Αφηρημένο

αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της αγγειογένεσης. έκφραση του VEGF πάνω ρυθμίζεται σε απόκριση προς μικρο-περιβαλλοντικές νύξεις που σχετίζονται με την κακή παροχή αίματος όπως υποξία. Ωστόσο, η ρύθμιση της έκφρασης του VEGF σε καρκινικά κύτταρα δεν περιορίζεται στην αντίδραση στο στρες λόγω της αυξημένης όγκο της μάζας του όγκου. μεσολαβητές λιπιδίων ειδικότερα της προσταγλανδίνης από αραχιδονικό οξύ προερχόμενο (PG) Ε

2 είναι ρυθμιστές της έκφρασης του VEGF και την αγγειογένεση σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, η αυξημένη οσμωτικότητα που δημιουργείται κατά την διάρκεια του παχέος απορρόφηση του νερού και τα περιττώματα ενοποίηση φαίνεται να ενεργοποιούν τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου και την προώθηση της PGE

2 γενιάς. Τέτοια φυσιολογική διέγερση μπορεί να παρέχει σηματοδότηση για την προώθηση του καρκίνου. Εδώ ερευνήσαμε την επίδραση της έκθεσης σε ένα υπέρτονο μέσο, ​​να μιμηθούν κολονικό περιβάλλον, για την παραγωγή VEGF από καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Ο ρόλος της ενεργοποίησης PGE

2 γενιάς και ΜΑΡΚ ταυτόχρονη αντιμετωπίστηκε με ειδική φαρμακολογική αναστολή. Ανθρώπινου κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου Caco-2 εκτέθηκαν σε ένα υπέρτονο περιβάλλον ανταποκρίθηκε με αξιοσημείωτη VEGF και PGE

2 παραγωγής. παραγωγή VEGF αναστάλθηκε από εκλεκτικοί αναστολείς της ERK 1/2 και μονοπάτια p38 ΜΑΡΚ. Για την αντιμετώπιση του ρυθμιστικού ρόλου της PGE

2 για την παραγωγή VEGF, Caco-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με cPLA

2 (ΑΤΚ) και αναστολείς COX-2 (NS-398), που μπλοκάρουν εντελώς PGE

2 γενιάς . Τα κύτταρα Caco-2 υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με ένα μη εκλεκτικό

ανταγωνιστή υποδοχέα PGE 2. Κάθε θεραπεία αύξησε σημαντικά την υπερτονική στρες που προκαλείται από την παραγωγή VEGF. Επιπλέον, η προσθήκη της PGE

2 ή εκλεκτικός αγωνιστής υποδοχέα ΕΡ

2 σε ενεργοποιημένα κύτταρα Caco-2 ανέστειλε την παραγωγή VEGF. Η αυτοκρινής ανασταλτικό ρόλο για PGE φαίνεται

2 να είναι επιλεκτική για υπέρτονο περιβάλλον δεδομένου ότι η παραγωγή VEGF που επάγεται από την έκθεση σε CoCl

2 μειώθηκε κατά την αναστολή της ταυτόχρονης PGE

2 γενιάς. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η υπερτονικότητα διεγείρει την παραγωγή VEGF σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Επίσης PGE

2 παίζει έναν ανασταλτικό ρόλο στην παραγωγή του VEGF από τα κύτταρα Caco-2 εκτεθεί σε υπεροσμωτικό στρες μέσω της ΕΚ

2 ενεργοποίηση

Παράθεση:. Τζεντίλε LB, Piva Β, Diaz BL (2011) Υπέρτονο το άγχος Προκαλεί VEGF παραγωγή στον τομέα των ανθρωπίνων καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή Caco-2: Ανασταλτικό ρόλο της Αυτοκρινές PGE

2. PLoS ONE 6 (9): e25193. doi: 10.1371 /journal.pone.0025193

Επιμέλεια: Ben C. Β Κω, Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 17η Δεκεμβρίου 2010? Αποδεκτές: 30 Αυγούστου 2011? Δημοσιεύθηκε: 28 Σεπ του 2011

Copyright: © 2011 Gentile et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Βραζιλία) και Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo ένα Pesquisa κάνει Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, Βραζιλία) (σε BLD) και του Υπουργείου Υγείας (Βραζιλία) PhD υποτροφία (σε LBG). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο σχηματισμός νέων αιμοφόρων αγγείων από προϋπάρχοντα αγγείωση είναι ένα κεντρικό διαδικασία στην ανάπτυξη των όγκων πιο ειδικά τα στερεά. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται αγγειογένεση και ρυθμίζεται από την ισορροπία των αρνητικών και θετικών βιοχημικών σημάτων. Τα νεοσχηματισμένα αιμοφόρα αγγεία είναι υπεύθυνα για την παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών για την αυξανόμενη μάζα του όγκου και μία διαδρομή για τη διάδοση των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων. Ο VEGF είναι το πιο σημαντικό θετικός ρυθμιστής της αγγειογένεσης χάρη στην ικανότητά του να προσλαμβάνει ενδοθηλιακά κύτταρα σε υποξικές τοποθεσίες και να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό αυτού του κυψελοειδούς τύπου, την προώθηση της διαφοροποίησης των αγγειακών δομών [1]. έκφραση VEGF συσχετίζεται θετικά με αρνητική έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, η έκφραση του VEGF συσχετίζεται με αυξημένη μεταστατικό δυναμικό [2], ενώ η έκφραση του υποδοχέα της είναι ένας δείκτης της μικρότερης μετεγχειρητική επιβίωση [3].

έκφραση VEGF είναι επάνω ρυθμιζόμενη σε απάντηση στις πολύ μικρές περιβαλλοντικές νύξεις που σχετίζονται με κακή αιμάτωση όπως υποξία [4], οξέωση [5] και χαμηλά επίπεδα θρεπτικών ουσιών [6]. Σε όγκους, μειωμένα επίπεδα O

2 οδηγεί σε HIF-1α σταθεροποίηση, μία υπομονάδα του μεταγραφικού παράγοντα HIF-1, και την επακόλουθη μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων που παρουσιάζουν ένα στοιχείο υποξαιμία απόκρισης (HRE) σε υποκινητές τους, όπως ο VEGF . Ωστόσο, ο VEGF ρύθμιση έκφραση σε καρκινικά κύτταρα δεν περιορίζεται στην αντίδραση στο στρες, λόγω του αυξημένου όγκου της μάζας του όγκου. Αρκετοί άλλοι παράγοντες έχει αποδειχθεί ότι επάγουν VEGF όπως αντιδραστικά είδη οξυγόνου [7] – [9], αυξητικούς παράγοντες [10], [11], κυτταροκίνες [12], και οι μεσολαβητές λιπιδίων [13] – [16]. Το αραχιδονικό οξύ προσταγλανδίνης που προέρχεται από (PG) Ε

2 είναι ένα κύριος ρυθμιστής της έκφρασης του VEGF και της αγγειογένεσης σε διάφορους τύπους καρκίνου και σε καρκίνο του παχέος εντέρου, ειδικότερα. Η εξωγενής PGE

2 επάγει HIF-1α σταθεροποίηση [13] και η έκφραση του VEGF [17] σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. VEGF και COX-2 έκφρασης και την αγγειογένεση όγκων συσχετίζονται θετικά σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου [18] – [20]

Ωστόσο, υποξία δεν είναι το μοναδικό εξωτερικό ερέθισμα άγχους το οποίο ενεργοποιεί κυτταρικές αποκρίσεις σε καρκίνο του παχέος εντέρου.. Οι συνεχώς μεταβαλλόμενες περιεχόμενα του εντερικού αυλού εκθέτουν φυσιολογικών και καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων σε μια μυριάδα των ερεθισμάτων. Τέτοια φυσιολογική διέγερση μπορεί να παρέχει σηματοδότηση για την προώθηση του καρκίνου. Στην πραγματικότητα, η αυξημένη οσμωτικότητα που δημιουργείται κατά τη διαδικασία του κόλου απορρόφηση του νερού και τα περιττώματα ενοποίηση [21] – [23] φαίνεται να ενεργοποιεί κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου και την προώθηση της COX-2 έκφρασης και PGE

2 γενεά, αλλά δεν ενεργοποιεί φυσιολογική εντερική κύτταρα [24]. Ο στόχος μας σε αυτή τη μελέτη ήταν να προσδιοριστεί η επίδραση του υπερτονικού στρες στην παραγωγή VEGF από Caco-2 κόλου κυτταρική σειρά καρκίνου. Ο πιθανός ρόλος της αυτοκρινούς PGE

2 και ΜΑΡΚ μονοπατιών στη ρύθμιση της παραγωγής VEGF σηματοδότησης αναλύθηκε επίσης.

Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Το χλωριούχο νάτριο (NaCl) ήταν που λαμβάνεται από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ) και διαλύθηκε σε αποστειρωμένο νερό για ένα απόθεμα διαλύματος 2 Μ συγκέντρωση. Η IPLA

2 αναστολέα, Bromoenol λακτόνη (BEL), η cPLA

2 /IPLA

2 αναστολέα, αραχιδονύλ τριφθορομεθυλοκετόνη (ATK), και προσταγλανδίνης E

2 αγοράστηκαν από την Cayman Chemical Co. ( Ann Arbor, ΜΙ) και αραιώνεται σε αιθανόλη αναλόγως προς τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αναστολείς για COX-2, NS-398 (Cayman)? p38, SB202190? JNK, SP600125? ΜΕΚ1 /2, U0126 (όλα από την Biomol, Plymouth Meeting, ΡΑ) αραιώθηκαν σε DMSO (Sigma). Τα μονοκλωνικά αντισώματα για προσδιορισμούς ανοσοκηλίδος ήταν αντι-COX-2 IgG ποντικού (κλώνος 33) από την BD Transduction Laboratories και αντι-GAPDH (κλώνος 6C5) IgG ποντικού από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), αραιωμένο σε 0,003 μg /mL. Η κατσίκα HRP-συνδεδεμένη δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού IgG από την Santa Cruz Biotechnology χρησιμοποιήθηκε σε 0,1 μg /mL.

Κυτταρική καλλιέργεια και θεραπείες

Caco-2 (ATCC ΗΤΒ-37, δώρο του Δρ Χοσέ Morgado Diaz, Instituto Nacional de καρκίνος, Βραζιλία) κυτταρική γραμμή διατηρήθηκε σε Dulbecco Τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 44 mM NaHCO

3, 1 mM ΝαΗ

2ΡΟ

4.Η

2O, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 10 mM HEPES, ΜΕΜ διάλυμα βιταμίνες, ΜΕΜ διάλυμα απαραίτητα και μη απαραίτητα αμινοξέα, 2 mM L-γλουταμίνη, 55 μΜ β-μερκαπτοαιθανόλη, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (όλα τα αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας από την Invitrogen). κυτταρική γραμμή IEC-6 (Rio de Janeiro Κυττάρων Bank, Βραζιλία) διατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 5% FBS και 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας (εμβαδόν επιφανείας της κυτταρικής ανάπτυξης 25, 75 και 150 cm

2). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με 0.25% θρυψίνη και 0.38 g /L EDTA σε HBSS χωρίς Ca

++ και Mg

++ και 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο απλώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων με επίπεδο πυθμένα (περιοχή των 9,03 εκατοστών

2 /καλά, Techno Plastic Products, Ελβετία). 1.9 mL από φρέσκο ​​συμπληρωμένο μέσο καλλιέργειας ϋΜΕΜ προστέθηκε σε φρεάτια καλλιέργειας με ή χωρίς φαρμακολογική αναστολείς και τα κύτταρα επωάστηκαν για 15 λεπτά (30 λεπτά για αναστολείς κινασών ΜΑΡ) στους 37 ° C. Όλα τα κύτταρα έλαβαν την ίδια ποσότητα του φορέα, ως εκ τούτου, η τελική συγκέντρωση ήταν κάτω του 0,1% του DMSO ή αιθανόλης και δεν τροποποιεί την ενεργοποίηση των κυττάρων. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με την προσθήκη 0-100 μι 2 Μ διαλύματος NaCl. ΫΜΕΜ προστέθηκε στο φρεάτιο για να ολοκληρωθεί τελικό όγκο 2 mL. Τελική οσμωτικότητα του μέσου μετά την προσθήκη 100 mM NaCl ήταν περίπου 540 mOsm, σε σύγκριση με 367 mOsm του ισοσμωτική μέσου. Μέσο οσμωτικότητα προσδιορίζεται εμπειρικά από την κατάψυξη μέθοδο χρησιμοποιώντας ένα οσμώμετρου (Advanced Instruments Inc., Norwood, ΜΑ). Για την ελαχιστοποίηση διακύμανση των κινητικών πειραμάτων το συνολικό χρόνο σε καλλιέργεια μετά την επίστρωση ήταν η ίδια για κάθε χρονικό σημείο που αναλύθηκε.

Προσδιορισμός της PGE

2 και VEGF σε υπερκείμενα

Η PGE

2 από Caco-2 κυτταρική γραμμή προσδιορίστηκε με ΕΙΑ σε υπερκείμενο καλλιέργειας ανάλογα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Cayman) και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την κυτταρική ενεργοποίηση με υπέρτονο στρες και φυγοκεντρήθηκαν στα 250 χ g για 5 λεπτά για την απομάκρυνση επιπλέοντα κύτταρα και καταψύχθηκαν στους -70 ° C. PGE

2 επίπεδα προσδιορίστηκαν με τη χρήση ενός μονοκλωνικού αντισώματος PGE

2 Kit ΕΠΕ. Μετά πλάκα ανάπτυξη αναγνώστηκε στα 405 nm σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας (Spectra Max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Η παραγωγή VEGF από Caco-2 κυτταρική γραμμή προσδιορίστηκε με ELISA σε υπερκείμενο καλλιέργειας ανάλογα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (R &? D Systems, UK). Εν συντομία, το μέσο καλλιέργειας συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την κυτταρική ενεργοποίηση με υπέρτονο στρες και φυγοκεντρήθηκαν στα 250 χ g για 5 λεπτά για την απομάκρυνση επιπλέοντα κύτταρα και καταψύχθηκαν στους -70 ° C. επίπεδα VEGF αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανθρώπινο VEGF Duoset (R &? D Systems, UK). Μετά πλάκα ανάπτυξη διαβάστηκε σε 450 nm σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας (Spectra Max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ένα ξέστρο κυττάρων (Costar) και 100 μΙ 10% SDS προστέθηκαν ανά φρεάτιο της πλάκας καλλιέργειας κυττάρων 6 φρεατίων. 100 μι 2 ρυθμιστικού × φόρτωσης (1,4 Μ β-μερκαπτοαιθανόλη, 184 mM βάση Tris, 80 μΜ βρωμοφαινόλη μπλε, 3% γλυκερόλη, 8% SDS, ρΗ 6.8) προστέθηκε στο προϊόν λύσης κυττάρου. Κυτταρολύματα αμέσως θερμάνθηκαν στους 100 ° C για 5 λεπτά πριν από την κατεργασία με υπερήχους σε 30% του πλάτους και 30 J ενέργειας σε ένα υψηλής έντασης υπερήχων επεξεργαστή. Τα δείγματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε SDS-PAGE 10% πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε 29 mA /γέλης για 1 ώρα. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Santa Cruz) και αποκλείστηκαν σε 5% άπαχο ξηρό γάλα σε 1 χ TBS (Tris 10 mM? NaCl 150 mM ρΗ 7,4) επί 12 ώρες για την επισήμανση της COX-2, ή για 2 h για όλα τα άλλα αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πλύσιμο, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα αραιωμένα σε TTBS (TBS με 0,2% Tween 20) και 0.05% αζίδιο του νατρίου επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου για COX-2 ή 12 ώρες στους 4 ° C για άλλα αντισώματα. Μετά δευτερογενή επισήμανση με HRP-συνδεδεμένη αντι-IgG αντισώματα, πρωτεΐνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ECL σύστημα ανάλυσης Western Blotting (Amersham Biosciences).

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσου όρου (SEM) των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Γραφήματα και τη δυτική κηλίδες που εμφανίζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή Bonferroni ή του Dunnett (Prism έκδοση 4.03, Graphpad Software, Inc. La Jolla, CA). Τα σύμβολα

+ και * αντιπροσωπεύουν

σ

τιμές & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο μη διεγερμένα ομάδα ή υπέρτονο άγχους /CoCl

2-διεγείρονται ομάδα αντίστοιχα

Αποτελέσματα

Υπέρτονο στρες επάγει την παραγωγή VEGF από Caco-2 και PGE

2 ρυθμίζει την παραγωγή αγγειογενετικών παράγοντας σε αυτό το περιβαλλοντικό στρες

Υπέρτονο στρες διεγείρει την παραγωγή του VEGF από Caco-2 μετά από 24 ώρες από την ενεργοποίηση ( Σχήμα 1Α) ακολουθώντας την ίδια απόκριση στη δόση και χρονική πορεία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) της PGE

2 γενιάς κάτω από τις ίδιες συνθήκες διεγερτική [24]. Όπως PGE

2 έχει περιγραφεί ότι παίζουν ένα ρόλο στην αγγειογένεση και VEGF παραγωγή προσδιορίσαμε αν PGE

2 ρυθμίζει την παραγωγή VEGF από Caco-2 κατά τη διάρκεια της διέγερσης με υπέρτονο μέσο. Inhibiton της PGE

2 από κατεργασία με cPLA

2 (ΑΤΚ) (Σχήμα 1Β) ή COX-2 (NS-398) αναστολείς (Σχήμα 1C) αυξημένη παραγωγή VEGF. Αυτό το φαινόμενο ανεστράφη με τη προσθήκη PGE

2 στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (Σχήμα 1ϋ) υποδεικνύοντας έναν ειδικό ρόλο για PGE 2.

(Α) κύτταρα Caco-2 διεγέρθηκαν με 10

-100 mM ΝθΟΙ επί 24 ώρες πριν από την ανάλυση της παραγωγής VEGF. παραγωγή VEGF προσδιορίστηκε με ELISA σε υπερκείμενα των κυττάρων Caco-2 διεγείρονται με υπερτονικό στρες (100 mM NaCl) επί 24 ώρες μετά την προ-θεραπεία με αναστολείς του cPLA

2, ATK (Β)? COX-2, NS-398 (C) ή PGE

2 (D). κύτταρα HCT116 διεγέρθηκαν με 100 mM ΝβΟΙ επί 24 ώρες μετά την προ-θεραπεία με αναστολείς του cPLA

2, ATK (Ε)? COX-2, NS-398 (F). +, *

ρ & lt? 0,05

, σε μη διεγερμένα κύτταρα ή κύτταρα διεγερμένα, αντίστοιχα. **

ρ & lt? 0,05

, σε σύγκριση με NS-398-κατεργασμένα κύτταρα. Γράφημα ράβδων δείχνουν μέσα ± SEM από δείγματα εις τριπλούν.

Η

Για να εξακριβωθεί αν η αναστολή της παραγωγής VEGF με Caco-2 διεγείρονται με υπέρτονο το άγχος ήταν συνέπεια της PGE

2 μέτρα και όχι συνέπεια της nonespecific δράση των φαρμακολογικών φαρμάκων που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα, πραγματοποιήσαμε το ίδιο πείραμα σε HCT116, μία κυτταρική γραμμή καρκίνου του παχέος εντέρου που δεν εκφράζει COX-2 και δεν παράγει ανιχνεύσιμα επίπεδα της PGE

2 υπό υπέρτονο στρες. Εμείς δεν παρατηρήσαμε καμία αλλαγή στην παραγωγή VEGF, αποκλείοντας τη δυνατότητα παρεμβολής των φαρμακολογικών αναστολέων (Εικόνες 1 Ε και F). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η PGE

2 που παράγεται από Caco-2 ενεργοποιείται από στρες υπέρτονο έχει μία αυτοκρινή ανασταλτική δράση επί της παραγωγής VEGF.

EP

2 υποδοχέας παίζει ένα ρόλο στην ρύθμιση της παραγωγής VEGF μέσω PGE

2 σε Caco-2 που διεγείρεται με υπερτονικό στρες

Για να προσδιοριστεί τι είναι ο μηχανισμός δράσης της PGE

2 στη ρύθμιση της παραγωγής VEGF σε υπέρτονο στρες, Caco-2 κύτταρα ενεργοποιήθηκαν με υπερτονικό μέσο κατά την διάρκεια 24 ώρες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με AH6809, ενός ανταγωνιστή του υποδοχέα ΕΡ. Επαληθεύσαμε η αναστολή της σηματοδότησης του υποδοχέα ΕΡ προκάλεσε αύξηση της παραγωγής VEGF (Σχήμα 2Α). Στη συνέχεια, να προσδιοριστεί ποια ειδικό υποδοχέα εμπλέκεται σε αυτό το φαινόμενο Caco-2 διεγέρθηκαν με υπέρτονο μέσο και κατεργάζεται με ATK και υποδοχείς ΕΡ αγωνιστές. Το

2 αναστολέας cPLA (ATK) αφαίρεσε την παρεμβολή της PGE

2 που παράγονται από καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και υποδοχείς ΕΡ ενεργοποιήθηκαν μόνο από εξωγενώς προστιθέμενη αγωνιστές. Κατά συνέπεια, το σχήμα 2Β δείχνει ότι η θεραπεία με ΑΤΚ αυξάνει την παραγωγή του VEGF και όταν PGE

2 ή 16,16-dimetil PGE

2, ένα τηγάνι αγωνιστή υποδοχέα ΕΡ, προστέθηκαν στο μέσο αυτό το αποτέλεσμα ανατράπηκε, ενισχύοντας ότι EP η ενεργοποίηση του υποδοχέα έχει μία ανασταλτική επίδραση στην παραγωγή VEGF. Αύξηση της παραγωγής VEGF με αναστολή της ενδογενούς PGE

2 επίσης αναστραφεί με butaprost, ένας ειδικός αγωνιστής υποδοχέα ΕΡ2 (Σχήμα 2Β). Η ενεργοποίηση με ΕΡ1, 17-φαινυλ-Trino-PGE

2, ή ΕΡ3, Sulprostone, αγωνιστές δεν είχε επίδραση επί αυξημένη παραγωγή VEGF. Δεδομένου ότι η έκφραση ΕΡ4 φαίνεται να απουσιάζει σε κύτταρα Caco-2 [26], τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η ενδογενής PGE

2 ρυθμίζει την παραγωγή VEGF που επάγεται από στρες υπέρτονο μέσω της ενεργοποίησης του ΕΡ2.

(Α) Caco-2 κύτταρα διεγέρθηκαν με υπέρτονο στρες (100 mM NaCl) επί 24 ώρες μετά την προ-αγωγή με ΕΚ και DP υποδοχέων ανταγωνιστής, ΑΗ 6809 (Α)? με αναστολέα της cPLA

2, ATK (10 μΜ)? PGE

2? ΕΡ υποδοχέων αγωνιστή, 16,16-διμεθυλο προσταγλανδίνης Ε

2? EP1 και EP3 υποδοχέων αγωνιστή, 17-φαινυλ -τρινορ προσταγλανδίνης Ε

2? ΕΡ2 υποδοχέα αγωνιστής, butaprost και αγωνιστή υποδοχέα ΕΡ3, sulprostone (Β)? ή με αναστολέα της PKA, Η-89. PGE

2 και τα ανάλογά της χρησιμοποιήθηκαν σε 0,1 μΜ. παραγωγή VEGF προσδιορίστηκε με ELISA σε υπερκείμενα των κυττάρων Caco-2. +, *

ρ & lt? 0,05

, σε σύγκριση με μη-διεγερμένα κύτταρα ή κύτταρα διεγερμένα, αντίστοιχα. **

p & lt? 0,05

, σε σύγκριση με ATK-επεξεργασμένα κύτταρα. Γράφημα ράβδων δείχνουν μέσα ± SEM από δείγματα εις τριπλούν.

Η

ΕΡ2 είναι ένας υποδοχέας τύπου ροδοψίνης συζευγμένο με Gs και μεσολαβεί αυξήσεις στρατόπεδο [27]. Έτσι ελέγξαμε αν PKA έπαιξε ρόλο στην PGE

2 αποτελέσματα μεσολάβηση ΕΡ2 κατά τη διάρκεια υπέρτονο στρες. Αναστολή της ΡΚΑ από H-89 αυξημένη παραγωγή VEGF από τα κύτταρα Caco-2 εκτέθηκαν σε υπέρτονο μέσο (Σχήμα 2C). Ενίσχυση του δυναμικού ανασταλτική οδό συμμετοχή PGE

2-ΕΡ2-cAMP-PKA.

Ο ρόλος των ενδοκρινών PGE

2 για CoCl

2 που προκαλείται από την παραγωγή VEGF

Επίσης, εξακριβώσει κατά πόσον PGE

2 είχε ένα ρόλο στη ρύθμιση της παραγωγής VEGF κάτω από ένα πρότυπο simulatory κατάσταση. Για την ενεργοποίηση της οδού που προκαλείται από υποξία Παράγοντα (HIF) και την προσομοίωση υποξία, τα κύτταρα Caco-2 ενεργοποιήθηκαν με CoCl

2. Μετά από 24 ώρες διέγερσης με CoCl

2, Caco-2 παρουσιάζεται σημαντική παραγωγή της PGE

2 (Σχήμα 3Α) και αυξημένη έκφραση της COX-2 (Σχήμα 3Β). Περαιτέρω πειράματα πραγματοποιήθηκαν μετά πρόσθεση μίας 1 mM του CoCl

2 στο μέσο μετά από 24 ώρες από την ενεργοποίηση. Επιπλέον, CoCl

2-διεγερμένα PGE

2 γενιάς εξαρτάται από COX-2, όπως αυτό ανεστάλη πλήρως με NS-398 (Σχήμα 3C).

κύτταρα Caco-2 διεγέρθηκαν με 0,1- 1 mM του CoCl

2 κατά τη διάρκεια 24 ωρών πριν από την PGE

2 και την παραγωγή VEGF (Α και D, αντίστοιχα) και ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης COX-2 (Β). PGE

2 και VEGF παραγωγή από τα κύτταρα Caco-2 διεγείρονται με 1 mM από CoCl

2 κατά τη διάρκεια 24 ωρών μετά από προ-θεραπεία με αναστολέα της COX-2, NS-398 (C και Ε, αντίστοιχα). παραγωγή VEGF από τα κύτταρα Caco-2 διεγείρονται με 0.1-1 πιΜ CoCl

2 κατά τη διάρκεια 24 h (D). PGE

2 και VEGF παραγωγή προσδιορίστηκαν με ELISA σε υπερκείμενα των κυττάρων Caco-2. COX-2 και GAPDH έκφραση σε κυτταρικά ιζήματα αναλύθηκε με κηλίδωση Western. +, *

ρ & lt? 0,05

, σε σύγκριση με μη-διεγερμένα κύτταρα ή κύτταρα διεγερμένα, αντίστοιχα. Γράφημα ράβδων δείχνουν μέσα ± SEM από δείγματα εις τριπλούν.

Η

Παρόμοια με υπέρτονο διέγερση του στρες, CoCl

2-ενεργοποιημένων κυττάρων παράγονται επίσης VEGF (Σχήμα 3D). Ωστόσο, αυτοκρινείς PGE

2 φαίνεται να έχει το αντίθετο αποτέλεσμα σε αυτή την κατάσταση δεδομένου ότι η παραγωγή της θεραπείας NS-398 ανέστειλε VEGF (Σχήμα 3Ε). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η PGE

2 έχει μια διεγερτική αυτοκρινή ρόλο στην παραγωγή VEGF σε CoCl

2 ενεργοποίησης.

Ο ρόλος των MAPKs στην παραγωγή του VEGF από τα κύτταρα Caco-2

Για να προσδιορίσετε εάν η παραγωγή του VEGF είχε διαφορικά ρυθμίζονται σε κύτταρα Caco-2 πέρα ​​από το δυναμικό αυτοκρινή ρόλο της PGE

2, στρίψαμε προς την ταυτοποίηση των οδών που εμπλέκονται ΜΑΡΚ. Δεδομένου ότι έχουμε δείξει πριν από ένα ρόλο για ERK 1/2, JNK και ρ38 σε PGE

2 γενιάς [24] και για να αποφευχθεί το ενδεχόμενο πρόβλημα αυτό μπορεί να αποτελέσει για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων, τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με την παρουσία 1 μΜ NS-398. Η φαρμακολογική αναστολή της ERK 1/2 και ρ38 μονοπατιών έδειξε ένα κοινό ρόλο στην ενεργοποίηση είτε υπέρτονο στρες ή CoCl

2 (Σχήματα 4Α και Β). JNK ρόλο ήταν πιο περιορισμένη, όπως SP 600 125 αξιοσημείωτα ανέστειλε την παραγωγή του VEGF που επάγεται από CoCl

2 ενεργοποίηση, ενώ δεν επηρέασε την παραγωγή του VEGF που επάγεται από υπέρτονο στρες (Εικόνες 4Α και Β).

Οι αναστολείς της JNK, SP600125 ? p38, SB202190? και ΜΕΚ 1/2, U0126 προστέθηκαν πριν από τη διέγερση με υπερτονικό στρες (100 mM NaCl) (Α) ή 1 mM CoCl

2 (Β) για 24 ώρες. κύτταρα Caco-2 προκατεργάστηκαν με 1 μΜ του NS-398 για την πρόληψη της ενδογενούς PGE

2 παραγωγή σε όλα τα δείγματα. παραγωγή VEGF προσδιορίστηκε με ELISA σε υπερκείμενα των κυττάρων Caco-2. +, *

ρ & lt? 0,05

, σε σύγκριση με μη-διεγερμένα κύτταρα ή κύτταρα διεγερμένα, αντίστοιχα. Γράφημα ράβδων δείχνουν μέσα ± SEM από δείγματα εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

Ο ρόλος της PGE

2 στην ανάπτυξη του καρκίνου είναι συνήθως περιγράφεται ως αυτοκρινή παράγοντα ικανό να διαμορφώνει πολλές πτυχές της η βιολογία καρκινικού κυττάρου, ιδίως εκείνων επιθηλιακής προέλευσης [28], [29]. PGE

2 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τον πολλαπλασιασμό, μεταστατική ικανότητα και παραγωγή προ-αγγειογόνων παραγόντων [17], [30], [31]. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες δεν έχουν συνήθως πληροφορίες σχετικά με τα ερεθίσματα που θα οδηγήσει την καταρράκτη αραχιδονικού οξέος και τελικά PGE

2 γενιάς πέρα ​​επαγόμενη έκφραση της COX-2. Έχουμε αποδείξει προσφάτως ότι ένα υπεροσμωτικό περιβάλλον μπορεί να επάγει COX-2 έκφρασης και PGE

2 γενεά σε Caco-2 κύτταρα καρκίνου κόλου [24]. Το πιο σημαντικό, μπορεί να προκαλέσει υπεροσμωτικότητα το βήμα περιοριστικά με PGE

2 γενιάς ενεργοποιώντας cPLA

2-α και επάγει την απελευθέρωση ελεύθερου αραχιδονικού οξέος. Κανονική εντερικά επιθηλιακά κύτταρα δεν έδειξε την παραγωγή της PGE

2 κάτω από την ίδια υπερωσμωτικού ερέθισμα. Έχοντας εντοπίσει ένα σχετικό φυσιολογικό ερέθισμα για καρκινικά κύτταρα κόλου, διερευνήσαμε την επίδραση της υπέρτονο μέσο για την παραγωγή του μείζονος προ-αγγειογόνο παράγοντα, VEGF, και η πιθανή αυτοκρινής επίδραση της PGE

2.

Προσανατολισμός των κυττάρων Caco-2 για να υπέρτονο μέσο οδήγησε σε σημαντική παραγωγή VEGF. Όπως αποδεικνύεται, πριν συμβεί αυτή η παραγωγή VEGF παράλληλα με την PGE

2 γενιάς. PGE

2 περιγράφεται ως ένας ισχυρός επαγωγέας του VEGF βασίζεται σε πειράματα όπου COX-2 υπερέκφραση αυξημένη παραγωγή VEGF από κυτταρικές σειρές του κόλου και καρκίνου του μαστού. Επιπλέον, αυτή η παραγωγή VEGF αναστάλθηκε από εκλεκτικούς αναστολείς COX-2. Ως εκ τούτου, επιδιώκεται να διερευνηθεί η επίδραση της αυτοκρινή PGE

2 γενεά σε κύτταρα Caco-2 που διεγείρεται από υπέρτονο μέσο. Παραδόξως, η αναστολή της είτε cPLA

2 ή COX-2, με ATK ή NS-398 αντίστοιχα, αύξησε περαιτέρω την παραγωγή του VEGF. Αυτό το φαινόμενο θα μπορούσε να αποδοθεί στην αναστολή της PGE

2 γενιάς, όπως η αποκατάσταση της PGE

2 επίπεδα με την εξωγενή προσθήκη επανήλθε παραγωγή VEGF στα αρχικά του επίπεδα σε ATK επεξεργασμένα κύτταρα Caco-2. κύτταρα HCT116 μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί με υπέρτονο μέσο για την παραγωγή VEGF. Ωστόσο, τα κύτταρα HCT116 ούτε εκφράζουν COX-2 ούτε παράγουν PGE

2 [31], παρά τα κύτταρα που ενεργοποιούνται ή όχι. Έτσι, η έλλειψη επίδρασης του ATK και NS-398 για HCT116 αποκλείει τυχόν ανοικτά επιπτώσεις στόχος αυτών των αναστολέων [32].

PGE

2 πράξεις σε μια ομάδα G-πρωτεΐνες-υποδοχείς που συνδέονται με ( GPCRs). Υπάρχουν τέσσερις GPCRs ανταποκρίνεται σε PGE

2 ορισθεί υποτύπων ΕΡ1, ΕΡ2, ΕΡ3 και ΕΡ4, οδηγώντας σε διακριτές οδό σηματοδότησης και η συνολική βιολογική δράση [27]. Για να προσδιοριστεί η εξάρτηση της PGE

2 αυτοκρινείς επιδράσεις στην σηματοδότηση EP, χρησιμοποιήσαμε ένα μη ειδικό ανταγωνιστή και των τεσσάρων υποδοχέων ΕΡ, AH 6809. Η αγωγή με AH 6809 μιμείται την επίδραση της αναστολής της παραγωγής VEGF με PGE

2, υποδεικνύοντας ότι PGE

2 σήματα μέσω των υποδοχέων της μεμβράνης πλάσματος του να ρυθμίζει προς τα κάτω την παραγωγή του VEGF που επάγεται από υπέρτονο μέσο. Το συγκεκριμένο υπότυπο εμπλέκονται φαίνεται να είναι ΕΡ2 ως εκλεκτικός αγωνιστής του, butaprost, είναι σε θέση να αντικαταστήσει πλήρως για PGE

2. Στην απέναντι, ούτε θεραπείες ΕΡ1 ούτε ΕΡ3 αγωνιστές που παρουσιάζονται το ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της παραγωγής VEGF. ΕΡ2 φαίνεται ζευγάρι με αυξημένα επίπεδα cAMP και επακόλουθη ενεργοποίηση του ΡΚΑ, όπως η αναστολή της PKA από H-89 αναπαράγει τις επιπτώσεις της αναστολής της PGE

2 γενιάς ή ενέργεια. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα πειράματα διεξήχθησαν με PGE

2 και τα ανάλογά της, σε συγκεντρώσεις που ήταν συμβατό με τα ενδογενώς παράγονται επίπεδα. έχουν επιπτώσεις στην παραγωγή του VEGF από τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου έχουν αποδοθεί σε PGE

2 χρησιμοποιώντας συγκεντρώσεις έως και 100 μΜ [13] αυτό που υπερβαίνουν κατά πολύ το ποσό των PGE

2 που πραγματικά χρειάζεται να ενεργοποιήσει τους υποδοχείς του [27], ή ό, τι είναι παράγεται στην καρκινική μάζα [33].

έχει δειχθεί η ενεργοποίηση του ΕΡ2-cAMP ΡΚΑ-GSK-3-σηματοδοτικό μονοπάτι οδηγεί σε μείωση της φωσφορυλίωσης β-κατενίνης, που επιτρέπει τη μετατόπιση και ενεργοποίηση της Tcf /Lef εξαρτώμενη μεταγραφή (για μια επισκόπηση, βλέπε [34]) των γονιδίων που εμπλέκονται στον καρκίνο, όπως COX-2 και VEGF. Ωστόσο, το μοντέλο μας υπέρτονο στρες, ΕΡ2 ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης προκαλεί καταστολή της παραγωγής του VEGF. Για την καλύτερη κατανόηση της ρύθμισης αυτής της οδού σε υπέρτονο στρες διερευνήσαμε το ρόλο της GSK-3in αυτή την ενεργοποίηση με τη χρήση του SB216763, ενός ανταγωνιστικού GSK-3 α και β αναστολέα (50-5000 ηΜ, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η θεραπεία αύξησε την παραγωγή VEGF, υποδεικνύοντας ότι η ανασταλτική επίδραση του ΕΡ2 στην παραγωγή αγγειογόνου παράγοντα δεν εξαρτάται από αυτό το κινάσης. Μία δυνατότητα για την ξεχωριστή επίδραση της ενεργοποίησης ΕΡ2 σε υπέρτονο άγχος είναι ότι ο κανονισμός αυτός συμβαίνει μέσω cAMP. Ορισμένες μελέτες έχουν δείξει cAMP μπορεί να αναστέλλουν την παραγωγή κυτοκινών με αναστολή Ras-εξαρτώμενη σήματα από ΡΚΑ, αδρανοποίηση ΜΕΚ σηματοδότηση /ΕΚΚ ή αναστέλλοντας φωσφορυλίωση της p38 ΜΑΡΚ [35] – [37]. Όπως ERK μονοπάτι /p38 ΜΑΡΚ ασχολείται με την παραγωγή μοντέλο επαγωγή VEGF μας, αυτές οι διαπιστώσεις θα μπορούσε να είναι ενδεικτική του μηχανισμού με τον οποίο σηματοδότησης ΕΡ2 μπλοκάρει την παραγωγή VEGF σε υπέρτονο στρες.

Για να προσδιορίσετε αν το ανασταλτικό ρόλο της PGE

2 μπορεί να επεκταθεί και σε άλλα ερεθίσματα, χρησιμοποιήσαμε CoCl

2 να επάγει σταθεροποίηση HIF-1α και μιμούνται την απόκριση σε υποξία [13]. Όπως φαίνεται για υπέρτονο διέγερση, CoCl

2 επάγεται PGE

2 γενιάς εξαρτιόταν από την COX-2. Η PGE

γενιάς 2 επίσης παράλληλα με την παραγωγή VEGF. Η επαγωγή της παραγωγής VEGF με CoCl

2 έχει δειχθεί προηγουμένως σε ανθρώπινους ινοβλάστες [38], κυτταρική σειρά καρκίνου του πνεύμονα [39], αμφιβληστροειδή επιθήλιο [40], γλοίωμα κυτταρικές γραμμές [41], του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές [42] και σε αστροκύτταρα [43], εντούτοις δεν υπήρξε καμία προσπάθεια να διερευνήσει τις δυνατότητες παραγωγής της PGE

2 ή αυτοκρινείς επιδράσεις της. Η αναστολή της COX-2 ανέστειλε την παραγωγή VEGF που επάγεται από CoCl

2, υποδεικνύοντας ένα διεγερτικό ρόλο για PGE

2 και ότι η αυτοκρινής επίδραση της PGE

2 εξαρτάται από το είδος των ερεθισμάτων που χρησιμοποιείται.

μέσον Υπέρτονο επάγει ενεργοποίηση αρκετών κινασών ΜΑΡ που μπορεί να εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης του VEGF [24]. Δεδομένου ότι αυτές οι ΜΑΡ κινάσες εμπλέκονται επίσης στην τόνωση cPLA

δραστηριότητα 2-α και η παραγωγή της PGE

2, θα εξαλειφθεί η ανασταλτική δράση της PGE

2 πριν επιχειρήσετε να αναλύσει το ρόλο τους στην παραγωγή VEGF. Caco-2 κύτταρα ενεργοποιούνται από υπέρτονο μέσο παρουσία του NS-398 δείχνουν σαφώς μια σημαντική εξάρτηση από την ρ38 και λιγότερο ούτω καθεξής ERK 1/2 για να παράγουν VEGF. CoCl

2 επαγόμενη παραγωγή VEGF από τα κύτταρα Caco-2 έδειξε παρόμοια προφίλ ευαισθησία σε ΜΑΡ αναστολείς κινάσης με εξαίρεση μια αξιοσημείωτη μείωση από τον αναστολέα JNK. Οι διακριτούς ρόλους για μονοπατιού ΙΝΚ δείχνουν ότι οι διαφορές σε υπέρτονο μέσο και CoCl

2-επαγόμενη παραγωγή του VEGF υπερβαίνουν ευαισθησία σε αυτοκρινή ανασταλτικές επιδράσεις της PGE

2. Αυτή τη στιγμή είναι υπό διερεύνηση αν οι διαφορές αυτές σηματοδότησης μπορεί να είναι υπεύθυνη για τις ξεχωριστές επιδράσεις της PGE

2 για κάθε είδος των ερεθισμάτων.

Ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του σημερινού μοντέλου για την ρύθμιση της αγγειογένεσης στον όγκο μάζα, ιδιαίτερα στον καρκίνο του παχέος εντέρου, είναι η ρύθμιση της λειτουργίας των ενδοθηλιακών κυττάρων από τα καρκινικά κύτταρα. Κατά συνέπεια, ο ρόλος της PGE

2 σε αγγειογένεση περιορίζεται σε ένα αυτοκρινή διέγερση της παραγωγής προ-αγγειογόνοι παράγοντες από το κύτταρο του όγκου. Αν και ενδιαφέρον, το μοντέλο αυτό δεν περιλαμβάνει τα πιθανά εξωτερικά ερεθίσματα που εμπλέκονται στην έκφραση COX-2 και VEGF παραγωγή ούτε καταστάσεις όπου το κύτταρο που εκφράζει COX-2 και την παραγωγή PGE

2 είναι άλλο από το καρκινικό κύτταρο. Για παράδειγμα, έκτοπη ανάπτυξη των HCT116 και ΗΤ29, κύτταρα που δεν εκφράζουν COX-2 ή παράγουν PGE

2, εξαρτάται από την έκφραση της COX-2 από τα ενδοθηλιακά και στρωματικά κύτταρα [44]. έκφραση COX-2 σε μοντέλα ποντικών με οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση,

Min

[33], [44] και APC

Δ716 [45] ποντίκια, περιορίζεται σε στρωματικά και διάμεσα κύτταρα. Οι διαφορές στην εξάρτηση JNK και αυτοκρινείς PGE

2 ανασταλτική επίδραση στην παραγωγή του VEGF από την ίδια κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου είναι μια σαφής ένδειξη για το πώς το μοντέλο πρέπει επίσης να λάβει υπόψη το γεγονός ότι τα κύτταρα αυτά εκτίθενται σε διαφορετικές μικροπεριβάλλον ερεθίσματα.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ Karen A. Bell για τις παρατηρήσεις της σχετικά με το χειρόγραφο.