Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια εξαιρετικά κακοήθης νόσος με εξαιρετικά φτωχή πρόγνωση. αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACIs) έδειξαν ελπιδοφόρα αντικαρκινική δράση έναντι προκλινικά μοντέλα καρκίνου του παγκρέατος, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να εντοπίσει κλινικά σχετική αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) για την καθοδήγηση της επιλογής των αναστολέων HDAC (HDACIs) προσαρμοσμένη στην θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

Μεθοδολογία

έκφραση HDAC σε επτά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και κανονικά ανθρώπινα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. αλληλεπιδράσεις κατά του όγκου μεταξύ της κατηγορίας Ι και ΙΙ-επιλεκτική HDACIs τάξης προσδιορίστηκαν με αναλύσεις ΜΤΤ και τυπική ισοβολογραφήματος /αναλύσεις λογισμικού CompuSyn. Οι επιδράσεις της HDACIs επί του κυτταρικού θανάτου, την απόπτωση και κυτταρικό κύκλο εξέλιξης, και ιστόνης Η4, αλφα-τουμπουλίνης, ρ21, και τα επίπεδα γH2AX προσδιορίστηκαν με δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, και κηλίδωση Western, αντιστοίχως.

αποτελέσματα

Η πλειοψηφία των κλάσεων I και II HDACs ανιχνεύθηκαν στα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές, αν και σε διάφορα επίπεδα. Θεραπείες με MGCD0103 (α κατηγορίας Ι-επιλεκτική HDACi) οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενες διακοπή της ανάπτυξης, κυτταρικό θάνατο /απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε G2 /M φάση, η οποία συνοδεύεται από την επαγωγή του ρ21 και DNA δίκλωνα σπασίματα (DSBs). Σε αντίθεση, MC1568 (μια κατηγορία ΙΙα-επιλεκτική HDACi) ή Tubastatin Α (αναστολέας HDAC6-επιλεκτική) έδειξαν ελάχιστες επιπτώσεις. Όταν συνδυάζεται ταυτόχρονα, MC1568 ενισχυθεί σημαντικά MGCD0103 που προκαλείται από διακοπή της ανάπτυξης, κυτταρικό θάνατο /απόπτωση, και τη σύλληψη του κύκλου G2 /M κυττάρων, ενώ Tubastatin Ένα μόνο συνεργικά ενισχυμένο MGCD0103 που προκαλείται από διακοπή της ανάπτυξης. Αν και MC1568 ή Tubastatin Ένα μόνο είχε κανένα προφανείς επιπτώσεις στο DNA DSBs και της έκφρασης p21, ο συνδυασμός τους με MGCD0103 οδήγησε σε συνεταιριστικές επαγωγή της p21 στα κύτταρα.

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι τάξεις μου και HDACs II είναι δυνητικοί θεραπευτικοί στόχοι για την αγωγή του καρκίνου του παγκρέατος. Ως εκ τούτου, τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος με παν-HDACIs μπορεί να είναι πιο ευεργετική από ταξικές ή ισομορφή-εκλεκτικοί αναστολείς

Παράθεση:. Wang G, Ο J, J Zhao, Yun W, Xie C, Taub JW, κ.ά. . (2012) της Κλάσης I και II αποακετυλασών ιστόνης είναι πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι για θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (12): e52095. doi: 10.1371 /journal.pone.0052095

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Απριλίου 2012? Αποδεκτές: 9 του Νοεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 14, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Πανεπιστήμιο Jilin, Changchun, Κίνα, το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 31071105), και εν μέρει από ένα ταμείο εκκίνησης από το Ινστιτούτο Barbara Ann Karmanos Καρκίνου, Wayne State University School of Medicine, Ντιτρόιτ , MI. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια εξαιρετικά κακοήθης νόσος, με σταθερά αυξανόμενη συχνότητα. Παρά το γεγονός ότι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ, μικρή βελτίωση σε πρόγνωση έχει σημειωθεί τα τελευταία 20 έτη [1] – [3]. Λόγω καθυστερήσεων στην κλινική διάγνωση, ο καρκίνος του παγκρέατος συχνά ανιχνεύεται σε προχωρημένο στάδιο και η πρόγνωση είναι εξαιρετικά φτωχή, με επιβίωση των 4 έως 6 μήνες [2]. Η γεμσιταβίνη (2 ‘, 2’-διφθοροδεοξυκυτιδίνη, dFdC) είναι το πρότυπο πρώτης γραμμής φάρμακο για τη θεραπεία ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος [4]. Ωστόσο, με διάμεση επιβίωση 5,7 μήνες και το ποσοστό επιβίωσης 1-χρόνου των 18%, η αποτελεσματικότητά του παραμένει χαμηλή [5], [6]. Ως εκ τούτου, ο καρκίνος του παγκρέατος παραμένει ένα εξαιρετικά χημειοθεραπεία κακοήθειας και χρειάζεται επειγόντως νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις.

αποακετυλασών ιστόνης (HDACs) παίζουν κρίσιμους ρόλους στην επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης με κατάλυση της απομάκρυνσης των ομάδων ακετυλίου, την τόνωση συμπύκνωση χρωματίνης και την προώθηση μεταγραφική καταστολή [7], [8]. HDACs περιλαμβάνουν μια μεγάλη ομάδα πρωτεϊνών που χωρίζεται σε τέσσερις κατηγορίες με βάση ομολογίες τους να HDACs ζύμης, υποκυτταρικό εντοπισμό τους και ενζυματικές δραστηριότητες τους [8] – [10]. Class Ι περιλαμβάνει HDAC1, 2, 3 και 8, τα οποία είναι όλα ομόλογα της πρωτεΐνης Rpd3 ζυμομύκητα. Αυτοί εκφράζονται παντού και βρίσκονται κυρίως στον πυρήνα [8] – [10]. ένζυμα Κατηγορίας II περιλαμβάνουν HDAC4, 5, 6, 7, 9 και 10, τα οποία είναι ομόλογα της πρωτεΐνης hda1 ζυμομύκητα. Αυτά τα ένζυμα παρουσιάζουν γενικά ιστο-ειδική έκφραση και μεταφοράς μεταξύ κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα σε απόκριση σε κυτταρικά σήματα [8], [11]. Από HDACs 6 και 10 περιέχουν δύο καταλυτικές θέσεις, τα ένζυμα αυτά είναι μερικές φορές περαιτέρω χαρακτηρίζονται ως ξεχωριστή υποκατηγορία (Class IIb) από HDACs 4, 5, 7 και 9 (κατηγορία ΙΙα) [8], [12]. Class III περιλαμβάνει τις επτά sirtuins, SIRT1-7, ομόλογα της πρωτεΐνης SIR2 ζύμης [8], [13]. HDAC11 περιέχει συντηρημένα κατάλοιπα που είναι κοινά τόσο τάξης Ι και τάξης ένζυμα ΙΙ και αντιπροσωπεύει μια ξεχωριστή κατηγορία των HDAC (κλάση IV) [8], [10], [14].

Η ανώμαλη επιγενετικές αλλαγές είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των ανθρώπινων καρκίνων [15]. Υψηλή έκφραση HDAC1 έχει βρεθεί ότι συσχετίζεται με προχωρημένο στάδιο των πνευμόνων και του καρκίνου του παγκρέατος [16] – [18]. Έτσι, HDACs μπορεί να αντιπροσωπεύουν υποσχόμενους στόχους για φαρμακολογική παρέμβαση του καρκίνου. Πολυάριθμες μικρό HDACIs μόριο έχουν αναπτυχθεί κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας [19], [20], οι οποίες έχουν δείξει ελπιδοφόρα αντικαρκινική δράση έναντι προκλινικά μοντέλα καρκίνου του παγκρέατος, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικούς ή παράγοντες στόχους [16], [21] – [24]. Ωστόσο, οι κλινικά σχετικές ισομορφών HDAC σε καρκίνο του παγκρέατος δεν έχουν προσδιοριστεί πλήρως. Knockout και πειράματα knockdown siRNA έχουν προτείνει ότι κατηγορίας Ι HDACs είναι απαραίτητες για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση σε αντίθεση με τάξης II HDACs 4 και 7 [25], [26]. Ωστόσο, η αναστολή της κατηγορίας ΙΙβ HDAC6 οδηγεί σε ακετυλίωση και η διατάραξη της λειτουργίας του συνοδού θερμικού σοκ 90 (Hsp90) σε κύτταρα λευχαιμίας [27]. Παρά το γεγονός ότι ορισμένοι HDACIs θεωρείται ότι είναι παν-HDACIs (π.χ., LBH-589, PXD-101, και SAHA), μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι τα ένζυμα κατηγορίας ΙΙα δεν είναι στοχευμένες από τα περισσότερα HDACIs (π.χ., FK-228, LBH-589 , MGCD0103, MS-275, PXD-101, και SAHA) σε φαρμακολογικά σχετικές συγκεντρώσεις [28]. Έτσι, αν και είναι όλο και περισσότερο εμφανές ότι η κατηγορίας Ι ένζυμα HDAC είναι κλινικά σχετικές για τον καρκίνο [25], [26], και αυτό είναι λιγότερο καθορίστηκε για την κατηγορία ενζύμων II ειδικά στο πλαίσιο με HDACs κατηγορίας Ι.

στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση των κατηγοριών Ι και II HDACs σε επτά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και ανθρώπινα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα και προσδιορίστηκε θεραπευτικές τους ρόλους τους σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με τη χρήση ταξικές, υποτάξη-, και ισομορφή εκλεκτικοί HDACIs. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν, για πρώτη φορά,

in vitro

συνεργική αντινεοπλασματική αλληλεπιδράσεις μεταξύ τάξης Ι και II HDACIs σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι σε φυσιολογικά ανθρώπινα παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα τάξη. Παρά το γεγονός ότι υπάρχει η ανάγκη για μελέτες παρακολούθησης σε

in vivo

μοντέλα, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι και οι δύο οι HDACs κατηγορίας Ι και κατηγορίας II είναι δυνητικοί θεραπευτικοί στόχοι για την αγωγή του καρκίνου του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

HDACIs

η νέα κατηγορία Ι-επιλεκτική HDACi MGCD0103 (Mocetinostat) [29], και η κατηγορία ΙΙα-επιλεκτική HDACi MC1568 [30] – [32] αγοράστηκαν από Σέλεκ Chemicals LLC ( Houston, ΤΧ). Το μυθιστόρημα HDAC6-εκλεκτικός αναστολέας Tubastatin A [33] αγοράστηκε από BioVision Inc. (Mountain View, CA). All οι HDACIs διαλύθηκαν σε DMSO και αποθηκεύεται στους -80 ° C, όπως συνιστάται από τους προμηθευτές.

Cell Culture

Το HPAC, MIAPaCa-2, BxPC-3, PANC-1 ( που προέρχονται από πρωτογενή όγκο [34]), AsPC-1, CFPAC-1, και Capan-1 (που προέρχονται από μετάσταση [34]) ανθρώπινη παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA). Τα φυσιολογικά κύτταρα του ανθρώπου παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά (HPDE) ελήφθησαν από Μ D. Anderson Cancer Κέντρο. Οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) ή RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) με 10% ορό εμβρύου θερμοαπενεργοποιημένο βοοειδούς (FBS? Hyclone Labs, Logan, UT) συν 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη σε 37 ° C υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2/95% αέρα.

In vitro

κυτταροτοξικότητα Αναλύσεις

In vitro

HDACi κυτταροτοξικότητες του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές και τα κύτταρα HPDE μετρήθηκαν με τη χρήση ΜΤΤ (3- [4,5-διμεθυλο-θειαζολ-2-υλ] -2,5-διφαινυλτετραζόλιο-βρωμίδιο, Sigma-Aldrich, St Louis , ΜΟ) αντιδραστήριο, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35], [36]. Εν συντομία, AsPC-1, BxPC-3, PANC-1 (ευρέως χρησιμοποιούμενα μοντέλα κυτταρικής γραμμής για παγκρεατικό έρευνα για τον καρκίνο), ή HPDE κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 100 μΙ ϋΜΕΜ /10% FBS σε πλακίδια των 96 φρεατίων. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C υπό την παρουσία 5 μεταβλητές συγκεντρώσεις MGCD0103 (0-4 μΜ), MC1568 (0-10 μΜ), ή Tubastatin Α (0-8 μΜ). Μετά από 96 ώρες, ΜΤΤ προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 1 mM. Μετά από 4,5 ώρες, κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν με την προσθήκη 100 μΙ 10% SDS σε 10 mM HCI. Οι οπτικές πυκνότητες μετρήθηκαν με μια ορατή αναγνώστη μικροπλάκας σε 590 nm. IC

50 τιμές υπολογίστηκαν ως συγκεντρώσεις του φαρμάκου απαραίτητες για την αναστολή της ανάπτυξης κατά 50% σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Τα στοιχεία για τις κυτταρικές σειρές που παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± πρότυπα σφάλματα από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η έκταση και η κατεύθυνση της MGCD0103 και MC1568 ή Tubastatin Α αντικαρκινική αλληλεπιδράσεις αξιολογήθηκαν με τυπική ανάλυση ισοβολογράμματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35], [37], [38], και με τη χρήση του λογισμικού CompuSyn (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ) . Εν συντομία, αλληλεπιδράσεις φαρμάκων ποσοτικοποιήθηκαν με τον προσδιορισμό του δείκτη συνδυασμού (CI), όπου CI & lt? 1, CI = 1, και CI & gt? 1 υποδεικνύουν συνεργιστική, πρόσθετο, και ανταγωνιστικά αποτελέσματα, αντίστοιχα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± πρότυπα σφάλματα από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Αποικίας Δοκιμασίες Σχηματισμού

Μια μέρα πριν τις θεραπείες HDACi, 300 500 κύτταρα BxPC-3 PANC-1 ή σπάρθηκαν σε δίσκους 100 mm σε πλήρη DMEM ή RPMI160. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του MGCD0103 (0-1,0 μΜ), MC1568 (0-10 μΜ), Tubastatin Α (0-4 μΜ), MGCD0103 συν MC1568 (0,5 μΜ 5 μΜ), ή MGCD0103 συν Tubastatin A (0,5 μΜ 2 μΜ) για 96 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με άνευ φαρμάκου DMEM ή RPMI1640 και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες DMEM ή RPMI1640 για έως 3 εβδομάδες. Οι αποικίες έγιναν ορατές με χρώση Coomassie Blue και μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± ποσοστά πρότυπα σφάλματα σε σχέση με μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Την έκταση και την κατεύθυνση των αντικαρκινικών αλληλεπιδράσεις μεταξύ MGCD0103 και MC1568 ή Tubastatin Μια προσδιορίστηκαν με τη χρήση του λογισμικού CompuSyn (ComboSyn, Inc.).

shRNA Νοκ ντάουν των HDAC στην PANC-1 κύτταρα

HDAC4 και HDAC6 shRNA lentivirus κλώνοι αγοράστηκαν από την RNAi Consortium (Sigma-Aldrich) και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα PANC-1. Μετά την επιλογή με πουρομυκίνη, μια πισίνα των μολυσμένων κυττάρων επεκτάθηκε και δοκιμάστηκε για HDAC4 ή HDAC6 έκφρασης με κηλίδωση Western (που ορίζεται κύτταρα HDAC4- ή HDAC6-shRNA). Μια ομάδα κυττάρων από τον αρνητικό μεταγωγής ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος (ορίζεται κύτταρα NTC-shRNA).

Ανάλυση Western Blot

Οι διαλυτές πρωτεΐνες εκχυλίσθηκαν από HPAC, MIAPaCa-2, BxPC -3, PANC-1, AsPC-1, CFPAC-1, Capan-1, ή κύτταρα HPDE, ακατέργαστα ή κατεργασμένα με HDACIs για 96 ώρες, και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικώς σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες (Thermo Fisher Inc., Rockford, IL) και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-HDAC1 (# 2062), -HDAC2 (# 2540), -HDAC3 (# 2632), -HDAC4 ( # 2072), -HDAC5 (# 2082), -HDAC7 (# 2882), -p21 (# 2947S), -γH2AX (# 2577S), (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), -HDAC6 (SC-11420, Σάντα Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), -HDAC8 (H6412), -HDAC10 (H3412), ακέτυλο (ac) τουμπουλίνης (T7451) (Sigma, Saint Louis, ΜΟ), -HDAC9 (SH030228P, ABGENT, San Diego, CA), -Ac-ιστόνης Η4, H4 -histone, ή αντίσωμα -β-ακτίνης (Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39], [40]. Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με Lumi-Light κηλίδωση Western υποστρώματος (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ), όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή.

Αξιολόγηση των Baseline και HDACi απόπτωση που επάγεται

BxPC-3 ή κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MGCD0103 (0,5 μΜ), MC1568 (5 μΜ), Tubastatin Α (2 μΜ), MGCD0103 συν MC1568 (0,5 μΜ 5 μΜ), ή MGCD0103 συν Tubastatin Α (0,5 μΜ 2 μΜ) για 96 h. Τα κύτταρα μετά συλλέχθηκαν και έντονα με πιπέτα, και ελήφθησαν δείγματα για τον προσδιορισμό βασική γραμμή και HDACi απόπτωση που επάγεται με τη χρήση της Απόπτωσης Annexin V-FITC /ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) kit (Beckman Coulter? Brea, CA) και μια ροή FACS Calibur κυτταρόμετρο ( Becton Dickinson, San Jose, CA), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35], [36], [41]. Αποπτωτικά γεγονότα καταγράφηκαν ως συνδυασμός της αννεξίνης V

+ /ΡΙ

– (πρώιμων αποπτωτικών) και αννεξίνης V

+ /ΡΙ

+ (τέλη αποπτωτικών /νεκρών) γεγονότα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική ποσοστά σφαλμάτων αννεξίνης V

+ κύτταρα του τριπλούν από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα.

Επιδράσεις της HDACIs επί του κυτταρικού κύκλου Πρόοδος σε κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος

BxPC-3 ή PANC-1 κύτταρα κατεργασμένα με MGCD0103 (0,5 μΜ), MC1568 (5 μΜ), Tubastatin Α (2 μΜ), MGCD0103 συν MC1568 (0,5 μΜ 5 μΜ), ή MGCD0103 συν Tubastatin A (0,5 μΜ 2 μΜ) για 96 ώρες συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν με παγωμένο 70% (ν /ν) αιθανόλη για 24 ώρες. Μετά από φυγοκέντρηση στα 200 χ g για 5 λεπτά, τα σφαιρίδια του κυττάρου πλύθηκαν με PBS (ρΗ 7.4) και επαναιωρήθηκαν σε PBS που περιείχε ΡΙ (50 μg /mL), Triton Χ-100 (0,1%, ν /ν), και DNase- δωρεάν RNase (1 μg /mL). περιεχόμενα DNA προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής (FACS Calibur). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έγινε με την ModFit

LT

TM3.0 λογισμικό ανάλυσης DNA (Becton Dickinson).

Στατιστική Ανάλυση

Οι διαφορές στα MGCD0103 IC

50s μεταξύ MC1568 ή Tubastatin Α επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων BxPC-3 ή PANC-1 κύτταρα και οι διαφορές σε κυτταρικό θάνατο /απόπτωση μεταξύ MGCD0103 και MC1568 ή Tubastatin A αγωγή (ατομικά ή συνδυασμένα) και μη κατεργασμένα κύτταρα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το paired t-test. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με GraphPad Prism 4.0.

Αποτελέσματα

HDAC Έκφραση και HDACi ευαισθησίες σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές και των HPDE κύτταρα

Οι HDACs κατηγορίας III (SIRTs 1- 7) δεν στοχεύονται από τα παραδοσιακά HDACIs [20] και δεν συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Έκφραση των κλάσεων Ι και II HDACs προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western σε HPAC, MIAPaCa-2, BxPC-3, PANC-1, AsPC-1, CFPAC-1, Capan-1, και η κανονική HPDE κυτταρική γραμμή. Οι HDACs κατηγορίας Ι (1, 2, 3, και 8) ανιχνεύθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές και αν τα επίπεδα ήταν μεταβλητή. Σε γενικές γραμμές, τα επίπεδα της HDACs Ι στα κύτταρα HPDE τάξη ήταν σχετικά μικρότερη σε σύγκριση με την πλειονότητα των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Είναι ενδιαφέρον ότι, η πλειοψηφία των κατηγορίας ΙΙα HDACs (εκτός από HDAC5) ανιχνεύθηκαν σε όλες σχεδόν τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές αλλά όχι στα κύτταρα HPDE. Σε αντίθεση, HDACs 6 και 10 ανιχνεύτηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές και τα επίπεδά τους στα κύτταρα HPDE ήταν συγκρίσιμα (αν όχι μεγαλύτερο) με εκείνα των καρκινικών κυτταρικών γραμμών (Σχήμα 1). Για τον προσδιορισμό των ρόλων αυτών HDACs σε παγκρεατικά ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση, χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά HDACIs, MGCD0103 (Mocetinostat, μια κατηγορία Ι-επιλεκτική HDACi) [29], MC1568 (μια κατηγορία ΙΙα-επιλεκτική HDACi) [30] – [ ,,,0],32], και Tubastatin α (μία νέα HDAC6 ειδικός αναστολέας) [33]. Θεραπείες του PANC-1 κύτταρα με μεταβλητές συγκεντρώσεις MGCD0103 (0-1,0 μΜ) είχε ως αποτέλεσμα μια εξαρτώμενη από τη δόση υπερακετυλίωση ιστόνης Η4, ενώ έχει καθόλου επιδράσεις στην άλφα-τουμπουλίνης (ένα υπόστρωμα HDAC6) ακετυλίωση ή συνολικά επίπεδα Η4 (Σχήμα 2Α) . Θεραπείες με MC1568 οδήγησε επίσης σε ακετυλίωση ιστόνης Η4 (προφανείς στα 5 και 10 μΜ), ωστόσο, σε πολύ μικρότερο βαθμό, σε σύγκριση με MGCD0103, και τα επίπεδα του ακετυλιωμένης Η4 ιστόνης σταθεροποιηθεί στα 5 και 10 μΜ. Περαιτέρω, αυτές οι θεραπείες δεν είχε καμία επίπτωση στην α-τουμπουλίνης ακετυλίωση (Εικόνα 2Β). Σε αντίθεση με τις άλλες δύο HDACIs, θεραπείες Tubastatin A (0-4 μΜ) οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενες υπερακετυλίωση του αλφα-τουμπουλίνης, η οποία σταθεροποιήθηκε στις 2 και 4 μΜ. Ωστόσο, αυτές οι θεραπείες δεν είχε καμία επίδραση στην ακετυλίωση ιστόνης Η4 (Σχήμα 2C). Αυτά τα αποτελέσματα επικυρώνονται τις ιδιότητες HDACi αυτών των παραγόντων και εν μέρει υποστηρίζεται ιδιαιτερότητες υποστρώματος τους.

Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από λογαριθμικής φάσης AsPC-1, BxPC-3, PANC-1, HPAC, MIAPaCa-2, CFPAC-1, Capan -1, και τα κύτταρα HPDE υποβλήθηκαν σε Western blots ανιχνεύθηκαν με αντι-HDAC ή αντίσωμα -β-ακτίνης, όπως περιγράφεται στα Υλικά και Μέθοδοι. Οι HDACs κατηγορίας Ι (1, 2, 3, και 8) ανιχνεύθηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές και αν τα επίπεδα ήταν μεταβλητή. Σε γενικές γραμμές, τα επίπεδα της HDACs Ι στα κύτταρα HPDE τάξη ήταν σχετικά μικρότερη σε σύγκριση με την πλειονότητα των παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Είναι ενδιαφέρον ότι, η πλειοψηφία των κατηγορίας ΙΙα HDACs (εκτός από HDAC5) ανιχνεύθηκαν σε όλες σχεδόν τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές αλλά όχι στα κύτταρα HPDE. Σε αντίθεση, HDACs 6 και 10 ανιχνεύτηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές και τα επίπεδά τους στα κύτταρα HPDE ήταν συγκρίσιμα (αν όχι μεγαλύτερο) με εκείνα των καρκινικών κυτταρικών γραμμών

Η

Πίνακες Α-Ο.: κύτταρα PANC-1 συλλέχθηκαν και λύθηκαν μετά από επώαση με ένα εύρος συγκεντρώσεων του MGCD0103 (0-1,0 μΜ), MC1568 (0-10 μΜ), ή Tubastatin Α (0-4 μΜ) για 96 ώρες. Οι διαλυτές πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε κηλιδώσεις Western ανιχνεύτηκαν με αντι-ακετυλιωμένη (AC)-h4,-h4, -Ac-τουμπουλίνης, ή αντίσωμα -β-ακτίνης. Πίνακας D: AsPC-1, BxPC-3, PANC-1, ή τα κύτταρα HPDE καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C για 96 h σε πλήρες θρεπτικό μέσο σε πλάκες 96-φρεατίων, με ένα εύρος συγκεντρώσεων του MGCD0103, MC1568, ή Tubastatin A , και οι κυτταρικές βιωσιμότητες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΜΤΤ και ένα ορατό φως ανάγνωσης μικροπλάκας. Τα IC

50 τιμές υπολογίστηκαν ως οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου απαραίτητες για την αναστολή της ανάπτυξης κατά 50% σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου καλλιεργήθηκαν απουσία φαρμάκου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. MG, MGCD0103? MC, MC1568? TA, Tubastatin Α Οι ίδιες συντομογραφίες χρησιμοποιήθηκαν σε όλη τη μελέτη εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Η

Θεραπείες των PANC-1 κύτταρα με μεταβλητές συγκεντρώσεις MGCD0103 (0-4 μΜ) οδήγησε σε δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης , όπως προσδιορίζεται με δοκιμασίες ΜΤΤ (τα δεδομένα δεν φαίνονται), με μια IC

50 2,0 μΜ (Σχήμα 2D). Σε αντίθεση, οι θεραπείες των κυττάρων με MC1568 (0-10 μΜ) ή Tubastatin Α (0-8 μΜ) οδήγησε σε περιορισμένη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης (ειδικά σε χαμηλότερες δόσεις, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) με ένα

εκτιμάται

IC

50 από 29,7 μΜ και 11,5 μΜ, αντιστοίχως (Σχήμα 2D). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με AsPC-1 και BxPC-3 κύτταρα (Σχήμα 2D). Απροσδόκητα, τα κύτταρα HPDE ανταποκρίθηκαν στο MGCD0103, καθώς και τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 2D). Αν και θεραπείες με Tubastatin Α (0-4 μΜ) οδήγησε επίσης σε περιορισμένη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης των κυττάρων HPDE (με εκτιμώμενη IC

50 11,5 μΜ), θεραπείες με MC1568 (0-10 μΜ) δεν έδειξε καμία επίδραση στο όλα (τα δεδομένα δεν φαίνονται και στο Σχήμα 2D).

Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η τάξη HDACs Ι παίζουν κρίσιμους ρόλους σε παγκρεατικά ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, ενώ τάξη HDACs II από μόνες τους να παίξουν ελάχιστη ρόλους σε αυτή την πτυχή. Ωστόσο, είναι πιθανό ότι η ταυτόχρονη στόχευση των τάξης Ι και τάξης II HDACs μπορεί να οδηγήσει σε συνεργιστική αύξηση σύλληψη των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων.

Synergistic Αντικαρκινική Αλληλεπιδράσεις μεταξύ κλάσης Ι και κλάσης II-Selective HDACIs σε κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος

για να δοκιμαστεί αυτή η πιθανότητα, κύτταρα PANC-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του MGCD0103, MC1568, ή Tubastatin Α, είτε μόνο του ή σε συνδυασμό για 96 ώρες. Η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης από αυτές τις αγωγές μετρήθηκε με δοκιμασίες ΜΤΤ. Όταν χορηγούνται ταυτόχρονα, MC1568 ή Tubastatin Μια ενισχυθεί σημαντικά MGCD0103 που προκαλείται αναστολή της ανάπτυξης (όπως αντανακλάται στη μειωμένη IC

’50) των κυττάρων (Εικόνες 3Α & amp? Β). Τα συνδυασμένα αποτελέσματα της MGCD0103 με MC1568 ή Tubastatin Α κατά τη σύλληψη της κυτταρικής ανάπτυξης ήταν σαφώς συνεργική, όπως προσδιορίζεται με πρότυπες αναλύσεις ισοβολόγραμμα (σχήματα 3C & amp? D) και υπολογίζοντας τιμές CI με το λογισμικό CompuSyn. Μία CI & lt? 1, ενδεικτική της συνέργειας, υπολογίστηκε για κάθε ένα από τους συνδυασμούς φαρμάκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σχεδόν ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν με BxPC-3 κύτταρα (Σχήματα 3Α, Β, Ε, και F). Για να παρέχουν άμεση απόδειξη ότι η στόχευση HDACs κατηγορίας II μπορεί να ενισχύσει την δραστικότητα κατά του όγκου των MGCD0103 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, shRNA knockdown σταθερών κλώνων για HDAC4 (ορίζεται κύτταρα HDAC4-shRNA), (κύτταρα χαρακτηρίζονται HDAC6-shRNA) HDAC6, και ένας αρνητικός έλεγχος (που ορίζεται κύτταρα NTC-shRNA) δημιουργήθηκαν σε PANC-1 κύτταρα (Σχήμα 3G). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα HDAC4-shRNA και HDAC6-shRNA έδειξαν σημαντικά αυξημένη ευαισθησία σε MGCD0103 σε σύγκριση με τα κύτταρα NTC-shRNA (MGCD0103 IC

50s ήταν 2,60, 1,06, και 0,83 μΜ για NTC-, HDAC4-, και HDAC6-shRNA κύτταρα, αντίστοιχα? ρ & lt? 0.005) (Σχήμα 3Η). Σε μεγάλη αντίθεση, η συνδυασμένη θεραπεία των κυττάρων με HPDE MC1568 και MGCD0103 οδήγησε σε ελαφρώς μειωμένη ευαισθησία MGCD0103 (Σχήμα 4Α). Πρότυπο ισοβολόγραμμα και ανάλυση CompuSyn δεν μπορούσε να εκτελεστεί λόγω της έλλειψης ανταπόκρισης των κυττάρων HPDE να MC1568. Αν και ταυτόχρονης θεραπείας των κυττάρων με HPDE Tubastatin Α και MGCD0103 οδήγησε επίσης σε ελαφρώς αυξημένη ευαισθησία σε MGCD0103 (Σχήμα 4Β), η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο παραγόντων ήταν στην καλύτερη προσθέτου όταν προσδιορίζεται με τυπική ανάλυση ισοβολογράμματος (Σχήμα 4C).

Πλαίσια Α και Β: MGCD0103 IC

50s του BxPC-3 ή PANC-1 κύτταρα προσδιορίστηκαν με την απουσία ή την παρουσία του MC1568 (πίνακας Α) ή Tubastatin Α (πίνακας Β) κατεργασία ταυτόχρονα. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05, ενώ ** υποδεικνύει ρ & lt? 0.005. Πάνελ C-F: Τυπική ανάλυση ισοβολόγραμμα της αναστολής της PANC-1 (πάνελ C & amp? D) ή BxPC-3 (πάνελ Ε & amp? F) κυτταρική ανάπτυξη με MGCD0103 και MC1568 (πάνελ C & amp? Ε) ή Tubastatin Α (πάνελ D & amp? F ). Τα IC

50 τιμές κάθε φαρμάκου απεικονίζονται στους άξονες? Η συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει την αθροιστική δράση, ενώ τα σημεία αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις κάθε φαρμάκου που προκύπτει σε 50% αναστολή της ανάπτυξης. Σημεία που βρίσκονται κάτω από τη γραμμή δείχνουν συνέργεια μεταξύ των συνδυασμών φαρμάκων, ενώ αυτά πάνω από τη γραμμή δείχνουν ανταγωνισμό. Πάνελ G και Η: shRNA σταθερών κλώνων για έναν αρνητικό μάρτυρα (NTC), HDAC4, και HDAC6 παρήχθησαν σε κύτταρα PANC-1. επίπεδα έκφρασης του HDAC4, HDAC6, ac-Η4 και ac-α-τουμπουλίνης προσδιορίστηκαν με κηλίδες Western (Πίνακας G). Ευαισθησία σε MGCD0103 αυτών shRNA σταθερών κλώνων προσδιορίστηκε με δοκιμασίες ΜΤΤ. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0.005

Η

Πάνελ Α και Β:. MGCD0103 IC

’50 κυττάρων HPDE προσδιορίστηκαν με την απουσία ή την παρουσία του MC1568 (πίνακας Α) ή Tubastatin Α (πίνακας Β) αντιμετωπίζονται ταυτόχρονα. Πίνακας C: Τυπική ανάλυση ισοβολόγραμμα της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων HPDE με MGCD0103 και Tubastatin A. Το IC

50 τιμές κάθε φαρμάκου σχεδιάζονται για τους άξονες? Η συνεχής γραμμή αντιπροσωπεύει την αθροιστική δράση, ενώ τα σημεία αντιπροσωπεύουν τις συγκεντρώσεις κάθε φαρμάκου που προκύπτει σε 50% αναστολή της ανάπτυξης. Σημεία που βρίσκονται κάτω από τη γραμμή δείχνουν συνέργεια μεταξύ των συνδυασμών φαρμάκων, ενώ αυτά πάνω από τη γραμμή δείχνουν ανταγωνισμό.

Η

Οι προσπάθειες στη συνέχεια ανέλαβε να καθορίσει εάν κατηγορίας Ι και τάξης ΙΙ-επιλεκτική HDACIs συνεργούν στην πρόκληση του παγκρέατος θάνατο των καρκινικών κυττάρων με προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας. Θεραπείες του PANC-1 ή BxPC-3 κύτταρα με μεταβλητές συγκεντρώσεις MGCD0103 για 96 ώρες είχε σαν αποτέλεσμα δοσο-εξαρτώμενη επαγωγή κυτταρικού θανάτου, όπως αντανακλάται από το μειωμένο αριθμό των αποικιών σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχήματα 5Α & amp? Β). Αυτό ήταν σε μεγάλη αντίθεση με τις θεραπείες με MC1568 ή Tubastatin Α η οποία παρήγαγε πολύ περιορισμένα αποτελέσματα επί του κυτταρικού θανάτου, ειδικά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (Σχήματα 5Α & amp? Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν χορηγούνται ταυτόχρονα, MC1568 ή Tubastatin Α ενίσχυσε σημαντικά MGCD0103-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, όπως αντανακλάται από την περαιτέρω μείωση του αριθμού των αποικιών σε σύγκριση με εκείνη από MGCD0103 θεραπεία μόνο (Σχήματα 5C & amp? D). Αυτές οι συνδυασμένες επιδράσεις της MGCD0103 και MC1568 ή Tubastatin Α για το θάνατο των κυττάρων PANC-1 ήταν συνεργιστική όταν προσδιορίζεται με τη χρήση του λογισμικού CompuSyn (CI = 0,46 και 0,77, αντίστοιχα). Ουσιαστικά τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν με BxPC-3 κύτταρα (CI = 0,30 και 0,54, αντίστοιχα).

Τριακόσια PANC-1 κύτταρα ή πεντακόσια BxPC-3 κύτταρα επιστρώθηκαν σε 100 mm δίσκους 1 ημέρα πριν από την οι θεραπείες με μεταβλητές συγκεντρώσεις MGCD0103, MC1568, ή Tubastatin Α, μόνη της (πλαίσια Α και Β) ή σε συνδυασμό (πάνελ C και D) επί 96 ώρες. Τα φάρμακα στη συνέχεια πλύθηκαν έξω, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ελεύθερο φαρμάκου πλήρες μέσο για έως 3 εβδομάδες. Οι αποικίες έγιναν ορατές με χρώση Coomassie Blue και μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± ποσοστά πρότυπα σφάλματα σε σχέση με μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Υποδηλώνει p & lt? 0,05, ενώ ** υποδεικνύει ρ & lt?. 0.005

Η

Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η κατηγορία HDACs παίζω καθοριστικό ρόλο στην παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση. Αν και τάξη II HDACs από μόνα τους παίζουν πολύ περιορισμένο ρόλο, συνεργάζονται με HDACs κατηγορίας Ι για την ενίσχυση της κατηγορίας Ι HDACs μεσολάβηση του παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση.

Επιδράσεις της Κατηγορίας Ι και Κατηγορίας II-Selective HDACIs στην απόπτωση και κυτταρικού κύκλου Πρόοδος σε παγκρεατικά κύτταρα καρκίνου

για να αρχίσει να καθορίσει τους μηχανισμούς με τους οποίους MGCD0103 και MC1568 ή Tubastatin Μια συνεργούν στην πρόκληση διακοπής της ανάπτυξης παγκρεατικού καρκίνου των κυττάρων και του θανάτου, εξετάσαμε την επόμενη τις επιπτώσεις των τριών HDACIs στην απόπτωση και διανομή του κυτταρικού κύκλου σε PANC-1 και BxPC-3 κύτταρα. Θεραπείες του PANC-1 ή BxPC-3 κύτταρα με MGCD0103 (0,5 μΜ) οδήγησε σε επαγωγή της απόπτωσης και κυτταρικού κύκλου σύλληψη στη G2 /M φάση. Σε αντίθεση, οι θεραπείες με MC1568 (5 μΜ) ή Tubastatin Α (2 μΜ) δεν είχε εμφανή επίδραση ούτε απόπτωση ή την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα αυτά (Σχήματα 6Α-D). Όταν συνδυάζονται ταυτοχρόνως, MC1568 αλλά όχι Tubastatin A, ενισχύεται σημαντικά MGCD0103 επαγόμενη απόπτωση και G2 /M συλλήψεως PANC-1 ή BxPC-3 κύτταρα (Σχήματα 6Α-D).

PANC-1 (πάνελ Α και κύτταρα Β) ή BxPC-3 (πλαίσια C και D) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MGCD0103, MC1568, ή Tubastatin Α, μόνη της ή σε συνδυασμό για 96 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για να μετρηθεί τόσο βασική γραμμή και HDACi προκαλούμενη απόπτωση (πάνελ Α και C) και διανομή του κυτταρικού κύκλου (πάνελ Β και D). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπικά σφάλματα τριπλών από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0.005. Πάνελ Ε και F: Επιδράσεις της κατηγορίας Ι και κατηγορίας II-επιλεκτική HDACIs επί της έκφρασης p21 και DNA DSBs στο BxPC-3 και τα κύτταρα PANC-1. PANC-1 (πίνακας Ε) ή BxPC-3 κύτταρα (πάνελ F) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MGCD0103, MC1568, ή Tubastatin Α, μόνη της ή σε συνδυασμό για 96 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και διαλυτές πρωτεΐνες εκχυλίζονται και υποβλήθηκε σε κηλίδωση Western για τη μέτρηση ρ21 και τα επίπεδα γH2AX. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι επάγουν απόπτωση και διακοπή κυτταρικού κύκλου σε G2 /M φάση μπορεί να αντιπροσωπεύει σημαντικές μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την κυτταρικό θάνατο και διακοπή αύξησης που προκαλείται από MGCD0103, ή MGCD0103 συν MC1568. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι τάξης HDACs Ι παίζουν κρίσιμους ρόλους σε παγκρεατικά απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και G2 έως την εξέλιξη της φάσης Μ και οι επιδράσεις αυτές μπορεί να ενισχυθεί με τάξη ΙΙα HDACs, αλλά όχι από HDAC6.

Επιδράσεις της κατηγορίας Ι και Class II-Selective HDACIs στο DNA δίκλωνα σπασίματα και έκφραση p21 σε κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος

Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή της HDACs σε καρκινικά κύτταρα προκαλεί βλάβη στο DNA, όπως DNA δίκλωνα σπασίματα (DSBs), η οποία μπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την επακόλουθη απόπτωση εάν δεν μπορούσε να επισκευαστεί το κατεστραμμένο DNA [42] – [45]. Περαιτέρω, HDACi επαγόμενη σύλληψη πολλαπλασιασμός είναι στενά συνδεδεμένη με την επαγωγή του ρ21 [45]. Έτσι, HDACs μπορεί να προωθήσει παγκρεατικό την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση μέσω της ρύθμισης της έκφρασης p21 και επιδιόρθωσης DNA DSB. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι θεραπείες του PANC-1 ή BxPC-3 κύτταρα με MGCD0103 οδήγησε σε σημαντική επαγωγή του ρ21 και του DNA DSBs, που αντικατοπτρίζεται στην επαγωγή γH2AX, ενός βιοδείκτη της DSBs [46]. Σε αντίθεση, οι θεραπείες με MC1568 ή Tubastatin Μια έδειξε καμία επίδραση σε DSBs DNA ή επαγωγής της p21. Όταν συνδυάζονται ταυτοχρόνως, τόσο MC1568 και Tubastatin Α συνεργατικά (αν όχι συνεργικά) ενισχυμένη MGCD0103 επαγόμενη έκφραση του p21 (σχήματα 6Ε & amp? F). Ωστόσο, αυτοί οι συνδυασμοί δεν έδειξαν περαιτέρω επιδράσεις στα επίπεδα γH2AX σύγκριση με τη θεραπεία MGCD0103 μόνο (Σχήματα 6Ε & amp? F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η τάξη είναι HDACs II που απαιτούνται για μέγιστη καταστολή της έκφρασης p21 κυρίως διαμεσολαβείται από HDACs κατηγορίας Ι, ωστόσο, είναι περιττό για την κατηγορία Ι HDACs μεσολάβηση επιδιόρθωση του DNA DSBs.

Συζήτηση

HDACIs αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη νέα κατηγορία αντικαρκινικών παραγόντων [19], [20], [45], [47]. Εκτός Vorinostat και Romidepsin που έχουν εγκριθεί από τον Αμερικανικό Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων για τη θεραπεία δερματικών Τ-κυτταρικό λέμφωμα, τουλάχιστον 11 άλλα HDACIs βρίσκονται υπό κλινική αξιολόγηση για την αντιμετώπιση τόσο συμπαγείς όγκους και αιματολογικές κακοήθειες [19]. Αν και HDACIs έχουν δείξει υποσχόμενα δραστηριότητες κατά του όγκου σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου του παγκρέατος [16], [21] – [24], παραμένει ασαφές ποια HDACs είναι οι σχετικές θεραπευτικοί στόχοι. Η απάντηση της αυτό το σημαντικό ζήτημα θα είναι μια προϋπόθεση για την επιλογή της βέλτιστης HDACi για τη θεραπεία αυτής της εξαιρετικά επιθετική νόσο.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αντιμετωπίσει το εν λόγω ζήτημα. Έχουμε καθορίζεται πρώτα τα προφίλ έκφρασης των κλάσεων I και II HDACs σε επτά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και κανονικά κύτταρα HPDE. SIRTs 1-7 (κατηγορία ΙΙΙ HDACs) εξαιρέθηκαν από το παραδοσιακό HDACIs δεν αναστέλλουν αυτή την κατηγορία των HDAC.