Αφηρημένο

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθειες σε όλο τον κόσμο. Αναδυόμενες στοιχεία έχουν δείξει ότι η ανώμαλη έκφραση των microRNAs (miRNAs) παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον πιθανό ρόλο του miR-217 στο GC. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο του miR-217 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων GC και εισβολή. Η έκφραση του miR-217 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε κύτταρα GC και GC ανθρώπινους ιστούς. Επιβάλλεται η έκφραση του miR-217 κύτταρα ανέστειλε GC πολλαπλασιασμό και την εισβολή. Επιπλέον, γλυπικάνη-5 (GPC5), ένα νέο ocncogene, αναγνωρίστηκε ως ο πιθανός στόχος του miR-217. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-217 εξασθενημένη GPC5 που προκαλείται από την προώθηση του πολλαπλασιασμού και της εισβολής στα κύτταρα GC. Συμπερασματικά, τα ευρήματα αυτά αποκάλυψαν ότι miR-217 λειτούργησε ως ογκοκατασταλτικό και ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό και τη διείσδυση των κυττάρων GC με τη στόχευση GPC5, η οποία μπορεί κατά συνέπεια να χρησιμεύσουν ως θεραπευτικός στόχος για τους ασθενείς GC

Παράθεση:. Wang H , Dong X, Gu Χ, Τσιν R, Jia Η Gao J (2015) Η microRNA-217 Λειτουργίες ως δυνητικοί ογκοκατασταλτικό στο γαστρικό καρκίνο από Στόχευση GPC5. PLoS ONE 10 (6): e0125474. doi: 10.1371 /journal.pone.0125474

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 10 Οκτωβρίου 2014? Αποδεκτές: 24, Μάρτη 2015? Δημοσιεύθηκε: 22, Ιουνίου του 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν αντικρουόμενα συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η τέταρτη πιο κοινή ανθρώπινη κακοήθειες και η δεύτερη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο, με περίπου ένα εκατομμύριο νέες περιπτώσεις ανά έτος [1-4]. Παρά τις πρόσφατες εξελίξεις στη διαγνωστική μέθοδο, χειρουργική τεχνική και τα νέα σχήματα χημειοθεραπείας, το ποσοστό της μακροχρόνιας επιβίωσης για GC είναι ακόμα αρκετά χαμηλό [5, 6]. Σε πολλούς ασθενείς, GC διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο με εκτεταμένη εισβολή και του λεμφικού μετάσταση. Η επιτυχής θεραπευτικές στρατηγικές είναι περιορισμένες και η θνησιμότητα είναι υψηλή [7]. Ως εκ τούτου, είναι επείγον να διερευνήσει τις θεμελιώδεις μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αντίσταση των ναρκωτικών, ιστολογική ανομοιογένεια, και την ανάπτυξη της μετάστασης για την ταυτοποίηση νέων δεικτών για τη διάγνωση και τη θεραπεία για τη GC.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, περίπου 22 -nucleotide, μη-κωδικοποιητική RNAs που λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθμιστές γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνη στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο [8, 9]. Με τη δέσμευση των συμπληρωματικών αλληλουχιών στις 3′-αμετάφραστες περιοχές (3′-UTR) του mRNA που στόχο τους, miRNAs μπορεί να επάγει την άμεση αποικοδόμηση του mRNA ή της αναστολής της μετάφρασής [10-13]. Αύξηση απόδειξη έχει δείξει ότι οι miRNAs εμπλέκονται σε πολλές σημαντικές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, την αγγειογένεση και ανοσολογική απόκριση. Απορρύθμιση της miRNAs μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογική γονιδιακή έκφραση σε διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του στομάχου [14-16]. Ωστόσο, η κατανόηση του ρόλου και της λειτουργίας των miRNAs στο GC είναι ακόμα σε πρώιμο στάδιο. Ομοίως, οι ρόλοι των πολλών άλλων εκφράζονται ανώμαλα miRNAs στην ανάπτυξη του GC είναι ακόμα άγνωστη.

Ελάττωση του miR-217 είναι ένα συχνό συμβάν σε διάφορους καρκίνους, υποδεικνύοντας σημαντικό ρόλο της στην καρκινογένεση [17-19]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τον πιθανό ρόλο του miR-217 στο GC. Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση του miR-217 μειώθηκε σε κυτταρικές σειρές GC και ιστών. Επιπλέον, χαμηλότερη έκφραση του miR-217was που σχετίζονται με το στάδιο pTNM. Η υπερέκφραση του miR-217 κατέστειλε κυττάρων GC εισβολής και του πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης και κηλίδα western επιβεβαίωσε ότι το miR-217might λειτουργία ως καταστολέας των όγκων σε GC από targetingGlypican-5 (GPC5).

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλοι οι ασθενείς συμφώνησαν να συμμετάσχουν στη μελέτη και έδωσαν γραπτή συγκατάθεση. Αυτή η μελέτη και η συναίνεση εγκρίθηκε από την ηθική του διοικητικού συμβουλίου του ινστιτούτου των συνδεδεμένων YANAN Νοσοκομείο Κουνμίνγκ Πανεπιστήμιο Ιατρικής και συμμορφώθηκε με τη δήλωση του Ελσίνκι.

δείγματα ιστών

Τα δείγματα των ανθρώπινων ιστών GC και αντιστοιχισμένο -adjacent μη-όγκου γαστρικών ιστούς που ήταν μακρύτερα από 5 cm από τους όγκους ελήφθησαν από 50 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή στο The Ενταγμένο Yanan Νοσοκομείο Κουνμίνγκ Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Φρέσκα δείγματα ήταν θραύση κατεψυγμένα inliquid άζωτο αμέσως μετά την εκτομή και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται με ενημερωμένη συγκατάθεση των ασθενών και επιβεβαιώθηκαν ιστολογικά με χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη. Η ιστολογική ποιότητας των καρκίνων αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια που καθορίζονται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν ραδιοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν την επέμβαση. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών που περιγράφονται στον Πίνακα S1.

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45 και μία κανονική γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων γραμμή GES-1 (ως μάρτυρα) αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Βιοχημείας και κυτταρικής Βιολογίας στο κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45 πολλαπλασιάστηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και GES-1 πολλαπλασιάστηκε σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (Invitrogen). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν with10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή 5% CO2.

εκχύλιση RNA και qRT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη από κατεψυγμένα δείγματα (ή τα κύτταρα) χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ ( Invitrogen) ακολουθώντας τον οδηγό του κατασκευαστή. 1mL του RNA χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η έκφραση του miR-217 με ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) με τα TaqMan miRNA kit αντίστροφη μεταγραφή andtheTaqMan miRNA δοκιμασία-ειδικούς εκκινητές RT για miR-217 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems, Foster City, CA). Η έκφραση του U6 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με 1 mL από κάθε cDNA σε ένα One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) Στάδιο εις διπλούν. Η έκφραση του miR-217 ορίστηκε με βάση τον κύκλο κατωφλίου (Ct), και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν as22

– [(Ct του miR-217) – (Ct του U6)] μετά από κανονικοποίηση σε σχέση με την έκφραση της U6 μικρό πυρηνικό RNA [20, 21] (S2 πίνακα).

κηλίδος Western

η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κατεψυγμένα δείγματα (ή τα κύτταρα) χρησιμοποιώντας συνολικά Protein Extraction Kit (KeyGen, Nanjing , Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης έγινε χρησιμοποιώντας ένα BCA Protein Assay Kit (KeyGen). Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για western blot ήταν πολυκλωνικό κουνελιού αντι-GPC5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), μονοκλωνικό ποντικού αντι-GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA).

Κυττάρων επιμόλυνση

Το miR-217 μιμούνται, μιμούνται τον έλεγχο (αγωνίζομαι), αναστολέα miR-217, ο έλεγχος αναστολέα, Pez-GPC5 και του φορέα ελέγχου αγοράστηκαν από RiboBio (Guangzhou, Κίνα). Τα κύτταρα HGC-27 σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων σε 30% συρροή μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση. Lipofectamine2000 (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση του πλασμιδίου μόνο του ή μαζί με το RNA ολιγονουκλεοτίδια.

δοκιμασίες λουσιφεράσης

κύτταρα από 8 × 10

3 απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 24-hincubation, ένα μείγμα από 100 ng-pLuc-3′-UTR, 5-pmol αρνητικό έλεγχο, miR-217mimic συνεπιμολύνθηκε με 20 ng Renilla σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000. Είκοσι τέσσερα hoursafter επιμόλυνση, πυγολαμπίδας και δραστηριοτήτων λουσιφεράσης Renilla ήταν μετράται με Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκε με συνδιαμόλυνση με ένα φορέα ρεπόρτερ Renilla.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

Κύτταρα (3000 /φρεάτιο) συλλέχθηκαν και εμβολιάστηκαν σε 96-wellplates και επωάστηκαν στους 37 ° C μετά την επιμόλυνση. Μετά από επώαση για 1 έως 5 ημέρες, για να προστίθεται το μέσο του κάθε φρεάτιο 10% Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8? Dojindo, Kumamoto, Japan), και οι πλάκες επωάστηκαν περαιτέρω για άλλες 3 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με 150 mL διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO? Sigma-Aldrich), και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Sunrise). Η δοκιμασία επαναλήφθηκε 3 φορές με έξι αντίγραφα.

κηλίδος Northern

Ολικό RNA απομονώθηκε από κάθε ιστό, χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen Life Technologies) και Northern blotting διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγούμενα [23] . Μετά Perfect υβριδοποίηση Hyb Plus στους 68 ° C, οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν και αναλύθηκαν. Northern στυπώματα υβριδοποιήθηκαν με ένα 18S ριβοσωματικού RNA (rRNA) cDNA χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Κυττάρων εισβολή

δοκιμασίες Εισβολή πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας θαλάμους εισβολή Transwell επικαλυμμένων με Matrigel (BD, ΗΠΑ) ως που περιγράφεται στο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν withmiR-217 μιμείται, αναστολέα ή αρνητικό ολιγονουκλεοτίδιο ελέγχου, καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες, και μεταφέρθηκε στην κορυφή του Matrigel επικαλυμμένων θαλάμους εισβολή σε DMEM χωρίς ορό (1 × 10

5 κύτταρα ανά Transwell). ΫΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου προστέθηκε στους κάτω θαλάμους. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα που παρέμειναν στην κορυφή του φίλτρου καθαρίζεται μακριά και τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω επιφάνεια μονιμοποιήθηκαν in90% αλκοόλ και ακολουθείται από χρωστική κρυσταλλικού ιώδους.

Ιστολογίας

η ιστολογική διάγνωση ήταν σύμφωνα με τη μέθοδο της γαστρικής βιοψίας triple-χώρο. Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν για μία νύχτα σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης, ενσωματωμένο σε παραφίνη, κόβονται σε πάχος 3 μm και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η &? Ε). Χρώσης

Στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο λογισμικού SPSS 17.0. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές, και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Η συσχέτιση μεταξύ miR-217 και GPC5 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τεστ συσχέτισης Spearman του. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων για τη στατιστική σημαντικότητα διεξήχθησαν με Μαθητή ζεύγη δύο tailed t-test ή One-way ANOVA. P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική.

Αποτέλεσμα

Η έκφραση του miR-217 είναι προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές GC

Εμείς πρώτον ποσοτικά το επίπεδο έκφρασης του miR-217 σε τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45) και GES-1 χρησιμοποιώντας βόρεια blot (Σχήμα 1Α). Το επίπεδο έκφρασης του miR-217 wasdecreased σε κυτταρικές σειρές GC σε σύγκριση με GES-1. QuantitativeRT-PCR έδειξε επίσης ότι η έκφραση του miR-217 μειώθηκε σε κυτταρικές σειρές GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45) σε σύγκριση με GES-1, ένα φυσιολογικό γαστρικό επιθηλιακή κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1Β ).

(A) Το επίπεδο έκφρασης του miR-217 σε τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45) και GES-1 προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας κηλίδος Northern . (Β) Η έκφραση του miR-217 είχε εκτιμηθεί σε κυτταρικές σειρές GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45) andGES-1using Ποσοτική RT-PCR.

Η

miR-217 ρυθμίζεται μειωτικά σε ιστούς GC

Ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει miR-217 έκφρασης σε 50 ιστούς GC και αντιστοιχισμένο παρακείμενων noncancerous ιστούς τους. Τα αντιπροσωπευτικά ιστολογικά χαρακτηριστικά του GC και αντιστοιχισμένο παρακείμενων noncancerous ιστούς του δείχθηκαν στο σχήμα 2Α. Μεταξύ 50 ιστούς όγκων, 44 περιπτώσεις εμφάνισαν μειωμένη έκφραση miR-217 σε σύγκριση με τα γειτονικά φυσιολογικούς ιστούς (88%, 44 50, Σχήμα 2Β). Η έκφραση του miR-217 ήταν χαμηλότερη σε ιστούς GC σε σχέση με το γειτονικό noncancerous ιστούς (Σχ 2C). . Επιπλέον, τα χαμηλότερα επίπεδα του miR-217 έκφραση που σχετίζεται με το στάδιο pTNM των ασθενών GC (Εικ 2Δ)

(Α) Οι ιστοί ήταν ιστολογικά επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας Η &? Χρώση Ε. (Αρχική μεγέθυνση, χ 100). (Β) miR-217 ανιχνεύτηκε σε 50 ασθενείς GC με πραγματικού χρόνου PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως log 2 Τ /Ν φορές μεταβολής των ιστών GC σε σχέση προς μη-όγκο γειτονικούς ιστούς. (Γ) Η έκφραση του miR-217 σε ιστούς GC σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς. Η έκφραση του miR-217 ομαλοποιήθηκε με U6 snRNA. (Δ) Η στατιστική ανάλυση της σχέσης μεταξύ επιπέδου miRNA και το στάδιο pTNM (Ι, ΙΙ, ΙΙΙ και IV). * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001. Μονόδρομη ANOVA εκτελέστηκε για ανάλυση.

Η

miR-217 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC και εισβολή

Η έκφραση του miR-217was αυξήθηκε σε επιμολυσμένα HGC-27 κύτταρα χρησιμοποιώντας miR-217 μιμείται (Σχήμα 3Α) και μειωμένη χρήση αναστολέα miR-217 (Σχήμα 3Β). Ο πολλαπλασιασμός μειώθηκε στα κύτταρα HGC-27 επιμολυσμένα withmiR-217 μιμείται σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με μπάλα ή χωρίς αγωγή (Σχήμα 3C). Εν τω μεταξύ, ο πολλαπλασιασμός αυξήθηκε σε HGC-27 κύτταρα επιμολυσμένα withmiR-217inhibitor σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο ή ακατέργαστο (Εικ 3D). Η εισβολής των κυττάρων επιμολυσμένων με miR-217 μιμείται μειώθηκε σε σύγκριση με την ομάδα αγωνίζομαι ή κύτταρα ομάδα ελέγχου και miR-217 αναστολέα αυξημένη κυτταρική εισβολή σε σύγκριση με την ομάδα αγωνίζομαι ή τον έλεγχο των κυττάρων ομάδα (Σχήμα 3Ε).

( Α) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR του miR-217 σε HGC-27 κυττάρων μετά από επιμόλυνση ofmiR-217 μιμούνται. Η έκφραση του miR-217 σε HGC-27 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-217 μιμείται ήταν up-regulated.U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) Η έκφραση του miR-217 σε HGC-27 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-217inhibitor ήταν κάτω regulated.U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. έκφρασης (C) έκτοπη miR-217 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως αποδεικνύεται με δοκιμασία CCK8. (D) Αναστολή της miR-217 έκφραση προωθείται σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως αποδεικνύεται με δοκιμασία CCK8. (Ε) Εισβολή ανάλυση των HGC-27cells μετά τη θεραπεία withmiR-217 μιμείται, αναστολείς ή αγωνίζομαι ή τον έλεγχο? η σχετική αναλογία των μεταστατικών κυττάρων ανά πεδίο παρουσιάζεται πιο κάτω, * ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

Η

miR-217 μεταγραφικούς μειώνει την έκφραση GPC5 με απευθείας στόχευση 3’ΙΙΤΡ

Ανάλυση με τη χρήση διαθέσιμων αλγορίθμων του ανέφερε ότι GPC5 ήταν ένα θεωρητικό γονίδιο στόχο του miR-217 (Σχήμα 4Α) [24]. Για να αποδείξει ότι το miR-217 στοχεύει άμεσα την GPC53’UTR, πραγματοποιήσαμε λουσιφεράσης προσδιορισμούς γονιδίου αναφοράς. Έκτοπη του miR-217 μειωμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης στο γονίδιο ανταποκριτή άγριου τύπου GPC5 αλλά όχι ο μεταλλαγμένος GPC5 3’UTR, υποδεικνύοντας ότι miR-217 στοχεύουν άμεσα το GPC5 3’UTR (Σχήμα 4Β). Το επίπεδο του mRNA της GPC5 μειώθηκε μετά από επιμόλυνση με miR-217 μιμείται και αυξημένη μετά την επιμόλυνση με miR-217 αναστολέα χρησιμοποιώντας qRT-PCR (Σχήμα 4C). Συνεπής με αυτό το αποτέλεσμα, η ικανότητα του miR-217 για να ρυθμίζουν την έκφραση της πρωτεΐνης GPC5 επαληθεύθηκε με στύπωμα Western (Εικόνα 4D).

(Α) Το 3′-UTR του mRNA GPC5 περιέχει τις αλληλουχίες πρόσδεσης του miR-217. (Β) Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης του υποδεδειγμένου GPC5reporter κατασκεύασμα σε HGC-27cells δείχνεται. τιμές λουσιφεράσης Firefly κανονικοποιήθηκαν προς δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla και σχεδιάστηκαν ως σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης. (C) miR-217 υπερέκφραση μείωσε σημαντικά τα επίπεδα GPC5 mRNA στα κύτταρα HGC-27 και ο αναστολέας miR-217 ενισχύεται σημαντικά τα επίπεδα GPC5 mRNA στα κύτταρα HGC-27. (D) κηλίδωση Western διεξήχθη για να εξεταστούν οι επιδράσεις της miR-217 στην έκφραση GPC5. GAPDH ανιχνεύθηκε επίσης ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Αποκατάσταση του miR-217 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC GPC5 μεσολάβηση και την εισβολή

Η υπερέκφραση της GPC5 προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC και εισβολή. Όταν miR-217 μιμούνται και Pez-GPC5 συνεπιμολύνθηκαν σε HGC-27 κύτταρα, miR-217 έκφρασης μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC GPC5 που προκαλείται και εισβολής (Σχήμα 5Α και 5C). Η αναστολή της GPC5 μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC και εισβολή. Όταν miR-217 αναστολέα και shGPC5 συνεπιμολύνθηκαν σε HGC-27 κύτταρα, miR-217 αναστολέα προώθησε την shGPC5-ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή (Σχήμα 5Β και 5D).

(Α) Η αύξηση κυττάρων σε HGC- 27co-επιμολυσμένα είτε με miR-217 μιμούνται ή 2,0 μg Pez-GPC5 ή pCDNA κενό φορέα χρησιμοποιώντας δοκιμασία CCK-8 πολλαπλασιασμό. (Β) Η ανάπτυξη των κυττάρων σε HGC-27co-επιμολυσμένα είτε με miR-217 αναστολέα ή 2,0 μg shGPC5 (χτυπήματα κάτω GPC5) ή pCDNA κενό φορέα χρησιμοποιώντας CCK-8 δοκιμασία πολλαπλασιασμού. (Γ) Το κύτταρο επεμβατική σε HGC-27co-επιμολυσμένα είτε με miR-217 μιμούνται ή 2,0 μg Pez-GPC5 ή pCDNA κενό φορέα χρησιμοποιώντας δοκιμασία εισβολής. (D) Η κυττάρων να εισβάλουν στα HGC-27co-επιμολυσμένα είτε με miR-217inhibitor ή 2,0 μg shGPC5 ή pCDNA κενό φορέα χρησιμοποιώντας δοκιμασία εισβολής. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01 και *** ρ & lt?. 0.001

Η

GPC5 υπερεκφράζεται σε κυτταρικές σειρές GC και δείγματα

Η έκφραση της GPC5 ήταν υψηλότερη σε κυτταρικές γραμμές GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45) σε σύγκριση με GES-1, ένα φυσιολογικό γαστρικό κυτταρική σειρά επιθηλιακών (Εικόνα 6Α). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του GPC5 ήταν επίσης υψηλότερη σε ιστούς GC από ότι σε παρακείμενες noncancerous ιστούς χρησιμοποιώντας κηλίδα western (Σχήμα 6Β).

(Α) Η έκφραση του mRNA της CPG5 είχε εκτιμηθεί σε κυτταρικές σειρές GC (SGC-7901, HGC-27, MGC-803, ΜΚΝ-45) και GES-1 χρησιμοποιώντας Ποσοτική RT-PCR. (Β) Το επίπεδο της πρωτεΐνης των CPG5 σε οκτώ ανθρώπινους ιστούς GC και των παρακείμενων φυσιολογικών μαρτύρων της ήταν ποσοτικά χρησιμοποιώντας κηλίδα western.

Η

Συζήτηση

GC προκαλεί σχεδόν ένα εκατομμύριο θανάτους παγκοσμίως κάθε χρόνο [ ,,,0],25]. Πρόσφατα, συσσωρεύοντας απόδειξη έχει προτείνει ότι miRNAs διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην παθογένεια της GC μέσω ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, τη μετανάστευση, τις διαφημίσεις εισβολή [26-28]. Σε αυτή τη μελέτη, miR-217 ήταν συχνά μειωτικά σε ανθρώπινες κυτταρικές GC γραμμές και τους ιστούς και το χαμηλότερο επίπεδο του miR-217 συνδέθηκε με το στάδιο pTNM του GC. Περαιτέρω πειράματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-217 μπορεί να καταστείλει GC κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. GPC5 ταυτοποιήθηκε ως άμεσο και λειτουργικό στόχο του miR-217. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι miR-217 φαίνεται να είναι μία νέα ογκοκατασταλτικό σε GC και ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω miR-217 μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου σε ασθενείς με GC. Προς τα κάτω ρύθμιση των miR-217 είναι ένα συχνό συμβάν σε διάφορους καρκίνους, υποδεικνύοντας σημαντικό ρόλο της στην καρκινογένεση [17-19]. Λι και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι το miR-217 ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε σαφή κελί καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων (ccRCC) σε σύγκριση με αντιστοιχισμένο φυσιολογικό ιστό [29]. Χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης του miR-217 συσχετίστηκε με υψηλότερο βαθμό του όγκου και το στάδιο. Σε αυτή τη μελέτη, miR-217 ήταν συχνά προς τα κάτω σε GC. Περιέργως, οι ασθενείς με χαμηλότερη έκφραση του miR-217 έτειναν να έχουν πιο προχωρημένο στάδιο TNM, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χαμηλή έκφραση ofmiR-217was που σχετίζονται με την εξέλιξη της GC. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-217 κατέστειλε κυττάρων GC εισβολής και του πολλαπλασιασμού. Μαζί με τα προηγούμενα αποτελέσματα, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το miR-217might διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην ομοιόσταση των ιστών GC και deregulatedmiR-217 θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάπτυξη ενός στομάχι νεοπλασίας.

Για να διερευνήσουν το μοριακό μηχανισμό του ρόλου ογκοκατασταλτικό του miR-217 σε GC, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης και κηλίδα western για να επιβεβαιώσετε ότι GPC5 ήταν ο στόχος του miR-217 σε κύτταρα GC. Για να επιβεβαιώσετε την άμεση ρύθμιση των GPC5 από miR-217, χρησιμοποιήσαμε GPC «φορέα αναφοράς 3 UTR που φέρει την πιθανή θέση πρόσδεσης miR-217 στην φθορισμού δημοσιογράφος. Επιπλέον, qRT-PCR και προσδιορισμός στυπώματος Western έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-217 ανέστειλε έκφραση GPC. Glypicans είναι μια οικογένεια πρωτεογλυκανών που συνδέονται με την exocytoplasmic επιφάνεια της μεμβράνης πλάσματος μέσω μίας άγκυρας γλυκοζυλ φωσφατιδυλινοσιτόλη [30, 31]. Έξι glypicans έχουν ταυτοποιηθεί σε θηλαστικά (GPC1 να GPC6) [32, 33]. GPC5 εκφράζεται κυρίως στις αναπτυσσόμενες κεντρικό νευρικό σύστημα, τα άκρα, τους νεφρούς, τους πνεύμονες και το ήπαρ [34, 35]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι μερικοί GPCs, ειδικά GPC3 andGPC5, θα μπορούσε να διαδραματίσει έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της εξέλιξης του καρκίνου [35, 36]. Για παράδειγμα,

Zhang

et al. έδειξαν ότι GPC5 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε SACC-M (υψηλή πνεύμονα-μεταστατική κυτταρική γραμμή) και σε κλινικά δείγματα των σιελογόνων αδενοκυστικό καρκίνωμα (SACC) περιπτώσεις με μετάσταση στους πνεύμονες [36]. Το συνολικό επίπεδο έκφρασης της GPC5 σε κλινικές περιπτώσεις SACC με μετάσταση στους πνεύμονες ήταν υψηλότερη. Williamson et al. έδειξαν ότι οι GPC5was γονίδιο που κωδικοποιεί ενισχυμένο στο 20% των ασθενών με κυψελιδικό ραβδομυοσάρκωμα (RMS) και ότι αυτή η γλυπικάνη υπερεκφράστηκε σε ασθενείς RMS. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης GPC5 με siRNA ανέστειλαν το ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων RMS. Μια άλλη μελέτη διαπίστωσε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης GPC5 προβλεφθεί κακή μετεγχειρητικών χρόνοι επιβίωσης για θεραπευτικά σεβαστή ασθενείς με NSCLC, υποδηλώνοντας την αξία της GPC5 ως μοριακός δείκτης προγνωστικός [35, 37]. Στη μελέτη μας, η έκφραση του GPC5 ήταν υψηλότερη στις κυτταρικές γραμμές GC και τα επίπεδα πρωτεΐνης του GPC5 ήταν επίσης υψηλότερη σε ιστούς GC σε σχέση με το γειτονικό noncancerous ιστούς. Η αναστολή της GPC5 μείωσε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC και εισβολή. Αποκατάσταση του miR-217 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC GPC5 μεσολάβηση και την εισβολή. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-217might δρα ως καταστολέας των όγκων σε καρκίνο του στομάχου με τη στόχευση GPC5.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι το miR-217was προς τα κάτω σε ιστούς GC και κυτταρικές σειρές. Χαμηλά επίπεδα έκφρασης miR-217 συσχετίσθηκαν με pTNM στάδιο των ασθενών. έκφραση Έκτοπη miR-217 οδήγησε σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού GC και εισβολή. Περαιτέρω έρευνα αποκάλυψε ότι GPC5 ήταν ένας πιθανός στόχος του miR-217. miR-217 μπορεί να χρησιμεύσει ως προγνωστικός δείκτης για την πρόγνωση και ένα θεραπευτικό στόχο για τους ασθενείς GC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. Περίληψη της κλινικοπαθολογικών παραμέτρων των ασθενών με καρκίνο του στομάχου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s001

(DOCX)

S2 πίνακα. Primer ακολουθία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0125474.s002

(DOCX)