Αφηρημένο

Ο ρόλος του miR-26a στα καρκινικά κύτταρα φάνηκε αμφιλεγόμενη σε προηγούμενες μελέτες. Μέχρι τώρα, ο ρόλος του miR-26a σε καρκίνο του στομάχου παραμένει απροσδιόριστη. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι miR-26a έντονα προς τα κάτω σε γαστρικό καρκίνο (GC) σε ιστούς και κυτταρικές γραμμές, και τα επίπεδα έκφρασης του συσχετίστηκαν με λεμφαδένα μετάσταση και το κλινικό στάδιο, όπως επίσης και τη συνολική επιβίωση και replase επιβίωση χωρίς του GC . Βρήκαμε επίσης ότι η έκτοπη έκφραση του miR-26a ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων GC και μετάσταση GC

in vitro

και

in vivo

. Έχουμε ακόμη εντοπιστεί ένα νέο μηχανισμό miR-26a για να καταστείλει την ανάπτυξη GC και μετάσταση. FGF9 αποδείχθηκε ότι είναι ένας άμεσος στόχος του miR-26a, χρησιμοποιώντας λουσιφεράσης δοκιμασία και κηλίδα western. FGF9 υπερέκφραση σε miR-26a-κύτταρα που εκφράζουν μπορούσε να διασώσει την εισβολή και την ανάπτυξη ελαττωμάτων του miR-26a. Επιπλέον, η έκφραση του miR-26a αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα πρωτεΐνης FGF9 με CG. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι λειτουργίες miR-26a ως καταστολέας των όγκων στην ανάπτυξη GC και εξέλιξης, και κρατά την υπόσχεση ως προγνωστικό βιοδείκτη και πιθανό θεραπευτικό στόχο για τη GC

Παράθεση:. Deng Μ, Tang εκατόλιτρο, Lu Xh, Liu μου, Lu Xm, Gu Yx, et al. (2013) miR-26a καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων και μεταστάσεων από Στόχευση FGF9 σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10.1371 /journal.pone.0072662

Επεξεργαστής: Η Sunny Sun, Ινστιτούτο Μοριακής Ιατρικής, Ταϊβάν

Ελήφθη: 29 του Μάρτη του 2013? Αποδεκτές: 12, Ιούλη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Nature Scientific Ίδρυμα της Κίνας (81101526, 31100936) και Guangzhou College Ίδρυμα Έναρξη Γιατρός Ιατρική (2012C11). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

miRNAs είναι ενδογενώς εκφράζονται, μικρά RNAs μη κωδικοποιητική που ρυθμίζουν αρνητικά την έκφραση του γονιδίου προκαλώντας αποικοδόμηση των mRNA στόχου, η αναστολή της μετάφρασης αυτών των mRNAs ή και των δύο [1]. miRNAs λάβει μέρος σε κρίσιμη κυτταρικές διαδικασίες όπως η αντίδραση στο στρες, την ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό [2]. Η αλλαγμένη έκφραση miRNA έχει αναφερθεί σε πολυάριθμες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του μαστού [3], [4], του πνεύμονα [5], το ήπαρ [6], το στομάχι [7], του παχέος εντέρου [8], τον εγκέφαλο [9], λευχαιμία [10], και λέμφωμα [11]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν καταδείξει ότι miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή καταστολείς όγκων, και είναι συχνά απορυθμίζεται σε όγκους [12], [13]. Από αυτή την άποψη, ογκογόνο miRNAs συχνά ρυθμίζεται προς τα πάνω, ενώ τα miRNAs καταστολής όγκου κατιούσα ρύθμιση σε όγκους. Για παράδειγμα, ας-7 έχει αναφερθεί να υποεκφράζεται στον καρκίνο του πνεύμονα και να στοχεύσει την ογκογόνο Ras [14], [15]. Αναφέραμε προηγουμένως ότι miR-216b είναι έντονα προς τα κάτω σε ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα και εξασθενεί την ανάπτυξη του όγκου μέσω στόχευσης KRAS [16]. Σε αντίθεση, το ογκογόνο miR-17-92 σύμπλεγμα miRNAs είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω στην ποικιλία των όγκων [17], και εκτελείται έκφραση αυτών των miRNAs στην καλά-μελετημένη Εμ-myc μοντέλο διαγονιδιακού ποντικού της Β λεμφώματος κυττάρων επιταχύνει δραματικά έναρξη και την εξέλιξη της νόσου [18]. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-26a σε καρκινικά κύτταρα φάνηκε αμφιλεγόμενη, καθώς είναι ένας καταστολέας όγκων σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [19], του καρκίνου του μαστού [20] και το ρινοφαρυγγικό καρκίνωμα [21], [22], αλλά είναι ένα ογκογονίδιο σε γλοίωμα [23 ] και χολαγγειοκαρκίνωμα [24]. Μέχρι τώρα, ο ρόλος του miR-26 σε καρκίνο του στομάχου ήταν ακαθόριστη.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση του miR-26a σε 40 ζεύγη φυσιολογικό και GC δείγματα από ποσοτική RT-PCR ανάλυση (qRT-PCR) . miR-26a βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω έντονα σε ιστούς GC σε σχέση με εκείνη των γειτονικών κανονικών ιστών του στομάχου. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με in situ υβριδισμό σε μικροσυστοιχίες ιστού που αποτελείται από 126 περιπτώσεις των ιστών GC και 41 περιπτώσεις παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Επιπλέον, μειωμένη miR-26a συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση και θα μπορούσε να προβλέψει ανεξάρτητα συνολική επιβίωση (OS) και replase επιβίωση χωρίς (RFS) στον καρκίνο του στομάχου. Λειτουργικές μελέτες αποκάλυψαν ότι το miR-26a κατέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη GC και μετάσταση στοχεύοντας FGF9.

Αποτελέσματα

miR-26a ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθρώπινο γαστρικό Καρκίνο

Χρησιμοποιώντας ένα qRT-PCR μέθοδος, τα επίπεδα miR-26a ανιχνεύθηκαν σε 40 ζεύγη γαστρικού καρκινικούς ιστούς και συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς τους, καθώς επίσης και γαστρικό κυτταρικές γραμμές. Μεταξύ των 40 ασθενών με καρκίνο του στομάχου, περίπου το 70% (28 από τους 40 ασθενείς) των όγκων αποκάλυψε μια περισσότερο από δύο φορές μείωση των επιπέδων miR-26a, με ένα 5,76-πλάσια μείωση σε σχέση με το παρακείμενο φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση του miR -26a ήταν ένα συχνό γεγονός στην ανθρώπινη GC (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, η έκφραση του miR-26a μειώθηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (ΜΚΝ-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, ΜΚΝ-45, και BGC-823) σε σύγκριση με το μη κακοήθη γαστρική κυτταρική γραμμή GES-1 (Σχήμα 1Β). Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που αφορούν τον βιολογικό ρόλο του miR-26a σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινογένεση, χρησιμοποιήσαμε in situ υβριδισμού για να αξιολογήσει την έκφραση του miR-26a σε 126 ΔΘ και 41 μη καρκινικούς ιστούς σε ιστικές μικροσυστοιχίες (TMAs). Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι οι βαθμολογίες έκφραση του miR-26a ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με GCs φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 1 C). Στη συνέχεια, θα καθορίσει την πιθανή κλινικοπαθολογοανατομικών επιπτώσεις των αλλοιωμένη έκφραση του miR-26a. Κλινικά δείγματα χωρίστηκαν σε χαμηλή έκφραση και ομάδες υψηλού έκφρασης με βάση τα αποτελέσματα της έκφρασης του miR-26a μεγαλύτερη ή μικρότερη από τη μέση. Σε συμφωνία με τα παραπάνω δεδομένα, εκτός από 41 στο σύνολο κανονικών δειγμάτων στο στομάχι, 35 (85%) είχαν υψηλή έκφραση του miR-26a. Αντίθετα, το 60% (76 από 126) των δειγμάτων γαστρικού καρκινώματος είχε χαμηλή έως αρνητική έκφραση του miR-26a. Από τα 126 άτομα με GC, 38 ήταν αρνητικά για μετάσταση λεμφαδένα, και το 45% αυτών των ασθενών είχε χαμηλή προς αρνητική έκφραση του miR-26a (Πίνακας 1). Ογδόντα οκτώ ασθενείς ήταν θετικοί για μετάσταση λεμφαδένα, και 67% από αυτούς έδειξαν αρνητική ρύθμιση ή την απώλεια της miR-26a (Πίνακας 1). Επιπλέον, βρήκαμε χαμηλή έκφραση του miR-26a σε 37% και 77% των γαστρικών όγκων που ταξινομούνται ως σταδίου Ι /ΙΙ και το στάδιο III /IV, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Ως εκ τούτου, η έκφραση του miR-26a συσχετίζεται αντιστρόφως με μετάσταση λεμφαδένα και κλινικό στάδιο (

P

= 0.019 και

P

& lt? 0.001, αντίστοιχα). Ωστόσο, miR-26a δεν συσχετίζεται με την ηλικία, το φύλο, την κυτταρική διαφοροποίηση, ή το βάθος εισβολή (στάδιο Τ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο miR-26α μπορεί να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην μετάσταση GC και εξέλιξης.

(Α) miR-26a ανιχνεύθηκε σε 40 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο με qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως log2 της πτυχής αλλαγή στο γαστρικό καρκίνο ιστούς (όγκος) σε σχέση με παρακείμενα φυσιολογικούς ιστούς (κανονική). (Β) σχετική έκφραση του miR-26a σε 6 κυτταρικές γραμμές που προέρχονται από καρκίνο του στομάχου και μία μη κακοήθη γαστρικού κυτταρική γραμμή (GES-1) προσδιορίσθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως log2 της πτυχής αλλαγή σε κυτταρικές σειρές GC σε σχέση με GES-1. (C) έκφραση miR-26a αναλύθηκε σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς (Normal) και GCs (Tumor) δείγματα για τις μικροσυστοιχίες ιστού με in situ υβριδισμό. Οι βαθμολογίες έκφραση εμφανίζεται ως οικόπεδα κουτί. Αντιπροσωπευτικά εικόνες της έκφρασης miR-26a με in situ υβριδισμού φαίνονται. Αρχική μεγέθυνση: × 200. (D) Επιβίωση ανάλυση GC. καμπύλες OS και RFS για 126 ασθενείς GC με υψηλή ή χαμηλή έκφραση του miR-26a είχαν κατασκευασθεί με την μέθοδο Kaplan-Meier και αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank.

Η

Μειωμένη miR-26a Correlates με κακή κλινική πρόγνωση

Για να αναλυθεί περαιτέρω η σημασία του miR-26a όσον αφορά την κλινική πρόγνωση, ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier διεξήχθη χρησιμοποιώντας τον ασθενή συνολική επιβίωση και ελεύθερη υποτροπής επιβίωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση του miR-26a είχαν μικρότερη διάμεση OS και RFS από ό, τι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του miR-26a (21,6 μήνες έναντι 39,0 μηνών,

P

& lt? 0.001 για το OS? 15,2 μήνες έναντι . 31,6 μήνες,

P

= 0,002 για την RFS? Σχήμα 1D). Χρησιμοποιήσαμε Cox αναλογικών κινδύνων παλινδρόμηση για να αξιολογηθεί περαιτέρω η συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση του miR-26a και την πρόγνωση. Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες, το στάδιο TNM, και τα επίπεδα του miR-26a είχαν σημαντικά σχετίζονται με το λειτουργικό σύστημα και RFS (Πίνακας 2, 3). Το τελικό μοντέλο πολλών μεταβλητών έδειξε ότι το συνολικό χρόνο επιβίωσης εξαρτάται σημαντικά από την μετάσταση λεμφαδένα, το στάδιο TNM, και τα επίπεδα miR-26a (Πίνακας 2), και ελεύθερη υποτροπής χρόνο επιβίωσης έκαναν επί λεμφαδένα μετάσταση και τα επίπεδα miR-26a (Πίνακας 3).

η

miR-26a Καταστέλλει GC ανάπτυξη και η μετάσταση

Σημειώνοντας την αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του miR-26a και μετάσταση, διερευνήθηκε η επίδραση των miR-26a επανέκφραση σε η μετανάστευση και ο εισβολή ικανότητες των κυτταρικών σειρών GC. Δύο κυτταρικές σειρές GC (SGC-7901 και AGS) με σχετικά χαμηλή βασική έκφραση του miR-26a (Εικόνα 1Β) μολύνθηκαν είτε με miR-26a ή φακοϊού ελέγχου και επιλέγονται με 5 mg /l πουρομυκίνης για δύο εβδομάδες. Στη συνέχεια, επούλωσης πληγών δοκιμασία και δοκιμασία Transwell διεξήχθησαν. Όπως ήταν αναμενόμενο, η υπερέκφραση του miR-26a κατέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων και τις ικανότητες εισβολής (Σχήμα 2Α, Β? Σχήμα S1).

(Α, Β) Το τραύμα δοκιμασίας (Α) και δοκιμασία εισβολής (Β) του επούλωσης SGC-7901 και AGS κύτταρα μολυσμένα με miR-26a ή αγωνίζομαι φακοϊό. Η δοκιμασία εισβολή μετρήθηκε μέσω δοκιμασιών Transwell με Matrigel. (Γ) Η αύξηση της ΓΓΕ-7901 και AGS κύτταρα μολυσμένα με miR-26a ή αγωνίζομαι φακοϊό αναλύθηκε. δοκιμασίες (Δ) την ανάπτυξη αποικιών σε μαλακό άγαρ διεξήχθησαν στις ΓΓΕ-7901 με υπερέκφραση του miR-26a ή αγωνίζομαι. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των προσδιορισμών εμφανίζονται (αριστερό πάνελ). Αρχική μεγέθυνση: × 200. (Ε) Η υπερέκφραση του miR-26a επάγει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. SGC-7901 κύτταρα μολύνθηκαν με miR-26a ή αγωνίζομαι φακοϊό. Τα αποπτωτικά κύτταρα εκτιμήθηκαν με Annexin V-FITC και ιωδιούχου προπιδίου χρώση και αναλύθηκαν με FACS. Όλα τα δεδομένα είναι presented.as μέση τιμή ± s.e.m από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

Για να καταδειχθεί η επίδραση του miR-26a στην ανάπτυξη GC, πραγματοποιήσαμε GC δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού έδειξαν ότι η έκτοπη έκφραση του miR-26a σε SGC-7901 και AGS εξασθενημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2C). Επιπλέον, έκτοπη έκφραση του miR-26a ανέστειλε την ικανότητα σχηματισμού αποικιών σε μαλακό άγαρ (Εικόνα 2D). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση των κυττάρων απόπτωσης και αποκάλυψε ότι miR-26a υπερέκφραση στη ΓΓΕ-7901 απόπτωση που επάγεται κυττάρων (Σχήμα 2Ε).

Στη συνέχεια, ελέγξαμε αν miR-26a θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στην ογκογένεση με τη χρήση γυμνών ξενομοσχεύματος ποντικού μοντέλα. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR-26a σε SGC-7901 κύτταρα σημαντικά κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνούς ποντικούς (Σχήμα 3Α? Σχήμα S2). Στη συνέχεια, SGC-7901 κύτταρα μολυσμένα με είτε miR-26a ή ελέγχου lentivirsus ενέθηκαν στην φλέβα ουράς γυμνών ποντικών για να εξετάσει μετάσταση πνεύμονα. Όπως φαίνεται Σχήμα 3Β, ένας σημαντικά χαμηλότερο αριθμό μακροσκοπικών πνευμονικών μεταστάσεων θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε miR-26a κύτταρα που υπερεκφράζουν από κύτταρα ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-26a μπορεί να καταστέλλουν την ανάπτυξη και τη μετάσταση GC.

(Α) Η ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. SGC-7901 κύτταρα μολυσμένα με miR-26a ή αγωνίζομαι φακοϊού ενέθηκαν υποδορίως σε γυμνά ποντίκια. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 5 ημέρες. Μετά από 30 ημέρες, τα ποντίκια θανατώθηκαν, νεκροψίες πραγματοποιήθηκαν, και οι όγκοι ζυγίζονται. (Β) μετάστασης όγκου σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού. SGC-7901 κυττάρων με υπερέκφραση του miR-26a ή σκαρφάλωμα ενέθηκαν στην φλέβα ουράς γυμνών ποντικών. Μετά από 45 ημέρες, τα ποντίκια θανατώθηκαν. μικρομεταστάσεων στον πνεύμονα ανά HE-βάφονται τμήμα σε μεμονωμένους ποντικούς υπολογίστηκαν. Κάθε ομάδα είχε έξι ποντικούς. Αρχική μεγέθυνση, × 100? κλίμακα bar: 50 μm. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM

Η

miR-26a Άμεσα στόχους και Αναστέλλει FGF9

Για να καταλάβουμε πώς miR-26a καταστέλλει την ανάπτυξη GC και μετάσταση, χρησιμοποιήσαμε τρεις αλγόριθμοι (Targetscan, Pictar και Μιράντα) για να βοηθήσει στον εντοπισμό των στόχων miR-26a σε ανθρώπινο γαστρικών καρκίνων. Από αυτά τα γονίδια στόχους που είχαν προβλεφθεί από τις τρεις αλγορίθμους (Πίνακας S1), FGF9 προσέλκυσε την προσοχή μας αμέσως, καθώς έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση ή μετάσταση [26] – [28]. Εμείς κλωνοποιήθηκε το πλήρους μήκους FGF9 3′-UTR σε έναν φορέα αναφοράς λουσιφεράσης. δοκιμασία λουσιφεράσης αποκάλυψε ότι miR-26a συνδέεται άμεσα με FGF9 3′-UTR, και με την οποία μειώνεται αξιοσημείωτα δραστηριότητες λουσιφεράσης (Σχήμα 4Α). Ωστόσο, η μετάλλαξη των υποθετικές θέσεις miR-26a στην 3′-UTR του FGF9 κατήργησε λουσιφεράσης αποκρισιμότητα σε miR-26a (Σχήμα 4Α). Για να αξιολογηθεί άμεσα την επίδραση του miR-26a επί της έκφρασης FGF9, εκτελέσαμε ανάλυση κηλίδος western. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Β, που προκαλείται λεντοϊού έκτοπη miR-26a κατέστειλε σημαντικά τα επίπεδα της πρωτεΐνης FGF9 σε SCG-7901 και AGS κύτταρα. Επιπλέον, knockdown του miR-26a, μέσα από την επιμόλυνση των αντι-miR-26a, σε GES-1 κύτταρα αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης FGF9 (Σχήμα 4Β? Σχήμα S1). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι FGF9 είναι μια άμεση κατάντη στόχο για miR-26a σε κύτταρα GC. Τα παραπάνω αποτελέσματα μας ώθησε να εξετάσει κατά πόσον miR-26a καταστέλλει την ανάπτυξη GC και μετάσταση μέσω καταστολή της έκφρασης FGF9. Για το σκοπό αυτό, FGF9 επανα-εκφράζεται σε miR-26a-επιμολυσμένα SGC-7901 κύτταρα. Σε miR-26a-εκφράζοντα κύτταρα, εκ νέου έκφραση του FGF9 διασωθεί η εισβολή και την ανάπτυξη ελαττωμάτων του miR-26a (Σχήμα 4C, D, E). Τέλος, εξετάσαμε αν η έκφραση του miR-26a συσχετίζονται με τα επίπεδα της πρωτεΐνης FGF9 στο GC. Υπήρχε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της πρωτεΐνης FGF9, που υποδεικνύεται με χρώση ανοσοϊστοχημείας, και η έκφραση του miR-26a εκτιμήθηκε με in situ υβριδισμό σε 126 ιστούς GC επί TMAs όπως χρησιμοποιείται παραπάνω (Σχήμα 4F? Figure1C). Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι το miR-26a έχει ιδιότητες συνάδουν με τη λειτουργία καταστολής όγκου. Η ικανότητα να ρυθμίζουν επίπεδα FGF9 θα μπορούσε να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, γιατί miR-26a μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη και τη μετάσταση GC.

(Α) Το στοιχείο 3′-UTR του FGF9 αγγελιοφόρου RNA είναι μερικώς συμπληρωματικό προς ΜΙΚ 26α. miR-26a ή ελέγχου σκαρφάλωμα και αναφοράς λουσιφεράσης που περιέχει είτε ένα άγριου τύπου ή μια μεταλλαγμένη 3′-UTR συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ. Και μια λουσιφεράσης Renilla εκφράζοντας κατασκεύασμα ασκεί ως εσωτερικού ελέγχου. (Β) ανάλυση Western blot της έκφρασης FGF9 στη ΓΓΕ-7901 και AGS κύτταρα μολυσμένα με miR-26a, και GES-1 επιμολυσμένα με αναστολείς miR-26a (Anti-miR-26a). (C, D, E) FGF9 καταργεί τις κατασταλτικές ρόλους του miR-26a σε εισβολή GC κυττάρων και την ανάπτυξη. SGC-7901 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά miR-26a ή αγωνίζομαι είχαν επιμολύνει με ή χωρίς πλασμίδια FGF9. δοκιμασίες Εισβολή (C), ανάλυση απόπτωση (D), και η ανάλυση κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Ε) πραγματοποιήθηκαν με τους παραπάνω κύτταρα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.e.m από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. διασποράς συσχέτιση οικόπεδο (F) Spearman των επιπέδων του miR-26a (προσδιορίζεται με in situ υβριδοποίηση) και πρωτεΐνες FGF9 (προσδιορίζεται με ανοσοϊστοχημεία) σε 126 δείγματα GC. Αντιπροσωπευτικά εικόνες της έκφρασης FGF9 με ανοσοϊστοχημεία εμφανίζονται (δεξιά πλευρά). Αρχική μεγέθυνση:. × 200

Η

Συζήτηση

miR-26a ανήκει στην οικογένεια miR-26, το οποίο περιέχει ένα άλλο μέλος miR-26b, δύο εκ των οποίων ίδια αλληλουχία σπίτι με την εξαίρεση 2 διαφορετικά νουκλεοτίδια στην ώριμη miRNAs. miR-26a είναι ένα λειτουργικό miRNA που άξιζαν προηγούμενη έρευνα [29]. Είναι γνωστό ότι miR-26a παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, την εξέλιξη και την διαφοροποίηση των κυττάρων διαφορετικών ιστών [29]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση miR-26α διαταραγμένο σε ένα αριθμό ανθρώπινων όγκων [19], [22], [24], [30], [31]. Ωστόσο, καμία από αυτές τις μελέτες σχετίζεται με καρκίνο του στομάχου. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε qRT-PCR και ISH για να δείξει ότι τα επίπεδα miR-26a σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς ήταν σημαντικά χαμηλότερες από αυτές του μη καρκινικούς ιστούς. Επιπλέον, τα επίπεδα miR-26a συνδέθηκαν με το κλινικό στάδιο και παρουσία μεταστάσεων λεμφαδένα. Kaplan-Meier ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι οι ασθενείς των οποίων οι πρωτογενείς όγκους που εμφανίζονται χαμηλή έκφραση του miR-26a είχαν μικρότερη OS και RFS σε GC. Επιπλέον, η ανάλυση Cox αναλογικών κινδύνων παλινδρόμησης έδειξε ότι η μειωμένη miR-26a σε όγκους ήταν ένας ισχυρός και ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας της μικρότερης OS και RFS. Με βάση τα στοιχεία συστοιχίας, είχε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ένας συνδυασμός πολλών miRNAs μπορεί να είναι χρήσιμα ως προγνωστικοί δείκτες σε γαστρικό καρκίνο [32], [33]. Επιπλέον, ένα ενιαίο-miRNA, όπως miR-218, μπορεί να είναι ένας προγνωστικός δείκτης [34]. Ωστόσο, αυτές οι miRNAs έχουν διερευνηθεί σε λίγες μόνο ασθενείς με γαστρικό καρκίνο. Εδώ, miR-26a μπορεί να είναι χρήσιμη ως προγνωστικό δείκτη για την πρόβλεψη της επιβίωσης και υποτροπής σε γαστρικό καρκίνο.

Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-26a σε κύτταρα GC εξασθενημένη μετανάστευση, εισβολή, πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη αποικίας ως καθώς και επαγόμενη απόπτωση. Επιπλέον, in vivo δεδομένα κατέδειξαν miR-26a ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση. Αυτά in vitro και in vivo δεδομένα κατέδειξαν περαιτέρω ότι λειτουργίες miR-26a ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του στομάχου. Αρκετές μελέτες υποστηρίζουν τα αποτελέσματα μας. Για παράδειγμα, αυτό miRNA μειώνεται σε ιστούς NPC και μπορεί να μετριάσει την ανάπτυξη των κυττάρων και ογκογένεση με τη στόχευση ΕΖΗ2 [22]. Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα παρουσιάζει επίσης μειωμένη έκφραση του miR-26a [19]. Η συστηματική χορήγηση της παρούσας miRNA σε ένα μοντέλο ποντικού χρησιμοποιώντας ένα HCC αδενο-σχετιζόμενος ιός (AAV) οδηγεί σε αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, διέγερση όγκο-ειδικών απόπτωση, και δραματική προστασία από την εξέλιξη της νόσου χωρίς τοξικότητα [35]. Ωστόσο, διάφορες πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν την ογκογόνο ρόλο του miR-26a σε όγκους όπως γλοίωμα και χολαγγειοκαρκίνωμα. Huse et al. ανέφερε ότι το miR-26a ήταν υπερεκφράζεται σε υψηλής ποιότητας γλοίωμα και άμεσα στοχευμένες ΡΤΕΝ [23]. Παρομοίως, miR-26a βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους ιστούς χολαγγειοκαρκίνωμα και να προωθήσει την ανάπτυξη χολαγγειοκαρκίνωμα με την ενεργοποίηση Β-κατενίνης [24]. Αυτά τα αμφιλεγόμενα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ρόλος του miR-26a ήταν ενδεχομένως ορισμένων ειδικών όγκων και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τους στόχους της σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι η ΡΤΕΝ [23], ΕΖΗ2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 και κυκλίνη Ε1 [37] είναι εν δυνάμει γονίδια προς τα κάτω στόχος του miR-26a. Σε αυτή τη μελέτη, FGF9, ένα νέο άμεσο και λειτουργικό στόχο της miR-26a, εντοπίστηκε σε GC. FGF9, επίσης γνωστή ως νευρογλοιακά παράγοντας ενεργοποίησης, είναι ένα από τα 23 μέλη της εντόνως διατηρημένη οικογένεια FGF. Ως εκκρινόμενη, γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη 26-kDa, έχει μιτογονικά αποτελέσματα σε μια ποικιλία διαφορετικών τύπων κυττάρων [26]. FGF9 έχει δειχθεί να εμπλέκονται σε διαφορετικές μορφές καρκίνου όπως ενδομητριοειδές αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών [26], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [27] και το καρκίνωμα του προστάτη [28]. Στις μελέτες μας, επιβεβαιώσαμε ότι FGF9 ήταν ένα άμεσο στόχο του miR-26a στα κύτταρα GC. Για να προσδιορίσετε αν το miR-26a καταστέλλει την ανάπτυξη GC και μετάσταση μέσω καταστολή της έκφρασης FGF9, βρήκαμε ότι FGF9 υπερέκφραση θα μπορούσε να σώσει την εισβολή και την ανάπτυξη ελαττωμάτων του miR-26a. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-26a αναστέλλει την ανάπτυξη GC και μετάσταση εν μέρει με τη στόχευση FGF9.

Στο σύνολό τους, παρατηρήσαμε ρύθμιση προς τα κάτω του miR-26a στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και απέδειξαν ότι miR-26a μπορεί να ενεργεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης OS και RFS. Βρήκαμε επίσης ότι το miR-26a διαθέτει την ικανότητα να καταστέλλουν την ανάπτυξη GC και τη μετάσταση με τη ρύθμιση FGF9. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν λειτουργίες miR-26a ως καταστολέας των όγκων σε GC και κρατά την υπόσχεση ως προγνωστικό βιοδείκτη και πιθανό θεραπευτικό στόχο για τη GC.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

η γαστρική επιθηλιακή κυτταρική σειρά GES-1 αγοράστηκε από το Ινστιτούτο του Πεκίνου για την Έρευνα του Καρκίνου (Πεκίνο, Κίνα). Οι κυτταρικές σειρές GC ΜΚΝ-28, ΓΓΕ-7901, AGS, MGC-803, ΜΚΝ-45, και BGC-823 ελήφθησαν από την Κινεζική Ακαδημία Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα). Αυτά τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, ΜΚΝ-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) ή F12 ( AGS) μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (Gibco BRL, ΝΥ, USA). Όλες οι επιμολύνσεις που χρησιμοποιούνται Λιποφεκταμίνης 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, USA)).

Κλινικά δείγματα

Όλα τα δείγματα ιστών που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη συλλέχθηκαν από το Χουνάν επαρχιακού Όγκων Νοσοκομείο (Changsha, Hunan, Κίνα). Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Guangzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο Αρχή Υγείας. Η συλλογή και η χρήση ιστών ακολούθησε τις διαδικασίες που είναι σύμφωνα με τα πρότυπα ηθικής δεοντολογίας όπως διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι

Τα δείγματα ιστών από 40 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (23 άνδρες και 17 θηλυκά?. Διάμεση ηλικία 59 χρόνων? Εύρος 40-84 χρόνια) χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση (qRT-PCR). Εκτομή καρκινικούς ιστούς (όγκος) και αντιστοιχισμένο συμφωνημένα φυσιολογικό γαστρικό ιστούς (Normal) κόπηκαν αμέσως, καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του RNA.

Οι μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs), που αποτελείται από 126 ΔΘ και 41 παρακείμενων φυσιολογικών ιστών στομάχου, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση υβριδισμού επί τόπου. Η μέση ηλικία των ασθενών με γαστρικό καρκίνο κατά τη διάγνωση ήταν 57 έτη (εύρος 31-82). Ο μέσος χρόνος παρακολούθησης για τη συνολική επιβίωση (OS) και ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (RFS) ήταν 22 μήνες και 15 μήνες, αντίστοιχα. Όλα τα δεδομένα από 126 δείγματα GC, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, του φύλου, θέση του όγκου, η ιστολογική ποιότητα, το βάθος εισβολή (στάδιο Τ), το κλινικό στάδιο, και μετάσταση λεμφαδένα ελήφθησαν από κλινικές και παθολογικές αρχεία και συνοψίζονται στον συμπληρωματικό πίνακα 2.

Ποσοτική RT-PCR Ανάλυση

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, USA). Αντίστροφη μεταγραφή και αντιδράσεις qRT-PCR διεξήχθησαν με τη χρήση ενός qSYBR-πράσινο κιτ PCR (Qiagen, Germantown, USA) και U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε σαν ένα ενδογενές ελέγχου. Διπλώστε αλλαγή προσδιορίστηκε ως 2

-ddCt. Η Ct είναι ο αριθμός κλασματική κύκλος στον οποίο ο φθορισμός κάθε δείγματος περνά το σταθερό κατώφλι. Η ddCt υπολογίστηκε με αφαίρεση της dCt του δείγματος αναφοράς (ιστός ζεύγη μη-όγκου για τη χειρουργική δειγμάτων και GES-1 κυττάρων επί έξι κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου) από το DCT της κάθε δείγμα. Οι αλληλουχίες των ειδικών εκκινητών για miR-26a και U6 snRNA ήταν 5′-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 ‘και 5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’, αντίστοιχα.

In situ υβριδισμός

και ανοσοϊστοχημεία

Ανίχνευση miR-26a με in situ υβριδισμό χρησιμοποιώντας το DIG-επισημασμένο κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA) -με βάση ανιχνευτή ειδικό για miR-26a (Exiqon, Vedbaek, Denmark) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Brie fl y, πλακίδια μικροσυστοιχιών ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ (5 λεπτά σε 2 μg /ml πρωτεάσης Κ), πλύθηκαν σε PBS και στη συνέχεια μπλοκάρει ενδογενή δραστηριότητα υπεροξειδάσης με 3% Η

2O

2. Ο υβριδισμός διεξήχθη στους 52 ° C όλη τη νύκτα μετά την προσθήκη 50 ηΜ DIG-σημασμένων ανιχνευτών LNA, ακολουθούμενο από πλύση αυστηρότητας σε SSC ρυθμιστικά. Μετά από αποκλεισμό (2% ορού προβάτου και 2 mg /ml BSA σε PBS με Tween-20) σε θερμοκρασία δωματίου, το συγκρότημα ανιχνευτή-στόχου έγινε ορατό με χρήση ενός αντισώματος αντι-DIG-POD, και σύνθετες DAB.

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε τομές microarray ιστού χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-FGF9 (Santa Cruz, CA, USA). Το συγκρότημα οπτικοποιήθηκε με στρεπταβιδίνη /υπεροξειδάση και πολύπλοκες DAB, και οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. Η in situ υβριδοποίηση και ανοσοϊστοχημεία αποτελέσματα βαθμολογήθηκαν με ένταση (0-4) και το ποσοστό της χρώσης (0 έως 100%). Σχετική έκφραση προκύπτει από τον πολλαπλασιασμό της έντασης από το ποσοστό. Οι διαφάνειες αναλύθηκαν από δύο ανεξάρτητους παθολόγους.

ανασυνδυασμένο φορέα

Η ανασυνδυασμένη φακοϊών που περιέχει πρόδρομο ή αγωνίζομαι ακολουθίες miR-26a είχαν αγοραστεί από SunBio (Σανγκάη, Κίνα). Για την ανάλυση της λουσιφεράσης, το πλήρους μήκους FGF9 3′-UTR ενισχύθηκε από ανθρώπινο αίμα γονιδιωματικό DNA και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός της προς τα κάτω περιοχή ενός πυγολαμπίδας κασέτα λουσιφεράσης σε φορέα λουσιφεράσης pMIR-REPORT (Ambion, Austin, ΤΧ, USA). Οι αντίστοιχες μεταλλαγμένο κατασκευάσματα, στην οποία τα πρώτα έξι νουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς την σπόρο-περιοχή miR-26a είχαν μεταλλαχθεί με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Για την κατασκευή φορέα FGF9 εκφράζουν, FGF9 ORF cDNA αγοράστηκε από την GeneCopeia (Rockville, MD, USA) και υποκλωνοποιήθηκε στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

Luciferase Reporter Assay

miR-26a ή φακοϊούς αγωνίζομαι και του φορέα pMIR-3’UTR ήταν συν-επιμολύνονται σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ. Renilla και λουσιφεράση πυγολαμπίδας δραστηριότητες μετρήθηκαν με το Dual-Luciferase Reporter σύστημα (Promega, Madison, WI) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Firefly δραστικότητα λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκε προς έκφραση λουσιφεράσης Renilla για κάθε δείγμα. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

Western Blot

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, προϊόντα λύσεως πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE, και ηλεκτρο-trophoretically μεταφέρθηκαν σε PVDF (διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου) μεμβράνη. Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάστηκε με αντίσωμα ποντικού έναντι αντι-FGF9 αντίσωμα (Santa Cruz, CA, USA) που ακολουθείται από HRP (ραφανιδική υπεροξειδάση) -επισημασμένο ποντικού κατσίκας-IgG (Santa Cruz, CA, USA) και ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος πρωτεΐνη-φόρτωσης.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Τα κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων σε επιθυμητές συγκεντρώσεις κυττάρων. Οι αριθμοί κυττάρων υπολογίστηκαν με θρυψίνη των κυττάρων και την πραγματοποίηση ανάλυσης χρησιμοποιώντας έναν μετρητή Coulter (Beckman Coulter, Fullerton, USA) στις υποδεικνυόμενες χρονικά σημεία εις τριπλούν.

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

Η κυτταρική μετανάστευση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς επούλωση της πληγής. Ένα τεχνητό «πληγή» δημιουργήθηκε σε μια συρρέουσα μονοστοιβάδα κυττάρων, και ελήφθησαν φωτογραφίες χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan) σε 24 ώρες.

Για την δοκιμασία εισβολής των κυττάρων, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί της βασικής μεμβράνης μήτρα που υπάρχει στο ένθετο μιας πλάκας καλλιέργειας των 24 φρεατίων (ΕΚ μήτρα, Chemicon, Temecula, CA) και βόειο εμβρυϊκό ορό προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. Μετά περαιτέρω 48 ώρες, τα μη εισβάλλοντα κύτταρα και μήτρα ΕΚ ήπια απομακρύνθηκαν με ένα βαμβάκι. Διηθητική κύτταρα που βρίσκονται στην κάτω πλευρά του θαλάμου βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, μετρήθηκαν και απεικονιστεί.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

πλάκες έξι φρεατίων καλύφθηκαν με ένα στρώμα από 0,6% άγαρ σε μέσο συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου. Κύτταρα (1 χ 10

4) παρασκευάστηκαν σε 0.3% άγαρ και εμβολιάζονται εις τριπλούν. Μετά οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για δύο εβδομάδες, οι αποικίες μετρήθηκαν.

Η απόπτωση Ανάλυση

Τα αποπτωτικά κύτταρα εκτιμήθηκαν με Annexin V-FITC και χρώση ιωδίου προπιδίου (BD, ΗΠΑ ) και αναλύθηκαν με ένα όργανο FACS Calibur (BD, ΗΠΑ). Τα συλλεχθέντα δεδομένα αναλύθηκαν με χρήση FlowJosoftware.

Ποντίκια μοντέλο ξενομοσχεύματος

Ο γαστρικός καρκίνος μοντέλο σε άτριχα ποντίκια δομήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του miR-26a στο σχηματισμό όγκων, SGC-7901 κύτταρα μολυσμένα με miR-26a ή σκαρφάλωμα ιοί πολλαπλασιάζονται και εμβολιάσθηκαν υποδορίως εντός της ραχιαίας λαγόνες άτριχων ποντικών (5 σε κάθε ομάδα). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 5 ημέρες. Μετά από 30 ημέρες, τα ποντίκια θανατώθηκαν, νεκροψίες πραγματοποιήθηκαν και οι όγκοι ζυγίζονται. Οι όγκοι των όγκων καθορίζονται σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: A × B

2/2, όπου το Α είναι η μεγαλύτερη διάμετρος και το Β είναι η διάμετρος κάθετα προς Α Για να προσδιοριστεί αποτέλεσμα miR-26a για μετάσταση όγκου, SGC-7901 κύτταρα που έχουν μολυνθεί με miR-26a ή σκαρφάλωμα ιοί ενέθηκαν στην φλέβα ουράς γυμνών ποντικών (6 σε κάθε ομάδα). Μετά από 45 ημέρες, διεξήχθησαν νεκροψίες. Οι αριθμοί των μικρομεταστάσεων στον πνεύμονα ανά HE-βάφονται τμήμα σε μεμονωμένους ποντικούς αναλύθηκαν με παρατήρηση μορφολογία. Τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την επιτροπή των ζώων Έρευνας Προστασίας της Guangzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Πρότυπο κατευθύνσεις φροντίδα των ζώων και εργαστηριακές ακολούθησαν.

Στατιστική Ανάλυση

Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν από το

t-

δοκιμής και x

2 τεστ. Συνολικά καμπύλες επιβίωσης και καμπύλες ελεύθεροι υποτροπών χαράχθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier, με τη δοκιμασία log-rank εφαρμόζεται για σύγκριση. Η επιβίωση μετρήθηκε από την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης. Μεταβλητές με τιμή

P

& lt? 0,05 σύμφωνα με την μονοπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν σε μεταγενέστερες πολυπαραγοντική ανάλυση με βάση το μοντέλο αναλογικού κινδύνου του Cox. δοκιμές συσχετισμού Spearman που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της ανά ζεύγη συσχέτιση της έκφρασης μεταξύ των miR-26a και FGF9 στους ιστούς GC. Όλες οι διαφορές ήταν στατιστικά σημαντικές σε επίπεδο

P

≤0.05. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS15.0.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

qRT-PCR μετρήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του miR-26a στη ΓΓΕ-7901 και AGS κύτταρα μολυσμένα με miR-26a lentivirus, καθώς και GES-1 κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολείς miR-26a

doi:. 10.1371 /journal.pone .0072662.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

qRT-PCR μετρήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του miR-26a των καρκινικών ιστών που προέρχονται από γυμνά ποντίκια την 30η ημέρα μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± s.e.m

doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s002

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1. γονίδια

στόχοι που είχαν προβλεφθεί από τους τρεις αλγορίθμους (Targetscan, Pictar και Μιράντα)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s003

(XLS)

Πίνακας S2.

Χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο του στομάχου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s004

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε J Ma και CK Wang για την τεχνική βοήθεια τους.