Αφηρημένο

Ιστορικό

Distant καρκίνοι του προστάτη είναι συνήθως ορμονοάντοχο και εμφανίζουν αυξημένη ανάπτυξη δεν αναστέλλεται από θεραπεία στέρησης ανδρογόνων . Η κατανόηση όλων των μοριακών μηχανισμών που συμβάλλουν στην ανεξέλεγκτη ανάπτυξη, είναι σημαντικό να αποκτήσει αποτελεσματικές στρατηγικές θεραπείας για ορμονοάντοχο καρκίνους του προστάτη (HRPC). Ο υποδοχέας αρυλ υδρογονάνθρακα (AhR) επηρεάζει έναν αριθμό βιολογικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης. Αρκετές μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι η εξωγενής προσδέματα AhR αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό αλλά πρόσφατα στοιχεία δείχνουν AhR μπορεί να διαθέτουν εγγενείς λειτουργίες που προάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε απουσία εξωγενών προσδεμάτων.

μέθοδοι /Αποτελέσματα

qRT-PCR και ανάλυση κηλιδώσεως Western χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό AhR mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε ευαίσθητα ορμόνη κύτταρα LNCaP καθώς ορμόνη πυρίμαχο καρκινικές κυτταρικές γραμμές DU145, PC3 και PC3M προστάτη. LNCaP κύτταρα εκφράζουν AhR mRNA και πρωτεΐνης σε πολύ χαμηλότερο επίπεδο από τις ορμόνες μοντέλα πυρίμαχων κυττάρων. Κυτταρική κλασματοποίηση και ανοσοκυτταροχημεία αποκάλυψε πυρηνικό εντοπισμό των AhR στις καθιερωμένες ορμονοάντοχο κυτταρικές σειρές, ενώ τα κύτταρα LNCaP στερούνται της πρωτεΐνης πυρηνικής AhR. Ανάλυση qRT-PCR που χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των βασικών επιπέδων ΟΥΡ1Β1 και ξενοβιοτικών δοκιμασία σύνδεσης στοιχείο απόκρισης επιβεβαίωσε συνδέτη ανεξάρτητη μεταγραφική δραστηριότητα της AhR σε DU145, PC3 και PC3M κύτταρα. Τα βασικά επίπεδα ΟΥΡ1Β1 μειώθηκαν με αγωγή με ειδικό αναστολέα Ahr και CH223191. Ένα

in vitro

δοκιμασία ανάπτυξης αποκάλυψε ότι CH223191 ανέστειλε την ανάπτυξη των DU145, PC3 και PC3M κύτταρα σε ένα ανδρογόνων εξαντλημένο περιβάλλον. Ανοσοϊστοχημική χρώση των καρκινικών ιστών του προστάτη αποκάλυψε αυξημένη πυρηνικό εντοπισμό του AhR βαθμού 2 και βαθμού 3 καρκίνων σε σύγκριση με την καλά διαφοροποιημένο βαθμού 1 καρκίνων.

Συμπεράσματα

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι AhR είναι συστατικώς δραστηριοποιούνται σε προηγμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ότι το μοντέλο της ορμόνης του καρκίνου του προστάτη πυρίμαχα. Χημική κατάλυση της AhR σηματοδότησης μπορεί να μειώσει την ανάπτυξη του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη κύτταρα, ένα αποτέλεσμα που δεν επιτυγχάνεται με αναστολείς των υποδοχέων των ανδρογόνων ή αύξηση των ανδρογόνων απεμπλουτισμένου ΜΜΕ

Παράθεση:. Richmond O, Ghotbaddini Μ, Allen C, Walker Α, Ζαχίρ S, Πάουελ JB (2014) ο υδρογονάνθρακας Receptor αρύλιο είναι συστατικά ενεργός στα κύτταρα προχωρημένους καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (4): e95058. doi: 10.1371 /journal.pone.0095058

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 20 Δεκέμβρη του 2013? Αποδεκτές: 23 Μαρτίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 22η Απριλίου, 2014

Copyright: © 2014 Richmond et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτές οι μελέτες υποστηρίχθηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Μειονοτήτων υγείας και της υγείας ανισότητες /Ερευνητικό Κέντρο στα Μειονοτικά Ιδρύματα Grant # 8 G12 MD007590. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικές ενδιαφέρον

Εισαγωγή

στις Ηνωμένες Πολιτείες, ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται για τους άνδρες [1]. Η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία εκτιμά ότι θα υπάρξουν περίπου 238.590 άνδρες διαγνώστηκαν με προστάτη και ότι 29.720 θα πεθάνουν από σχετικές προστάτη αίτια το 2013 [1]. Σύμφωνα με τις εθνικές στατιστικές επιβίωσης, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για τους άνδρες διαγνώστηκαν με τοπικές ή περιφερειακές καρκίνος του προστάτη είναι 100%. Ωστόσο, οι άνδρες διαγνώστηκαν με μια μακρινή μετάσταση έχουν ένα πενταετές ποσοστό επιβίωσης μόλις 29% [2].

Από προστάτη είναι εξαρτώμενη από ανδρογόνα, η κύρια θεραπεία περιλαμβάνει θεραπεία στέρησης ανδρογόνων (ADT) για μεταστατική νόσο [3] . Οι περισσότεροι καρκίνοι του προστάτη ανταποκρίνονται αρχικά να ADT όπως μετράται από τη μείωση της ειδικό αντιγόνο ορού προστάτη (PSA). Ωστόσο, εντός 2 ετών οι περισσότεροι ασθενείς να σταματήσει να ανταποκρίνεται στη θεραπεία και την ανάπτυξη ορμονοάντοχο καρκίνο του προστάτη (HRPC) [4], [5]. Δεν υπάρχει θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη ορμονοάντοχο (HRPC), η οποία αν και ADT ανθεκτικά εξακολουθεί υποδοχέα ανδρογόνου εξαρτώμενη [6]. Πολυάριθμες μηχανισμοί έχουν εμπλακεί στην παρατεταμένη ανδρογόνων σηματοδότηση υποδοχέα σε HRPC. Αυτές περιλαμβάνουν αυξήσεις στην έκφραση του υποδοχέα ανδρογόνων, η αυξημένη στεροειδογένεση εντός των κυττάρων του όγκου, σημειακές μεταλλάξεις που μεταβάλλουν δραστικότητα υποδοχέα ανδρογόνων, αλλαγές στην ισορροπία του συν-ενεργοποιητή /συν-καταστολέα πρωτεΐνες, και οι αλλαγές σε κυτταρικές οδούς που αλληλοπαρεμβολές με τον υποδοχέα ανδρογόνων [5 σηματοδότησης ], [7]. Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι ο υποδοχέας υδρογονανθράκων αρυλ μπορούν να συμμετέχουν σε στιχομυθία με την AR και την υποστήριξη της ανάπτυξης AR υπό ανδρογόνων υποβαθμισμένες συνθήκες. Επιπλέον, μελέτες έχουν δείξει ότι AhR έχει αντίκτυπο στην μεταγραφική δραστικότητα υποδοχέα ανδρογόνων. AhR και η AhR πυρηνικές μεταθέτη (ARNT) αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα ανδρογόνων [8]. Ωστόσο, μόνο AhR ήταν σε θέση να ενισχύσει μεταγραφική δραστικότητα υποδοχέα ανδρογόνων εν απουσία εξωγενούς συνδέτη [9].

Επί του παρόντος, AhR είναι το μόνο γνωστό μέλος συνδετήρα-ενεργοποιημένη του βασικού-έλικας-βρόχου-έλικας ( bHLH) της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων. Ενεργοποιείται από την σύνδεση ενός ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών τοξινών συμπεριλαμβανομένων πολυαρωματικών και πολυκυκλικοί υδρογονάνθρακες (ΡΑΗ) [10]. Ενώ στο κυτοσόλιο, AhR βρίσκεται σε ένα συγκρότημα που αποτελείται από δύο μόρια HSP90, συν-chaperone Ρ23, AhR πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης Ανοσιοφιλίνης σαν (ΑΙΡ) και κινάσης τυροσίνης c-src [11], [12], [13] , [14]. Αυτή η σύνθετη πρωτεΐνη έχει σχεδιαστεί για να διατηρήσει το ανενεργό διάπλαση και την πρόληψη της πυρηνικής μετατόπισης.

Με την δέσμευση με συνδέτες, ενεργοποιείται AhR μετατοπίζεται στον πυρήνα και ετεροδιμερίζεται με την πρωτεΐνη AhR πυρηνικό μεταθέτη (ARNT) [10], [15] . Το συγκρότημα πυρηνικών AhR αλληλεπιδρά με στοιχεία ξενοβιοτικών ανταπόκριση (XRE) στους υποκινητές γονιδίων της φάσης Ι και φάσης ΙΙ ενζύμων που μεταβολίζουν το φάρμακο για την ενίσχυση της μεταγραφής [16], [17], [18]. Μετά την επαγωγή του AhR αποκριτικών γονιδίων, AhR σηματοδότηση τερματίζεται αμέσως υποβάθμιση ή με σύνδεση με έναν αναστολέα της πρωτεΐνης [19], [20], [21].

ενεργοποίηση συνδέτη AhR έχει αναφερθεί ότι ανταγωνίζονται υποδοχέα ανδρογόνων σηματοδότηση. Ισχυροί AhR αγωνιστή, 2,3,7,8-τετραχλωρο-διβενζο

σ

-διοξιν (TCDD), ανέστειλε τεστοστερόνη-εξαρτώμενη μεταγραφική δραστικότητα και η τεστοστερόνη ρυθμίζονται ειδικό προστατικό αντιγόνο (PSA) έκφραση σε ένα εξαρτώμενο από την δόση τρόπο [22]. TCDD επίσης αναστέλλει εξαρτώμενη από ανδρογόνα πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [23]. Συν-ενεργοποίηση των AhR και υποδοχέα ανδρογόνων με TCDD και διυδροτεστοστερόνη (DHT), μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης AR [24]. Η παρατήρηση αυτή συνέβαλε στην ικανότητα του AhR να προωθήσει την πρωτεόλυση του AR μέσω συναρμολόγησης ενός ουβικιτίνης συγκρότημα λιγάσης στην οποία AhR δρα ως υπομονάδα υπόστρωμα αναγνώρισης για την πρόσληψη AR και μπορεί να εξηγήσει τις αντιανδρογόνου δράσεις ενός αριθμού προσδεμάτων AhR [25].

Παρά τις μελέτες που επιβεβαιώνουν ρύθμιση συνδέτη AhR της σηματοδότησης AR, AhR μπορεί να διαθέτουν εγγενείς λειτουργίες που ρυθμίζουν την αύξηση των καρκίνων του προστάτη ανεξάρτητα από την κατάσταση AR που δεν έχει πλήρως μελετηθεί. Δομικά, AhR περιέχει τόσο ένα σήμα πυρηνικού εντοπισμού και ένα σήμα πυρηνικής εξαγωγής που απαιτούνται για την πυρηνική-κυτταροπλασματική παλινδρόμηση των AhR [26]. Αρκετές αναφορές αποκαλύπτουν συστατική σηματοδότησης AhR μέσα σε διάφορους τύπους καρκίνου. Εν απουσία εξωγενών συνδετών, AhR υπερέκφραση επάνω ρυθμισμένη την έκφραση του γονιδίου στόχου ΟΥΡ1Β1 στο πρώιμο στάδιο του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα [27]. ΟΥΡ1Β1 εκφράζεται επίσης σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων απουσία ενός εξωγενούς συνδέτη. έκφραση ΟΥΡ1Β1 συνοδεύεται από αυξημένη έκφραση AhR και συστατική δραστικότητα του υποδοχέα [28], [29]. Η εξάντληση των AhR πρωτεΐνη είχε ως αποτέλεσμα την επακόλουθη μείωση της έκφρασης ΟΥΡ1Β1, επιβεβαιώνοντας ότι η βασική έκφραση ΟΥΡ1Β1 ρυθμίζεται από ιδιοσυστατική σηματοδότηση AhR. Οι προ-κακοήθη και κακοήθη μαστικού ιστούς αναφερθεί mRNA ιδιοσυστατικά εκφράζουν ΟΥΡ1Β1. Σε αυτούς τους όγκους του ανθρώπου και των τρωκτικών του μαστού, AhR ήταν επίσης υπερ-εκφράζεται και ουσιαστικά δραστική [30].

Επιπλέον, ηπάτωμα κύτταρα ποντικού δεν έχουν εκτεθεί σε εξωγενές συνδετήρες AhR δείχθηκε να περιέχει μεταγραφικά ενεργή AhR. Επίσης, ένα σημαντικό επίπεδο συστατικής δραστικότητας AhR αναφέρθηκε σε κύτταρα που απομονώθηκαν από καρκίνωμα κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων (HNSCC) ασθενείς (DiNatale2012). Επίσης, παροδική υπερέκφραση AhR σε μηδενική κυτταρική σειρά AhR προκάλεσε επίσης συνδέτη ανεξάρτητη μεταγραφική δραστηριότητα [29], [31].

προστάτη ιστό αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία αποκάλυψε ότι η καλοήθης υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) επιθηλιακά κύτταρα έχουν μειωθεί σημαντικά AhR έκφραση σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό. Ωστόσο, η έκφραση AhR ήταν συχνά αυξημένη σε περισσότερες αποδιαφοροποιημένων περιοχές του όγκου [32]. Μια ξεχωριστή μελέτη ανιχνεύθηκε επίσης σημαντικά υψηλότερη έκφραση AhR και ενεργοποίηση σε κύτταρα όγκου σε σύγκριση με καλοήθη αδενικό επιθήλιο [33].

Η κυτταρική γραμμή LNCaP, που προέρχεται από μετάσταση λεμφαδένα, είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο ανθρώπινου προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή χρησιμοποιηθεί για να αποδείξει την ευαισθησία ανδρογόνων. LNCaP κύτταρα εκφράζουν ένα μεταλλαγμένο υποδοχέα ανδρογόνου και του ειδικού προστατικού ανδρογόνου [34]. LNCaP κύτταρα δεν είναι ογκογονικά σε γυμνά ποντίκια [35], [36]. Σε αντίθεση, ανδρογόνο αναίσθητος κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, DU145 και PC3 είναι ιδιαίτερα ογκογόνα σε γυμνά ποντίκια. Παρόλο που δεν εκφράζουν τον υποδοχέα ανδρογόνων, θα αποκρίνονται στα ανδρογόνα, αλλά δεν έχουν κατασταλεί ανάπτυξη υπό ανδρογόνων στερηθεί συνθήκες ανάπτυξης [37], [38]. Αυτές οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται συνήθως ως

in vitro

μοντέλα για μελέτες που περιλαμβάνουν ορμόνες καρκίνου του προστάτη πυρίμαχα. Η κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη PC3M απομονώθηκε από γυμνούς ποντικούς μετά intraspenic ένεση κυττάρων PC3 και είναι ιδιαίτερα μεταστατική [39]. Αν και αρκετές μελέτες έχουν δείξει τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης συνδεσμικού AhR σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, καμία μελέτη δεν έχει διερευνηθεί ο ρόλος των ιδιοσυστατική σηματοδότηση Ahr στις καρκίνο του προστάτη κυτταρική ανάπτυξη. Έχουμε αναφέρει προηγουμένως ότι AhR απαιτείται για τη διατήρηση των ορμονών ανεξάρτητη σηματοδότησης και ανάπτυξης με τον υποδοχέα ανδρογόνων σε C4-2 κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα στοιχεία αυτά δείχνουν έναν άμεσο ρόλο για AhR σε εξαρτώμενη από ανδρογόνα υποδοχέα αύξηση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [29]. Σε αυτή την παρούσα μελέτη δείξαμε ότι AhR είναι ουσιαστικά δραστική σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη κύτταρα και ότι εκτομή του συστατική AhR σηματοδότησης να αναστέλλουν ανδρογόνο ανάπτυξη ανεξάρτητη δεν εξαρτάται από την κατάσταση του υποδοχέα ανδρογόνων.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

AhR αγωνιστή, 2,3,7,8-τετρα-διβενζο

σ

διοξιν (TCDD), αγοράστηκε από AccuStandard (New Haven, Connecticut). ανταγωνιστή AhR, (CH223191) αγοράστηκε από Sigma Aldrich. Ανδρογόνων ανταγωνιστή υποδοχέα, Casodex (CDX) αγοράστηκε από την Sigma Aldrich.

Cell Culture

προσκολλημένες καλλιέργειες μονοστοιβάδας ανθρώπινων καρκίνου προστάτη κυτταρικές γραμμές LNCaP, DU145, PC3 και PC3M διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 100 mmol /L κάθε πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C με 5% CO2 σε υγρή ατμόσφαιρα, και μέσα αντικαταστάθηκαν κάθε τρίτη ημέρα. Τα κύτταρα χωρίστηκαν (1:03), όταν έφθασαν κοντά σε συρροή. Η απάντησή τους στα ανδρογόνα για τη δράση ανάπτυξης και του υποδοχέα ανδρογόνων παρακολουθήθηκε διακεκομμένα κατά τη διάρκεια της μελέτης.

RNA Εκχύλιση και Ποσοτική qRT-PCR Ανάλυση

Ολικό RNA απομονώθηκε από μονοστιβάδες κυττάρων που αναπτύσσονται σε ιστοκαλλιέργεια 100 mm πιάτα χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen). 2 μg του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ Superscript II (Invitrogen), σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Το cDNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε ένα μίγμα αντίδρασης 25 μΐ και υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το ακόλουθο πρωτόκολλο: μία αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 39 κύκλους ενίσχυσης (95 ° C για 10 s και 55-65 ° C για 30 s), 95 ° C για 10 s, 65 ° C για 5 s και 95 ° C για 50 s. Το 25 μΙ μείγμα αντίδρασης qPCR αναμίχθηκε με GoTaq qPCR Master Mix (Promega). καμπύλη Melt αναλύσεις έγιναν μετά από κάθε τρέξιμο για να εξασφαλιστεί ένα ενιαίο προϊόν. Σχετική έκφραση γονιδίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο υπολογισμού ΔΔCq. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: L-19: Forward (5′-3 ‘) TCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTT & amp? Αντίστροφη (5′-30:) TGCCTGTCACTATTCCTCATGCCA & amp? Reverse (5’-3 ‘) TCTGCTGGTCAGGTCCTTGTTGAT Η ιδιαιτερότητα αυτών των εκκινητών σύνολα επικυρώθηκαν από την εκτέλεση πειραμάτων με χρήση ειδικών Τα siRNAs που στοχεύουν AhR στο «TTGAGACCAGCCTGACCAACATGA ΟΥΡ1Β1 Forward (5’-3.». Tran et al [29].

Protein Απομόνωση και Ανάλυση Western Blot

τα δείγματα πρωτεΐνης απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ Thermo Scientific NE-ανά εκχύλιση για κυτταρικά κλάσματα ή εμπορικά διαθέσιμο ρυθμιστικό λύσης κυττάρου (κυτταρική σηματοδότηση ) για ολική πρωτεΐνη. τα δείγματα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με το μονοκλωνικό αντίσωμα 1 μg /ml ποντίκι AhR στο 1:1000 αραίωση σε 5% γάλα. οι κηλίδες πλύθηκαν τρεις φορές (15 min κάθε φορά) με TBST. Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν σε 1:2500 αραίωση του δευτερογενούς αντισώματος και πλύθηκαν τρεις φορές (15 λεπτά η κάθε μία) με TBST, τρεις φορές (10 λεπτά η κάθε μία) με TBS και μία φορά με ddH20 (10 λεπτά). Συγκροτήματα οπτικοποιήθηκαν με το κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) όπως καθορίζεται από τον κατασκευαστή. Πολλαπλές εκθέσεις κάθε σετ δειγμάτων παρήχθησαν. Η σχετική συγκέντρωση της πρωτεΐνης-στόχου προσδιορίζεται με ανάλυση υπολογιστή και ομαλοποιήθηκε ως προς ένα εσωτερικό πρότυπο (τοποϊσομεράση, β-τουμπουλίνη, β-ακτίνη).

ανοσοκυτταροχημική χρώση και φθορισμού μικροσκοπία

κύτταρα αναπτύσσονται πάνω σε γυαλί καλυπτρίδες σε πλάκες 6-φρεατίων πλύθηκαν σε ψυχρό PBS και μονιμοποιήθηκαν με επώαση σε 1:01 μεθανόλη: ακετόνη διάλυμα σε 4 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια ξηραίνεται στον αέρα. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν και ενυδατωμένο με ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.05% Tween 20 (TBST) και μεταφέρθηκε σε μία καθαρή πλάκα 6 φρεατίων. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα σε διάλυμα 5% γάλα εντός TBST να εμποδίσει μη ειδικής σύνδεσης, που ακολουθείται από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα με αντι-AhR πολυκλωνικό αντίσωμα καθαρισμένο με συγγένεια κουνέλι σε 1 μg /ml σε 1:1000 αραίωση σε διάλυμα 4% γάλα σε TBST. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές (15 λεπτά καθένα) με TBST. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αραίωση 1:200 του ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC), συζευγμένης αντισώματα αντι-κουνελιού (εργαστήρια Jackson Immunoresearch, West Grove, ΡΑ) σε 4% γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές (15 λεπτά η κάθε μία) με TBST, τρεις φορές (10 λεπτά η κάθε μία) με TBS και μία φορά με ddH20 (10 λεπτά). Τα κύτταρα στη συνέχεια τοποθετείται σε διαφάνειες χρησιμοποιώντας UltraCruz σκληρό οριστεί μέσο στερέωσης περιέχει 4’6′-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI).

XRE

Δεσμευτική

4 × 10

4 κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα επιμολύνθηκαν με XRE ρεπόρτερ, καθώς και με θετικό και αρνητικό πλασμίδια ανταποκριτές ελέγχου χρησιμοποιώντας attractene. Μετά από 18 ώρες επιμόλυνσης, τα μέσα άλλαξαν σε στάνταρ μέσο προσδιορισμού (DMEM + 0.5% FBS 0,1 mM ΝΕΑΑ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για άλλες 24 ώρες υπό κανονικές συνθήκες των κυττάρων. Μια διπλή δοκιμασία λουσιφεράσης εκτελέστηκε μετά από 42 ώρες επιμόλυνσης, και οι τιμές δραστηριότητα υποκινητή που εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες φθορισμού (AFU). Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και το τυπικό σφάλμα υποδεικνύεται.

Πολλαπλασιασμός Μελέτες

Η ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το Promega CellTiter 96 Κυττάρων Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μία τελική συγκέντρωση 1,0 × 10

5 μg /mL σε RPMI. 50 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος (5.000 κύτταρα) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο της πλάκας 96-φρεατίων που περιέχει 50 μΙ μέσου με αντίστοιχες θεραπεία με αποτέλεσμα ένα συνολικό όγκο 100 μΙ. Οι μικροπλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 24-72 ώρες σε μια υγροποιημένη, 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών, μετά την επώαση, 20 μΐ διαλύματος MTS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 4 ώρες. 100 μΙ διαλύματος τερματισμού προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 1 ώρα. Οι απορροφήσεις διαβάστηκαν στα 570 nm χρησιμοποιώντας τον αναγνώστη μικροπλακός πολύτροπη Synergy H1m.

ανοσοϊστοχημική χρώση

slides ιστών αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε βαθμολογούνται κάτω σειρά αιθανόλης (70, 90 και 100% ) και τέλος ddH20. Αντιγόνα ανακτήθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό Biocare πριν από την επώαση σε 0.3% Η

2O

2 για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές (5 λεπτά κάθε φορά) σε PBS. Τα πλακίδια μπλοκαρίστηκαν με επώαση σε διάλυμα αποκλεισμού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου φυσιολογικό ορό κατσίκας. Τα πλακίδια επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα 1 μg /ml κουνελιού αντι-AhR (1:100 αραίωση) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά την επώαση με πρωτογενές αντίσωμα, τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές (5 λεπτά κάθε φορά) με PBS πριν από την επώαση 1 ώρας με κατσίκα, (1:400) αραίωση δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές (5 λεπτά κάθε φορά) σε PBS και επωάστηκαν 10 λεπτά, με diaminobenzedine ανά κατασκευάζει οδηγίες. Και πάλι, τα πλακίδια πλύθηκαν τρεις φορές (5 λεπτά κάθε φορά) με PBS, ξεπλύθηκαν με DDH

2Ο και αφυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένες up-σειρά αιθανόλης πριν καθαρίστηκαν σε ξυλόλιο και στερεώθηκαν χρήση μέσων στερέωσης ξυλόλιο βάση. Εικόνες από κάθε δείγμα ιστού, καθώς και αντίστοιχες αιματοξυλίνη και ηωσίνη λεκέδες συνελήφθησαν σε μεγέθυνση 400χ για μετέπειτα βαθμολόγησης. Anti-AhR αντιδραστικότητα βαθμολογήθηκε σε μία κλίμακα 1-3 (1 = χαμηλή αντιδραστικότητα και 3 = υψηλή αντιδραστικότητα) για το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα της κάθε δείγμα ιστού από δύο ανεξάρτητους ερευνητές.

Στατιστική Ανάλυση

Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον 3 φορές και όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή + SEM. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκαν με t-test ή ANOVA χρησιμοποιώντας λογισμικό INSTAT (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

I.. AhR υπερεκφράζεται σε προχωρημένους καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές

καρκινικές κυτταρικές σειρές DU145, PC3 και PC3M προστάτη χρησιμοποιήθηκαν ως μοντέλα καρκινικών κυττάρων ορμονοάντοχο προστάτη. Αυτές οι 3 κυτταρικές γραμμές έχουν δειχθεί να διατηρούν ρυθμούς ανάπτυξης σε ένα ανδρογόνο εξαντλημένο περιβάλλον [37], [38], [39]. LNCaP είναι ένα ανδρογόνο μοντέλο κύτταρο ευαίσθητο καρκίνο του προστάτη των οποίων ο ρυθμός ανάπτυξης μειώνεται κάτω από συνθήκες ανδρογόνων απεμπλουτισμένου [34]. Η έκφραση του mRNA AhR στις κυτταρικές σειρές ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR. έκφραση της πρωτεΐνης AhR κάθε γραμμή εξετάστηκε με western blot. κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη Advance έχει μια αύξηση στην έκφραση του mRNA και AhR πρωτεΐνη σε σύγκριση με το ανδρογόνο ευαίσθητο, LNCaP, κυτταρική γραμμή. LNCaP κύτταρα εκφράζουν τόσο mRNA AhR και πρωτεΐνες. Ωστόσο, DU145 και κυττάρων PC3 έχουν μια αύξηση κατά 2,5 και 5 φορές σε AhR mRNA αντιστοίχως (Εικ. 1Β). Αυτό συσχετίζεται με την αύξηση κατά 2 φορές σε AhR πρωτεΐνης στο DU145 και αύξηση περισσότερο από 2,5 φορές σε κύτταρα PC3 (Εικ. 1Α). κύτταρα PC3M έχουν την μεγαλύτερη αύξηση σε έκφραση AhR όταν συγκρίνονται με κύτταρα LNCaP. Υπήρξε μια 10 φορές αύξηση σε PC3M mRNA και 3-πλάσια αύξηση στην πρωτεΐνη AhR (Εικ. 1).

A. Σύνολο κυτταρικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν από LNCaP, DU145, PC3 και PC3M προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος SDS πολυακρυλαμίνης και κηλιδώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-AhR. Αντι-β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Εικόνα J χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί desitometric μέτρα από 3 ανεξάρτητες μεμβράνες. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση ± SEM (η = 3) και αναλύθηκαν με student t-test. Στατιστικά σημαντικές διαφορές (* p & lt? 0,05) σε σύγκριση με τον έλεγχο LNCaP. B. Ολικά RNAs απομονώθηκαν και ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση του mRNA των AhR στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. mRNA επίπεδα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας L-19 το οποίο χρησιμεύει ως εσωτερικός έλεγχος. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση ± SEM (η = 3) και αναλύθηκαν με student t-test. (*) Υποδηλώνει στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων.

Η

II. Συνδέτη Ανεξάρτητη πυρηνικό εντοπισμό των AhR

Για να προσδιοριστεί εντοπισμός των AhR πρωτεΐνης, απομονώσαμε κυτταρικά κλάσματα και εκτελούνται ανοσοαποτύπωση για AhR στα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα. Η ανάλυση στυπώματος Western των κυτταρικών κλασμάτων απεκάλυψε ότι η αύξηση της έκφρασης AhR στις προηγμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη συνοδεύεται από πυρηνική συσσώρευση του AhR χωρίς διέγερση από ένα εξωγενές συνδετήρα. Παρόλο AhR πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε στα κυτταροπλασματικά κλάσματα των κυττάρων LNCaP, δεν AhR ανιχνεύθηκε σε πυρηνικό κλάσματα LNCaP. Σε αντίθεση, οι προχωρημένο καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές έδειξαν υψηλή έκφραση της πρωτεΐνης AhR στα πυρηνικά κλάσματα (Σχ. 2Α). Ανοσοκυτταροχημεία επιβεβαίωσε την παρουσία του AhR στον πυρήνα της DU145, PC3 και PC3M κύτταρα. Η απουσία οποιασδήποτε επικάλυψης χρώση στη συγχωνευμένη εικόνα των DAPI χρώση των πυρήνων και FITC-βάφονται AhR κατέδειξε επίσης ότι τα κύτταρα LNCaP δεν διαθέτουν πυρηνικά AhR (Εικ. 2Β).

Α. Πυρηνική και κυτταροπλασματική κλασματοποίησης: Κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν σε 100 mm δίσκους μέχρι -75% συρροή, πλύθηκαν με ψυχρό PBS και κυτταρικά κλάσματα απομονώθηκαν με ανά κατασκευάζει οδηγίες χρησιμοποιώντας ένα κιτ ΝΕ-ανά εκχύλιση. Τα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για έκφραση πρωτεΐνης AhR. Το σχετικό επίπεδο της κυτταροπλασματικής AhR κανονικοποιήθηκε με έκφραση β-τουμπουλίνης και το σχετικό επίπεδο της πυρηνικής AhR κανονικοποιήθηκε με την έκφραση της τοποϊσομεράσης. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM των διορθωμένων τιμών από τρία ανεξάρτητα πειράματα και (*) υποδηλώνει συστατική πυρηνική επίπεδα AhR που είναι σημαντικά διαφορετική μεταξύ των κυτταρικών σειρών. B. υποκυτταρικός εντοπισμός της AhR σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη με ανοσοκυτταροχημική χρώση: Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν επί καλυπτρίδων και σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη: ακετόνη. AhR οπτικοποιήθηκε με χρώση με αντι-AhR πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού που ακολουθείται από αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με FITC κατσίκας. Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με βαφή φθορισμού DAPI. Εικόνες από FITC και DAPI-φθορισμού κανάλια συγχωνεύθηκαν. Εικόνες συνελήφθησαν σε ευρεία μικροσκόπιο φθορισμού Ολύμπου (μεγέθυνση 400Χ).

Η

III. Συστατική AhR μεταγραφική δραστηριότητα

Ο δημοσιογράφος Cignal XRE χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η βασική δραστηριότητα του μονοπατιού σηματοδότησης AhR σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές. Η δοκιμασία που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή δραστικότητας προαγωγέα AhR αποκάλυψε ότι οι εκ των προτέρων κύτταρα καρκίνου προστάτη DU145, PC3 και PC3M, όλοι έχουν ένα υψηλό επίπεδο AhR σύνδεσης προς XRE απουσία ενός εξωγενούς συνδέτη. Το ευαίσθητο στα ανδρογόνα LNCaP κυτταρική σειρά κατέδειξε δεσμευτικές ελάχιστες XRE. PC3 κύτταρα έδειξαν την υψηλότερη δραστικότητα προαγωγέα με ένα 10-πλάσια αύξηση σε XRE σύνδεση σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές LNCaP. DU145 και τα κύτταρα PC3M έδειξε μια 2.5 και 8-πλάσια αύξηση στη δραστικότητα προαγωγέα σε σύγκριση με την κυτταρική σειρά LNCaP, αντίστοιχα (Σχ. 3Α).

A. Κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη επιμολύνθηκε με ένα πλασμίδιο ρεπόρτερ XRE, καθώς και με θετικό και αρνητικό πλασμίδια ανταποκριτές ελέγχου χρησιμοποιώντας attractene. Μετά την επιμόλυνση, μία δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Οι τιμές δραστηριότητα υποκινητή που εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες φθορισμού (AFU). Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση ± SEM (η = 3) και αναλύθηκαν με student t-test. (*) Υποδηλώνει στατιστικώς σημαντικές διαφορές (* Ρ & lt? 0,05). Ανάλυση Β qRT-PCR της έκφρασης mRNA ΟΥΡ1Β1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ του αναστολέα AhR (CH223191) ή ελέγχου του οχήματος (DMSO) για 24 ώρες και τα συνολικά RNAs απομονώθηκαν και ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η έκφραση του mRNA του ΟΥΡ1Β1 σε κάθε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη. mRNA επίπεδα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας L-19 το οποίο χρησιμεύει ως εσωτερικός έλεγχος. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση ± SEM (η = 3) και αναλύθηκαν με student t-test. (*) Δηλώνει στατιστικά σημαντικές διαφορές (* P & lt? 0,05) σε σύγκριση με LNCaP καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή

Η

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ένα μεταγραφικά ενεργό AhR σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές.. Αρκετές αναφορές έχουν επιβεβαιώσει αυξημένα AhR και ΟΥΡ1Β1 αλλά όχι CYP1A1 σε ογκογόνο μοντέλα [30], [40]. Αυτές οι μελέτες δείχνουν την ύπαρξη διαφορών στη ρύθμιση αυτών των δύο γονιδίων. CYP1A1 και CYP1B1 εκφράσεις είναι τόσο μεσολάβηση AhR αλλά οι διαφορές στη δομή του υποκινητή μπορεί να οδηγήσει σε διαφορική έκφραση. Οι εκθέσεις δείχνουν ότι το CYP1A1 είναι ο έλεγχος με την ενεργοποίηση συνδέτη του AhR και ΟΥΡ1Β1 ρυθμίζεται από συστατική AhR σηματοδότηση [41], [42], Κατά συνέπεια, για να επιβεβαιωθεί μεταγραφική δραστικότητα του μονοπατιού σηματοδότησης AhR, AhR αποκρίνεται γονίδιο, CYP1B1 μετρήθηκε με qRT- PCR στο ανδρογόνο κυτταρική γραμμή ευαίσθητη LNCaP καθώς και τις προηγμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, DU145, PC3and PC3M. LNCaP κύτταρα εκφράζονται ελάχιστα επίπεδα ΟΥΡ1Β1 μεταγραφής. DU145 και PC3 κύτταρα έδειξαν μια αύξηση 12 και 25 φορές σε ΟΥΡ1Β1 σε σύγκριση με τα κύτταρα LNCaP. κύτταρα PC3M κατέδειξε την μεγαλύτερη φορές αύξηση στην ΟΥΡ1Β1 με σχεδόν 30 φορές αύξηση σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP. Αναστολή της AhR σηματοδότησης με άμεσος αναστολέας, CH223191, οδήγησε σε σημαντική μείωση στα επίπεδα ΟΥΡ1Β1 στις προηγμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Λόγω της χαμηλής βασικής έκφρασης ΟΥΡ1Β1 σε κύτταρα LNCaP, CH223191 δεν είχε σημαντική επίδραση στην έκφραση του mRNA ΟΥΡ1Β1 (Σχ. 3Β).

IV. Κατάλυση της Καταστατική AhR Σηματοδοσίας Αναστέλλει ανδρογόνων ανεξάρτητη ανάπτυξη

Τα παραπάνω στοιχεία αποδεικνύουν την ικανότητα του ανταγωνιστή AhR, CH223191, να αναστέλλουν συστατική σηματοδότηση AhR. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της συστατικής AhR σηματοδότησης για το ρυθμό αύξησης του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη κύτταρα, κάθε κυτταρική γραμμή αναπτύχθηκε σε απουσία και παρουσία του ειδικού αναστολέα Ahr και CH223191. LNCaP, DU145, PC3 και PC3M καρκίνου του προστάτη κύτταρα αναπτύχθηκαν σε παρουσία AhR αναστολέα CH223191191 σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 1 μΜ έως 50 μΜ (Σχ. 4Α). Κατάλυση AhR σηματοδότησης ήταν αρκετή για να μειώσει το ρυθμό ανάπτυξης όλων των κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των ανδρογόνων ευαίσθητα κύτταρα LNCaP. Για την επιβεβαίωση των επιδράσεων του CH223191191 ήταν AhR εξαρτώμενη, τα κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με έναν φορέα ελέγχου (SCR) και ένα φορέα που φέρει ειδικό shRNA για στόχευση AhR πρωτεΐνη (-AhR). Τα προκύπτοντα κύτταρα τα οποία εκφράζουν AhR (SCR) και στερούνται AhR πρωτεΐνης (-AhR) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ CH223191191 (Εικ. 4Β). Τα κύτταρα DU145 (SCR) ανταποκρίνονται στη θεραπεία CH223191191 με μια σημαντική μείωση στο ρυθμό ανάπτυξης, ενώ κύτταρα η DU145 (-AhR) εμφάνισαν καμία απάντηση ανάπτυξη στον ανταγωνιστή AhR (Εικ. 4Β). αναστολή των υποδοχέων των ανδρογόνων από Casodex ήταν αποτελεσματική μόνο στα κύτταρα LNCaP. Θεραπεία του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (DU145, PC3 και PC3M) με CDX δεν είχε καμία επίδραση στον ρυθμό ανάπτυξης. LNCaP κύτταρα παρουσίασαν 40% μείωση στο ρυθμό ανάπτυξης παρουσία του CDX. θεραπεία CH223191 είχε ως αποτέλεσμα την μεγαλύτερη αναστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα DU145. DU145 κύτταρα έδειξαν επίσης το υψηλότερο ποσοστό αύξησης όλων των κυτταρικών σειρών κάτω από συνθήκες ελέγχου. Επίσης, συν-θεραπεία με CH223191 και CDX ως αποτέλεσμα μια επιπλέον μείωση στο ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με CH223191 μόνη της σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 4C). αναστολής της ανάπτυξης των καρκινικών κυτταρικών σειρών προστάτη με CH223191191 παρέμεινε για μέχρι και 72 ώρες (Εικ. 4D).

A. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων σε 5.0 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 1 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 25 μΜ ή 50 μΜ CH223191. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με τη χρήση Promega CellTiter 96 Κυττάρων Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού ανά κατασκευάζει οδηγίες. Β Επιβεβαίωση της έκφρασης της πρωτεΐνης AhR σε DU145 κύτταρα με έλεγχο ομελέτα φορέα (SCR) και shRNA lentivirus κατά AhR (-AhR) με western αποτύπωση. 20 μg πρωτεΐνης που απομονώθηκε από αναλύθηκε με κηλίδωση Western. β-δράση χρησιμοποιείται ως έλεγχος φόρτωσης. Ο πολλαπλασιασμός των DU145 (SCR) και τα κύτταρα DU145 (-AhR) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία πολλαπλασιασμού CellTiter 96 κυττάρων με την παρουσία και απουσία 50 μΜ CH223191. C. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε σχάρα απογυμνώνεται μέσα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO (CON), 20 μΜ Casodex (CDX), 50 μΜ CH223191 ή ένας συνδυασμός CDX και CH223191 για 72 ώρες. Η κυτταρική ανάπτυξη μετρήθηκε με τη χρήση Promega CellTiter 96 Κυττάρων Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού ανά κατασκευάζει οδηγίες. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση ± SEM (n = 3), * ρ & lt? 0.05. Δ κύτταρα στερήθηκαν ορού για 24 ώρες και καλλιεργούνται σε απογυμνωμένο από ξυλάνθρακα (CSS) μέσα μαζικής ενημέρωσης. Τα κύτταρα όπου στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DMSO (Con) ή 50 μΜ CH223191 για ένα επιπλέον χρόνο 24, 48 ή 72 ώρες. Σε κάθε τελικό σημείο, τα κύτταρα αναλύθηκαν ως προς την περιεκτικότητα του DNA χρησιμοποιώντας την δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων, όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει μέσο όρο ± SEM (n = 3). (*) Υποδηλώνει μία σημαντική διαφορά σε σχέση με τις αντίστοιχες του ελέγχου DMSO.

Η

V. AhR πυρηνική συσσώρευση στον καρκίνο του προστάτη ιστών

Η έκφραση και ο εντοπισμός των AhR αξιολογήθηκε σε ιστούς του καρκίνου του προστάτη με ανοσοϊστοχημική χρώση. Σύμφωνα με τον στόχο της παρούσας μελέτης να δείξει ότι AhR είναι ουσιαστικά δραστική στον προχωρημένο καρκίνο του προστάτη, θα αξιολογηθεί η έκφραση AhR στον προστάτη καρκινικούς ιστούς που κυμαίνονται από βαθμό 1 σε βαθμό 3. Grade 1 ιστοί είναι καλά διαφοροποιημένα και τα κύτταρα φαίνονται φυσιολογικά. Βαθμού 2 ιστοί είναι μετρίως διαφοροποιημένες και τα κύτταρα εμφανίζονται ελαφρώς διαφορετικά από το κανονικό. Βαθμού 3 ιστοί είναι ελάχιστα διαφοροποιημένες και τα κύτταρα εμφανίζονται ανώμαλα και έχουν την τάση να αναπτύσσονται και να εξαπλωθεί πιο επιθετικά. 100% των ιστών χρωματίστηκαν θετικά για κυτταροπλασματικό AhR. Ωστόσο, μόνο το 14% του βαθμού 1 ιστοί ήταν θετικοί για την πυρηνική AhR σε σύγκριση με 50% των ιστών βαθμού 2 και βαθμού 3 καρκίνο (εικ. 5Α και τον πίνακα 1). Η παρουσία των πυρηνικών AhR βαθμού 2 και βαθμού 3 ιστούς, μαζί με την in vitro δεδομένα από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη υποδηλώνουν μεταγραφικά ενεργή AhR σε αυτές τις υψηλότερες όγκους βαθμού. Επιπλέον, όλοι βαθμού 1 όγκων θετικά για την πυρηνική AhR όλοι έχουν ταξινομηθεί ως Stage IV όγκους. Ανάλυση της συνολικής έκφρασης AhR αποκάλυψε ότι Βαθμού 2 και 3 όγκοι έχουν σημαντικά μεγαλύτερη συνολική AhR σε σύγκριση με το βαθμό 1 ιστών (εικ. 5Β). Επιπλέον, περίπου 80% των ιστών με Gleason score 7 ή μεγαλύτερο έχουν αυξημένη αντι-AhR αντιδραστικότητα σε σύγκριση με μόνο 47% των ιστών με Gleason στείλει 2-6 (Πίνακας 2).

A. Εκπρόσωπος Grade 1, Grade 2 και της κατηγορίας 3 του προστάτη καρκινικούς ιστούς: Άνω πάνελ χρώση με πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-AhR? κάτω πάνελ χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη. Τα βέλη απεικονίζουν θετική αντιδραστικότητα αντι-AhR στον πυρήνα του βαθμού 2 και βαθμού 3 όγκους. B. Σύνολο αντι-AhR αντιδραστικότητα σκόραρε στο βαθμό 1, βαθμού 2 και βαθμού 3 του προστάτη καρκινικούς ιστούς με βάση το επίπεδο της έντασης τόσο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα (0-1).