Αφηρημένο

Ιστορικό

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα microRNAs απορυθμίζεται στο θυρεοειδή καρκίνο και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση των ογκογονιδίων στόχων ή /και ογκοκατασταλτικά γονίδια.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Μελετήσαμε τη λειτουργία των miR-126-3p στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα, και ως δείκτης της επιθετικότητας της ασθένειας. Βρήκαμε ότι το miR-126-3p έκφραση ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε μεγαλύτερους όγκους, σε δείγματα όγκων με εξωθυρεοειδική εισβολή, και στην υψηλότερη ομάδα κίνδυνο καρκίνου του θυρεοειδούς σε 496 θηλώδες δείγματα καρκίνου του θυρεοειδούς από το The ομάδα μελέτης του καρκίνου Genome Atlas. Σε ένα ανεξάρτητο σύνολο του δείγματος, να μειώσει miR-126-3p έκφραση παρατηρήθηκε σε θυλακιώδη καρκίνων του θυρεοειδούς (που έχουν καψική και αγγειακή προσβολή) σε σύγκριση με θυλακιώδη αδενώματα. Μηχανιστικά, έκτοπη υπερέκφραση του miR-126-3p σημαντικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς,

in vitro

(p & lt? 0,01) και

in vivo

(p & lt? 0.01), ο σχηματισμός αποικίας (p & lt? 0.01), ο σχηματισμός σφαιροειδές όγκου (p & lt? 0.05), κυτταρική μετανάστευση (p & lt? 0.05), VEGF έκκρισης και το σχηματισμό ενδοθηλιακού σωλήνα, και μετάσταση στους πνεύμονες

in vivo

. Βρήκαμε 14 προβλέψει γονίδια-στόχους, τα οποία ήταν σημαντικά μεταβληθεί κατά miR-126-3p επιμόλυνση στα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς, και οι οποίες εμπλέκονται στη βιολογία του καρκίνου. Από αυτά τα 14 γονίδια,

SLC7A5

και

ADAM9

επιβεβαιώθηκαν να αναστέλλεται από miR-126-3p υπερέκφραση και να είναι άμεσοι στόχοι του miR-136-3p.

συμπεράσματα /Σημασία

για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αποδεικνύει ότι το miR-126-3p έχει μια λειτουργία όγκου-κατασταλτικό στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα, και συνδέεται με την επιθετική φαινότυπο της νόσου.

Παράθεση: Xiong Υ, Kotian S, Zeiger MA, Zhang L, Kebebew Ε (2015) miR-126-3p Αναστέλλει καρκίνο του θυρεοειδούς ανάπτυξη κυττάρων και τη μετάσταση, και συνδέεται με επιθετικό καρκίνο του θυρεοειδούς. PLoS ONE 10 (8): e0130496. doi: 10.1371 /journal.pone.0130496

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 20 Μάρτη, 2015? Αποδεκτές: 19 Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 5 του Αύγ 2015

Αυτό είναι ένα ανοικτό άρθρο πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 δημόσιο τομέα αφοσίωση

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από την εντός των τειχών ερευνητικό πρόγραμμα του Κέντρου έρευνας για τον Καρκίνο, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγγραφείς δεν έχουν σύγκρουση συμφερόντων να αποκαλύψει

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του θυρεοειδούς είναι η πιο κοινή ενδοκρινική καρκίνο. και μία από τις πιο ταχέως αναπτυσσόμενη διαγνώσεων καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες [1,2]. καρκίνων του θυρεοειδούς προέρχονται από παραθυλακοειδή κύτταρα (μυελώδη) και θυλακιώδη κύτταρα (μη-μυελοειδές), οι οποίες αντιπροσωπεύουν πάνω από το 95% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς και κατατάσσονται σε τέσσερις μεγάλες ιστολογικές ομάδες: θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς (FTC), θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς (PTC ), ο καρκίνος του θυρεοειδούς αναπλαστικό (ATC), και καρκίνωμα Hürthle κυττάρων (HCC).

τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNA που είναι μήκους περίπου 21 νουκλεοτιδίων και τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης [3,4]. miRNAs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και δείχνουν αξιοσημείωτη ειδικότητα ιστού, και miRNAs έχουν επίσης βρεθεί να είναι καλή βιοδείκτες του καρκίνου [5]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι διάφορες miRNAs απορρυθμισμένη σε καρκίνους του θυρεοειδούς που προέρχονται από θυλακιώδη κύτταρα [6-8]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, βρήκαμε ότι η έκφραση του miR-126-3p ήταν προς τα κάτω σε δείγματα κακοήθους θυρεοειδή όγκων σε σύγκριση με τα δείγματα καλοηθών όγκων του θυρεοειδούς [9,10]. Μειωτικά miR-126-3p έκφραση παρατηρήθηκε σε FTC και HCC, τα οποία είναι μόνο ιστολογικά διακρίνονται από θυλακιώδη ή αδενώματα Hürthle όταν καψικό εισβολή και /ή αγγειακή προσβολή είναι παρόντες. Ο ρόλος του miR-126-3p στον καρκίνο του θυρεοειδούς δεν έχει μελετηθεί στο παρελθόν, αλλά η ανάλυση της έκφρασης μας σε δείγματα καρκίνου του θυρεοειδούς δείχνει ότι η απώλεια του miR-126-3p μπορεί να σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του θυρεοειδούς, και ότι μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκοκατασταλτικό.

στην παρούσα μελέτη, ελέγξαμε την υπόθεση ότι το miR-126-3p είναι ένα ογκοκατασταλτικό και σχετίζεται με φαινότυπο της νόσου. Έχουμε καθορίζεται η λειτουργία των miR-126-3p στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα, χρησιμοποιώντας τόσο

in vitro

και

in vivo

μοντέλα. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR-126-3p σημαντικά ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων θυρεοειδούς, σχηματισμό αποικιών, σχηματισμός σφαιροειδές όγκου, τη μετανάστευση, την έκκριση VEGF και του σχηματισμού σωλήνα HUVEC, και μεταστάσεις στους πνεύμονες

in vivo

. Επιπλέον, βρήκαμε ότι miR-126-3p ρυθμίζει την έκφραση πολλών σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που κωδικοποιεί διαλυτή ουσία οικογένεια μεταφορέα 7 μέλος 5 (

SLC7A5

) και ένα disintegrin και μεταλλοπρωτεϊνασών πρωτεΐνη που περιέχει την περιοχή 9 (

ADAM9

), και ότι στοχεύει άμεσα αυτά τα γονίδια. Τέλος, miR-126-3p έκφραση βρέθηκε να σχετίζεται με την επιθετικότητα της νόσου.

Μέθοδοι

Η επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του National Cancer Institute, National Institutes of Health ενέκρινε τη μελέτη σε ζώα πρωτόκολλο. Όταν τα ποντίκια φτάσει ανθρώπινες κριτήρια ευθανασία, οι ποντικοί απεικονίστηκαν, και υποβάλλονται σε ευθανασία με εισπνοή CO2. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Γραφείο για τα Ανθρώπινα Έρευνας προστασία και την πληροφόρηση των ασθενών συλλέχθηκαν προοπτικά στα πλαίσια του πρωτοκόλλου του πλοίου εγκεκριμένο από θεσμική αναθεώρηση των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας το Κέντρο Κλινικής (Bethesda, Maryland) μετά από έγγραφη συγκατάθεση.

δείγματα ανθρώπινου θυρεοειδούς όγκων, κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινα θυρεοειδούς ιστός ελήφθη κατά τη στιγμή της αφαίρεσης του όγκου, αμέσως καταψύχθηκαν ταχέως και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Διαδοχικές τομές ιστού χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση RNA και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση και ότι το περιεχόμενο των κυττάρων του όγκου ήταν 80% ή υψηλότερη. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Γραφείο για τα Ανθρώπινα Έρευνας προστασία και την πληροφόρηση των ασθενών συλλέχθηκαν προοπτικά στα πλαίσια του πρωτοκόλλου του πλοίου εγκεκριμένο από θεσμική αναθεώρηση των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας μετά από έγγραφη συγκατάθεση.

κυτταρικές σειρές καρκίνου του Ανθρώπου θυρεοειδούς XTC- 1 (HCC), FTC-133 (FTC), και TPC-1 (PTC) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 4500 mg /L D-γλυκόζη και L-γλουταμίνη, και 110 mg /L πυρουβικό νάτριο, συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), της θυρεοειδοτρόπου ορμόνης (10 mU /ml), πενικιλλίνη (10000 U /ml), στρεπτομυκίνη (10.000 U /mL), Fungizone (250 mg /mL), και η ινσουλίνη (10 μg /mL) σε ένα πρότυπο υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε ένα 5%

2 και 95% O

2 ατμόσφαιρα CO. κύτταρα FTC-133-Luc2 δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση κυττάρων FTC-133 με ένα φορέα λουσιφεράσης που εκφράζουν και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο ίδιο μέσο με G418 σε συγκέντρωση 200 μg /ml [11]. Οι κυτταρικές γραμμές επικυρώνονται χρησιμοποιώντας σύντομο διαδοχική επανάληψη προφίλ

miRNA επιμόλυνση

Ένα miRNA μιμούνται για HSA-miR-126-3p (miRNA μιμούνται, Δοκιμασία ID:. MC12841? Applied Biosystems, Foster City , CA) διαμολύνθηκε σε κύτταρα σε συγκέντρωση 25 ηΜ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα ολιγονουκλεοτίδιο δεν αντιπροσωπεύουν οποιαδήποτε γνωστή miRNA (miRNA Mimic αρνητικού ελέγχου # 1? Applied Biosystems). Χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος

απομόνωση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

συνολικό RNA απομονώθηκε από τις κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η δοκιμασία TaqMan microRNA (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της miR-126-3p επίπεδο έκφρασης (HSA-miR-126-3p, Δοκιμασία ID: 002228). Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με ένα miRNA-ειδικό εκκινητή, ακολουθούμενη από PCR πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας ανιχνευτές TaqMan. U6 χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Οι σχετικές ποσότητες των

ADAM9

και

SLC7A5

mRNAs προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TaqMan (Applied Biosystems) σε ένα σύστημα HT ΑΒΙ 7900? ανθρώπινο

GAPDH

χρησιμοποιήθηκε σαν ένα ενδογενές ελέγχου. Η μέθοδος ΔΔ Ct χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των επιπέδων έκφρασης.

κηλίδος Western

λύμα ολόκληρου κυττάρου παρασκευάστηκε με ρυθμιστικό RIPA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) και χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πρωτεΐνης ADAM9 με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-ADAM9 αντίσωμα (αραίωση 1: 1000? Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, ΜΑ) και για την ανίχνευση της πρωτεΐνης SLC7A5 με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-SLC7A5 αντίσωμα (αραίωση 1: 500? Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, ΜΑ). πρωτεΐνη GAPDH, ένα στοιχείο ελέγχου, ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού (# 0411) αντισώματος-GAPDH αντι (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Διάδοση δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη χρήση του CyQUANT Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών φθορισμού (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), με διέγερση στα 485 nm και εκπομπή ανίχνευση στα 538 nm.

δοκιμασία Μετανάστευση

Κινητή μετανάστευση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα BD Επιμελητηρίου (Catalog # 354578, BD Biosciences, Bedford, ΜΑ), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κυττάρων μέσο καλλιέργειας με 10% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό στο κάτω φρεάτιο του θαλάμου Boyden. τα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς σπάρθηκαν στο άνω διαμέρισμα του θαλάμου σε μέσο ελεύθερο ορού (4 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο). Μετά από επώαση στους 37 ° C σε 5% CO

2 για 22 ώρες, τα μη μεταναστεύοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την άνω επιφάνεια, και τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει διαμέσου της μεμβράνης προς την κάτω επιφάνεια χρώσθηκαν με την Diff-Quik Stain Set (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Εικόνες ελήφθησαν από την μεμβράνη του κάθε ενθέματος κάτω από ένα μικροσκόπιο (50 Χ μεγεθύνσεις) με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή. Οι εικόνες που προβλήθηκαν στην οθόνη του υπολογιστή και τα κύτταρα σε πέντε πεδία κάθε ένθετο μετρήθηκαν.

πολιτισμό σφαιροειδές

Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση miRNA, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν, επαναιωρείται σε μέσο καλλιέργειας , και καλλιεργήθηκαν σε ένα Ultra Low πλάκα Cluster (Costar, Corning, ΝΥ) σε 3,5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο. Οι πλάκες καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2, και το μέσο αλλάχθηκε κάθε 2 έως 3 ημέρες. Μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο. Η συνολική έκταση που καταλαμβάνεται από τα σφαιροειδή εντός μίας εικόνας μετρήθηκε με την περικύκλωση της περιμέτρου κάθε σφαιροειδούς, σηματοδοτώντας το σύνολο της περιοχής, και τον υπολογισμό των αριθμών pixel χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

δοκιμασία μαλακού άγαρ για σχηματισμό αποικιών

Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση miRNA, FTC-133 κύτταρα υπέστησαν κατεργασία τρυψίνης, απαριθμήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας. Δύο στρώσεις προσδιορισμούς μαλακού άγαρ εκτελέστηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων. Το κάτω στρώμα του άγαρ (2 mL /κυψελίδα) περιείχαν 0.6% άγαρ (Difco άγαρ ευγενής? BD Diagnostics, Sparks, MD) σε μέσο F-12 του Ham, συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη (100 U /ml), στρεπτομυκίνη ( 10.000 U /mL), και Fungizone (250 ng /mL). Τριάντα χιλιάδες κύτταρα αναμείχθηκαν με 1 mL άνω διάλυμα άγαρ (0,35% άγαρ σε μέσο καλλιέργειας). Μετά από 30 λεπτά, 1 mL του μέσου καλλιέργειας προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2, και τα μέσα αλλάχθηκαν δύο φορές την εβδομάδα. Μετά από δύο εβδομάδες καλλιέργειας, οι αποικίες των κυττάρων βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο. καταμέτρηση των αποικιών έγινε σε τρεις διαφορετικούς τομείς.

μελέτες ξενομοσχεύματος όγκου

FTC-133 κύτταρα που περιέχουν γονίδιο αναφοράς λουσιφεράσης

luc2

επιμολύνθηκαν με miR-126-3p ή ΜΙΚ NC και εμβολιάσθηκαν υποδορίως (10

6 βιώσιμα κύτταρα) μέσα στα αριστερά και δεξιά πλευρές του αθυμικών γυμνών ποντικών. Οι όγκοι μετρήθηκαν με παχύμετρο σε διαφορετικά χρονικά σημεία, και οι όγκοι υπολογίστηκαν ως μήκος Χ πλάτος Χ ύψος. δείγματα αυτοψίας όγκου φωτογραφήθηκαν για να τεκμηριώσουν ακαθάριστες μορφολογία, και στη συνέχεια ζυγίστηκαν δείγματα. FTC-133-

luc2

κύτταρα (7.5 × 10

5) επιμολυσμένα με miR-126-3p και miR-NC ενέθηκαν σε αθυμικά γυμνά ποντίκια μέσω της φλέβας της ουράς, και οι ποντικοί απεικονίστηκαν εβδομαδιαίως χρησιμοποιώντας ένα Xenogen IVIS 100 σύστημα.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

μετανάστευση καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία πληγή γρατσουνιά δοκιμασίας [12] στην οποία 150.000 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miRNAs, τοποθετήθηκαν σε θεραπεία έξι φρεατίων πλάκες, και αφέθηκαν να προσκολληθούν και να αναπτυχθούν για 44 ώρες (miRNAs). Στη συνέχεια, τρεις κάθετες τραύματα έγιναν με ένα στείρο ρύγχος πιπέτας 10 μΙ, και στη συνέχεια μια οριζόντια γραμμή έγινε στις τρεις γραμμές, έτσι ώστε θα μπορούσε να παρατηρηθεί κύτταρα στο ίδιο σημείο. Τα κύτταρα επιθεωρήθηκαν κάθε 12 ώρες και οι μετρήσεις πλάτους που λαμβάνονται μέχρι 24 ώρες.

VEGF ELISA

Culture υπερκείμενο μέσο συλλέχθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση του καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων με miR-NC ή ΜΙΚ 126-3p. επίπεδα VEGF μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Human VEGF Quantikine ELISA (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ). επίπεδα VEGF κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα ολικής πρωτεΐνης με τη χρήση του Pierce BCA Protein Assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Ανοσοϊστοχημεία

παραφίνη ενσωματωμένα τμήματα ιστών του πνεύμονα από ποντίκια ενιεμένα με FTC-133- Luc2 κύτταρα επιμολυσμένα είτε με miR-NC ή miR-126-3p από-παραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν. Οι τομές στη συνέχεια κατεργάζεται με αντι-VEGF (ab46154, Abcam, Cambridge, ΜΑ). Διαφάνειες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ScanScope XT ψηφιακό σαρωτή διαφανειών, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).

σχηματισμό ενδοθηλιακών δοκιμαστικό σωλήνα

Τα κύτταρα επιμολυσμένα με miR-NC και miR-126-3p απλώθηκαν σε πυκνότητα 3000-4000 κυττάρων σε μια πλάκα 96 φρεατίων, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα αφέθηκαν να συνδεθούν όλη τη νύχτα, και υπόγειο matrigel μήτρα (BD Biosciences) τοποθετήθηκε πάνω από τα κύτταρα. Κύτταρα HUVEC (Lonza, Walkersville, MD) προστέθηκαν στη συνέχεια στο επάνω μέρος του στρώματος matrigel σε πυκνότητα 60.000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Ο σχηματισμός ενδοθηλιακού σωλήνων παρατηρήθηκε και φωτογραφήθηκε την πάροδο του χρόνου.

συστοιχία mRNA έκφραση γονιδιώματος σε επίπεδο

TPC-1 και FTC-133 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-126-3p και miR-NC . Τρεις ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, USA). Εκατό πενήντα νανογραμμάρια ολικού RNA χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση του cDNA αντίστροφη μεταγραφή, τη σύνθεση, την ενίσχυση, τον κατακερματισμό, και τερματικό επισήμανσης χρησιμοποιώντας GeneChip WT Sense Target Σήμανση και αντιδραστήρια ελέγχου (Affymetrix, Santa Clara, CA). Περίπου 25 ng /μΙ cDNA υβριδοποιήθηκε σε Affymetrix Human Gene 1,0 ST Array GeneChip. Οι συστοιχίες πλύθηκαν και χρωματίζονται χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο ρευστών διαδικασία FS450_0007 σε ένα ρευστών Σταθμός Affymetrix 450. Οι εντάσεις καθετήρα σαρώθηκαν με σαρωτή GeneChip 3000. Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Partek Γονιδιωματική Σουίτα λογισμικού (Partek, Inc., St. Louis, ΜΟ). ανάλυση διακύμανσης χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα σύνολα ανιχνευτή που ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των δύο ομάδων. Ο κατάλογος γονίδιο φιλτράρεται με μια πολλαπλή μεταβολή αποκοπής των 1.3 και προσαρμόζεται σ & lt? 0.05. Το σύστημα Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της οδού

miRNA-126-3p προβλέψεις στόχο

TargetScan 5.1 (http:. //Targetscan .org /) χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό πιθανών γονιδίων άμεσο στόχο για miR-126-3p.

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία

Το ζευγάρι 1.573 βάσεων 3′-UTR της ανθρώπινης

ADAM9

κλωνοποιήθηκε σε ένα άδειο φορέα αναφοράς λουσιφεράσης, pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), δημιουργώντας ένα άγριου τύπου

ADAM9

3′-UTR κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης (pEZX-ADAM9-3’UTR) . Το ζεύγος 2.947-βάσεων 3′-UTR της ανθρώπινης

SLC7A5

επίσης κλωνοποιήθηκε σε pEZX-MT01, δημιουργώντας ένα άγριου τύπου

SLC7A5

3′-UTR κατασκεύασμα ανταποκριτή λουσιφεράσης (pEZX-SLC7A5- 3’UTR). Για τον προσδιορισμό διπλής λουσιφεράσης, τα κύτταρα FTC-133 καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 24 φρεατίων και συν-επιμολύνθηκαν με 0.25 μ§ του κατασκευάσματος ανταποκριτή και 15 pmol του miR-126-3p ή miR-NC χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . Στις 24 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν και αναλύθηκαν για τόσο πυγολαμπίδας και

Renilla

δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το miR Λουσιφεράσης Assay Kit (GeneCopoeia) σε αναγνώστη μικροπλακός SpectraMax M5e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή.

η ανάλυση των δεδομένων

ο καρκίνος του Εθνικού Ινστιτούτου καρκίνου Γονιδιώματος Atlas (TCGA) σύνολο δεδομένων για τον καρκίνο του θυρεοειδούς χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η σύνδεση μεταξύ miR-126-3p έκφρασης και της νόσου επιθετικότητα (δεδομένα πύλη, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). τιμές κανονικοποιημένη ένταση (log 10) για miR-126-3p έκφρασης ελήφθησαν από 454 θηλώδους δείγματα καρκίνου του θυρεοειδούς. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα, χρησιμοποιήθηκαν μια ανάλυση της διακύμανσης και τεστ t, ανάλογα με την περίπτωση. Μία τιμή ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

miR-126-3p έκφραση στον καρκίνο του θυρεοειδούς συσχετίζεται με την επιθετική φαινότυπο της νόσου και οι όγκοι με κάψας και αγγειακή προσβολή

Είχαμε προηγουμένως εντοπιστεί miR-126-3p να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε θυρεοειδή καρκίνους του ωοθυλακίου κυττάρου προέλευσης και σε τύπους όγκων που ήταν δύσκολο να διαγνώσει με εξέταση βιοψίας όγκου ως καψικό εισβολή και αγγειακή προσβολή δεν μπορεί να προσδιορίσει με κυτταρολογία. Έτσι, μας ενδιαφέρει στον καθορισμό εάν miR-126-3p έκφραση σχετίζεται με την επιθετικότητα της νόσου και ειδικά σε όγκους με κάψας εισβολή και αγγειακή προσβολή. Για να διερευνήσουν αυτή, χρησιμοποιήσαμε το σύνολο δεδομένων TCGA για θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς. Βρήκαμε ότι miR-126-3p έκφραση ήταν χαμηλότερη σε μεγαλύτερες πρωτογενείς όγκους (Σχήμα 1Α), σε δείγματα όγκων με εξωθυρεοειδική εισβολή (Σχήμα 1Β), και σε υψηλού κινδύνου καρκίνου του θυρεοειδούς ομάδα (Σχήμα 1 C). Με δεδομένη τη σύνδεση του miR-126-3p με πιο επιθετική θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, είμαστε δίπλα ρώτησε αν miR-126-3p έκφραση ήταν χαμηλότερη σε εντοπισμένους όγκους με κάψας εισβολή και αγγειακή προσβολή χρησιμοποιώντας θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς και αδενώματα δείγματα για τα οποία κακοήθεια είναι εγκατεστημένος μόνο από η παρουσία αυτών των δύο χαρακτηριστικά του καρκίνου. Βρήκαμε miR-126-3p ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε εντοπισμένες θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς, σε σύγκριση με θυλακιώδη αδενώματα (Σχήμα 1 D). Τα ευρήματα αυτά μαζί δείχνουν ότι το miR-126-3p μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην έναρξη και ή εξέλιξη του καρκίνου του θυρεοειδούς.

(Α) miR-126-3p είναι σημαντικά χαμηλότερη σε μεγαλύτερες καρκίνο θηλώδες θυρεοειδούς (Τ3 σε σύγκριση με Τ2 και όγκους Τ1). Τα δεδομένα για τα δείγματα TCGA με τα διαθέσιμα στοιχεία το μέγεθος του όγκου. Τ1 όγκοι λιγότερο από 2 εκατοστά και δεν αναπτύσσεται έξω από το θυρεοειδή, Τ2 όγκοι & gt? 2 εκατοστά αλλά & lt? 4 εκατοστά και δεν αναπτύσσεται έξω από το θυρεοειδή, όγκοι Τ3 μέτρηση & gt? 4 εκατοστά ή η καλλιέργεια έξω από το θυρεοειδή. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01, *** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001. άξονας Υ είναι log

10 κανονικοποιημένη έκφραση. (Β) miR-126-3p έκφραση είναι σημαντικά χαμηλότερη σε θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς με την ελάχιστη και μέτρια εξωθυρεοειδική εισβολή. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01, *** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001. άξονας Υ είναι log

10 κανονικοποιημένη έκφραση. (C) miR-126-3p έκφραση είναι σημαντικά χαμηλότερο σε υψηλή και ενδιάμεση θηλώδους κίνδυνο καρκίνου του θυρεοειδούς MACIS σε σύγκριση με όγκους χαμηλού κινδύνου MACIS. MACIS είναι ένα προγνωστικό σύστημα βαθμολόγησης που χρησιμοποιείται στη βάση δεδομένων TCGA που βασίζεται στην παρουσία της μετάστασης, την ηλικία του ασθενούς, την πληρότητα της εκτομής, η τοπική διείσδυση, και το μέγεθος του όγκου. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01, *** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001. άξονας Υ είναι log

10 κανονικοποιημένη έκφραση. (D) miR-126-3p έκφραση είναι σημαντικά χαμηλότερη σε θυλακιώδη καρκίνου του θυρεοειδούς από θυλακιώδη θυρεοειδούς αδένωμα. Όλα θυλακιώδη καρκίνο του θυρεοειδούς περίπτωση είχαν ιστολογική απόδειξη του καψικού και αγγειακής εισβολής και τα αδενώματα δεν υπάρχει καμιά ένδειξη καψικού και αγγειακής εισβολής. ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0.01. άξονας Υ είναι 2 ^ -. (ΔΔCt)

Η

miR-126-3p ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του θυρεοειδούς, αποικία και το σχηματισμό σφαιροειδές, και την κυτταρική μετανάστευση

Με δεδομένη την σύνδεση μεταξύ ΜΙΚ 126-3p έκφρασης και επιθετικό φαινότυπο της νόσου του καρκίνου του θυρεοειδούς, θέλαμε να καθορίσει εάν η λειτουργία των miR-126-3p στον καρκίνο του θυρεοειδούς θα μπορούσε να μηχανιστικά να εξηγήσει αυτή τη συσχέτιση. Εμείς υπερεκφράζεται miR-126-3p σε τρία καλά χαρακτηρισμένα και επικυρώνονται κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς (TPC-1, FTC-133 και XTC-1) χρησιμοποιώντας miR-NC ως αρνητικός έλεγχος για να προσδιοριστεί η επίδρασή της επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. miR-126-3p υπερέκφραση ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σημαντικά σε TPC-1 και FTC-133 κύτταρα σε 120 ώρες, κατά 52% (ρ & lt? 0.001) και 37% (ρ & lt? 0.001), αντίστοιχα? Ωστόσο, ανέστειλε πολλαπλασιασμό μόνο κατά 16% σε κύτταρα XTC-1 σε 168 ώρες (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 2Α, 2Β και 2C). Ένα προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ διεξήχθη για να αξιολογηθεί αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη σε FTC-133, το οποίο είναι ένα που σχηματίζουν αποικίες καρκίνο του θυρεοειδούς κυτταρική γραμμή. Βρήκαμε ένα σημαντικά χαμηλότερο αριθμό των αποικιών σε κυτταρικές γραμμές FTC-133 που υπερεκφράζουν miR-126-3p (Σχήμα 2D). Επίσης μελετήσαμε την επίδραση του miR-126-3p στο σχηματισμό σφαιροειδές καρκίνο του θυρεοειδούς του όγκου των κυττάρων. Οι κυτταρικές σειρές FTC-133 και XTC-1 σχηματίσουν σφαιροειδή όταν καλλιεργούνται σε φιάλες εξαιρετικά χαμηλή προσκολλημένη πολιτισμό, και μετά από επιμόλυνση με miR-126-3p, ο αριθμός και το μέγεθος των σφαιριδίων ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 2Ε).

(Α-Γ) τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων θυρεοειδούς σύμφωνα με miR-126-3p υπερέκφραση. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυττάρων. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM). (* Υποδηλώνει ρ & lt? 0,05? ** Υποδεικνύει ρ & lt? 0,01? *** Υποδεικνύει ρ & lt? 0.001). (D) miR-126-3p υπερέκφραση αναστέλλει το σχηματισμό αποικιών στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. Οι αριθμοί των αποικιών σε κυτταρικές γραμμές FTC-133. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει τον αριθμό των αποικιών ανά πεδίο. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM (*** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001). (Ε) miR-126-3p υπερέκφραση μειώνει το μέγεθος και τον αριθμό των σφαιροειδή. Top πίνακα: αντιπροσωπευτική εικόνα των σφαιριδίων σε καλλιέργεια με miR-126-3p υπερέκφραση (FTC-133 κύτταρα). Κάτω πίνακας: Ποσοτικοποίηση των σφαιροειδές διαφορές μεταξύ XTC-1 και κύτταρα FTC-133 με miR-126-3p υπερέκφραση. Η συνολική έκταση που καταλαμβάνεται από τα σφαιροειδή εντός μίας εικόνας μετρήθηκε με την περικύκλωση της περιμέτρου κάθε σφαιροειδούς, σηματοδοτώντας το σύνολο της περιοχής, και τον υπολογισμό των αριθμών pixel με λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει το μέγεθος και τον αριθμό των σφαιροειδών. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM (* υποδηλώνει ρ & lt? 0,05).

Η

Είμαστε δίπλα προσδιοριστεί η επίδραση του miR-126-3p στην κυτταρική μετανάστευση, χρησιμοποιώντας την επούλωση των πληγών μηδέν δοκιμασία. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR-126-3p κλείσιμο ανέστειλε σημαντικά πληγή σε κύτταρα TPC-1 (ρ & lt? 0.001), FTC-133 κύτταρα (ρ & lt? 0.001), και τα κύτταρα XTC-1 (ρ & lt? 0,01) (σχήμα 3Α). Για την επιβεβαίωση των ευρημάτων μας, χρησιμοποιήσαμε επίσης μια δοκιμασία θαλάμου Boyden για να μελετήσει την επίδραση των miR-126-3p στην κυτταρική μετανάστευση. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR-126-3p επίσης ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση (Σχήμα 3Β).

Wound δοκιμασίας (Α) και δοκιμασία θαλάμου Boyden (Β) δεδομένα επούλωσης. MiR-126-3p υπερέκφραση μειώθηκε σημαντικά τραύματος πλάτος κλείσιμο στις 24 ώρες σε όλες τις καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει την απόσταση του τραύματος. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM (** υποδεικνύει ρ & lt? 0,01? *** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001). MiR-126-3p υπερέκφραση μείωσε σημαντικά τον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν σε όλα τα κύτταρα καρκίνου του θυρεοειδούς στη δοκιμασία θαλάμου Boyden. Ο άξονας Υ αντιπροσωπεύει τον αριθμό των μετανάστευσαν κυττάρων ανά πεδίο. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM (* υποδηλώνει ρ & lt? 0,05? ** υποδεικνύει ρ & lt? 0,01? *** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001).

Η

miR-126-3p ρυθμίζει την ανάπτυξη του θυρεοειδούς και μετάσταση όγκου

in vivo

η

Επειδή μας

in vitro

δεδομένα, θέλαμε να αξιολογηθεί η επίδραση του miR-126-3p στην ανάπτυξη του όγκου

in vivo

και να καθορίσει αν παροδικά αυξημένα επίπεδα του miR-126-3p θα μπορούσε να έχει μια σταθερή, μακροπρόθεσμη επίδραση φαινοτυπική. Βρήκαμε ότι μοσχευμάτων όγκων που προέρχονται από FTC-133-

luc2

κύτταρα επιμολυσμένα με miR-126-3p ήταν σημαντικά μικρότερο και ζύγιζαν λιγότερο από μοσχευμάτων όγκων από την ομάδα miR-NC (p & lt? 0,01) (Σχήμα 4Α) . Επειδή μία από τις πιο δραματικές συνέπειες της miR-126-3p υπερέκφραση

in vitro

ήταν στην κυτταρική μετανάστευση, είμαστε δίπλα καθοριστεί αν miR-126-3p ρυθμιζόμενη μετάσταση

in vivo

. Για να προσδιορίσετε αν η υπερέκφραση του miR-126-3p θα μπορούσε να αναστείλει την μετάσταση του όγκου

in vivo

, FTC-133-

luc2

κύτταρα επιμολυσμένα με miR-126-3p και miR-NC ενέθηκαν σε αθυμικά γυμνούς ποντικούς μέσω της φλέβας της ουράς, και οι ποντικοί απεικονίστηκαν κάθε εβδομάδα. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του miR-126-3p δραματικά κατέστειλε μετάσταση πνεύμονα σε αυτό το μοντέλο (Σχήμα 4Β).

(Α) η ανάπτυξη των καρκινικών ξενομοσχευμάτων σε γυμνούς ποντικούς. Αριστερό πλαίσιο: αντιπροσωπευτικό εικόνες του μεγέθους ποντίκια ξενομοσχευμάτων κατά την αυτοψία. Μέση και δεξί πλαίσιο: δραστηριότητα λουσιφεράσης όγκου και μέτρηση του όγκου του όγκου και του βάρους. κύτταρα FTC-133-Luc2 επιμολυσμένα με miR-126-3p και miR-NC εμβολιάστηκαν υποδορίως στα πλευρά αθυμικών άτριχων ποντικών. (Β) μετάστασης όγκου. Αριστερό πλαίσιο: Εκπρόσωπος εικόνες των ποντικιών με μεταστάσεις δείχνει σήμα φωταύγειας. Μεσαίο πάνελ: Ποσοτικοποίηση των διαφορών έντασης του σήματος φωταύγειας μεταξύ miR-126-3p και miR-NC. κύτταρα FTC-133-Luc2 επιμολυσμένα με miR-126-3p και miR-NC ενέθηκαν σε αθυμικά γυμνά ποντίκια μέσω της φλέβας της ουράς, και οι ποντικοί απεικονίστηκαν με ένα 100 σύστημα Xenogen IVIS. Η σχετική σήμα φωταύγειας κάθε ποντικού υπολογίζεται ως ο λόγος του αρχικού σήματος με το σήμα που λαμβάνεται 14 ημέρες μετά την ένεση. Οι εικόνες που παρουσιάζονται εδώ ελήφθησαν 7 εβδομάδες μετά την φλεβική έγχυση των κυττάρων όγκου. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM (* υποδηλώνει ρ & lt? 0,05? ** υποδεικνύει ρ & lt? 0,01? *** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001). Όλα τα ζωικά πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές. Δεξιά πίνακα: Ένας εκπρόσωπος μικροσκοπική εικόνα (αιματοξυλίνη και ηωσίνη [H & amp? Ε] χρώση) του μεταστατικού όγκου των πνευμόνων που προκαλείται από τα κύτταρα FTC-133-Luc2 επιμολυσμένα με miR-NC και ένα H & amp? E-χρωματισμένο τμήμα των μεταστατικών όγκων των πνευμόνων που προκαλείται από FTC -133-Luc2 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-126-3p.

η

miR-126-3p ρυθμίζει ADAM9 και έκφραση SLC7A5 σε καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς

Δεδομένου ότι το miR-126-3p είχε μια επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η μετανάστευση και η μετάσταση

in vitro

και

in vivo

, ενδιαφερθήκαμε για τον προσδιορισμό μονοπάτι του στόχου (ες) και το γονίδιο (-α). Χρησιμοποιήσαμε δύο προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό υποψήφιο miR-126-3p στόχους: (1). Γονιδιώματος-ευρεία ανάλυση έκφρασης με υπερέκφραση του miR-126-3p και (2) μια ανάλυση στόχου βάση δεδομένων πρόβλεψης

Ολοκληρωμένες αναλύσεις των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία και στόχο την πρόβλεψη σάρωσης αποκάλυψε 14 γονίδια ως στόχοι του miR-126-3p (S1 πίνακα). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση μονοπάτι με αυτά τα 14 γονίδια. Τα κορυφαία ασθένειες και βιολογικών λειτουργιών που προσδιορίζονται από το IPA συνοψίζονται στον Πίνακα S2. Καρκίνος ήταν η κορυφαία κατηγορία ασθενειών, με τέσσερα μόρια που εμπλέκονται σε αυτή την οδό που μειώθηκαν σημαντικά κατά miR-126-3p υπερέκφραση. Επιπλέον, μεταξύ των 14 γονιδίων, βρήκαμε ότι

SLC7A5

είχαν τα υψηλότερα αλλαγές φορές και στις δύο κυτταρικές σειρές κατά miR-126-3p υπερέκφραση, και

ADAM9

είχε το δεύτερο υψηλότερο αλλαγή φορές (2,8 φορές σε) σε κύτταρα FTC-133, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τις δύο

in vitro

και

in vivo δοκιμασίες

στην παρούσα μελέτη. Τόσο

ADAM9

και

SLC7A5

παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές καρκίνους και έχει αποδειχθεί να απευθύνονται από miR-126-3p [13-16]. Έτσι, μας ενδιαφέρει να καθοριστεί εάν τα επίπεδα SLC7A5 και πρωτεΐνες ADAM9 άλλαξαν μετά miR-126-3p υπερέκφραση. Βρήκαμε ότι miR-126-3p υπερέκφραση μειωμένη έκφραση πρωτεΐνης SLC7A5 σε TPC-1 και τα κύτταρα (Σχήμα 5Α) 1 XTC-και μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης ADAM9 σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (TPC-1, FTC-133, και XTC-1) (Σχήμα 5Β). Βρήκαμε επίσης ότι miR-126-3p υπερέκφραση μειωτικά την έκφραση της πρωτεΐνης ADAM9 σε FTC-133-

luc2

ξενομοσχευμάτων όγκου που είχε εμβολιαστεί υποδορίως στα πλευρά αθυμικών γυμνών ποντικών και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 ημέρες (Σχ 5C ). Λαμβάνοντας υπόψη αυτά τα αποτελέσματα, είμαστε δίπλα καθοριστεί αν

ADAM9

και /ή

SLC7A5

ήταν άμεσοι στόχοι του miR-126-3p. Πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς λουσιφεράσης σε κύτταρα FTC-133 συν-επιμολύνθηκαν με pEZX-ADAM9-3’UTR (φορέα με 3′-UTR του

ADAM9

) και miR-126-3p ή miR-NC. Βρήκαμε ότι miR-126-3p υπερέκφραση μειώθηκε σημαντικά δραστικότητα λουσιφεράσης σε σύγκριση με τον αρνητικό μάρτυρα (Σχήμα 5D), προτείνοντας ότι miR-126-3p στοχεύει άμεσα την περιοχή 3′-UTR του

ADAM9

και

SLC7A5

στον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα. Είμαστε δίπλα ανέλυσε εάν υπήρχε σχέση μεταξύ miR-126-3p έκφρασης και έκφραση ADAM9 και SLC7A5 mRNA στο TCGA θηλώδους καρκίνου του θυρεοειδούς σύνολο δεδομένων, και βρήκε μια σημαντική αντίστροφη συσχέτιση με την έκφραση SLC7A5 mRNA (r = -0,257, p & lt? 0.01), αλλά όχι με έκφραση ADAM9 mRNA (Σχήμα 5Ε).

(Α) ανοσοστυπώματα του SLC7A5 και GAPDH σε κυτταρικές γραμμές XTC-1 TPC-1 και, τα οποία επιμολύνθηκαν με είτε miR-126-3p ή miR-NC για 72 ώρες. Η κυτταρική γραμμή FTC-133 δεν είχε καμία ανιχνεύσιμη έκφραση πρωτεΐνης για SLC7A5. (Β) Τα ανοσοστυπώματα για ADAM9 και GAPDH σε TPC-1, κυτταρικές γραμμές XTC-1 FTC-133 και, τα οποία επιμολύνθηκαν με είτε miR-126-3p ή miR-NC για 72 ώρες

in vitro

. (Γ) Τα ανοσοστυπώματα για την ανίχνευση ADAM9 και GAPDH σε ξενομοσχεύματα όγκου FTC-133-Luc2 που είχε εμβολιαστεί υποδορίως στα πλευρά αθυμικών γυμνών ποντικών και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 10 ημέρες. (D) δραστηριότητα λουσιφεράσης του pEZX-SLC7A5-3’UTR και pEZX-SLC7A5-3’UTR σε κύτταρα FTC-133 όταν συν-επιμολυσμένα με miR-126-3p ή miR-NC. Όλες οι μετρήσεις λουσιφεράσης έγιναν εις τριπλούν και οι αναγνώσεις έγιναν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM (*** υποδεικνύει ρ & lt? 0.001). (Ε) Το επίπεδο έκφρασης του miR-126-3p σημαντικά αντίστροφα με το επίπεδο έκφρασης του

SLC7A5

σε 481 θηλώδες δείγματα καρκίνου του θυρεοειδούς από το σύνολο δεδομένων TCGA. *** Υποδεικνύει ρ & lt?. 0.001

Η

miR-126-3p μειώνει την έκκριση του VEGF και του σχηματισμού ενδοθηλιακού σωλήνα

Δεδομένου ότι βρήκαμε miR-126-3p έκφραση είναι χαμηλότερο σε εντοπισμένες ωοθυλακίων καρκίνο του θυρεοειδούς με καψικούς και αγγειακή εισβολή, και miR-126-3p έχει αναφερθεί για τη ρύθμιση της αγγειογένεσης και στόχος

VEGF

, έχουμε την επόμενη προσδιοριστεί αν miR-126-3p ρυθμίζει την αγγειογένεση στον καρκίνο του θυρεοειδούς κυττάρων [17-20] . Βρήκαμε ότι miR-126-3p υπερέκφραση μειώθηκε σημαντικά η έκκριση του VEGF σε δύο από τις τρεις καρκίνου του θυρεοειδούς κυττάρων

in vitro

(Σχήμα 6Α). Ένας από τους κύριους καθοριστικούς παράγοντες για την επιτυχή ανάπτυξη του όγκου είναι η ικανότητα να προσλάβει νέα αιμοφόρα αγγεία. Έτσι, αναλύσαμε το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης VEGF στον πνεύμονα μεταστατικούς όγκους από τα

in vivo

μελέτες και σχηματισμός σωλήνων ενδοθηλιακών με την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας HUVEC

in vitro

.