Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ και PI3K /AKT μονοπάτια /mTOR εμπλέκεται στην πλειονότητα των καρκίνων. Ενεργοποίηση μεταλλάξεις σε δύο από αυτές τις οδούς έχει περιγραφεί σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC), υποδεικνύοντας έτσι το δυναμικό τους ως θεραπευτικοί στόχοι. Αυτή η μελέτη αξιολόγησε το συνδυασμό ενός αναστολέα της ΡΙ3Κ /mTOR (PF-04691502 /PF-502) σε συνδυασμό με έναν αναστολέα ΜΕΚ (PD-0325901 /PD-901) σε κυτταρικές σειρές CRC και τον ασθενή που προέρχεται από τα μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου CRC (PDTX) .

Υλικά και Μέθοδοι

Τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα του PF-502 και PD-901 αξιολογήθηκαν ως μεμονωμένοι παράγοντες και σε συνδυασμό έναντι μιας ομάδας κυτταρικών σειρών CRC με διάφορες μοριακές υπόβαθρα. Συνέργεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bliss προσθετικός. Σε επιλεγμένες κυτταρικές σειρές, ερευνήσαμε τις συνδυασμένες συνέπειες στην κατάντη δράστες με ανοσοαποτύπωση. Ο συνδυασμός στη συνέχεια αξιολογήθηκε σε αρκετές πλήρως γενετικά σχολιασμένη μοντέλα CRC PDTX.

Αποτελέσματα

Οι

in vitro

πειράματα έδειξαν ένα ευρύ φάσμα IC

50 τιμές για δύο παράγοντες έναντι ενός πάνελ κυτταρική γραμμή. Ο συνδυασμός του PF-502 και PD-901 επέδειξε συνεργική αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα με τιμές Bliss στο εύρος πρόσθετο. Όπως αναμενόταν, το ρ-ΑΚΤ και ρ-ΕΚΚ ρυθμίστηκαν προς τα κάτω με PF-502 και PD-901, αντίστοιχα. Σε μοντέλα PDTX, μετά από έκθεση 30 ημερών στο PF-502, PD-901 ή του συνδυασμού, ο συνδυασμός επέδειξε ενισχυμένη μείωση στην ανάπτυξη του όγκου σε σύγκριση με είτε απλός παράγων, ανεξάρτητα από KRAS ή ΡΙ3Κ κατάστασης μεταλλάξεων.

συμπεράσματα

Ο συνδυασμός της PI3K /mTOR και ένας αναστολέας ΜΕΚ επέδειξαν ενισχυμένη αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις έναντι κυτταρικών σειρών CRC και τα μοντέλα PDTX

Παράθεση:. Pitts TM, Newton TP, Bradshaw-Pierce EL , Addison R, Arcaroli JJ, Klauck PJ, et al. (2014) Διπλή Φαρμακολογική στόχευση της ΜΑΡ κινάσης και PI3K /mTOR Pathway σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (11): e113037. doi: 10.1371 /journal.pone.0113037

Επιμέλεια: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, Καναδάς

Ελήφθη: 19 Ιουνίου του 2014? Αποδεκτές: 17η Οκτωβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 17 Νοέμβρη 2014

Copyright: © 2014 Pitts et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Pfizer Inc και το Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Κέντρο Καρκίνου P30 Grant CA046934. Οι χρηματοδότες είχε ένα μικρό ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης και την απόφαση να δημοσιεύσει. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στη συλλογή και ανάλυση δεδομένων, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς αυτού του χειρογράφου έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά συμφέροντα: Pfizer παρέχει οικονομική στήριξη σε SGE για ογκολογία υποτροφίες. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Δύο από τις πιο εμπλέκονται κυτταρικά μονοπάτια σε καρκίνους είναι οι φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3 κινάσες (PI3K) και η ενεργοποιημένη από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση (ΜΑΡΚ) μονοπάτια. Η τάξη Ι (ΡΙ3Κ) είναι ετεροδιμερείς κινάσες λιπιδίων τα οποία περιέχουν ένα ρυθμιστική υπομονάδα ρ85 και μία καταλυτική υπομονάδα ρ110 [1]. ΡΙ3Κ φωσφορυλιώνει την 3-υδροξυλ ομάδα της φωσφατιδυλινοσιτόλης, που συμμετέχουν σε μια ποικιλία από μονοπάτια σηματοδότησης σημαντική για τον καρκίνο όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, χημειοταξία, την επιβίωση, την εμπορία, και ομοιόσταση γλυκόζης [2], [3]. Λόγω των διαφορετικών κυτταρικής λειτουργίας του, ο άξονας ΡΙ3Κ είναι ιδιαίτερα εμπλέκεται σε καρκίνους του ανθρώπου? έως 30% όλων των καρκίνων του ανθρώπου έχουν μια μετάλλαξη σε ένα συστατικό ΡΙ3Κ οδός [4]. Σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), το

PIK3CA

γονίδιο, που κωδικοποιεί την ρ110α καταλυτική υπομονάδα της ΡΙ3Κ κατηγορίας Ι, έχει βρεθεί να μεταλλαχθεί σε 10-20% των δειγμάτων όγκου CRC [5].

Ένας μεταγενέστερος συστατικό του μονοπατιού σηματοδότησης της ΡΙ3Κ είναι ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR). Η κυτταρική ανάπτυξη είναι μια από τις κύριες λειτουργίες που διέπονται από mTOR? ενεργοποίηση του mTOR μέσω της οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ είναι κρίσιμη για την κυτταρική πρόσληψη σε ισορροπία θρεπτικών συστατικών και της ανάπτυξης, και παρεκκλίνουσα υπερενεργοποίηση αυτής της οδού συμβάλλει στην ογκογένεση [6], [7]. Ο ρόλος του mTOR σε αυτές τις κυτταρικές λειτουργίες που ένας ελκυστικός στόχος για αναστολή καθιστά? δεδομένου ότι η ανάπτυξη της ραπαμυκίνης πριν από σαράντα χρόνια, πολλές πρώτη και δεύτερη αναστολείς mTOR γενιάς έχουν συντεθεί και βρίσκονται σε διάφορα στάδια κλινικών και προκλινική ανάπτυξη [8], [9].

Η ΜΑΡΚ /ΕΚΚ (ΜΕΚ) συγκροτήματα είναι συστατικά του άξονα σηματοδότησης Ras /Raf. Σηματοδότηση μέσω αυτής της οδού έχει ως αποτέλεσμα αυξημένο πολλαπλασιασμό και την αντίσταση σε απόπτωση, ενώ συστατική ενεργοποίηση συμβάλλει στην χημειοαντίσταση σε αρκετούς καρκίνους [10], [11]. Μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS, ΕΡΑ, ή BRAF (όλα τα ανάντη των ΜΕΚ συγκροτήματα) είναι πολύ κοινό στην CRC, και έχουν βρεθεί σε 50-60% των δειγμάτων όγκου [12], [13]. Μια ποικιλία παραγόντων έχουν αναπτυχθεί που στοχεύουν EGFR, RAS, RAF, ή ΜΕΚ, πολλά από τα οποία βρίσκονται σε κλινικές δοκιμές και μερικά από τα οποία έχουν ήδη εγκριθεί [14].

Παρεμβολή μεταξύ του PI3K /AKT /mTOR υπάρχει μονοπάτι: για παράδειγμα, ΡΙ3Κ μπορεί να ενεργοποιηθεί με RAS, και ο καταστολέας όγκου tuberin (ένας αρνητικός ρυθμιστής του mTOR) είναι ένα άμεσο υπόστρωμα της ERK [15] – [17]. Έχει βρεθεί επίσης ότι η ταυτόχρονη εμφάνιση αλλοιώσεων της ΡΙ3Κ-ΑΚΤ-mTOR και RAS-RAF-ΜΕΚ μονοπάτια εμφανίζεται στο ένα τρίτο των δειγμάτων CRC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ταυτόχρονη αναστολή και των δύο οδών μπορεί να είναι απαραίτητη για θεραπευτικό όφελος [12]. Επιπλέον, θεωρείται ότι ο άξονας σηματοδότησης RAS-RAF-ΜΕΚ μπορεί να δράσει ως αντισταθμιστικό μηχανισμό με αναστολή του μονοπατιού PI3K-AKT-mTOR, και αντίστροφα [18], [19]. Η απόδειξη της εκτεταμένης cross-talk μεταξύ αυτών των οδών έχει δημιουργήσει μεγάλο ενδιαφέρον στην ταυτόχρονη αναστολή, με πολλές διαφορετικές στρατηγικές τώρα σε εξέλιξη [20].

Για να διερευνήσει την αποτελεσματικότητα των ταυτόχρονη αναστολή τόσο της PI3K-AKT-mTOR και τα μονοπάτια RAS-RAF-ΜΕΚ, εξετάσαμε τον συνδυασμό του PF-04691502 (PF-502) με PD-0325901 (PD-901). PF-502 είναι ένας από του στόματος βιοδιαθέσιμο, ισχυρός ανταγωνιστικός της ΑΤΡ αναστολέας της κινάσης της ΡΙ3Κ Ι και mTOR [21] τόσο τάξη, [22]. Σε ένα πρόσφατα ολοκλήρωσε τη φάση Ι κλινικής δοκιμής, PF-502 βρέθηκε να είναι καλά ανεκτή με την κούραση, μείωση της όρεξης, ναυτία υπεργλυκαιμία, εξάνθημα, έμετος, διάρροια και φλεγμονή του βλεννογόνου είναι οι πιο συνηθισμένα ανεπιθύμητες ενέργειες. Ωστόσο πλειονότητα από αυτούς ήταν Βαθμού 1 ή 2. [23] PD-901 είναι ένας πολύ ισχυρός, αναστολέας του στόματος, μικρού μορίου του ΜΕΚ1 και ΜΕΚ2 που έδειξαν κάποια δραστηριότητα σε πρώιμες κλινικές δοκιμές και συνδέθηκε με τοξικότητες χαρακτηριστικό αυτής της κατηγορίας παραγόντων : εξάνθημα

, διάρροια, κόπωση, ναυτία και διαταραχές της όρασης, [24]. PD-901 είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές Φάσης Ι για την θεραπεία του CRC σε συνδυασμό με ΡΚΙ-587 (PF-0521384), ενός αναστολέα διπλή ΡΙ3Κ /mTOR με παρόμοια δραστικότητα προς PF-502 [24] – [26]. Ένα όφελος αυτού του συνδυασμού είναι ότι μέσω της αναστολής του ανάντη ΡΙ3Κ, ανατροφοδότηση προς τα πάνω ρύθμιση της ΑΚΤ κατόπιν αναστολής mTOR αποφεύγεται [27].

Στην παρούσα μελέτη περιγράφεται η ενισχυμένη κατά του όγκου δραστικότητα του διπλού ΡΙ3Κ /αναστολέας mTOR PF-502 και ο αναστολέας ΜΕΚ PD-901 στο

in vitro

και

in vivo

μοντέλα καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικές ουσίες και Αντιδραστήρια

PF-04691502 (PF-502) και PD-0325901 (PD-901) δόθηκαν από την Pfizer Inc. (San Diego, CA). Για

in vitro

εργασία, και οι δύο παράγοντες διαλύθηκαν σε 100% DMSO σε μια συγκέντρωση 10 mM. Για

in vivo μελέτες

, PF-502 αιωρήθηκε σε 0.5% μεθυλοκυτταρίνη σε νερό, και PD-901 αιωρήθηκε σε 0.5% υδροξυπροπυλομεθυλοκυτταρίνη, 0,2% Tween-80 σε νερό.

Κυττάρων γραμμές και Πολιτισμού

Ανθρώπινο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection, DSMZ, ή την κορεατική κινητό Γραμμή Τράπεζας. κύτταρα Geo, που περιγράφηκε προηγουμένως [28], ευγενικά από τον Dr. Fortunato Ciardiello (Cattedra di Oncologia Medica, Dipartimento Ιατρο-Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale «F Magrassi e A Lanzara,» Seconda Universita ‘degli Studi di Napoli, Νάπολη, Ιταλία). ΚΜ12Ι_4, KM12C και KM20, που περιγράφηκε προηγουμένως [29], ήταν όλα ευγενώς από τον Scott Kopetz (MD Anderson Cancer Κέντρο, Houston, TX). Όλα τα κύτταρα ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε RPMI 1640. Όλα μέσο συμπληρώθηκε με 10% FBS, 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη και 1% ΜΕΜ μη βασικά αμινοξέα. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C υπό ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Τα κύτταρα συνήθως ελέγχονται για την παρουσία μυκοπλάσματος (MycoAlert? Cambrex BioScience). Όλες οι κυτταρικές σειρές CRC που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη έχουν χαρακτηριστεί πλήρως και επικυρώνονται στο Πανεπιστήμιο του Κολοράντο Κέντρο Καρκίνου DNA αλληλουχίας και ανάλυση Core.

σουλφοροδαμίνη Β (SRB) και CyQuant κυτταρικού πολλαπλασιασμού Αναλύσεις

Cells σπάρθηκαν σε σαφείς πλάκες 96 φρεατίων σε 2000-8000 κύτταρα ανά φρεάτιο, ανάλογα με τις ιδιότητες κυτταρικής γραμμής. Για τη δοκιμασία CyQuant, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μαύρες τοιχώματα πλακών. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες με μόνο μέσα ή ποικίλες συγκεντρώσεις του PD-901 (0,015 umol /L-1 umol /L) ή PF-502 (0,08 umol /L-5 umol /L), ως μονοί παράγοντες ή σε συνδυασμό. Για τη δοκιμασία CyQuant, πλάκες παρασκευάστηκαν και διαβάζονται σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Life Technologies, Carlsbad, CA). Σουλφοροδαμίνη Β δοκιμασίας (SRB) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 10% τριχλωροοξικού acidat 4 ° C για 30 λεπτά, πλύθηκαν 3Χ με ύδωρ, και ξηραίνεται σε RT. Αυτά στη συνέχεια χρωματίστηκαν με σουλφοροδαμίνη Β (SRB) διάλυμα (0,4% w /v SRB σε 1% οξικό οξύ) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πλύθηκε 3 χ με 1% οξικό οξύ, και το υπόλοιπο SRB διαλυτοποιήθηκε με 10 mM μη ρυθμισμένου Tris . Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 492 nm, χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη Synergy 2 πλάκας (Biotek, Winooski, VT). Δεδομένα ομαλοποιήθηκε με απορρόφηση της χωρίς φάρμακο (ΝΔ). Ένα αποτέλεσμα συνδυασμού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο Bliss προσθετικός όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31].

κασπάσης 3/7 Δραστηριότητα

Η κασπάση-Glo 3/7 φθορισμού δοκιμασία (Promega, Milwaukee, WI) χρησιμοποιήθηκε ως ένας δείκτης της αποπτωτικής δραστηριότητας μέσω κασπάσης 3 και 7 δραστηριότητα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε λευκό τοιχώματα πλακών σε 2000-8000 κύτταρα ανά φρεάτιο, ανάλογα με τις ιδιότητες κυτταρικής γραμμής. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επωάστηκαν για την υποδεικνυόμενη χρονική στιγμή με μόνο ή ποικίλες συγκεντρώσεις του PD-901 ή PF-502 media, ως μονοί παράγοντες ή σε συνδυασμό. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως πολλαπλή μεταβολή, κανονικοποιημένη με τον έλεγχο.

κλωνογενείς δοκιμασίες

Τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 2000 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. PD-901 ή PF-502 προστέθηκε σαν απλούς παράγοντες ή σε συνδυασμό και επωάστηκαν για 72 ώρες. Μετά από 72 ώρες τα κύτταρα πλύθηκαν σε πλήρες μέσο και μέσα χωρίς φάρμακο προστέθηκε πίσω για επιπλέον 72 ώρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη για 30 λεπτά και χρωματίστηκαν με 2% κρυσταλλικό ιώδες. Το κρυσταλλικό ιώδες ακολούθως διαλυτοποιείται σε 1% οξικό οξύ και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε μια πλάκα 96 φρεατίων. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 565 nm, χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη Synergy 2 πλάκας (Biotek, Winooski, VT). Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκε για τον έλεγχο.

Ανοσοκηλίδωση και Antibody Array

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες με είτε PD-901 ή PF-502, ή το συνδυασμό. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Cell Signaling, Danvers, ΜΑ). Μετά κατεργασία με υπερήχους και την φυγοκέντρηση, με ένα σύνολο 30 μα λύματος πρωτεΐνης φορτώθηκε σε γέλη NuPage (Life Technologies, Carlsbad, CA), ηλεκτροφορήθηκε, και μεταφέρθηκε σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας το iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η μεμβράνη αποκλείστηκε και ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα, πλένεται επί 10 λεπτά 3 χ με, και ανιχνεύθηκαν με DyLight δευτερογενή αντισώματα (κυτταρική σηματοδότηση, Danvers, ΜΑ), και απεικονίζεται με τη χρήση του Licor Οδύσσεια (Licor, Lincoln, ΝΕ). Όλα τα πρωτογενή αντισώματα αγοράζονται από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ) και αραιώνεται σύμφωνα με τις κατασκευές »οδηγίες. Για την συστοιχία αντισωμάτων, αποκόπηκαν οι όγκοι λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA χρησιμοποιώντας έναν ομογενοποιητή ιστών FastPrep24 (ΜΡ Biologicals, Santa Ana, CA). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε και προστέθηκε στο PathScan στρες και Array σηματοδοτήσει απόπτωση Αντίσωμα σύμφωνα τις κατασκευές »οδηγίες. Array αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας το Licor Οδύσσεια (Licor, Lincoln, NE). Ένταση του κάθε κηλίδα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Studio εικόνας (Licor, Lincoln, ΝΕ) και την πυκνότητα του κάθε κηλίδας γράφημα.

Patient προερχόμενο ξενομοσχεύματος Μελέτες

πέντε έως έξι εβδομάδων θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών (Harlan Labs, Indianapolis, ΙΝ) χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις μελέτες σε ζώα, κλουβιά σε ομάδες των 5, που διατηρείται σε κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών φωτός, και δεδομένου αποστειρωμένο φαγητό και νερό

κατά βούληση

. Τα ξενομοσχεύματα που λαμβάνονται από ασθενή δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, ένα δείγμα όγκου συλλέχθηκε κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης από έναν ασθενή συναινούντες στο Πανεπιστήμιο του Νοσοκομείου Κολοράντο. Tumor υλικό που απομένει μετά την ιστοπαθολογική ανάλυση κόπηκε σε 2 έως 3 mm

3 κομμάτια, βυθισμένος στο Matrigel, και εμφυτεύεται υποδορίως στο πλευρό πέντε γυμνών ποντικών. Μετά όγκοι επεκτάθηκαν μέσω τουλάχιστον της παραγωγής F3, που αποκόπηκαν, κομμένα, και εγχέεται στο αριστερό και το δεξί πλευρές των περίπου 25 ποντίκια για κάθε μελέτη ξενομοσχεύματος (50 στο σύνολο των όγκων διαιρούνται μεταξύ τεσσάρων ομάδων: ελέγχου του οχήματος, PF-502 μόνο παράγοντα , PD-901 μόνο παράγοντα, και PF-502 /PD-901 συνδυασμού). Όταν το μέσο μέγεθος του όγκου έφθασε σε όγκο περίπου 200 mm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις διαφορετικές ομάδες. Τα ποντίκια παρακολουθούνταν καθημερινά για σημάδια τοξικότητας και ζυγίζονται δύο φορές την εβδομάδα. Η θεραπεία χορηγήθηκε μία φορά την ημέρα (10 mg /kg PF-502 και /ή 1,0 mg /kg PD-901) από του στόματος καθετηριασμό. Ο όγκος του όγκου (εξίσωση για τον όγκο = (μήκος Χ πλάτος

2) × 0,52) αξιολογήθηκε δύο φορές την εβδομάδα με την ψηφιακή δαγκάνες, χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού Μελέτη Διευθυντής (Studylog Systems, South San Francisco, CA). ρυθμοί ανάπτυξης των όγκων προσδιορίστηκαν για κάθε μεμονωμένο όγκο με σύμπτωση των δεδομένων όγκου του όγκου κατά τη διάρκεια της περιόδου θεραπείας σε μια εκθετική εξίσωση ρυθμού ανάπτυξης με SAAM II v. 2.3. (Η Ομάδα Έψιλον, Charlottesville, VA). Στο τέλος της θεραπείας, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με CO

2 υπερδοσολογία ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση πριν από την αφαίρεση των όγκων για περαιτέρω ανάλυση.

Ανάλυση Δεδομένων

Η μονόδρομη ANOVA με αναλύσεις ένα Tukey post-test χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημασία μεταξύ πολλαπλών ομάδων. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το Prism έκδοση 5.0,

ρ

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Ηθική Δήλωση

Όλες οι εργασίες των ζώων και εκτελέστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του η Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC). Ειδική έγκριση για τα πειράματα ποντικού ελήφθη με το πρωτόκολλο 51410 (08) 1Ε με τίτλο «Ανάπτυξη και συντήρηση του Δημοτικού GI Tumor Bank για το σχεδιασμό Ορθολογική Θεραπεία με τη χρήση του ποντικιού μοσχεύματα όγκου». Όλα εύλογες προσπάθειες έγιναν για τη βελτίωση ταλαιπωρία, συμπεριλαμβανομένης αναισθησία για επώδυνες διαδικασίες. Οι ανθρώπινοι όγκοι ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Κολοράντο Διοικητικό πολλαπλές Institutional Review (COMIRB) ενέκρινε αριθμό πρωτοκόλλου 08-0439. Συναίνεση για την ανάκτηση του όγκου γράφτηκε.

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματα του PF-502 και PD-901 ως ενιαίο μέσα στον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου

κυτταρικές σειρές CRC ήταν που εκτίθενται σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις PF-502 και PD-901 για 72 ώρες, ο πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε και IC

50 τιμές υπολογίστηκαν από τις μέσες πολλαπλασιασμό των πειραμάτων εις τριπλούν. Όπως απεικονίζεται στα Σχήματα 1 και 2 υπήρξε μια μεγαλύτερη από 10-πλάσια διαφορά στην IC

’50 μεταξύ των ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών CRC που δεν σχετίζεται με την κατάσταση μεταλλάξεων του KRAS, BRAF, ή PIK3CA. Τέσσερις κυτταρικές γραμμές CRC με ποικίλες γονότυπους επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της ένωσης για 72 ώρες και ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία CyQuant. δοκιμασίες Proliferaion διεξήχθησαν εις τριπλούν και IC

50 τιμές υπολογίστηκαν από το μέσο όρο πολλαπλασιασμού. Κατάστασης μεταλλάξεων του KRAS, BRAF, και PIK3CA βρίσκονται σε χρωματιστά κουτιά.

Η

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της ένωσης για 72 ώρες και ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία SRB. Αναλύσεις πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και IC

50 τιμές υπολογίστηκαν από το μέσο όρο πολλαπλασιασμού. Κατάστασης μεταλλάξεων του KRAS, BRAF, και PIK3CA βρίσκονται σε χρωματιστά κουτιά.

Η

Συνδυαστική επιπτώσεις της PI3K /mTORi PF-502 και το MEKi, PD-901 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές

LOVO (KRAS

G13D /PIK3CA

WT), HCT116 (KRAS

G13D /PIK3CA

H1047R), WiDr (BRAF

V600E /PIK3CA

P449T), και Geo (KRAS

G13D /PIK3CA

WT) επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση συνδυασμός.

Κάθε μία από τις 4 κυτταρικές σειρές CRC εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις της PI3K /mTORi, PF-502 και η MEKi PD- 901 ως μονοί παράγοντες ή σε συνδυασμό για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία CyQuant και οι τιμές αναστολής που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3Α. Ο συνδυασμός επέδειξε μεγαλύτερη επίδραση στην αναστολή του πολλαπλασιασμού σε όλες τις τέσσερις CRC κυτταρικές σειρές που ελέγχθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώθηκαν στις κυτταρικές γραμμές CRC χρησιμοποιώντας το μοντέλο Bliss προσθετικότητα. τιμές Bliss υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι και η βαθμολογία για κάθε συνδυασμό παρουσιάζεται στο Σχήμα 3Β. HCT116, WiDr και GEO δύο δείχνουν μέσες βαθμολογίες Bliss λίγο πάνω από 1 επιδεικνύοντας μια μεγαλύτερη από αθροιστική δράση (1,08 ± 0,09, 1,11 ± 0,08, 1,08 ± 0,08, αντίστοιχα), ενώ LOVO αποδεικνύεται περίπου αθροιστική δράση (1.019 ± 0,08,). Για να προσδιοριστεί εάν η επίδραση συνδυασμός που παρατηρείται συσχετίστηκε με μη αναστρέψιμη αναστολή του πολλαπλασιασμού, μία κλωνογόνο ανίχνευση πραγματοποιήθηκε. Οι τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC εκτέθηκαν σε 0,6 μmol /L του PF-502 και 0,3 μmol /L του PD-901 σαν απλούς παράγοντες και σε συνδυασμό. Και οι τέσσερις κυτταρικές σειρές παρουσίασαν μείωση ικανότητας κλωνισμού του συνδυασμού έναντι είτε απλός παράγων ενώ η HCT116, GEO, και WiDr έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές. (Σχήμα 4).

LOVO (KRAS

G13D), HCT116 (KRAS

G13D /PIK3CA

H1047R), WiDr (BRAF

V600E /PIK3CA

P449T), GEO (KRAS

G13D). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορους συνδυασμούς PF-502 και PD-901 για 72 ώρες. (Α) Κλάσμα αναστέλλεται η γραφική παράσταση μετά από έκθεση σε ενιαίο παράγοντα και συνδυασμό. (Β) προσθετικότητα Bliss υπολογίστηκε και να εκτιμήσει συνδυαστικές επιδράσεις. Μέση βαθμολογία ευδαιμονία απεικονίστηκαν γραφικά.

Η

(Α) LOVO, (Β) HCT116, (C) WiDr, και (Δ) GEO απλώθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και εκτίθενται σε μοναδικός παράγοντας η PI3K /mTORi , PF-04691502, η MEKi, PD-0325901 ή ο συνδυασμός για 72 ώρες. Drug απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με μέσο για να καταστεί δυνατή η εκ νέου ανάπτυξη των κλώνων. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και φωτογραφήθηκαν. (Ε) Ο κρύσταλλος ιώδες διαλύθηκε σε 1% οξικό οξύ και η απορρόφηση αξιολογήθηκε σε μία συσκευή ανάγνωσης πλάκας. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκε για τον έλεγχο και γράφημα. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, προσαρμοσμένο σ τιμές ANOVA του Tukey: *

σ

, 0.05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001 vs οχήματος, #

σ

, 0,05, ##

σ

& lt? 0,01, ###

σ

& lt? 0,001 vs PF-502, & amp?

σ

, 0.05, & amp? & amp?

σ

& lt? 0,01, & amp? & amp? & amp?

σ

& lt? 0,001 vs PD-901. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

χαρακτηρίζεται επίσης τις επιπτώσεις της PI3K /mTORi, PF-502 και η MEKi, PD-901 σε καθιερωμένες κατάντη δράστες των σχετικών οδών. PF-502 έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν ΑΚΤ, 4EBP1 και φωσφορυλίωση S6RP [22], ενώ PD-901 αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της ERK [32], [33]. Να επικυρώσει τα αποτελέσματα αυτών των 2 παραγόντων και να αναζητήσουν ενδείξεις ενός συνεταιρισμού αποτέλεσμα, η διαφοροποίηση των κατάντη στόχων στα μονοπάτια ΜΑΡΚ και ΡΙ3Κ αναλύθηκαν. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 5, η αγωγή με PF-502 ή PD-901 που επάγεται μειώσεις στην ρΑΚΤ, pS6RP, P4EBP1, και pERK αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον ότι, κατά την έκθεση στο MEKi, PD-901 παρατηρήσαμε μια πιο έντονη μείωση στην pS6RP από ό, τι παρατηρήθηκε στα κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία PF-502 σε τρεις από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC. Οι μειώσεις αυτές διατηρήθηκαν σε μεγάλο βαθμό στο συνδυασμό.

Η

Η απόπτωση ενισχύεται μετά από έκθεση στο συνδυασμό του PF-502 και PD-901 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου

Τα κλωνογόνων δεδομένα έδειξαν ότι ο συνδυασμός οδήγησε σε παρατεταμένη αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα, έτσι μετρήσαμε την απόπτωση ως μια άλλη φαινοτυπική παράμετρο. Για να γίνει αυτό εκθέσαμε τις τέσσερις κυτταρικές σειρές CRC έως 0,6 μmol /L του PF-502 και 0,3 μmol /L του PD-901 σαν απλούς παράγοντες και σε συνδυασμό για 24 ώρες. Η απόπτωση μετρήθηκε με τη δοκιμασία 3/7 Caspase Glo. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 6, αν και υπήρξε μια τάση προς αυξημένη απόπτωση με το συνδυασμό σε όλες τις κυτταρικές σειρές, σε κύτταρα WiDr αυτές οι επιδράσεις ήταν στατιστικώς σημαντική σε σύγκριση με τα δύο απλούς παράγοντες.

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± SD, προσαρμοσμένη σ τιμές ANOVA του Tukey: *

σ

, 0.05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001 vs οχήματος, #

p

, 0,05, ##

σ

& lt? 0,01, ###

σ

& lt? 0,001 vs PF-502, & amp?

σ

, 0.05, & amp? & amp?

σ

& lt? 0,01, & amp? & amp? & amp?

σ

& lt? 0,001 vs PD-901. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

αντικαρκινική δράση του PF-502 και PD-901 σε ξενομοσχεύματα όγκου που προέρχεται ασθενή

Επόμενο για να επιβεβαιωθούν τα αποτελέσματα κατά του όγκου που παρατηρείται σε μας em

in vitro

μοντέλο, εκθέσαμε τέσσερα ξενομοσχευμάτων όγκου που προέρχεται ασθενούς (PDTX) μοντέλα με διαφορετικά κατάστασης μεταλλάξεων στο ΡΙ3Κ /mTORi, PF-502, το MEKi, PD901, ή τον συνδυασμό. Οι επιδράσεις κατά του όγκου της κάθε ένωσης εκτιμήθηκε με προσδιορισμό του ρυθμού ανάπτυξης του κάθε όγκου σε κάθε ομάδα αγωγής. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 7Α, μόνο το μοντέλο CUCRC040 (

KRAS

G12V /PIK3CA

E542G) έδειξε ένα σημαντικό όφελος από τη θεραπεία συνδυασμού πάνω από θεραπείες και μόνο παράγοντα (p & lt? 0,05). Η θεραπεία συνδυασμού ήταν επίσης στατιστικά σημαντική στο CUCRC108 (KRAS

G12C) και CUCRC125 (KRAS

WT) μοντέλα PDTX σύγκριση με τους μάρτυρες, αλλά όχι σε σύγκριση με τις ομάδες μόνο θεραπεία παράγοντα (Σχήμα 7Β-C). Και, το CUCRC042 (KRAS

G13D) μοντέλο ήταν σχετικά αδιάφορη σε όλες τις θεραπείες (Σχήμα 7D). Οι καμπύλες ανάπτυξης όγκου που φαίνεται στο Σχήμα S1.

Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει ένα μονό όγκο. Μέσος ρυθμός αύξησης του όγκου ± τυπική απόκλιση αντιπροσωπεύονται από το μπαρ και λαβές. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± SD, προσαρμοσμένη τιμές ρ ANOVA του Tukey: * Ρ & lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο?

† P & lt? 0,05 έναντι 901?

‡ P & lt? 0,05 έναντι 502.

Η

Ο συνδυασμός του PF-502 και PD-901 αναστέλλει μονοπάτια προ-επιβίωσης και τις επιπτώσεις αποπτωτικών δεικτών σε μοντέλα PDTX

Για την εκτίμηση τα αποτελέσματα σχετικά με τις οδούς της ΡΙ3Κ σηματοδότησης /mTORi, PF-502 και η MEKi, PD-901 στα μοντέλα PDTX, μία συστοιχία αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκε με τα προϊόντα λύσης των όγκων που συλλέγονται από την ομάδα για κάθε μοντέλο κατά το τέλος της μελέτης. Οι όγκοι υποβλήθηκαν σε λύση σε ρυθμιστικό RIPA και εφαρμόζεται στο PathScan στρες και Array σηματοδοτήσει απόπτωση Αντίσωμα σε ίσες συγκεντρώσεις. Οι συστοιχίες οπτικοποιήθηκαν σε Licor Οδύσσεια και την πυκνότητα /ένταση των κηλίδων εις διπλούν από τρία διαφορετικά καρκινώματα κανονικοποιήθηκαν με τον έλεγχο του οχήματος και γράφημα. Επίπεδα pERK και ρΑΚΤ μειώθηκαν στις ομάδες θεραπείας PD-901 και PF-502, σε σύγκριση με τον έλεγχο, στο CUCRC040, CUCRC108 και CUCRC125 PDTX μοντέλα, τα οποία είναι σύμφωνη με τα προφίλ ανάπτυξης του όγκου και την ανταπόκριση που παρατηρήθηκε στις ακόλουθες ομάδες θεραπείας ( Το σχήμα 8Α-Β και σχήμα S2). Επιπροσθέτως, η ρύθμιση προς τα κάτω του pERK και ρΑΚΤ διατηρήθηκε στις ομάδες συνδυασμού σε αυτά τα μοντέλα. Ωστόσο, μόνο στο μοντέλο CUCRC040 ήταν το επίπεδο της pERK στην ομάδα συνδυασμού στην πραγματικότητα χαμηλότερο από ό, τι τα δύο χέρια και μόνο παράγοντα. Το ανθεκτικό μοντέλο CUCRC042 δεν παρουσίασαν καμία μείωση στην pERK ή ρΑΚΤ (Σχήμα 8Α-Β και σχήμα S2). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε θεραπεία με CUCRC042 PD-901 είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της ρΑΚΤ και αύξηση των ρΒΑϋ (Σχήμα 8Β-C και το Σχήμα S2).

Η ολική πρωτεΐνη καθαρίστηκε από PDTX στο τέλος της θεραπείας και αξιολογούνται μια συστοιχία αντισωμάτων στρες και της απόπτωσης. Η πυκνότητα των κηλίδων ελήφθησαν και απεικονίστηκαν γραφικά. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD, προσαρμοσμένο σ τιμές ANOVA του Tukey: *

σ

, 0.05, **

σ

& lt? 0,01, ***

σ

& lt? 0.001 vs οχήματος, #

σ

, 0,05, ##

σ

& lt? 0,01, ###

σ

& lt? 0,001 vs PF-502, & amp?

σ

, 0.05, & amp? & amp?

σ

& lt? 0,01, & amp? & amp? & amp?

σ

& lt? 0,001 vs PD-901. Όλα τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά των τριών ξεχωριστών όγκων από κάθε ομάδα.

Η

Συζήτηση

Περίπου το 40% των καρκίνων του παχέος εντέρου φιλοξενεί μια μετάλλαξη στο γονίδιο KRAS που προκαλεί αυτό το μονοπάτι να είναι ενεργά. Άλλες μεταλλάξεις σε αυτή την οδό, συμπεριλαμβανομένων των RAS (ΕΡΑ και HRAS) και BRAF περιλαμβάνουν ένα άλλο 1-3% και 5-15%, αντίστοιχα [34], [35]. μεταλλάξεις PIK3CA συμβαίνουν σε περίπου 15% των καρκίνων του παχέος και αυτών 8-9% έχουν μεταλλάξεις σε αμφότερες PIK3CA και KRAS [34], [36]. Με τις δύο αυτές σημαντικές προ-επιβίωσης /πολλαπλασιασμού οδοί ενεργός σε ορθοκολικούς καρκίνους, εκτός από το cross-talk /ανάδρασης που λαμβάνει χώρα μεταξύ αυτών των οδών, υπάρχει μια λογική για τη στόχευση και τις δύο οδούς με μικρά μόρια αναστολείς.

αναστολείς της οδού RAS /RAF /MEK ήταν γύρω για πάνω από μια δεκαετία και μόνο παράγοντα κλινικές μελέτες έχουν σε μεγάλο βαθμό απογοητευτική. Για παράδειγμα, μια δοκιμή Φάσης II με CI-1040, ένα αναστολέα ΜΕΚ πρώτης γενιάς, σε προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου δεν παρουσίασε σημαντική αντικαρκινική δραστικότητα. Ωστόσο, μια πιο πρόσφατη δοκιμή Φάσης II με τη δεύτερη γενιά ΜΕΚ αναστολέα selumetinib έδειξαν παρόμοια δραστικότητα με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα καπεσιταβίνη σε ασθενείς CRC [37], [38]. Με μέτρια αποτελέσματα στο μοναδικός παράγοντας ΜΕΚ αναστολή σε παχέος εντέρου, είναι προφανές ότι η συνδυασμένη θεραπεία θα πρέπει να διερευνηθεί.

Πολλές προκλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η στόχευση τόσο το RAS /RAF /MEK και η PI3K /AKT /mTOR μονοπάτι είναι πιο ευεργετική σε πολυάριθμους τύπους όγκων [39] – [42]. Στον καρκίνο των ωοθηκών συν-στόχευση της ΡΙ3Κ /mTOR και RAS /ΜΕΚ μονοπάτι επέδειξε συνεργική αναστολή του πολλαπλασιασμού και την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου [42]. Ομοίως, σε μοντέλα καρκίνου του μαστού βασικοκυτταρικό-όπως, παρατηρήθηκε μία ενισχυμένη αναστολή του πολλαπλασιασμού και αύξηση της απόπτωσης

in vitro

και την αύξηση αναστολή ανάπτυξης όγκου παρατηρήθηκε

in vivo

[39] . Τα περισσότερα από τα δεδομένα σε καρκίνο του παχέος εντέρου έχει στην μεταλλαγμένο μοντέλα KRAS καθώς ο πληθυσμός αυτός έχει ανάγκη από νέα νέες θεραπείες. Roper

et. al

. έδειξαν ότι ο συνδυασμός της ΡΙ3Κ και η αναστολή της ΜΕΚ προάγει την απόπτωση και υποχώρηση του όγκου σε μοντέλα ποντικών του παχέος εντέρου [41]. Μια άλλη μελέτη σε ανθρώπινα μοντέλα του παχέος PDTX, αποδεικνύεται περισσότερο από ένα αποτέλεσμα της στάσης του όγκου, με και μικρή υποχώρηση που υποδηλώνει αυτό το σχήμα ο συνδυασμός δεν μπορεί να μεταφραστεί σε διαρκή θεραπευτικά αποτελέσματα [40].

Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε τόσο καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές και τα μοντέλα PDTX να αποδείξει ότι ΡΙ3Κ /ΜΕΚ συνδυαστική θεραπεία είναι πιο δραστική από θεραπεία απλού παράγοντα σε μοντέλα CRC με διακριτά μοριακό υπόβαθρο. Τόσο PF-502 και PD901 παρουσίασαν δραστικότητα απλός παράγων έναντι σε ένα μεγάλο πάνελ του ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικών γραμμών ανεξάρτητα από RAS ή PIK3CA κατάστασης μεταλλάξεων. Όταν ο συνδυασμός δοκιμάστηκε σε KRAS μεταλλαγμένο, BRAF μεταλλαγμένο ή KRAS /PIK3CA διπλές μεταλλάξεις υπήρχε ένα ενισχυμένο φαινόμενο του συνδυασμού σε διάφορες συγκεντρώσεις με HCT116, WiDr και GEO παρουσιάζουν μια ελαφρώς πιο ισχυρή επίδραση συνδυασμό σε σύγκριση με LOVO. Η ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες μετά από έκθεση σε συνδυασμό επίσης μειωμένη υποδεικνύοντας ότι η αναστολή αυτών των οδών οδηγεί σε μια κυτταροτοξική παρά κυτταροστατική φαινότυπο. Αυτό υποστηρίχθηκε περαιτέρω από την αύξηση της απόπτωσης σε συνδυασμό. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι κατά την κατεργασία με την MEKi, PD901, αξιοσημείωτη μείωση παρατηρήθηκε στις pS6RP σε τρία από τα τέσσερα μοντέλα CRC κυτταρική γραμμή. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η δραστηριότητα TORC1, η οποία πραγματοποιεί φωσφορυλίωση S6 είναι ένα σημείο σύγκλισης που ενσωματώνει πολλαπλές οδούς σηματοδότησης ανάντη σε ορισμένους τύπους όγκων. Για παράδειγμα, σε ευαίσθητους MAPKi μελανώματος, κατεργασία με ένα Ράφι ή MEKi, έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη PS6, ενώ στις αδρανείς μοντέλα καμία μείωση στην φωσφορυλίωση παρατηρείται [43]. Το ίδιο μπορεί να ισχύει στις τρεις PD-901 ευαίσθητες κυτταρικές σειρές CRC (HCT116, LOVO, και WiDr), σε αντίθεση με την πιο ανθεκτική κυτταρική γραμμή CRC, GEO, που μπορεί να δείχνουν ότι μειώθηκε pS6RP μπορεί να χρησιμεύσει ως ένας δείκτης της ανταπόκρισης.

στη συνέχεια θα μεταβεί em> in vitro

δεδομένων μας

in vivo

χρησιμοποιώντας μοντέλα CRC PDTX μας. Αυτά τα μοντέλα πιστεύεται ότι παρέχουν σημαντικές βελτιώσεις έναντι των τυπικών ξενομοσχεύματα κυτταρικής σειράς, αν και η κλινική επικύρωση βρίσκεται σε εξέλιξη [40], [44]. Παρόμοια με την

in vitro

δεδομένα υπήρχαν ετερογενή αποκρίσεων σε θεραπεία συνδυασμού με ένα μοντέλο, CUCRC040, επιδεικνύοντας μια στατιστικά σημαντική επίδραση συνδυασμό. Αυτό ήταν σε αντίθεση με τα CUCRC108 και CUCRC125 μοντέλα, όπου ο συνδυασμός ήταν μόνο στατιστικά διαφορετικό από το όχημα και να CUCRC042 που δεν εμφάνισαν αποτελέσματα της θεραπείας. Είναι ενδιαφέρον, ανθεκτικό αυτό μοντέλο PDTX, παρουσίασε μια αύξηση στην ρΑΚΤ όταν αγωγή με το MEKi, PD-901, η οποία συνδέεται με την αύξηση σε ρΒΑϋ, μια πρωτεΐνη που μπορεί να έχουν αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα και να οδηγήσει σε αυξημένη επιβίωση των κυττάρων [45]. Αυτό μπορεί να αξίζει να επιδιωχθεί ως ένα υποθετικό μηχανισμό αντίστασης.

Παρά την ισχυρή προκλινική στοιχεία που να υποστηρίζουν συν-στόχευση του PI3K /mTOR και ΜΑΡΚ σε διάφορους τύπους όγκων, τα πρώτα αποτελέσματα των κλινικών δοκιμών έδειξαν μικτή επιτυχία [46 ] – [48]. Οι συνδυασμοί ήταν γενικά καλά ανεκτές και θεραπευτικές δόσεις επιτεύχθηκαν με πρώιμη απόδειξη της δραστικότητας κατά του όγκου που παρατηρείται σε ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα και χαμηλής ποιότητας ορώδες καρκίνο των ωοθηκών, ενώ σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου συρρίκνωση του όγκου σπανίως τεκμηριωμένη.

σε μια μελέτη φάσης Ι, ασθενείς με καρκίνο του παχέος υποβλήθηκαν σε υποψήφιους μοριακό προφίλ για μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS, BRAF, PIK3CA και τα επίπεδα έκφρασης των PTEN και pMET. Αυτοί οι ασθενείς στη συνέχεια προσφέρθηκε πρώτα-in-ανθρώπινες μελέτες Φάσης Ι με βάση τα αποτελέσματα αυτών των τροποποιημένων προφίλ έκφρασης γενετική /πρωτεΐνης. Οι επιλογές που περιλαμβάνονται αντι-EGFR μονοκλωνικά αντισώματα δεύτερης γενιάς (εάν KRAS άγριου τύπου), αναστολείς της οδού ΡΙ3Κ (αν PIK3CA μετάλλαξη ή χαμηλή έκφραση ΡΤΕΝ), αναστολέα mTORC1 συν αντι-IGF1R mAb (αν χαμηλή έκφραση ΡΤΕΝ), αναστολείς της οδού PI3K συν ΜΕΚ αναστολείς (αν KRAS ή μετάλλαξη BRAF), αναστολέα BRAF (αν BRAF μετάλλαξη) και αντι-HGF mAb (εάν η υψηλή έκφραση pMET) [49].