Αφηρημένο

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τον δυτικό κόσμο και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της διατροφής, προτείνεται να παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην αιτιολογία της. Πραγματοποιήσαμε μια μακροπρόθεσμη πείραμα σίτιση στο ποντίκι για την αντιμετώπιση γονιδιακής έκφρασης και αλλαγές μεθυλίωσης που προκύπτουν σε ιστολογικά κανονικό κολονικό βλεννογόνο ως υποθετικό καρκίνο προδιαθέτουν εκδηλώσεων που διατίθενται για την έγκαιρη ανίχνευση. Η έκφραση 94 γονιδίων ανάπτυξης ρυθμιστικών προηγουμένως συνδέονται με την ανθρώπινη CRC μελετήθηκε σε δύο χρονικά σημεία (5 εβδομάδων και 12 μηνών) στο ετεροζυγώτες

MLH1

+/-

ποντίκια, ένα ζωικό μοντέλο για το σύνδρομο του ανθρώπου Lynch (LS), και άγριου τύπου

MLH1

+ /+

αδερφάκια, τροφοδοτείται από είτε δυτικού τύπου (WD) ή ΑΙΝ-93g δίαιτα ελέγχου. Σε ποντίκια που τρέφονταν με WD, εγγύς βλεννογόνο του παχέος εντέρου, τον κυρίαρχο χώρο του σχηματισμού καρκίνου σε LS, παρουσίασαν σημαντική μείωση την έκφραση σε ογκοκατασταλτικά γονίδια,

DKK1, Hoxd1

,

Slc5a8

, και

SOCS1

, οι δύο τελευταίες μόνο στα

MLH1

+/-

ποντίκια. Μειωμένη έκφραση mRNA συνοδεύτηκε από αυξημένη μεθυλίωση προαγωγού των αντίστοιχων γονιδίων. Η ισχυρότερη μείωση έκφρασης (7,3 φορές) μαζί με μια σημαντική αύξηση στη μεθυλίωση του υποκινητή παρατηρήθηκε σε

DKK1

, ένας ανταγωνιστής της κανονικής οδού σηματοδότησης Wnt. Περαιτέρω, η αδρανοποίηση του

DKK1

φαίνεται να προδιαθέτουν για νεοπλασίες στο εγγύς κόλον. Αυτό και το γεγονός ότι

MLH1

το οποίο έδειξε μόνο μέτρια μεθυλίωση εξακολουθούσε να εκφράζεται τόσο σε

MLH1

+/-

και

MLH1

+ /+

ποντίκια δείχνουν ότι η έκφραση μειώνεται και η αδρανοποίηση των

DKK1

, ειδικότερα, είναι μια εξέχουσα νωρίς δείκτης για την ογκογένεση του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Pussila Μ, Sarantaus L, Dermadi Bebek D, Valo S, Reyhani Ν, Ollila S, et al. (2013) Cancer-πρόβλεψη των αλλαγών της γονιδιακής έκφρασης σε κολικό βλεννογόνο της Δυτικής Διατροφή Fed

MLH1

+/- ποντίκια. PLoS ONE 8 (10): e76865. doi: 10.1371 /journal.pone.0076865

Επιμέλεια: Ajay Goel, Πανεπιστήμιο Baylor Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 22, 2013? Αποδεκτές: 28 Αυγ 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτωβρίου 2013

Copyright: © 2013 Pussila et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε οικονομικά από τις επιχορηγήσεις από το Ευρωπαϊκό Συμβούλιο Έρευνας (2008-ΑτΕ-232635), το Ίδρυμα Sigrid Juselius (https://www.sigridjuselius.fi/foundation), Φινλανδικά Καρκίνο Οργανώσεις (https://www.cancer.fi/en /), Η Ακαδημία της Φινλανδίας (https://www.aka.fi/eng), και Biocentrum Ελσίνκι (https://www.helsinki.fi/biocentrum/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) εξελίσσεται ως μια πολυσταδιακή διαδικασία, η οποία απαιτεί μια σειρά γενετικών και επιγενετικών αλλοιώσεις. Η διαδικασία επιταχύνεται σε άτομα με κληρονομική προδιάθεση του καρκίνου, και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της διατροφής, φαίνεται να είναι σε θέση κλειδί στην αιτιολογία της [1,2]. Η σημασία των επιγενετικών αλλαγών, όπως αλλαγές μεθυλίωσης του DNA κατά την κίνηση της CRC έχει πλέον αναγνωρισθεί [3,4], ακόμα, οι πρώτες εκδηλώσεις σε φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου διαθέσιμα για την έγκαιρη ανίχνευση και την πρόληψη της ανάπτυξης του καρκίνου παραμένουν να διευκρινισθούν.

Αν και κληρονομείται μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο (TSG) APC (αδενωματώδη πολυποδίαση coli), ένα σημαντικό συστατικό του /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, και η επισκευή αναντιστοιχία (MMR) γονίδια (π.χ.

MLH1

, mutL ομόλογο 1), οι οποίες ελέγχουν το ρυθμό μετάλλαξης σε ένα κύτταρο [2] μπορεί να προσδώσει υψηλό κίνδυνο διάρκειας ζωής του καρκίνου με πρώιμη ηλικία έναρξης, καρκίνο του παχέος εντέρου είναι σαφώς μια ασθένεια του αυξανόμενη ηλικία [3,4]. Κατά συνέπεια, οι αλλαγές μεθυλίωσης ένα μικρό υποσύνολο των ΕΠΠΕ έχουν ανιχνευθεί στο γήρανση κολικό βλεννογόνο των φυσιολογικών υγιών ατόμων, και αυτό συνεπάγεται μεθυλίωση γονίδια τα οποία συχνά γίνονται περισσότερο αισθητά μεθυλιωμένη σε νεοπλασματικά κύτταρα [5-7], γεγονός που υποδηλώνει το ρόλο τους στην έναρξη του καρκίνου και προχώρηση. Μαζί με τη γήρανση μερικές εξωγενείς ενώσεις από διαιτητικές πηγές είναι σημαντικές τροποποιητές προτύπων μεθυλίωσης στο κόλον [8], πιθανώς εξηγεί γιατί δυτικούς πληθυσμούς που καταναλώνουν σημαντικές ποσότητες κόκκινου κρέατος, τα κορεσμένα λιπαρά και ζάχαρη, και μόνο μέτριες ποσότητες διαιτητικών ινών, βιταμινών και μετάλλων (π.χ. ασβέστιο, φυλλικό οξύ και η βιταμίνη D), καθώς και παράγωγα φυτικών θρεπτικών συστατικών παρουσιάζουν τα υψηλότερα CRC επιπτώσεις στον κόσμο [1] (World Cancer Research Fund, www.dietandcancerreport.org). Επιγενετικές αλλαγές παρέχουν έτσι μια πιθανή σχέση μεταξύ διατροφής και καρκίνου [9] και τονίζουν την ανάγκη να διευκρινίσει τις διατροφικές επιπτώσεις στη γονιδιακή ρύθμιση στο εντερικό βλεννογόνο.

Τα ζωικά μοντέλα, ιδιαίτερα τα τρωκτικά, παρέχουν έναν πολύτιμο πόρο στον τομέα της περιβαλλοντικής επιγενετική συμπεριλαμβανομένων των μελετών σχετικά με τις αλλαγές με τη μεσολάβηση μέσω της διατροφής [10]. Αποτελέσματα που υποδηλώνουν ότι η δυτικού τύπου διατροφή (WD) προκαλεί γαστρεντερικά όγκων σε μοντέλα ποντικών για την οικογενή καρκίνο του εντέρου, ακόμη και σε άγριου τύπου (WT) ποντίκια χωρίς θεραπεία καρκινογόνο [11-14] μας ώθησε να μελετήσει τις επιπτώσεις των ανοιγμάτων WD στη γονιδιακή ρύθμιση και μεθυλίωση στο κανονικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου με ή χωρίς κληρονομική προδιάθεση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Έχουμε επιλέξει 94 γονίδια ανάπτυξης ρυθμιστικών προηγουμένως συνδέονται με την ανθρώπινη CRC και μελέτησε την έκφραση τους στον ετεροζυγώτη

MLH1

+/-

ποντίκια ανάλογο με σύνδρομο ανθρώπινης Lynch (LS), και WT

MLH1

+ /+

αδερφών. Κατά τη διάρκεια μιας μακροχρόνιας πείραμα σίτιση χρησιμοποιήσαμε το δικό μας τροποποίηση του δυτικού τύπου δίαιτα (WD *), η οποία πολύ μοιάζει με το New Western διατροφής (NWD) που φαίνεται να επάγουν καλοήθεις και κακοήθεις νεοπλασίες στο κόλον των φυσιολογικών C57BL /6 ποντικών μετά από μια 18 πείραμα σίτιση μήνες [12]. Η κύρια διαφορά μεταξύ NWD και WD * είναι η πηγή λίπους το οποίο σε WD * άλλαξε σε μεγάλο βαθμό από το πετρέλαιο σε ζώο (γάλα) λίπος και έτσι μοιάζουν περισσότερο λίπος που καταναλώνεται από δυτικούς πληθυσμούς. Εδώ, εγγύς παχέος εντέρου, η κυρίαρχη θέση του σχηματισμού καρκίνου στο LS [15], αποκάλυψε αρκετές σημαντικές αλλαγές σχετίζονται με την ηλικία στο γονίδιο εκφράσεις. Ορισμένες αλλαγές ενισχύεται από την WD * και μερικά βρέθηκαν μόνο σε ποντίκια με γενετική προδιάθεση του καρκίνου. Δείξαμε επίσης ότι οι αλλαγές έκφραση ανιχνεύεται από την ιστολογικά φυσιολογικό βλεννογόνο ήταν εξαιρετικά νωρίς συμβαίνουν πριν από την

APC

αδρανοποίηση και το δεύτερο χτύπημα στο

MLH1

.

Μέθοδοι

ποντίκια

ετεροζυγώτες B6.129-

MLH1

tm1Rak

ποντίκια (MLH1

+/-) (στέλεχος 01XA2) ελήφθησαν από την NCI -MMHCC? Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, Mouse Repository, NCI-Frederick, MD. Σε B6.129-

MLH1

tm1Rak

ποντίκια, εξόνιο 2 λείπει σε ένα από τα δύο

MLH1

αλληλόμορφα που οδηγεί σε μη λειτουργική πρωτεΐνη MLH1 [16 ]. MLH1

+/- ποντίκια έχουν αυξημένη νοσηρότητα σε σύγκριση με νεογνά WT τους και περίπου το ένα τρίτο αναπτύξουν όγκους, όπως λεμφώματα καθώς και όγκοι του λεπτού και του παχέως εντέρου και έναν αριθμό άλλων οργάνων κατά τη διάρκεια της ζωής τους [17]. Η MLH1

+/- και MLH1

+ /+ ποντίκια γονότυπος χρησιμοποιώντας γονιδιακό DNA που εξάγεται από αφιερώνει σύμφωνα με το πρωτόκολλο που δημοσιεύονται στην ιστοσελίδα Ποντίκι Repository (https://mouse.ncifcrf.gov/protocols.asp; ID = 01XA2 & amp? p_allele = MLH1% 3Ctm1Rak% 3E & amp? prot_no = 1) (Βλέπε Υλικά και Μέθοδοι S1)

δήλωση Ηθικής

Ποντίκια εκτράφηκαν και αντιμετωπίζονται σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από. το εθνικό ζώο Πείραμα Διοικητικού συμβουλίου στη Φινλανδία (ESLH-2008 – 06.502 /ΥΜ-23). Τα ποντίκια ευθανασία με εισπνοή CO2.

Δίαιτες

Στην ηλικία των 5 εβδομάδων (χρονικό σημείο 0, tp0),

MLH1

+ /-

και

MLH1

+ /+

ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο διατροφικές ομάδες (n = 8 /ομάδα, συμπεριλαμβανομένων και των δύο φύλων) που τροφοδοτείται με ΑΙΝ-93g ( AIN) δίαιτα ελέγχου [18] ή δυτικού τύπου (WD *) δίαιτα (Harlan Teklad, Madison, WI) (Πίνακας 1, λεπτομερή περιγραφή των δίαιτες και διατροφικές συνθέσεις τους είναι στον πίνακα S1).

Η AIN93- g

WD *

πηγές λίπους (g /kg)

α (g /kg)

bSoybean Oil70-άνυδρου λίπους γάλακτος-133Canola Oil-55Sunflower Oil-12Carbohydrate SourcesStarch397306Maltodextrin13295Sucrose100116Protein Source200 ( καζεΐνη) 232 (καζεΐνη, η βιταμίνη δωρεάν) Συνολική περιεκτικότητα σε ενέργεια (kcal /g) 3.84.6Kcal από το λίπος (%) 17.239.2Kcal από υδατάνθρακες (%) 63.942.3Kcal από πρωτεΐνη (%) 18.818.5Vitamin D (IU /kg) 1000100Folic οξύ (mg /kg) 20.2Calcium50.5Table 1. Διατροφή διατροφικές πληροφορίες.

Για αναλυτική σύνθεση των πειραματικών δίαιτες βλέπε πίνακα S1.

α Εάν δεν αναφέρεται διαφορετικά

b Εάν δεν αναφέρεται διαφορετικά CSV Λήψη CSV

Η προετοιμασία των δειγμάτων

Οκτώ ποντίκια για κάθε ομάδα σε tp0 (MLH1

+/-, MLH1

+ /+) και ΤΡ1 (12 μηνών) (MLH1

+ /+ AIN, MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, MLH1

+/- WD *) 48 ποντίκια συνολικά θυσιάστηκαν και δείγματα. Οι ιστολογικές μελέτες διεξήχθησαν στο Φινλανδικό Κέντρο Εργαστήριο Ζώων Παθολογίας (FCLAP), Πανεπιστήμιο του Ελσίνκι, Φινλανδία.

Για γονιδιακού DNA και το συνολικό RNA εκχυλίσεις, ο βλεννογόνος (6 x 4 mm) διαχωρίζεται από το υποκείμενο υποβλεννογόνο και μυϊκό σύστημα κάτω από ένα ανατομικό μικροσκόπιο. Δείγματα για εξαγωγή RNA αποθηκεύθηκαν σε RNAlater (Qiagen, Valencia, CA) στους -80 ° C.

εκχύλιση RNA και αντίστροφη μεταγραφή

Τα συνολικά δείγματα RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Plus Kit ( Qiagen, Valencia, CA) με ένα επιπλέον Dnase θεραπείας (Qiagen, Valencia, CA). Η ακεραιότητα του RNA αναλύθηκε με τις Agilent 2100 (τεχνολογίες Agilent, Santa Clara, CA) Bioanalyzer και μόνο υψηλής ποιότητας RNA (αριθμός ακεραιότητα RNA RIN & gt? 8) χρησιμοποιήθηκε για αντιδράσεις σύνθεση cDNA, οι οποίες έτρεξε ως διπλότυπα και συνενώθηκαν για την RT αντιδράσεις -qPCR. Η αντίστροφη μεταγραφή είτε από 200 ng (μεμονωμένα δείγματα για StellARray) ή 1600 ng (πισίνες οκτώ δείγματα, 200 ng εκάστη, από οκτώ διαφορετικούς ποντικούς που ανήκουν σε κάθε ομάδα ΤΡ1 για TaqMan RT-qPCR) του ολικού RNA επιτεύχθηκε με την M-MuLV RNase H

+ (Thermo Scientific, Φινλανδία) ή Εκθέτης III (τεχνολογίες ζωής, Carlsbad, CA), αντιστοίχως, με τη χρήση τυχαίων εκκινητών σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών.

μελέτες έκφρασης RNA

τα RNA εκφράσεις ιστολογικά δείγματα φυσιολογικού ιστού από το εγγύς βλεννογόνο του κόλου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια ποσοτική παραγγελία StellARray

πλατφόρμα TM (Lonza Group Ltd, Bar Harbor βιοτεχνολογία). Η StellARray περιλαμβάνονται 94 γονίδια (73 ΕΠΠΕ) προηγουμένως συνδέονται με την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου ή /και σε τεκμηριωμένη να παρουσιάζουν νησί CpG (CGI) υπερμεθυλίωση στο CRC και άλλων ανθρώπινων καρκίνων (Πίνακας S2).

APC

συμπεριλήφθηκε στη συστοιχία ως δείκτης της συνεχιζόμενης καρκινογένεσης. Οκτώ ποντικοί από κάθε ομάδα μελέτης χωριστά αναλύθηκαν για την έκφραση των 94 γονιδίων που ενδιαφέρουν (48 συστοιχίες RT-qPCR συνολικά).

Κάθε StellARray πλάκα φορτώθηκε με 20 μΙ SYBR Green κύριο μίγμα που περιέχει 8 μ.λίτρα του δείγματος συγκεκριμένων cDNA και τροποποιημένα

Thermus brockianus

DNA πολυμεράσης (Thermo Scientific, Φινλανδία). Οι συστοιχίες RT-qPCR έτρεξαν σε κυκλοποιητή Mx3000P (τεχνολογίες Agilent, Santa Clara, CA) χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους ποδηλασία: 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 7 λεπτά, 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 s, και 60 ° C για 1 λεπτό. Τα δεδομένα φθορισμού αποκτήθηκαν κατά τη διάρκεια του σταδίου C ανασύνδεσης /επέκτασης 60 °. Το αστάρι ειδικότητα παρακολουθήθηκε μέσω μιας ανάλυσης καμπύλης τήξης. Οι διαφορές έκφρασης μεταξύ των διαφορετικών ομάδων ποντικών αναλύθηκαν με τη χρήση του Παγκόσμιου Pattern Recognition ™ (GPR), το λογισμικό (Bar Harbor Βιοτεχνολογίας, Trenton, ME)

Τα αποτελέσματα των στατιστικά σημαντικές αλλαγές της έκφρασης σε σχέση με την WD * και /ή κληρονομική προδιάθεση καρκίνου επικυρώθηκαν σε TP1 χρησιμοποιώντας δοκιμασίες TaqMan (Πίνακας S3). Σε αντίθεση με StellARray RT-qPCR, η ανάλυση TaqMan RT-qPCR έγινε από ομαδοποιημένα δείγματα. Κάθε ομαδοποιημένο δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν για τα γονίδια-στόχους, καθώς και τα ενδογενή γονίδια αναφοράς χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες παραμέτρους ποδηλασία: 1 κύκλος των 95 ° C για 10 λεπτά, 40 κύκλοι των 95 ° C για 15 s, και 60 ° C για 1 λεπτό. Θερμική ποδηλασία και απόκτησης δεδομένων φθορισμού έγιναν με StepOnePlus ανακυκλωτή (Life Technologies, Carlsbad, CA) και τιμές Cq κλήθηκαν χρησιμοποιώντας την υποβοήθηση των δεδομένων του λογισμικού v2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Τα ομοιόμορφα εκφράζονται γονίδια αναφοράς (

HDAC1

και

Stk4

) επιλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο GeNorm [19] ανάμεσα από τα 94 γονίδια που περιλαμβάνονται στο StellARray.

MLH1

επίπεδα έκφρασης σε tp0 επίσης ποσοτικά χρησιμοποιώντας δοκιμασία TaqMan.

Εάν το ποσό της πρότυπο ήταν πολύ χαμηλή για να δώσει αξιόπιστα αποτελέσματα, η επικύρωση RT-qPCR διεξήχθη με τη χρήση προ-ενισχυμένου cDNA. Για κάθε ομάδα ΤΡ1, ομαδοποιημένα δείγματα ήταν multiplex προ-ενισχύθηκε με τη χρήση 16 ng του cDNA με TaqMan προενισχυτή Master Mix Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι παράμετροι κυκλοποίησης ήταν ως εξής: α. 1 κύκλος των 95 ° C για 10 λεπτά και 10 κύκλους προ-ενίσχυση των 95 ° C για 15 s, και 60 ° C για 4 λεπτά

μεθυλίωσης DNA ανάλυση

Για την ανάλυση μεθυλίωσης του DNA, μόνο τα γονίδια που είχαν δείξει μείωση της έκφρασης σημαντική mRNA (δηλαδή υποψήφιο υπερμεθυλίωση ΕΠΠΕ) σε συνδυασμό με κληρονομική προδιάθεση ή /και WD * επιλέχθηκαν, και τα επίπεδα μεθυλίωσης των νησιών τους CpG (CGIs) αξιολογήθηκαν ξεχωριστά για κάθε tp0 και TP1 ποντίκι. Γονιδιωματικό DNA για την ανάλυση μεθυλίωσης εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας DNeasy Blood & amp? Ιστού Kit (Qiagen, Valencia, CA) από δείγματα ιστού από το άμεσο περιβάλλον του εκείνα που χρησιμοποιούνται για μελέτες έκφρασης RNA.

Η ποσοτική ανάλυση μεθυλίωσης διεξήχθη με MassARRAY EPITYPER

σύστημα TM Sequenom του (Sequenom GmbH, Hamburg , Γερμανία), η οποία είναι ένα όξινο θειικό τεχνολογία που βασίζεται στηρίζονται σε βάση-ειδική διάσπαση RNA και εκρόφησης ιονισμού φασματομετρία μάζας υποβοηθούμενης από μήτρα λέιζερ χρόνου πτήσεως (MALDI-TOF-MS) για τον προσδιορισμό της σχετικής έκταση της μεθυλίωσης σε θραύσματα DNA που περιέχει είτε μία ή περισσότερες μετέπειτα CpG θέσεις, οι οποίες αναφέρονται ως μονάδες CpG [20]. Στο φάσμα μάζας, ένα διακριτό πρότυπο σήματος προκύπτει από την μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων αλληλουχίας στόχου, και το λογισμικό EPITYPER καθορίζει τις επιμέρους αναλογίες μεθυλίωσης (δηλ αναλογίες ένταση σήματος ως ποσοστό του μεθυλιωμένου σε μη μεθυλιωμένα σήματα) για CpG τοποθεσίες /μονάδα εντός μια αλληλουχία στόχο. Το σύστημα είναι σε θέση να ανιχνεύσει τα επίπεδα μεθυλίωσης τόσο χαμηλά όσο 5%.

Τα αμπλικόνια πρωτίστως επιλεγεί για την κάλυψη των CGIs σχολιασμένο από το πρόγραμμα περιήγησης στο γονιδίωμα UCSC και να συμπίπτει με την θέση έναρξης της μεταγραφής και 5 ‘UTR ή να κοντά τους. Συνολικά, δώδεκα διαφορετικά αμπλικόνια (μήκη μεταξύ 174 και 499 bp) αναλύθηκαν εκ των οποίων οκτώ ανήκαν στην προ-επικυρωμένη Ποντίκι Πρότυπο EpiPanel και οι τέσσερις ήταν δοκιμασίες μεθυλίωσης του DNA έθιμο σχεδιαστεί με τη χρήση του λογισμικού EpiDESIGNER Sequenom του (Sequenom GmbH, www.epidesigner.com), για τις οποίες αλληλουχίες εκκινητών και θέσεις-στόχους παρέχονται στον πίνακα S4. Προκειμένου να μειωθεί η μεταβλητότητα μεθυλίωση εισαχθεί κατά τη διάρκεια της PCR [21], τρεις επαναληπτικές ενισχύσεις εκτελέσθηκαν και συνενώθηκαν για ανάλυση μάζας. Η αρχική δεδομένων μεθυλίωση φιλτράρεται από Sequenom να αποκλείσει κακή μετρήσεις ποιότητας. μονάδες CpG που απέφερε δεδομένα σε μεγαλύτερη από 75% των δειγμάτων πέρασαν την αρχική ελέγχου ποιότητας. Από αυτά, επιλέχθηκαν δείγματα τα οποία απέδωσαν δεδομένα σε μεγαλύτερη από 80% για όλες τις μονάδες CpG μέσα σε ένα amplicon για το εν λόγω ζεύγος δείγματος /αμπλικόνιο. Για περαιτέρω ανάλυση, μονάδες CPG που είχε στη διάθεσή της λιγότερο από το 50% όλων των δειγμάτων και των δειγμάτων που είχε στη διάθεσή της λιγότερο από το 50% του συνόλου των μονάδων CpG δεδομένα αποκλείστηκαν δεδομένων. Μετά τον έλεγχο ποιότητας 78% των μονάδων CpG αναλύθηκαν (152 από 196) και όλα τα 48 δείγματα συμπεριλήφθηκαν σε περαιτέρω βήματα ανάλυση.

Στατιστικές αναλύσεις

StellARray RT-qPCR, ένα κοινό κατώφλι ορίστηκε σε όλες τις 48 πλάκες εντός του πειράματος. Οι διαφορές έκφρασης μεταξύ των διαφορετικών ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Παγκόσμιο Pattern Recognition ™ (GPR), το λογισμικό, το οποίο εκτελεί τη διόρθωση της αποδοτικότητας και την εξομάλυνση της ομάδας γονιδίων και ελέγχου αναφοράς (www.bhbio.com/BHB/dw/products.gpr.html). GPR λαμβάνει επίσης πλεονέκτημα της βιολογικής επαναλήψεων να εξάγει σημαντικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Το σύστημα StellARray δεν λειτουργεί με το χρήστη ορίζονται γονίδια αναφοράς. Αντ ‘αυτού, ο αλγόριθμος λογισμικού GPR καθορίζει το καλύτερο σύνολο των γονιδίων αναφοράς εντός της πείραμα συγκρίνοντας την έκφραση όλων των γονιδίων που περιλαμβάνονται στην δοκιμασία μεταξύ των δειγμάτων δοκιμής και ελέγχου, δημιουργεί ένα παγκόσμιο πρότυπο των αλλαγών έκφρασης, και δημιουργεί ένα ιεραρχημένο κατάλογο των σημαντικών αλλαγές [22]. Με αυτόν τον τρόπο η επιλογή των γονιδίων αναφοράς είναι αμερόληπτη δεδομένου ότι επιτρέπει τα πειραματικά δεδομένα για τον ορισμό των σταθερώς εκφραζόμενα γονίδια αναφοράς.

Σε προσδιορισμούς TaqMan, σχετικές μεταβολές έκφρασης του mRNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το συγκριτικό C

t (ΔΔC

t) μέθοδο, η οποία παρουσιάζει τα δεδομένα ως φορές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση ρυθμίζεται σύμφωνα με ενδογενή γονίδια αναφοράς και σε σχέση με την ομάδα ελέγχου [23]. Δεδομένα υποβοήθησης λογισμικό v2.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για την (Cq) δεδομένα, και μια μέθοδος διάμεσος μετάθεση [24] χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σημασία της έκφρασης πολλαπλές μεταβολές ποιοτικό έλεγχο και την ομαλοποίηση του κύκλου ποσοτικοποίησης σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου με επίπεδο σημαντικότητας

P

& lt? 0.05.

Η συσχέτιση μεταξύ των προτύπων έκφρασης StellARray 5 εβδομάδων

MLH1

+ /+

και

MLH1

+/-

ποντίκια μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση συσχέτισης Pearson (

R

αξία) του συστήματος PASW Στατιστικά 18.

λογισμικό Chipster [25] χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει και να αναλύσει το δεδομένα μεθυλίωσης. Το εργαλείο μη μετρικών Multi-Dimensional Scaling (NMDS) χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή δύο διαστάσεων χάρτες με βάση την ανομοιότητα δείγμα υπολογίζεται χρησιμοποιώντας Ευκλείδεια απόσταση, και το εργαλείο δενδρόγραμμα χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία δενδρογράμματα δειγμάτων χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένων δεδομένων με Pearson συσχέτιση και μέθοδο του μέσου σύνδεσης . Για Chipster αναλύσεις, τιμές που λείπουν μεθυλίωση των ατομικών μονάδων CpG ορίστηκαν ως η μέση τιμή της μονάδας CpG εντός της συγκεκριμένης ομάδας ποντίκι.

σύγκριση της μέσης επίπεδα μεθυλίωσης μεταξύ διαφορετικών ομάδων ποντικών διεξήχθη χρησιμοποιώντας Mann-Whitney test του συστήματος PASW Στατιστικά 18.

Αποτελέσματα

Παχέος νεοπλασίες αναπτυχθεί κυρίως στην WD * ποντίκια

σε γενικές γραμμές, ένα εγγύς αδενοκαρκίνωμα και πέντε αδενωμάτων /υπερπλαστικούς πολύποδες παρατηρήθηκαν στο 32 ποντίκια σε ΤΡ1. Η σημασία της WD * επί CRC κινδύνου σε σειρά ποντικού μας τονίζεται από το γεγονός ότι 5 από 6 ποντικούς με νεοπλασίες τράφηκαν με WD * και ότι WD * προκάλεσε ανάπτυξη του όγκου και σε ποντικούς άγριου τύπου χωρίς κληρονομική προδιάθεση, δηλαδή το μόνο καρκίνωμα και ένα αδένωμα βρέθηκαν στο

MLH1

+ /+

WD * ποντίκια (Πίνακας 2, Σχήμα S1). Η ενιαία ΥΡΙΑ τροφοδοτείται ποντίκι ανάπτυξη νεοπλασίας (υπερπλαστική πολύποδας) ήταν φορέας μετάλλαξης.

Ομάδα Mouse

DKK1

εκφράζεται (n = 16)

DKK1 δεν

εκφράζεται ( n = 16)

MLH1

+ /+

AIN62

MLH1

+/-

AIn3

α5

MLH1

+ /+

WD * 4

β4

γ

MLH1

+/-

WD * 35

α, β, bdTable 2.

DKK1

αδρανοποίηση και του παχέος νεοπλασίες σε διαφορετικές ομάδες ποντικών

ένα υπερπλασίας πολύποδα.?

β αδένωμα?

αδενοκαρκίνωμα γ?

D δεν ιστολογικά επιβεβαιωμένη CSV Λήψη CSV

MLH1

+/- και MLH1

+ /+ ποντίκια δείχνουν παρόμοια πρότυπα έκφρασης mRNA κατά την έναρξη

Κατά την έναρξη της πειραματικής σίτισης περίοδο (tp0), η MLH1

+/- και MLH1

+ /+ ποντίκια έδειξαν εξαιρετικά καλή συσχέτιση (Pearson του

R

= 0.989,

P

& lt? 0,01) μεταξύ των προτύπων έκφρασης του mRNA των 94 γονιδίων που περιλαμβάνονται στο έθιμο StellARray RT-qPCR array (Σχήμα S2A). Ωστόσο, διαφέρει από τα άλλα γονίδια, αλλά σύμφωνα με τις διαφορετικούς γονότυπους, η έκφραση του

MLH1

ήταν περίπου 50% χαμηλότερη στους ποντικούς ετεροζυγώτες σε σχέση με τους ποντικούς WT (σχήμα S2B). Συνολικά, μια ισογονιδιακές υπόβαθρο στην αρχή κατέστησε δικαιολογημένο για τον λόγο ότι οι διαφορές έκφρασης που θα εμφανιστούν μεταξύ των διαφορετικών ομάδων ποντικών αργότερα απέκτησε και όχι το αποτέλεσμα της κληρονομική γενετική σύσταση.

WD * ή /και κληρονομική προδιάθεση συνδέονται με διαφορική έκφραση διαφόρων γονιδίων σε ΤΡ1

σε ηλικία 12 μηνών (ΤΡ1), η έκφραση αρκετών γονιδίων βρέθηκε να είναι αυξημένη ή μειωμένη σε σύγκριση με tp0 (πίνακες 3 και 4). Όλα τα αποτελέσματα GPR (

P

-τιμές και διπλώστε αλλαγές) των διαφορών έκφρασης μεταξύ των διαφορετικών ομάδων ποντικών για όλα τα 94 γονίδια είναι στον Πίνακα S5. Εννέα από τα 94 γονίδια έδειξε στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0.05) αλλαγές έκφρασης μεταξύ tp0 και ΤΡ1 σε όλες τις ομάδες ποντικών (MLH1

+ /+ AIN, MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, MLH1

+/- WD *) (Πίνακας 3). Μειωμένα επίπεδα mRNA παρατηρήθηκαν στο

CCND1

(Κυκλίνη D1),

Cdh1

(καντερίνη 1), και

Mal

(μυελίνη και πρωτεΐνη λεμφοκυττάρων Τ πρωτεΐνη κυτταρική διαφοροποίηση), ενώ αυξημένη έκφραση παρατηρήθηκε σε

Axin2

,

Cdx1

(Ουραίο τύπου ομοιοκυτίου 1),

Fzd10

[Frizzled ομόλογο 10 (

Drosophila

)],

Mbd2

(μεθυλ-CpG πρωτεΐνη δέσμευσης τομέας 2),

Mbd4

(μεθυλ-CpG πρωτεΐνη δέσμευσης τομέα 4), και νουκλεοτιδίου γουανίνης

Rasgrf2

(Ras πρωτεΐνη-ειδική απελευθέρωση συντελεστής 2). Δεδομένου ότι αυτές οι αλλαγές δεν εξαρτώνται από την κληρονομική προδιάθεση ή WD * μπορούν να αποδοθούν στη γήρανση.

MLH1

+ /+

ΥΡΙΑ

MLH1

+/-

ΥΡΙΑ

MLH1

+ /+

WD

MLH1

+/-

WD

μειωτικά GenesFold Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

)

CCND1

3.3 (0.003) 3.8 (0.000) 4.3 (0.001) 3.6 (0.000)

Cdh1

5.4 (0.002) 4.9 (0.000) 5.9 (0.002 ) 8.4 (0.000)

Mal

3.4 (0.025) 3.4 (0.014) 3.2 (0.034) 2.7 (0.028) ρυθμίζεται προς τα πάνω GenesFold Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

)

Axin2

2.6 (0.005) 3.0 (0.002) 1.8 (0.039) 1.6 (0.028)

Cdx1

4.1 (0.002) 5.6 (0.000) 3.4 (0.002) 5.4 (0.000)

Fzd10

4.8 (0.002) 7.6 (0.000) 3.4 (0.021) 5.0 (0.000)

Mbd2

3.3 (0.004) 4.7 (0.000) 3.2 (0.003) 5.7 (0.000)

Mbd4

3.0 (0.005) 6.0 (0.000) 3.0 (0.004) 3.3 (0.000)

Rasgrf2

2.3 (0.002) 1,8 (0.006) 2.3 (0.001) 1.5 (0.040) Πίνακας 3. γονίδια που δείχνουν στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0.05) διαφορές μεταξύ mRNA έκφραση tp0 και ΤΡ1 σε όλες τις τέσσερις ομάδες ποντικών? στην ομάδα ελέγχου (MLH1

+ /+ AIN) και οι τρεις ομάδες μελέτης (MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD, MLH1

+/- WD).

CSV CSV Κατεβάστε

MLH1

+ /+

ΥΡΙΑ

MLH1

+/-

ΥΡΙΑ

MLH1

+ /+

WD

MLH1

+/-

WD

ρυθμίζουν προς τα κάτω GenesFold Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

)

DKK1

2.0 (0.110) 5.1 (0.012) 6.2 (0.003) 7.3 (0.003)

Slc5a8

1.3 (0.078) 1.7 (0.041) 1.3 (0.224) 1.5 (0.032)

Hoxd1

1.1 (0,348 ) 2.0 (0.075) 2.1 (0.019) 1.5 (0.191)

SOCS1

1.6 (0.460) 2.7 (0.067) 1.0 (0.485) 3.1 (0.026) ρυθμίζεται προς τα πάνω GenesFold Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

) Διπλώστε Αλλαγή (

P

)

Dkk2

2.2 (0.108) 2.2 (0.037) 1,7 (0,329) 1.0 (0.637)

Rprm

1.4 (0.442) 2.0 (0.017) 1.1 (0.725) 3.3 (0.019)

Acaa1b

2.4 (0.120) 1.8 (0.140) 3.5 (0.124) 9.4 (0.000) Πίνακας 4. γονίδια που δείχνουν στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0.05) διαφορές έκφρασης του mRNA μεταξύ tp0 και ΤΡ1 σε τουλάχιστον μία από τις ομάδες μελέτης, αλλά όχι στην ομάδα ελέγχου (MLH1

+ /+ Αιν).

CSV CSV Κατεβάστε

Στατιστικά σημαντικές αλλαγές της έκφρασης μεταξύ tp0 και ΤΡ1 σχετίζεται με κληρονομική προδιάθεση καρκίνου (MLH1

+/-) ή /και WD * παρατηρήθηκαν σε επτά γονίδια (Πίνακας 4, Πίνακας S5)? μειωμένη έκφραση στο

DKK1

[Dickkopf ομόλογο 1 (

Xenopus laevis

)]

, Slc5a8

[(Solute οικογένεια φορέα 5 (ιωδιούχο μεταφορέα), μέλος 8]

, Hoxd1

(ομοιοκυτίου D1), και

SOCS1

(κατασταλτικά κυτοκίνης σηματοδότησης 1), και αυξημένη έκφραση στο

Dkk2

[Dickkopf ομόλογο 2 (

Xenopus laevis

)],

Rprm

(Reprimo, TP53 εξαρτάται G2 σύλληψη υποψήφιος μεσολαβητής), και

Acaa1b

(ακετυλο-συνένζυμο Α ακυλτρανσφεράσης 1Β).

Η ισχυρότερη μείωση έκφρασης (7.3 φορές) παρατηρήθηκε στο μεταξύ το MLH1

+/- ποντίκια που τρέφονταν με WD το Wnt σηματοδότησης γονίδιο καταστολής

DKK1

*. σε ετεροζυγώτες ποντίκια που τρέφονταν με AIN και WT ποντίκια που τρέφονταν με WD *, η μείωση ήταν 5.1 και 6.2 φορές, αντίστοιχα. Είναι ενδιαφέρον, το ομοιοκυτίου γονίδιο

Hoxd1

παρουσίασαν μείωση έκφραση σχετιζόμενη με την ηλικία (2,1 φορές) μόνο στο MLH1

+ /+ WD * ομάδα, και η στατιστικά σημαντική μείωση των σχετικών να WD * περαιτέρω παρατηρήθηκε όταν αυτή η ομάδα ήταν σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

MLH1

+ /+

Αιν) σε TP1 (1,9 φορές) (Πίνακας S5). Η μείωση της έκφρασης του μεταφορέα βουτυρικού

Slc5a8

σχετίζεται μόνο με την

MLH1

ετεροζυγωτία (1,5 και 1,7 φορές σε WD * και AIN ομάδες, αντίστοιχα), ενώ

SOCS1

, μία κυτοκίνη ρυθμιστή σηματοδότησης, ήταν σημαντικά προς τα κάτω ρύθμιση (3,1 φορές), μόνο εάν και οι δύο παράγοντες κινδύνου ήταν παρόντες, δηλαδή η

MLH1

+/-

WD * ομάδα.

Η έκφραση του

Dkk2

, ένας άλλος ρυθμιστής σηματοδότησης Wnt, αυξήθηκε σημαντικά στο MLH1

+/- ομάδα ΥΡΙΑ (Πίνακας 4), έτσι ώστε σε ΤΡ1,

Dkk2

έκφραση μεταξύ MLH1

+/- ποντίκια ήταν σημαντικά χαμηλότερη (2.2 φορές) στην ομάδα του WD * σε σύγκριση με την ομάδα ΑΙΝ (Πίνακας S5).

Rprm

έδειξαν στατιστικά σημαντική σχετιζόμενη με την ηλικία αύξηση της έκφρασης σε σχέση με το

MLH1

ετεροζυγωτία (3.3 και 2.0. Διπλώστε το WD * και AIN, αντίστοιχα).

Acaa1b

παρουσίασαν σημαντική αύξηση της έκφρασης του MLH1

+/- WD * ποντίκια (9,4 φορές) και τα επίπεδα έκφρασης αποκάλυψε μια σημαντική διαφορά (5,0 φορές) όταν το

MLH1

+/-

WD * ποντίκια ήταν σε σύγκριση με το

MLH1

+/-

ΥΡΙΑ ομάδα στο ΤΡ1 (Πίνακας S5).

Δεν υπήρχαν διαθέσιμα δείγματα ιστών /αποσπάσματα για την επικύρωση των αποτελεσμάτων στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Ως εκ τούτου, TaqMan RT-qPCR χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση μεταβολές έκφραση συνδέεται με τον καρκίνο-προδιαθέσεως

MLH1

μετάλλαξη και /ή WD *. Η ισογονιδιακές υπόβαθρο και τα δικά μας αποτελέσματα που ποντίκια έδειξαν παρόμοια πρότυπα έκφρασης mRNA κατά την έναρξη (Σχήμα S2A, S2B) κατέστησε δικαιολογημένο να συνδυάσει τα μεμονωμένα δείγματα (n = 8) από κάθε ομάδα σε πισίνες για μεταγενέστερη χρήση στα πειράματα επικύρωσης. Σχήμα 1 απεικονίζει τις διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ των ομάδων μελέτης και της ομάδας ελέγχου σε TP1.

Σχετική έκφραση σε διαφορετικές ομάδες μελέτης (MLH1

+/- AIN, MLH1

+ /+ WD *, και MLH1

+/- WD *) είναι σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (MLH1

+ /+ Αιν). Κάθε δείγμα είναι ένα μίγμα από οκτώ δείγματα RNA από οκτώ διαφορετικές ΤΡ1 ποντίκια που ανήκουν σε κάθε ομάδα ποντικών. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM (τυπικό σφάλμα του μέσου) (n = 3), * σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Διάμεση μέθοδο μετάθεση,

P

& lt? 0.05. (Α)

MLH1

δείχνει την ίδια διαφορά έκφραση του 50% μεταξύ των γονότυπων κατά την αφετηρία της μελέτης. (Β)

DKK1

είναι σημαντικά κάτω ρυθμίζεται στις ομάδες μελέτης με WD * και /ή

MLH1

ετεροζυγωτία. (C)

Slc5a8

δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές έκφραση σε TP1. (D)

Hoxd1

ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σχέση με την WD * και στις δύο γονότυπους? η ρύθμιση προς τα κάτω είναι ιδιαίτερα ισχυρή στην MLH1

ομάδα + /+ WD. (Ε)

SOCS1

δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές έκφραση σε TP1. (F)

Dkk2

ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σχέση με την WD * και στις δύο γονότυπους.

Η

Οι αναλύσεις TaqMan επιβεβαίωσε την παρατήρηση ότι

DKK1

είναι ένα από τα πιο εξέχοντες υποψηφίους με την έκφραση στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου μεταβάλλεται σε συνεργασία με την κληρονομική προδιάθεση του καρκίνου και WD *. Λόγω των χαμηλών επιπέδων

DKK1

mRNA, RT-qPCR διεξήχθη σε προ-ενισχυμένο cDNA (ενίσχυση αξία ομοιομορφία του -0,76).

επίπεδα DKK1

mRNA ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (

MLH1

+ /+

Αιν) σε όλες τις ομάδες μελέτης [MLH1

+ /+ WD *, 1,5 φορές (εύρος 1,4-1,7)? MLH1

+/- AIN, 1.4 (1.3-1.5)? MLH1

+/- WD *, 1.2 (1.1 έως 1.2)] (Εικόνα 1Β). Η έκφραση του

Hoxd1

ήταν σημαντικά δεν μειώθηκε μόνο σε MLH1

+ /+ WD * ποντίκια [1,9 (1,7-2,2)], ένα εύρημα που ήδη παρατηρείται σε StellARray, αλλά και στην MLH1

+/- WD * ομάδα [1.3 (1.2-1.3)] (Εικόνα 1Δ), τονίζοντας την επίδραση της WD * στο

Hoxd1

έκφρασης. Ο TaqMan RT-qPCR επιβεβαίωσε επίσης τη σημασία της WD * σχετικά με την έκφραση της

Dkk2

, όπου σε StellARray μια στατιστικά σημαντική μείωση παρατηρήθηκε στην MLH1

+/- WD * ποντίκια [1.2, (1.2- 1.3)], αλλά τώρα επίσης σε ποντίκια WT τρέφονται με WD * [1.2 (1.2-1.3),

P

= 0,053] (Σχήμα 1 F). Η έκφραση του

Acaa1b

βρέθηκε επίσης να είναι σημαντικά αυξημένη, τόσο στο MLH1

+/- WD * και MLH1

+ /+ WD * ποντίκια [2,6 (2,3-2,8) και 1,7 ( 1.7 έως 1.8), αντίστοιχα] (Σχήμα S3). Τα επίπεδα έκφρασης του

Slc5a8

και

SOCS1

δεν διέφερε μεταξύ της ομάδας ελέγχου και των ομάδων μελέτης (Σχήμα 1C, E).

Αξίζει να σημειωθεί ότι, χωρίς σημαντική ηλικίας ή διατροφή σχετικές αλλαγές έκφρασης βρέθηκαν στο

Αρο

ή

MLH1

. Όπως και στην αρχή, η έκφραση του

MLH1

ήταν περίπου 50% χαμηλότερα στα ποντίκια ετεροζυγώτες σε σύγκριση με τα ποντίκια WT, υποδεικνύοντας ότι η δεύτερη απενεργοποίησης χτύπημα του

MLH1

δεν είχε ακόμη συμβεί από TP1 ( Σχήμα 1Α). Η έκφραση του

Αρο

ήταν παρόμοια και στις δύο γονότυπους (StellARray).

Σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA συνοδεύουν μειωμένη έκφραση των γονιδίων

Τα επίπεδα μεθυλίωσης του CGIs του γονίδια τα οποία είχε δείξει στατιστικά σημαντική μείωση στην έκφραση του mRNA σε συνεργασία με το

MLH1

ετεροζυγωτία ή /και WD * (

DKK1, Slc5a8, Hoxd1

, και

SOCS1

? Πίνακας 4 ) αναλύθηκαν ξεχωριστά για κάθε tp0 και ΤΡ1 ποντίκι χρησιμοποιώντας MassARRAY EPITYPER

σύστημα TM Sequenom του. Επιπλέον,

MLH1

, και

Sfrp1

που είχε δείξει την ηλικία που σχετίζονται με μείωση της έκφρασης της οριακής σημασίας (1,4 φορές,

P

= 0,06) στο MLH1

+ 0.05.