κατάσταση ότι η EMT ενεργοποιείται σε πολλούς τύπους καρκίνων [33] – [35]. Παρά την πρόσφατη πρόοδο, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διευκρινιστεί ο ρόλος της EMT στην εισβολή και τη μετάσταση των όγκων. Κατά τη διαδικασία της μετάστασης του όγκου, τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία μεταστάσεις, να αποκτήσουν τις δεξιότητες της αυτο-ανανέωσης, παρόμοια με αυτή που παρουσιάζεται από βλαστικά κύτταρα, προκειμένου να διαδώσει τις μεταστάσεις [24].

Μαζί, αυτές οι ενδείξεις υποδεικνύουν μια πιθανή σύνδεση μεταξύ του καρκίνου βλαστικά κύτταρα και τα μεσεγχυματικά κύτταρα-εμφάνιση που δημιουργείται από EMTs.

σε αυτό το πλαίσιο, σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να δείξει ότι η απόκτηση EMT συνδέεται με την αύξηση των βλαστική ικανότητα υπογραφές σε ένα πρωτογενές κύτταρο γραμμή που λήφθηκε στο εργαστήριο μας. καρκίνος του πνεύμονα Α549 είναι ένα καλά-χαρακτηριζόμενη κυτταρική γραμμή η οποία έχει χρησιμοποιηθεί ως ένα σύστημα μοντέλο για τη μελέτη των μηχανισμών της καρκινογένεσης, η απόπτωση και εξέλιξη του καρκίνου στον καρκίνο του πνεύμονα [36], [37]. Επειδή EMT παίζει βασικό ρόλο στην εξέλιξη του όγκου, εμείς επιλέξαμε Α549 κυτταρική γραμμή ως πρότυπο σύστημα της EMT. Εστιάσαμε την προσοχή μας σε LC31 κυτταρική σειρά που λαμβάνονται στο εργαστήριο μας και να ερευνήσει την επίδραση των TGFβ-1 για EMT και μηχανισμό βλαστική ικανότητα σε αυτή τη γραμμή. Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [38], [39], δείξαμε ότι ΤΟΡβ-1 επάγει ΕΜΤ σε κύτταρα Α549 με απόκτηση μεσεγχυματικών μορφολογία, αυξημένη έκφραση δεικτών μεσεγχυματικών όπως βιμεντίνη και CD90 και μειωμένη έκφραση των επιθηλιακών δεικτών όπως κυτταροκερατίνες και CD326. Αφού οριστεί ότι το μοντέλο της μελέτης EMT μας είναι αξιοποιήσιμες, ελέγξαμε την επίδραση των TGFβ-1 για LC31 κυτταρική σειρά. Εμείς αντιμετωπίζονται LC31 κυτταρική γραμμή με ΤGFβ-1 2 ng /ml για 80 ημέρες. Μόνο μετά από περίπου 20 ημέρες, παρατηρούμε μορφολογικές αλλαγές που είναι σύμφωνες με την απόκτηση του ΕΜΤ φαινοτύπου όπως χαρακτηρίζεται από την απώλεια της έκφρασης των επιθηλιακών δεικτών όπως κυτοκερατίνες, e-cadherin και CD326 και του κέρδους ή αυξημένη έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών όπως βιμεντίνης αντικαθιστώντας κερατίνες. Μετά από 20 ημέρες θεραπείας, τα κύτταρα LC31 έγινε επίμηκες, κεντρικό πυρήνα με ινοβλαστών όπως το σχήμα και την αύξηση της αναδιοργάνωσης των ινών στρες.

EMT διαρκεί 48 ώρες σε Α549, επειδή έχει ισχυρότερη δείκτες μεσεγχυματικών έκφραση από LC31 χρειάζεται 20 ημέρες για να υποβληθεί σε EMT .

Ως εκ τούτου, το LC31 κυτταρική σειρά εμφανίζει αρκετά χαρακτηριστικά τυπικά EMT: μείωση στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου, ισοπέδωση και σκέδαση, έκφραση δεικτών μεσεγχυματικών. Slug, Twist και β-κατενίνης, η κύρια μεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην EMT, οι

Τα αποτελέσματα αυτά ανοίγουν ρυθμίζεται στα κύτταρα αγωγή και αυτοί οι παράγοντες αυξάνουν με την αύξηση της ΤΟΡβ-1 χρόνο θεραπείας, επιβεβαιώνοντας φαινότυπος ΕΜΤ τους.

Η τρόπος για να εξακριβωθεί αν LC31 πρωτογενές πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου, ευαίσθητο προς ΤGFβ-1 θεραπεία, θα μπορούσε να αυξήσει τα χαρακτηριστικά των αρχέγονων κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα EMT-LC31 εμφανίζουν επίσης φαινότυπο βλαστικών κυττάρων, όπως χαρακτηρίζεται από την αυξημένη δυναμικότητα pneumosphere σχηματισμού σε σύγκριση με γονική LC31 κυτταρική σειρά με EMT pneumospheres μεγαλύτερη από τη γονική pneumopheres. Επιπλέον EMT pneumospheres ήταν θετικά για CD133 δείκτη ενισχύοντας την υπογραφή βλαστική ικανότητα. Το πιο σημαντικό, είναι γνωστό ότι η συν-έκφραση της Sox-2, Nanog και Oct4 σε ανθρώπινο ή ποντικού σωματικά κύτταρα μπορούν να επαναπρογραμματίσει αυτά τα κύτταρα σε πολυδύναμα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν [40], [41]. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι οι εκφράσεις του Sox-2, Nanog και Oct4 δραματικά up-ρυθμίζονται σε κυτταρική σειρά EMT-LC31 σε σύγκριση με γονική κυτταρική σειρά. Στο σύνολό τους αυτά τα δεδομένα, η κυτταρική γραμμή LC31 με EMT υπογραφή παρουσίασαν αύξηση χαρακτηριστικά βλαστικών κυττάρων, τα οποία σχετίζονται με την υπερβολική έκφραση της Sox-2, Nanog και Oct4.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η c-kit και του συνδέτη εκφράζονται σε καρκίνο του πνεύμονα. Ανοσοϊστολογική μελέτες σχετικά με την έκφραση c-kit έδειξε ότι η πρωτεΐνη εκφράζεται μη φυσιολογικά μόνο σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και όχι σε πνευμονοκύτταρα ή κανονικά βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων [42]. Επιπλέον, Λεβήνας et al. [43], [44] έδειξαν ότι η θεραπεία των πνευμόνων κυττάρων όγκου με δοξορουβικίνη, σισπλατίνη, ετοποσίδη ή ως αποτέλεσμα την επιλογή των κυττάρων που επιβιώνουν φαρμάκου που εκφράζουν CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, και η πυρηνική βήτα-κατενίνης με χαμηλή έκφραση των δεικτών διαφοροποίησης κυτοκερατινών 8/18. Στη μελέτη μας, έχουμε αποδείξει ότι TGFβ-1 προκαλεί επίσης αύξηση της έκφρασης m-RNA c-kit, ένας άλλος δείκτης βλαστική ικανότητα, ενισχύοντας την υπόθεση ότι η κυτταρική σειρά LC31 με EMT υπογραφή παρουσίασαν αύξηση της τάξης του στελέχους φαινότυπο. Ένα άλλο ενδιαφέρον αποτέλεσμα είναι η ρύθμιση προς τα πάνω του CD133 στην κυτταρική σειρά ΕΜΤ-LC31, κύριος δείκτης για την ταυτοποίηση CSCs στον καρκίνο του πνεύμονα, όπως αναφέρεται από Eramo et al. [14] και Tirino et al. [15]. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε μια αύξηση του CD133 τόσο σε RT-PCR και στυπώματος Western, αλλά όχι σε κυτταρομετρία και ανοσοφθορισμού σε προσκολλημένα κύτταρα. Υπάρχουν πολλά έργα στα οποία αμφιβάλλει σχετικά με τους περιορισμούς στη χρήση των αντισωμάτων συζητούνται [45]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται πιο συχνά αναγνωρίζουν AC133 και AC141 υψηλά γλυκοζυλιωμένη επίτοπους [46]. Ως εκ τούτου, η χρήση τους ενέχει τον κίνδυνο υποτιμηθεί μη γλυκοσυλιωμένες μορφές του αντιγόνου. Επιπλέον, αρκετές μάτισμα CD133 mRNA έχουν εντοπιστεί, η οποία με τη σειρά του να οδηγήσει σε πρωτεΐνη προϊόντα που δεν αναγνωρίζονται από κοινού αντισώματα? Τέλος, εγγενή όρια του ανοσοφθορισμού και κυτταρομετρία μεθοδολογίες, πράγμα που συνεπάγεται την ευαισθησία αντίσωμα, βλάβη επιτόπιο λόγω ρουτίνα στερέωση /διαδικασίες ένταξης, ανάκτηση αντιγόνου, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη [47] ενζυματικά στάδια της παρασκευής των κυττάρων. Σε αυτό το πλαίσιο, μπορούμε επίσης να υποθέσουμε ότι ΤΟΡβ-1 θεραπεία προκαλούν διαμορφωτική αλλαγή των επιτόπων CD133 και το αντίσωμα του δεν είναι σε θέση να αναγνωρίσει το μόριο σε διαδικασίες κυτταρομετρίας και ανοσοφθορισμού. Στις pneumospheres, πιθανότατα, τρισδιάστατο δομή επιτρέπει την έκθεση των επιτόπων που αναγνωρίζονται από κοινά αντισώματα. Επιπλέον, δεν υπόκεινται σε ενζυμική βήματα που θα μπορούσαν να βλάψουν την κυτταρική δομή.

Αν και αυτή η εξέταση, RT-PCR και κηλίδας Western επιβεβαιώνουν την ίδια τη λειτουργία βλαστική ικανότητα της κυτταρικής σειράς EMT-LC31 μετά τη θεραπεία του TGFβ-1 με πάνω ρύθμιση τόσο CD133 m-RNA και CD133 πρωτεΐνη.

Τέλος, για την αξιολόγηση TGFβ-1 επίδραση στην ογκογόνο δυναμικό, θα πραγματοποιούνται τόσο μαλακό δοκιμασία άγαρ και ογκογενετικότητας

in vivo

. ΤΟΡβ-1, σύμφωνα με την έννοια καρκινικά βλαστικά κύτταρα, επάγει μια αύξηση του σχηματισμού αποικιών σε μαλακό πειράματα άγαρ και ο όγκος των όγκων ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των μη επεξεργασμένων LC31 κυτταρικής γραμμής επιβεβαιώνοντας ότι φαινότυπο ΕΜΤ δεν προωθείται μόνο φαινότυπο βλαστική ικανότητα, αλλά και την ογκογονικότητα . Εν κατακλείδι, τα κύτταρα με φαινότυπο EMT προωθείται ογκογενετικότητας.

Ως εκ τούτου, η μεγάλη πιθανότητα ότι η EMT παράγει κύτταρα με πολλές από τις ιδιότητες της αυτο-ανανέωση των βλαστικών κυττάρων επαληθεύεται από την αυξημένη έκφραση του Nanog, Oct4 και Sox2, προσδιοριστικών παραγόντων αυτο-ανανέωσης και CD133 και c-Kit, κύρια βλαστική ικανότητα δείκτες των ΚΕΠ στον καρκίνο του πνεύμονα.

Εν κατακλείδι, αναφέρουμε ότι η επαγωγή της EMT από TGFβ-1 θεραπεία σε ένα δημοτικό πνεύμονα αποτελέσματα κυτταρική σειρά καρκίνου στην απόκτηση του προφίλ μεσεγχυματικών και up-ρύθμιση της έκφρασης των δεικτών των βλαστικών κυττάρων.

Αυτή η μελέτη αναδεικνύει τη δυνατότητα να αντιμετωπίσει μια νέα φαρμακολογική προσέγγιση έναντι κυττάρων EMT-φαινότυπο ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν για την πρόληψη της εξέλιξης του όγκου και του σχηματισμού μετάστασης.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Τα πειραματικά πρωτόκολλα έχουν αξιολογηθεί και εγκριθεί από την επιτροπή δεοντολογίας σχετικά με τη χρήση των ζώων Biogem. Το πειραματικό σχέδιο έχουν το αναγνωριστικό έγκριση 10.08 και έχουν κοινοποιηθεί 26η Μάη

ου 2008 προς τον Υπουργό Υγείας της Ιταλίας, σύμφωνα με τις εθνικές νομοθεσίες που αφορούν την προστασία της καλής διαβίωσης των ζώων. Ο ασθενής, που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη, είχε υπογράψει συγκατάθεση, η οποία εγκρίθηκε από την εσωτερική επιτροπή δεοντολογίας μας (Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Νάπολη).

Cell Culture

Α549 κυτταρική σειρά αγοράστηκε από την ATCC Τράπεζα Κυττάρων και καλλιεργήθηκε σε RPMI1640 (Lonza, Μιλάνο, Ιταλία) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) στους 37 ° C, 5% CO

2. LC31 κυτταρική σειρά έχει ληφθεί στο εργαστήριο μας από έναν ασθενή που επηρεάζονται από πλακώδες αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα με τη γραπτή συγκατάθεση, η οποία εγκρίθηκε από την εσωτερική επιτροπή δεοντολογίας μας (Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Νάπολη) και καλλιεργήθηκε σε ΙΜϋΜ (Lonza) σε 10% FBS [14] . Για τα πειράματα, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 90% συρροή.

ΤΟΡβ-1 θεραπεία και Ανάπτυξης Καμπύλες

Προκειμένου να διεγείρει διεργασία EMT, Α549 και κυτταρικές σειρές LC31 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 ng /ml ΤΟΡβ -1 (Abcam, Μιλάνο, Ιταλία) για 30 και 80 ημέρες, αντίστοιχα. ΤGFβ-1 έχει προστεθεί δύο φορές την εβδομάδα στο μέσο. Για να ελεγχθεί η πιθανή αναστολή της ανάπτυξης λόγω της ΤΟΡβ-1 θεραπεία, 10.000 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία 24well για κάθε κυτταρική σειρά και ΤGFβ-1 και χωρίς θεραπεία επεξεργασμένα κύτταρα αποκολλήθηκαν κάθε 24 ώρες επί 10 ημέρες. Ο αριθμός των κυττάρων για κάθε πειραματική συνθήκη μετρήθηκε και παριστάνεται σε ένα γραμμικό γράφημα. Ο χρόνος διπλασιασμού (DT) προσδιορίστηκε από τις καμπύλες ανάπτυξης με τη χρήση του τύπου: όπου τα t και t

0 ήταν οι χρόνοι στους οποίους μετρήθηκαν τα κύτταρα, και Ν και Ν

0 ήταν οι αριθμοί των κυττάρων σε χρόνους t και t

0, αντίστοιχα.

pneumospheres δοκιμασία

για να αξιολογηθεί η επίδραση του ΤΟΡβ-1 επί pneumospheres ανάπτυξη και τον σχηματισμό, το LC31 κυτταρική σειρά επιστρώθηκε σε πυκνότητα 60.000 κύτταρα ανά φρεάτιο σε έξι φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως (Corning Inc., Corning, ΝΥ, USA) σε μέσο κυτταρικής BEBM, συμπληρωμένο με BEGM [προσυσκευασμένο SingleQuots περιέχουν ρετινοϊκό οξύ, εκχύλισμα υπόφυσης βοοειδούς, ινσουλίνη, υδροκορτιζόνη, τρανσφερίνη, triiodotyronine, επινεφρίνη, ανθρώπινο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα, γενταμικίνη και αμφοτερικίνη Β (όλα από την Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland) συν ανθρώπινου EGF (10 ng /ml? Sigma, Μιλάνο, Ιταλία) και την ανθρώπινη bFGF (10 ng /ml? Sigma, Μιλάνο , Ιταλία). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C με 5% CO

2. Φρέσκα δείγματα του ΤΟΡβ-1, EGF και bFGF προστέθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Μετά από 48-72 ώρες καλλιέργειας, σφαίρες ήταν ορατές στο μικροσκόπιο ανεστραμμένης φάσης-αντίθεσης.

κυτταρομετρίας ροής

Για να αξιολογηθεί η επίδραση των TGFβ-1 τόσο βλαστική ικανότητα και τη διαφοροποίηση του φαινοτύπου των Α549 , και LC31 κυτταρικές σειρές, 200.000 κύτταρα βάφτηκαν με τα ακόλουθα αντισώματα (2 μg /ml): ποντικού αντι-ανθρώπινο CD90 FITC (Becton & amp? Dickinson, Buccinasco, Μιλάνο, Ιταλία), μεσεγχυματικά δείκτη, ποντικού αντι-ανθρώπινο CD133 ΡΕ ( Miltenyi Biotec, Calderara di Reno, Μπολόνια, Ιταλία), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD326 PerCP (EpCAM, Becton & amp? Dickinson), επιθηλιακά δείκτη, ποντικού αντι-ανθρώπου βιμεντίνη (ϋΑΚΟ, Μιλάνο, Ιταλία) και ποντικού αντι-Cytokeratin (κλώνος CK3 -6H5, Miltenyi Biotec). Τα αντισώματα επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι. Μετά την επώαση, τα δείγματα πλύθηκαν με PBS και αναλύθηκαν με FACSAriaII (Becton Dickinson).