Αφηρημένο

Ιστορικό

σχηματίζουν οστικές μεταστάσεις είναι μια κοινή και απενεργοποίηση συνέπεια του καρκίνου του προστάτη (ΚΓΠ). Ο πιθανός ρόλος της δραστηριότητας των οστεοκλαστών στην Cap οστικές μεταστάσεις δεν εξηγείται πλήρως. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε

ex vivo

αν η οστεολυτική δραστηριότητα είναι παρούσα και πως αποκλείεται σε ασθενείς καπάκι με μεταστάσεις που σχηματίζουν οστό.

Μεθοδολογία

Σαράντα έξι ασθενείς επηρεάζεται από πρόσφατα διαγνωστεί ΚΓΠ και υγιείς μάρτυρες είχαν εγγραφεί. Κατά τη διάγνωση, 37 ασθενείς είχαν μόνο ένα πρωτογενή όγκο, ενώ 9 είχαν πρωτογενούς όγκου και μεταστάσεων ταυτόχρονη σχηματισμού οστού. Σε όλους τους ασθενείς δεν υπήρχε ένδειξη μετάστασης σε άλλες τοποθεσίες μη οστών. Για όλους τους ασθενείς και τους ελέγχους συλλέξαμε το αίμα και τα δείγματα ούρων. Αξιολογήσαμε την ομοιόσταση των οστών των ασθενών? κάναμε (PBMC) καλλιέργειες περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων αίματος για την ανίχνευση

in vitro

οστεοκλαστογένεσης? εμείς δοσολογούνται έκφραση μορίων που εμπλέκονται στην επαγόμενη από καρκίνο osteoclatogenesis, όπως ΚΑΝΚΕ, OPG, TNF-α, DKK-1 και IL-7 ορό. Από Real-Time PCR, έχουμε ποσοτικά την έκφραση του γονιδίου της IL-7 DKK-1 και για μικρο-ανατομή του όγκου και των τμημάτων τους υγιείς ιστούς.

Κύρια Ευρήματα

μεταστατικό ασθενείς CaP οστών έδειξε διαταραχή του μεταβολισμού των οστών με αυξημένη επαναρρόφηση οστού και σχηματισμός σε σύγκριση με μεταστατικό ασθενείς μη οστών και των υγιών μαρτύρων. Οι καλλιέργειες CaP PBMC έδειξαν μία ενισχυμένη οστεοκλαστογένεση σε μεταστατικούς ασθενείς οστών, λόγω της αύξησης του λόγου RANKL /OPG. Διαπιστώσαμε αυξημένη DKK-1 επίπεδα ορού και ιστών γονιδιακή έκφραση σε ασθενείς σε σύγκριση με τους ελέγχους. IL-7 είχε ως αποτέλεσμα υψηλή περιεκτικότητα σε ορούς των ασθενών, αλλά και την έκφραση του γονιδίου ιστό της ήταν συγκρίσιμη σε ασθενείς και μάρτυρες.

Συμπεράσματα

Δείξαμε

ex vivo

ότι οστεοκλαστογένεσης είναι ενεργός μηχανισμού σε φωλιάσματος του όγκου των οστών που σχηματίζουν μεταστατικό καρκίνο και ότι ορού DKK-1 επίπεδα αυξημένη σε ασθενείς ΚΑΠ, προτείνοντας να ερευνήσει σε βάθος το ρόλο του ως καρκινικός δείκτης

Παράθεση:. Roato Ι, D’Amelio P, Gorassini Ε , Grimaldi Α, Bonello L, Fiori C, et al. (2008) Οι οστεοκλάστες είναι ενεργά στο Bone Σχηματίζοντας μεταστάσεις του καρκίνου του προστάτη ασθενείς. PLoS ONE 3 (11): e3627. doi: 10.1371 /journal.pone.0003627

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30, Σεπτεμβρίου 2008? Αποδεκτές: 15η Οκτωβρίου του 2008? Δημοσιεύθηκε: 3, Νοεμβρίου, 2008

Copyright: © 2008 Roato et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Compagnia di San Paolo και Regione Piemonte (Ricerca Sanitaria Finalizzata 2008)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

προστάτη καρκίνο (ΚΓΠ) είναι η δεύτερη συχνότερη αιτία θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες [1]. Ένα τυπικό χαρακτηριστικό της ΚΓΠ είναι η ικανότητα να metastatize στο κόκκαλο, καθώς πάνω από το 80% των ανδρών που πέθαναν για κάλυμμα αναπτύξει οστικές μεταστάσεις [2]. Η ανάπτυξη της ΚΓΠ στα οστά προωθεί κυρίως οστεοβλαστική βλάβες με υποκείμενη οστεολυτικές περιοχές [1]. Σε φυσιολογικές συνθήκες οστεοκλαστών (OC) και τη δραστηριότητα των οστεοβλαστών είναι καλά ισορροπημένο, αλλά σε παθολογική κατάσταση αυτή η ισορροπία (ομοιόσταση των οστών) διαταράσσεται. Ο ρόλος της ΣΛ σε οστεολυτικές μεταστάσεις έχει αποδειχθεί σαφώς, και έχει προταθεί ότι ΣΛ θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στις οστεοβλαστικές μεταστάσεις, καθώς και. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων CaP, οστεοβλάστες και συνθήκες λειτουργίας υποδεικνύουν ότι οστό τροπισμός θα μπορούσε να προκληθεί από την εξάρτηση του όγκου σε έναν ή περισσότερους οστεοβλαστών /παράγοντες OC-προερχόμενο για την ανάπτυξη και συντήρηση των καρκινικών κυττάρων [3].

προηγουμένως αποδειχθεί ότι οι ασθενείς με οστεολυτικές οστικές μεταστάσεις από διάφορους συμπαγείς όγκους έδειξαν αυξημένη αυθόρμητη οστεοκλαστών, λόγω της αυξημένης απελευθέρωσης Τ κυττάρων προ-osteoclastogenic παράγοντες, όπως TNF-άλφα, IL-7 και RANKL [4]. Ο ρόλος της OPG άξονα /RANKL στο συστατικό οστεολυτικές του Cap-μεσολάβηση οστικές μεταστάσεις έχει διευκρινιστεί [5], ενώ TNF-α και IL-7 πιθανές λειτουργίες σε Cap βλάβες των οστών παραμένουν ασαφείς.

Άλλοι βασικοί παράγοντες στη βιολογία του οστού είναι Wnts, μια οικογένεια μικρών εκκρινόμενων γλυκοπρωτεϊνών, η οποία αναστέλλει τη διαφοροποίηση OC [6], διεγείρει οστεοβλαστογενέσεως και mineralizing δραστηριότητα των οστεοβλαστών [7]. Η δραστηριότητα της οικογένειας WNT ανταγωνίζεται από διάφορους εκκρίνονται παράγοντες όπως dickkopf πρωτεΐνες (DKK). Πρόσφατα στοιχεία που αναφέρθηκαν έκφραση DKK-1 σε μερικές ανθρώπινα δείγματα όγκων, προτείνοντας ότι ένας καρκίνος διαμεσολαβείται διαμόρφωση του WNT δραστηριότητα επηρεάζει το μεταστατικό φαινότυπο [8], [9].

Αυτή η έρευνα διατομής σχεδιάστηκε για να μελετήσει τον τρόπο οστών που σχηματίζουν μεταστάσεις από ΚΓΠ επηρεάζει τον κύκλο εργασιών των οστών, το σχηματισμό OC από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), καθώς και την παραγωγή των osteoclastogenic και αντι-osteoclastogenic παράγοντες σε ασθενείς που πάσχουν από μεταστατικό CaP των οστών.

Σας αναφέρω ένα αυξημένο οστεοκλαστογένεση σε μεταστατικούς ασθενείς CaP οστών, λόγω της αύξησης του δείκτη ορού RANKL /OPG, υποδηλώνοντας ότι η ενισχυμένη σχηματισμός OC διαδραματίζει ενεργό ρόλο σε μεταστάσεις που σχηματίζουν οστό. Διαπιστώσαμε υψηλά επίπεδα και γονιδιακής έκφρασης DKK-1 στον ορό σε ασθενείς με CaP σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες.

Αποτελέσματα

κύκλου εργασιών των οστών αυξάνεται σε μεταστατικούς ασθενείς οστών

Οι δείκτες των οστών κύκλος εργασιών ήταν υψηλότερα σε ασθενείς με μεταστάσεις οστού σε σύγκριση με μεταστατικό ασθενείς μη οστών και των υγιών μαρτύρων (Πίνακας 1). Πιο αναλυτικά, οι ασθενείς ΚΓΠ δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στην οστική πυκνότητα, αλλά είχαν υψηλότερα PTH, BAP, BGP, TRAPC5b και τα επίπεδα διασταυρώσεων από τους υγιείς μάρτυρες. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τη διαταραχή στην ομοιόσταση των οστών με αυξημένη επαναρρόφηση οστού και σχηματισμός σε μεταστατικούς ασθενείς.

Η

οστεοκλαστογένεσης αυξάνεται στο Cap οστικές μεταστάσεις

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον η αύξηση της οστικής απορρόφησης σε μεταστατικό ασθενών οφείλεται στην αύξηση σχηματισμό OC, εξετάσαμε την ικανότητα των

in vitro

PBMCs να διαφοροποιούνται αυθόρμητα σε συνθήκες λειτουργίας σε ασθενείς με ή χωρίς οστικές μεταστάσεις και σε υγιείς μάρτυρες.

η διαφοροποίηση OC καταδείχθηκε με την παρουσία πολυπύρηνων /TRAP θετικά κύτταρα από ασθενή με καρκίνο και υγιείς PBMCs ελέγχου (Σχ. 1Α-C). Όπως έδειξε στο Σχ. 1D ο αριθμός των συνθηκών λειτουργίας ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μεταστατικούς ασθενείς οστών (μέση ± SE, 216,22 ± 39,55) από ό, τι σε ασθενείς χωρίς οστικές μεταστάσεις (112,71 ± 14,76) και σε υγιείς μάρτυρες (73,55 ± 11,69),

ρ

& lt ?. 0.001

TRAP θετικά πολυπύρηνων ταυτοποιήθηκαν ως αντισυλληπτικά χάπια και μετρήθηκαν, και στους δύο ασθενείς και υγιείς μάρτυρες καλλιέργειες, (Α). Ο αριθμός OC σε μεταστατικούς ασθενείς οστών ήταν σημαντικά υψηλότερη από ό, τι στο μεταστατικό ασθενείς μη οστών,

σ

& lt? 0.004 και σε υγιείς μάρτυρες,

σ

& lt?. 0.001 (Β)

αναλογία RANKL /OPG είναι αυξημένη στο μεταστατικό ασθενείς

για να διερευνήσει τους παράγοντες που ευθύνονται για την αυξημένη οστεοκλαστών σε ασθενείς, εμείς δόση τα επίπεδα του TNF-α, RANKL και OPG στον ορό. Τα επίπεδα ΤΝΡ-α στον ορό δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των τριών ομάδων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), ενώ παρατηρήσαμε μια σημαντικά αυξημένη αναλογία RANKL /OPG στην οστική μεταστατική ορούς (19.62 ± 6.52) σε σύγκριση με μη-μεταστατική τους ασθενείς (5,48 ± 2,48) και υγιείς μάρτυρες (6,89 ± 2,6),

σ

& lt?. 0.03

επίπεδο IL-7 ορού είναι αυξημένη σε ασθενείς με καρκίνο

Εμείς μετριέται IL-7 επίπεδα ορού σε ασθενείς και τους ελέγχους. Ορός IL-7 τα επίπεδα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε μεταστατικούς ασθενείς οστών (μέση ± SE, 19,86 ± 2,01 pg /ml) από ό, τι στους υγιείς μάρτυρες (7,07 ± 1,27 pg /ml), ρ & lt? 0.001. Εμείς δόση συγκρίσιμα επίπεδα IL-7 στο μεταστατικό μη οστών (19,75 ± 3,55 pg /ml) και μεταστατικούς ασθενείς οστού (19,86 ± 2,01 pg /ml), (Σχ. 2Α). Αυτό το αποτέλεσμα μας οδήγησε να διερευνήσει κατά πόσον τα καρκινικά κύτταρα ήταν υπεύθυνα για την αύξηση της IL-7 παραγωγή? Ως εκ τούτου, εξετάσαμε την ποσοτική IL-7 έκφραση σε ΚΓΠ και σε υγιείς ιστούς του προστάτη. Τα καρκινικά κύτταρα εξέφρασαν χαμηλά και συγκρίσιμα επίπεδα IL-7 σε ασθενείς και υγιείς μάρτυρες (Εικ. 2Β). Αυτό υποδηλώνει ότι η αυξημένη κυκλοφορούσα IL-7 μπορεί να εξαρτάται από την παραγωγή από το ανοσοποιητικό κύτταρο συστήματος, όπως Τ και Β λεμφοκύτταρα [4].

IL-7 τα επίπεδα του ορού σε ασθενείς με /χωρίς οστικές μεταστάσεις και σε υγιείς μάρτυρες μετρήθηκαν με ELISA. Bone μεταστατικό (

ρ

& lt? 0,01) και μεταστατικούς ασθενείς μη οστών (

ρ

& lt? 0,03) είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IL-7 ορού σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες (Α). CaP και υγιών ιστών αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR, προκειμένου να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση του γονιδίου της IL-7. Η IL-7 κβάντωσης εκφράστηκε ως IL-7 επί β-ακτίνης (το γονίδιο ελέγχου) αριθμός αντιγράφων πλασμιδίου. Το ιστόγραμμα έδειξε συγκρίσιμα επίπεδα έκφρασης της IL-7 στην ΚΓΠ και υγιείς ιστούς.

Η

DKK-1 έκφραση είναι υψηλότερη σε ασθενείς με CaP

Βιβλιογραφικά δεδομένα αναφέρουν ότι DKK-1 εμπλέκεται στα οστά ομοιόσταση [8]. Εμείς δόση DKK-1 επιπέδου στον ορό σε ασθενείς ΚΓΠ και υγιείς μάρτυρες. ασθενείς CaP έδειξαν υψηλότερα επίπεδα DKK-1 από τους υγιείς μάρτυρες,

σ

& lt? 0.004 (Εικ. 3Α). Για να αξιολογηθεί κατά πόσον ή όχι DKK-1 παράγεται από τους ιστούς του καρκίνου, μελετήσαμε την έκφραση της στην ΚΓΠ και υγιείς ιστούς με RQ-PCR. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι CaP ιστού εκφράζονται πολύ πιο DKK-1 από τους υγιείς ιστούς, σ & lt?. 0.001 (Σχ. 3Β)

DKK-1 επίπεδα χορηγήθηκαν σε ασθενείς ορό με /χωρίς οστικές μεταστάσεις και σε υγιείς ελέγχους από ELISA. Οστών μεταστατικό (

σ

& lt? 0.004) και μεταστατικούς ασθενείς μη οστών (

σ

& lt? 0,01) είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα DKK-1 στον ορό σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (Α). ΚΓΠ και υγιείς ιστοί αναλύθηκαν από την Real-Time PCR, προκειμένου να ποσοτικοποιηθεί η έκφραση DKK-1gene. Η κβάντωση DKK-1 εκφράστηκε ως DKK-1 σε β-ακτίνης (το γονίδιο ελέγχου) αριθμός αντιγράφων πλασμιδίου. Το ιστόγραμμα έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης DKK-1 σε Cap από ό, τι στους υγιείς ιστούς,

σ

& lt?. 0.001 (Β)

Η

Συζήτηση

Ο καρκίνος του προστάτη αναπτύσσουν συχνά σχηματίζουν οστικές μεταστάσεις? παρ ‘όλα αυτά ένα γρήγορο οστεολυτική δραστηριότητα είναι παρούσα σε μεταστατικό σύγκριση με τους ασθενείς μη μεταστατικό [10]. Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων CaP προωθεί παρεκκλίνουσα αναδιαμόρφωση των οστών δεν είναι σαφώς καθορισμένες. Η αποκάλυψη του φωλιάσματος όγκων στα οστά, μπορεί να παρέχουν νέα εργαλεία για την έγκαιρη διάγνωση των μεταστάσεων στα οστά και να προτείνει νέες θεραπευτικές αγωγές για τον έλεγχο της εξέλιξης καπάκι. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να διερευνηθεί ο τρόπος με τον οστεολυτικές των οστικών μεταστάσεων επηρεάζει τον κύκλο εργασιών των οστών, το σχηματισμό OC από PBMC, και την παραγωγή osteoclastogenic και αντι-osteoclastogenic παράγοντες σε ασθενείς που πάσχουν από μεταστατικό CaP των οστών.

Στο επιλογή των περιπτώσεων καπάκι, αποφασίσαμε να αποφευχθεί ασθενείς με προχωρημένο μεταστατική νόσο, δεδομένου ότι θεραπευτικές αγωγές θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν προκατάληψη για την ανάλυσή μας. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε μια ανισορροπία μεταξύ του οστού και του αριθμού μη οστών μεταστατικό ασθενών, η οποία εξαρτάται από την παρουσία μιας μικρότερης ποσότητας οστού μεταστατικών σε σύγκριση με ασθενείς με μεταστατικό CaP μη οστών κατά τη διάγνωση [3]. Στην πραγματικότητα, στη φυσική ιστορία της νόσου, μεταστάσεις στα οστά είναι ένα συχνό, αλλά αργά συμβάν [11].

Η οστική ανακύκλωση ενισχύθηκε σε μεταστατικό ασθενείς οστών, ιδίως παρατηρήσαμε τόσο μια αύξηση στο σχηματισμό οστού και δείκτες απορρόφησης. επίπεδο ΡΤΗ αυξήθηκε ελαφρά στην μεταστατική ασθενείς οστού σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες, σύμφωνα με την ικανότητα της παραθορμόνης για την προώθηση της ανάπτυξης και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη στα οστά [12].

Η παρατηρούμενη αύξηση στην επαναρρόφηση οστού και ο προηγουμένως αποδειχθεί αυθόρμητη οστεοκλαστογένεσης σε καρκινοπαθείς με οστεολυτικές μεταστάσεις [13] μας ώθησε να διερευνήσει οστεοκλαστογένεσης από PBMC ασθενών ΚΓΠ

in vitro

. σχηματισμός OC ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με μεταστατικό οστού σε σύγκριση τόσο με μεταστατικό ασθενείς μη οστών και των υγιών μαρτύρων. Για τον εντοπισμό των παραγόντων που ευθύνονται για την αύξηση του σχηματισμού OC, μετρήσαμε τα μόρια εμπλέκονται κυρίως σε οστεοκλαστών, όπως TNF-άλφα, RANKL, OPG, IL-7 και DKK-1. Τα επίπεδα του ΤΝΡ-α στον ορό δεν αυξήθηκαν σημαντικά σε ασθενείς καπάκι, διαφορετικά από άλλους μεταστατικούς όγκους των οστών, όπου ΤΝΡ-άλφα παίζει σημαντικό ρόλο στην οστεοκλαστογένεση [14]. Διαφορετικά, η αναλογία RANKL /OPG ήταν υψηλότερη σε μεταστατικούς ασθενείς οστών, εξηγώντας την αυξημένη οστεοκλαστογένεση και σύμφωνα με προηγούμενα δεδομένα της βιβλιογραφίας [15].

Η αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων του όγκου, το ανοσοποιητικό σύστημα και ο ιστός των οστών έχει καταστεί σχετικό αντικείμενο εντατικής μελέτης. Εφόσον η IL-7 εμπλοκή σε μετάσταση στα οστά προηγουμένως καταδείχθηκε σε άλλους όγκους [4], [16], ερευνήσαμε το θέμα αυτό δείχνει μια αύξηση στα επίπεδα ορού της IL-7 σε ασθενείς καπάκι με και χωρίς αλλοιώσεις οστών. Η αύξηση της IL-7 μπορεί να εξηγεί την Επαυξημένης RANKL /OPG, αφού η IL-7 διεγείρει την παραγωγή RANKL από τα Τ κύτταρα [17]. Αξιολογήσαμε την έκφραση του γονιδίου της IL-7 στο καπάκι και το φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, που δείχνουν συγκρίσιμη IL-7 έκφραση σε καρκίνο του προστάτη και των φυσιολογικών ιστών. Αυτό το αποτέλεσμα διαφέρει από δημοσιευμένα δεδομένα μας για τον καρκίνο του πνεύμονα, όπου ο ιστός του όγκου εξέφραζαν υψηλότερα IL-7 επίπεδα σε σχέση με την κανονική ομόλογό [18]. Προτείνουμε ότι αυτή η ασυμφωνία μπορεί να οφείλεται στο διαφορετικό τύπο όγκου και των οστών μεταστατική συμπεριφορά, όπως ο καρκίνος του πνεύμονα προκαλεί μεταστάσεις οστεολυτικές, ενώ CaP παράγει κυρίως σχηματισμού αλλοιώσεων των οστών. Το αυξημένο επίπεδο IL-7 του ορού μπορεί να εξαρτάται από το ανοσοποιητικό σύστημα ενεργοποίησης εναντίον του όγκου. Στην πραγματικότητα, έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι τα Τ και Β κύτταρα παράγουν IL-7, και στις δύο όγκων και άλλων παθολογιών που σχετίζονται προς επαναρρόφηση οστού [4], [19], [20]. Σηματοδότηση Wnt παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των οστών, καθώς αναστέλλει OC διαφοροποίηση [6], διεγείρει οστεοβλαστογενέσεως και mineralizing δραστηριότητα των οστεοβλαστών [7]. WNT πρωτεΐνες εκφράζονται επίσης από την ΚΓΠ και μπορούν να προωθήσουν την οστική όγκου εισβολή [21]. DKK είναι ένα διαλυτό αναστολέας κανονικών σηματοδότηση WNT [22]. Μια πρόσφατη μελέτη συσχετίζει DKK-1 σε καρκίνο του μαστού με την παρουσία οστικών μεταστάσεων [23]. Δεδομένα σχετικά με DKK-1 έκφρασης σε Cap είναι πενιχρά: ορισμένοι συγγραφείς αναφέρουν αύξηση της έκφρασης DKK-1 σε οστεολυτικές βλάβες, αλλά όχι στις πρωτογενείς όγκους [8]. Αίθουσα

et al

ανέφεραν ότι Cap-προέρχεται DKK-1 εμπλέκεται στην οστεοβλαστική δραστηριότητα σε οστικές μεταστάσεις, αφού DKK-1 σηματοδότηση μπορεί να ευθύνεται για τη διακοπή της ανταπόκρισης των οστών σε κύτταρα καπάκι από οστεολυτικές στην οστεοβλαστική και αντίστροφα [24 ]. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκαν μόνο οι ασθενείς με μεταστάσεις σχηματισμού των οστών, ως εκ τούτου, δεν είμαστε σε θέση να συσχετίσουν δραστηριότητα οστεολυτικές που προκαλείται από τα κύτταρα ΚΓΠ και DKK-1 έκφρασης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Παρ ‘όλα αυτά, βρήκαμε ένα μεγάλο ποσό DKK-1 σε ορολογικές δείγματα από ασθενείς με καρκίνο και μια ενισχυμένη έκφραση γονιδίου DKK-1 σε ιστούς καπάκι, που υποδηλώνει ότι οι DKK-1 επίπεδα αυξήθηκαν ορού σε ασθενείς CaP μπορεί να εξαρτάται από την έκκριση CaP κύτταρο. Αυτό το αποτέλεσμα θα μελετήσει είναι βαθιά, προκειμένου να αξιολογήσουν το δυνητικό ρόλο των DKK-1 ως καρκινικός δείκτης στο καπάκι. Επιπλέον, θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι τα κύτταρα CaP διεγείρουν περιβάλλον του μυελού των οστών να αυξήσουν την απελευθέρωση DKK-1 έως άγνωστων μηχανισμών. Σε μεταστατικό ασθενείς των οστών μας, τα επίπεδα DKK-1 στον ορό είναι ελαφρώς αυξημένη σε σύγκριση με μη μεταστατικό ασθενείς, χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά. Αυτό θα μπορούσε να εξαρτηθεί από χαμηλό αριθμό των ασθενών μας, αλλά ερευνά ένα μεγάλο αριθμό ασθενών, αναμένουμε να δείξει τη διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων, επιβεβαιώνοντας τα στοιχεία από τη βιβλιογραφία [23].

Υλικά και Μέθοδοι

οι ασθενείς και οι δείκτες της οστικής

το πειραματικό σχέδιο και όλες οι μελέτες που έχουν διεξαχθεί σχετικά με τους ασθενείς που είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Ιδρύματος μας (Azienda Ospedaliera-Universitaria San Giovanni Battista στο Τορίνο) και γραπτή συγκατάθεση από ασθενείς και υγιείς μάρτυρες ελήφθη. Η μελέτη πληθυσμού περιελάμβανε 46 ασθενείς που πάσχουν από νεοδιαγνωσθέντες ΚΓΠ (37 είχε μόνο ένα πρωτογενή όγκο, ενώ 9 είχαν πρωτοπαθή όγκο και ταυτόχρονη μεταστάσεις σχηματισμού των οστών) και 20 υγιείς άνδρες. Σε όλους τους ασθενείς δεν υπήρχε ένδειξη μετάστασης σε άλλες τοποθεσίες μη οστών. Έχει αποδειχθεί ότι η απώλεια οιστρογόνου επηρεάζουν σημαντικά οστεοκλαστών σχηματισμός [25]. Έτσι μελετήσαμε ΚΓΠ, η οποία, όντας ένα μόνο αρσενικό όγκου, αποφεύγει από προεπιλογή όλες τις πιθανές προκαταλήψεις λόγω των κυκλικών διακυμάνσεων των οιστρογόνων μετά την εμμηνόπαυση και πτώση των επιπέδων των οιστρογόνων στα θηλυκά. Οι ασθενείς και οι έλεγχοι της ίδιας ηλικίας και δείκτη μάζας σώματος. Οστική πυκνότητα (BMD) μετρήθηκε με διπλό εκπομπή απορροφησιομετρία ακτίνων Χ με ένα Hologic QDR 4500 οσφυϊκών σπονδύλων και του αυχένα του μηριαίου, τόσο σε ασθενείς και μάρτυρες. Άτομα με εντερικές ασθένειες δυσαπορρόφησης, άλλου είδους ανεπάρκεια διατροφικής κατάστασης, δευτερογενή οστεοπόρωση ή λήψη φαρμάκων που δραστηριοποιούνται επί του κύκλου εργασιών των οστών ή αντι θεραπεία του καρκίνου αποκλείστηκαν. Η παρουσία οστικών μεταστάσεων επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας σάρωση οστού

99Tc και περαιτέρω μελέτες απεικόνισης, σύμφωνα με την καθιερωμένη κλινική πρακτική.

Προκειμένου να διερευνηθεί κατάσταση μεταβολισμού των οστών, οι ασθενείς και οι έλεγχοι υποβλήθηκαν σε ανάλυση των κλινικών δεικτών πρότυπο του μεταβολισμού των οστών, όπως ΡΤΗ ορού, αλκαλική φωσφατάση οστών (ΒΑΡ), ασβέστιο, φωσφορικό, οστεοκαλσίνης (BGP) και των ουροφόρων δεοξυπυριδινολίνης (ουρική σταυρωτές συνδέσεις) [26]. Ειδικότερα, διασυνδέει δοσολογία επελέγη στην κλινική πρακτική για την παρακολούθηση της μεταστατικής νόσου των οστών και την απόκριση σε αντι-επαναρρόφησης θεραπείες, όπως τα διφωσφονικά [27], [28]. Ως δείκτες της οστικής απορρόφησης που μετριέται επίσης τρυγικό οξύ Ανθεκτική φωσφατάσης 5β (TRAP5b) στον ορό [29], με το κιτ BoneTRAP ELISA (Suomen Bioanalytiikka Oy, Turku, Fin). Ορολογικών δεικτών, όπως PSA και ιστολογική διαβάθμιση, σύμφωνα με Gleason, καταγράφηκαν για όλους τους ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη [30], [31]. Όλες οι βιοχημικές μετρήσεις έγιναν σε ένα μόνο αίματος ή του ουροποιητικού δείγμα σε ένα μόνο χρονικό σημείο ανά άτομο.

κυτταροκαλλιέργειες

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13], για όλους τους ασθενείς και υγιείς μάρτυρες, τα PBMC απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα και καλλιεργούνται σε α-ΜΕΜ, συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλλίνη 100 U /ml και στρεπτομυκίνη 100 μg /m (Cambrex, Bio Science, Walkersville, MD), χωρίς την προσθήκη εξωγενών διεγερτικών παραγόντων όπως m-CSF και RANKL. Μετά από 15 ημέρες, οι καλλιέργειες σταμάτησαν, ώριμη ΣΛ ταυτοποιήθηκαν ως πολυπύρηνα περιέχουν τρία ή περισσότερα πυρήνες και θετικά για έκφραση TRAP (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ).

Οι κυτοκίνες δοσολογία

προκειμένου να αξιολογηθεί παράγοντες που εμπλέκονται στην οστεοκλαστογένεση το ποσό του συνολικού RANKL ορού (ελεύθερο και OPG-δεσμευμένου), OPG, TNF-α, IL-7 και DKK-1 προσδιορίστηκαν με εμπορικώς διαθέσιμο κιτ ELISA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα αναλύθηκαν εις διπλούν και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές. Οι ευαισθησίες ήταν: 1,56 να 30000 pg /ml για το σύνολο των RANKL (Apotech Corporation, Epalinges, CH)? 0 να 4000 pg /ml για OPG? 0,12 να 32 pg /ml για ΤΝΡ-άλφα? 0,1 να 16 pg /ml για την IL-7 (R &? Σύστημα D, Abingdon, UK) και 0,38 να 50 pmol /L για το DKK-1 (Biomedica, Wien, A)

εκχύλιση RNA από φορμαλίνη. σταθερό, ιστούς παραφίνης (FFPE) Κάλυμμα

Εμείς εξάγεται RNA από FFPE ΚΓΠ και υγιείς ιστούς. Για 19 ασθενείς, πήραμε δείγματα από όγκο και υγιή κομμάτια ιστού, επιλέχθηκαν οι περιοχές του όγκου στα τμήματα αιματοξυλίνη /ηωσίνη από μικροσκόπιο και το χέρι αποσυντίθενται. RNA απομονώθηκε από FFPE μπλοκ CaP ιστού (10 μm τομές) χρησιμοποιώντας τη RecoverAll Σύνολο Nucleic Acid Απομόνωση Kit (Ambion, Huntingdon, UK). 1 μg του RNA μετατράπηκε μέχρι μονόκλωνο cDNA από το High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Warrington, Ηνωμένο Βασίλειο).

Δημιουργία πλασμιδίου ασθενή πρότυπο

εκκινητές PCR για την IL -7, DKK-1 και β-ακτίνης σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό v2.0 Primer Express και συντέθηκαν από την Applied Biosystems (Warrington, Ηνωμένο Βασίλειο). Η IL-7 και τις αλληλουχίες β-ακτίνης δημοσιευθεί προηγουμένως [18], ενώ οι αλληλουχίες DKK-1 ήταν: 5′-νόημα GGAAGCGCCGAAAACG-3 ‘και 5′-αντινόημα ACACACATATTCCATTTTTGCAGTA-3’. Καθαρισμένα φρέσκα προϊόντα PCR του 80-bp για την IL-7, 75-bp για DKK-1 και 78-bp για β-ακτίνη ήταν άμεσα κλωνοποιήθηκαν με χρήση ΤΑ Cloning Kit διπλού υποκινητή (Invitrogen, Carlsbad, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18] . Θετικοί κλώνοι αλληλουχία για να επιβεβαιώσουν την ταυτότητά τους. 10 μg του πλασμιδίου που επιλέγεται για τα γονίδια υπέστησαν πέψη με ένζυμο περιορισμού 8 U του Hind III επί μία νύκτα στους 37 ° C. Γραμμικοποιημένα πλασμίδια τελικά καθαρίστηκαν με NucleoSpin καθαρίσει κιτ εκχύλισης (Macherey-Nagel, Düren, D), επαναιωρήθηκαν με 1 χ ΤΕ και OD

260 προσδιορίστηκε. Αντιγραφή αριθμού υπολογίστηκε από τη συγκέντρωση πλασμίδιο, μέσο μοριακό βάρος των νουκλεοτιδίων (660 g /mol) και το πλασμίδιο συν τοποθετήστε μήκος.

πραγματικού χρόνου ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου IL-7 και DKK-1

Λαμβάνοντας υπόψη το υψηλότερο ποσό της IL-7 ορού και DKK-1 σε ασθενείς CaP με και χωρίς οστικές μεταστάσεις, αποφασίσαμε να διερευνήσει κατά πόσο αυτοί οι παράγοντες που παράγονται από τα καρκινικά κύτταρα. Πραγματοποιήσαμε ποσοτική ανάλυση της IL-7 και DKK-1 έκφραση με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (RQ-PCR), β-ακτίνη ήταν ο έλεγχος καθαριότητας. ανάλυση RQ-PCR του IL-7 και DKK-1 διεξήχθη χρησιμοποιώντας το σύστημα iCycler iQ ™ (Βίο Rad, Hercules, CA, USA). ανιχνευτές TaqMan σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό v2.0 Primer Express και συντέθηκαν από την Applied Biosystems (Warrington, Ηνωμένο Βασίλειο). IL-7 και β-ακτίνης ανιχνευτές ειδικούς TaqMan χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως [18], ενώ ο ανιχνευτής DKK-1 ήταν (5′-ATGCGTCACGCTATGTGCTGCC-3 ‘). Όλες οι ανιχνευτές σημάνθηκαν στο 5 ‘άκρο με 6-καρβοξυ φθορεσκεΐνη (FAM) και την 3’ άκρο με 6-καρβοξυ-tetrametil ροδαμίνη (TAMRA). Αντιδράσεις για την IL-7, DKK-1 και β-ακτίνης ποσοτικοποίηση διεξήχθησαν σε μΙ τελικό όγκο 25 με 2 μΙ cDNA δείγματος, 1 × iQ Supermix (Βίο Rad, Hercules, CA, USA), 0,3 μΜ εκάστου εκκινητή και 0,4 μΜ των ανιχνευτών. Εκκινητές PCR ήταν το ίδιο που χρησιμοποιείται για την IL-7, DKK-1 και β-ακτίνης κλωνοποίησης. Οι συνθήκες ενίσχυσης για κβαντισμό ήταν: 95 ° C για 15 λεπτά, 50 κύκλους στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 58 ° C για IL-7, 60 ° C για DKK-1 και β-ακτίνης για 1 λεπτό

.

Στατιστικές αναλύσεις

οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το στατιστικό πακέτο για τις Κοινωνικές Επιστήμες (spssx /pc) λογισμικού 15.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Οι συνεχείς μεταβλητές εκφράσθηκαν ως μέσος όρος και τυπική απόκλιση. Για να συγκριθούν οι ασθενείς με και χωρίς οστικές μεταστάσεις και ελέγχων, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση ένας τρόπος της διακύμανσης (ANOVA). Bonferroni διόρθωση πραγματοποιήθηκε για πολλαπλές συγκρίσεις. Να διερευνήσει την επίδραση των συνεχών μεταβλητών που αναλύθηκαν στο σχηματισμό OC, έχουμε τοποθετηθεί ένα μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης με τη διαδικασία βήμα τρόπο. Η έκφραση του γονιδίου του DKK-1 και IL-7 συγκρίθηκε μεταξύ όγκου και υγιή ιστό με δοκιμή Τ ζεύγη Student. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές για

σ

& lt?.. 0.05

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Raffaele Troiano για την τεχνική βοήθεια