Αφηρημένο

Ιστορικό

Το αργό εκχυλίσματα

Selaginella

tamariscina

, ένα ανατολίτικο φαρμακευτικό φυτό, έχουν αποδεικνύεται για τη θεραπεία πολλών ασθενειών του ανθρώπου. Αυτή η μελέτη ερεύνησε τους μηχανισμούς με τους οποίους

Selaginella

tamariscina

αναστέλλει την εισβολής του ανθρώπινου καρκινώματος του στόματος πλακωδών κυττάρων (OSCC) HSC-3 κύτταρα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ, έχουμε αποδείξει ότι

Selaginella

tamariscina

εξασθενημένο HSC-3 κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Οι αντι-μεταστατική δραστηριότητες του

Selaginella

tamariscina

συνέβησαν τουλάχιστον εν μέρει, λόγω της προς τα κάτω ρύθμιση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (ΜΜΡ) -2 και ΜΜΡ-9 δραστηριότητα ζελατινάσης και την προς τα κάτω ρύθμιση έκφραση πρωτεΐνης. Η έκφραση και η λειτουργία τόσο του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 ρυθμίζονται από

Selaginella

tamariscina

σε ένα μετεγγραφικό επίπεδο, όπως φαίνεται από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και προσδιορισμούς ανταποκριτή. Χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δεδομένα έδειξαν περαιτέρω ότι η σύνδεση του στοιχείου δέσμευσης πρωτεΐνης (CREB) απόκριση cAMP και πρωτεΐνη ενεργοποίησης-1 (ΑΡ-1) προς την ΜΜΡ-2 προαγωγό μειωθεί στο υψηλότερο επίπεδο δοσολογίας του

Selaginella

tamariscina

. Η δραστικότητα δέσμευσης του DNA πρωτεΐνης ειδικότητας 1 (SP-1) με τον υποκινητή ΜΜΡ-9 επίσης κατεστάλη με την ίδια συγκέντρωση.

Selaginella

tamariscina

δεν επηρέασε την ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεϊνική κινάση οδό σηματοδότησης, αλλά δεν αναστέλλουν τις επιδράσεις της ζελατινάσης, μειώνοντας την ενεργοποίηση της κινάσης σερίνης-θρεονίνης Akt.

συμπεράσματα

Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι

Selaginella

tamariscina

μπορεί να είναι ένας ισχυρός επικουρικό θεραπευτικό μέσο για την πρόληψη του καρκίνου του στόματος

Παράθεση:. Yang JS, Lin CW, Hsin CH, Hsieh MJ, Chang YC (2013)

Selaginella

tamariscina

Εξασθενεί μετάσταση μέσω Akt Pathways στο Προφορική καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (6): e68035. doi: 10.1371 /journal.pone.0068035

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 12 Απριλίου του 2013? Αποδεκτές: 23η Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 14, Ιουνίου, 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια ερευνητική επιχορήγηση από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC100-2632-B-040-001-my3). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

λογαριασμούς ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου περίπου το 3% όλων των καρκίνων στις Ηνωμένες Πολιτείες, και το καρκίνωμα του στόματος πλακωδών κυττάρων (OSCC) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου κεφαλής και τραχήλου [1]. Το υψηλό ποσοστό της μετάστασης σε τραχηλικούς λεμφαδένες προκαλεί το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης του καρκίνου [2] από το στόμα. Τα καρκινικά κύτταρα συνήθως μεταδίδεται από εκκρίνει διάφορα μόρια που αποδομούν την εξωκυττάρια μήτρα (ECM), κατακλύζουν τα αιμοφόρα αγγεία, και μεταναστεύουν σε απομακρυσμένα όργανα [3]. μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) είναι μια μεγάλη ομάδα ενζύμων που ρυθμίζουν τη σύνθεση της ECM κατά τη διάρκεια της κανονικής ανάπτυξης και παθολογικές αντιδράσεις [4]. Αν και διάφορες MMPs συμβάλλουν στην καρκινικών κυττάρων της μετάστασης, οι ζελατινάσες ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έχουν πιο εντατικά μελετηθεί [5]. ΜΜΡ-2, επίσης γνωστή ως ζελατινάση Α, είναι μια πρωτεΐνη 72-kDa που εκφράζεται στους περισσότερους ιστούς και τα κύτταρα [6]. Σε αντίθεση, ΜΜΡ-9 (ζελατινάση Β), μια πρωτεΐνη 92-kDa, είναι υπό όρους παρατηρείται σε λευκοκύτταρα [7]. Αυξημένα ΜΜΡ-2 και την έκφραση ΜΜΡ-9 έχουν παρατηρηθεί σε επεμβατικές και μεταστατική περιπτώσεις ανθρώπινης καρκίνο του στόματος [8-10]. Ως εκ τούτου, έχουν επικεντρωθεί οι προσπάθειες έχουν γίνει για την ανάπτυξη αναστολέων ΜΜΡ (ΜΜΡΙ) να σταματήσει την εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων [11].

Selaginella

tamariscina

είναι ένα βότανο που χρησιμοποιείται παραδοσιακά στην ανατολίτικη φάρμακο που παρουσιάζει αρκετές θεραπευτικές ικανότητες. Πρώτον, επειδή

Selaginialla tamariscina

έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν το σάκχαρο του αίματος και τα επίπεδα του υπεροξειδίου των λιπιδίων του ορού, εμφανίζει πιθανές χρήσεις για τη θεραπεία του διαβήτη [12,13]. Δεύτερον, βιοφλαβονοειδή απομονωθεί από

Selaginella

tamariscina

αποδειχθεί αντιβακτηριακές και αντιμυκητιακές επιδράσεις [14-16]. Τρίτον, ακατέργαστα εκχυλίσματα από

Selaginella

tamariscina

έχουν ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων μεσαγγειακών κυττάρων, και έχει μειωθεί η ιντερλευκίνη-1 βήτα και την παραγωγή του παράγοντα-α νέκρωσης όγκων [17]. Τέταρτον,

Selaginella

tamariscina

θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός παράγων χημειοπροληπτικές έναντι διαφόρων κυτταρικών γραμμών καρκίνου του ανθρώπου, όπως ο γαστρικός καρκίνος [18], ο καρκίνος του πνεύμονα [19], του καρκίνου του μαστού [20], και του τραχήλου της μήτρας καρκίνου [21]. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διαφωτίσει τις συνέπειες των

Selaginella

tamariscina

για τα ανθρώπινα OSCC κύτταρα HSC-3. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

Selaginella

tamariscina

σταμάτησε από το στόμα των καρκινικών κυττάρων μετανάστευση μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έκφρασης και μειώνοντας την δραστικότητα σύνδεσης DNA με την υποστηρικτής στοιχεία. Επιπλέον, τα αντι-μεταστατικές επιδράσεις που σχετίζονται με την αδρανοποίηση της κινάσης σερίνης-θρεονίνης Akt.

Υλικά και Μέθοδοι

Απόσπασμα από το

Selaginella

tamariscina

Selaginella

tamariscina

αγοράστηκε από καταστήματα βοτάνων και ξηραίνεται ολόκληρα φυτά (100 g) εκχυλίστηκαν δύο φορές με 500 ml 50% αιθανόλη σε απεσταγμένο νερό. Τα συγκεντρωμένα εκχυλίσματα διηθήθηκαν και συμπυκνώθηκαν στους 70 ° C χρησιμοποιώντας έναν περιστροφικό εξατμιστήρα υπό χαμηλή πίεση. Το συμπυκνωμένο ακάθαρτο εκχύλισμα καταψύχθηκε στους -80 ° C για 2-3 ημέρες και στη συνέχεια ξηράνθηκε με ψύξη σε ένα λυοφιλοποιητή και αποθηκεύεται στους -20 ° C. Η απόδοση εκχύλισης ήταν 2.8% (w /w) και η χημική προφίλ Selaginella tamariscina εκχύλισμα (STE) αναλύθηκε με τη χρήση υγρής χρωματογραφήματα υψηλής πίεσης (HPLC) -φασματομέτρου μάζας [19]. Εν συντομία,

Selaginella

tamariscina

αναλύθηκαν με φασματόμετρο HPLC μάζας χρησιμοποιώντας HPLC (Hitachi L-6200 με ένα ανιχνευτή Diode Array L-4500) με μάζα ΡΕ Sciex Qstar Pulsar ESI-TOF φασματόμετρο. Δείγματα (10 μλ) εγχύθηκαν επάνω σε μια 100 RP-18 στήλη Merck LiChrospher (4 χ 250 mm). Η στήλη εξισορροπήθηκε σε 0.05% οξικό οξύ /νερό (διάλυμα Α) και η έκλουση των συστατικών επιτεύχθηκε με αύξηση της συγκέντρωσης του διαλύματος Β (100% ακετονιτρίλιο) από 0 έως 100% σε 30 λεπτά με ρυθμό ροής 1 ml /min. Η απορροφητικότητα μετρήθηκε στα 254 nm. Οι μοριακές μάζες των κορυφών προσδιορίστηκαν από τα φάσματα μάζας ηλεκτροψεκασμού ιονισμού χρησιμοποιώντας πολλαπλώς φορτισμένο ιόν προφίλ [19]. Το εκχύλισμα διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma Co., USA) και παρασκευάστηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για τα επόμενα πειράματα.

Κυτταρική καλλιέργεια και

Selaginella

tamariscina

εκχύλισμα (STE) θεραπεία

HSC-3, ένα ανθρώπινο γλώσσα πλακωδών κυττάρων γραμμή καρκινώματος ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA, USA), καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ , USA), 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 2 mM γλουταμίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη. Όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37

oC σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Για τη θεραπεία STE, κατάλληλες ποσότητες διαλύματος αποθέματος STE προστέθηκαν σε μέσο καλλιέργειας για να επιτευχθούν οι υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις και κατόπιν επωάστηκαν με κύτταρα για την υποδεικνυόμενη χρονικές περιόδους, ενώ διμεθυλο σουλφοξειδίου διάλυμα χωρίς STE χρησιμοποιήθηκε ως τυφλό αντιδραστήριο.

Προσδιορισμός της κυτταρικής βιωσιμότητας (ΜΤΤ δοκιμασία)

για το πείραμα κυτταρικής βιωσιμότητας, ένα τετραζολίου μικροκαλλιέργειας (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζόλιο) διεξήχθη χρωματομετρική δοκιμασία για να προσδιοριστεί η κυτταροτοξικότητα της STE. HSC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με STE σε μια συγκέντρωση μεταξύ 0-100 μg /mL σε 37

oC για 24 ώρες. Μετά την περίοδο έκθεσης, το μέσο απομακρύνθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και στη συνέχεια επωάστηκαν με 20 μι ΜΤΤ (5 mg /mL) (Sigma Chemical Co., St. Louis, ΜΟ, USA) για 4 h. Ο αριθμός βιώσιμων κυττάρων ανά δίσκο είναι ευθέως ανάλογη προς την παραγωγή φορμαζάνης, η οποία μπορεί να μετρηθεί φασματοφωτομετρικά στα 563 nm μετά διαλυτοποίηση με ισοπροπανόλη.

In vitro πληγή κλείσιμο

HSC-3 κύτταρα (1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων για 24 ώρες, τραυματίστηκε από ξύσιμο με ένα ρύγχος πιπέτας, μετά επωάστηκαν με μέσο DMEM που περιέχει 0.5% FBS και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς STE (0, 25, 50 , 75 και 100 μg /mL) για 0, 12 και 24 ώρες. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (χ 100).

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασίες

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμάστηκαν σύμφωνα με τις μεθόδους που περιγράφονται από τους Yang et al. [19]. Μετά από θεραπεία με STE (0, 25, 50, 70 και 100 μg /mL) για 24 ώρες, επιζώντα κύτταρα συλλέχθηκαν και σπάρθηκαν σε Boyden θάλαμο (Neuro Probe, Cabin John, MD, USA) στους 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε μέσο ελεύθερο ορού και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37

oC. Για την ανίχνευση εισβολής, 10 μL Matrigel (25 mg /50 ml? BD Biosciences, MA, USA) εφαρμόσθηκε σε μm πόρου φίλτρα μεμβράνης 8 μέγεθος πολυανθρακικό και ο θάλαμος πυθμένα περιείχε πρότυπο μέσο. Φίλτρα μετά ξηράνθηκαν στον αέρα για 5 ώρες σε μία καλύπτρα στρωτής ροής. Τα εισέβαλαν κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη και χρωματίστηκαν με 5% Giemsa. Οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός. Η δοκιμασία μετανάστευσης διεξήχθη όπως περιγράφεται στη δοκιμασία εισβολή χωρίς επίστρωση Matrigel.

Προσδιορισμός της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 με ζυμογραφία ζελατίνης

Οι δραστηριότητες των ΜΜΡ-2 σε όρους μέσο μετρήθηκαν με προσδιορισμούς πρωτεάσης ζελατίνης ζυμογραφία. Εν συντομία, τα οποία συλλέγονται μέσα ενημέρωσης του κατάλληλου όγκου (ρυθμίζεται με ζωτική αριθμό κυττάρων) παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό δείγματος SDS χωρίς βρασμό ή τη μείωση και υποβλήθηκαν σε 0.1% ζελατίνη-8% SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα πηκτώματα πλύθηκαν με 2,5% Triton Χ-100 και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμιστικό αντίδρασης (40 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0? 10 mM ΟαΟ

2 και 0,01% NaN3) επί 12 ώρες σε 37

oC . Στη συνέχεια, γέλη βάφτηκε με Coomassie brilliant blue R-250.

Παρασκευή συνολικά κυτταρολύματα

Για ολική παρασκευή κυτταρολύματα, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS δύο φορές και ξύνεται με 0.2 mL ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος RIPA που περιέχει κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης, και στη συνέχεια στροβιλίστηκαν στους 4

oC για 10 λεπτά. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση 10,000 rpm για 10 λεπτά στους 4

oC, και το αδιάλυτο σφαιρίδιο απορρίφθηκε. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των συνολικά κυτταρολύματα προσδιορίστηκε με δοκιμασία Bradford.

Western

ανάλυση κηλίδος

Τα 20 μg δείγματα από συνολικά κυτταρολύματα ή πυρηνικά κλάσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας το Mini-Protean Tetra Σύστημα ηλεκτροφόρησης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Η κηλίδα στη συνέχεια επωάστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (20 mM Tris, 137 mM NaCl, ρΗ 7,6) για 1 ώρα για να εμποδίσει μη-ειδική σύνδεση και στη συνέχεια όλη τη νύκτα με πολυκλωνικά αντισώματα έναντι ΜΜΡ-2, ΜΜΡ -9, ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2, τρεις MAPKs (ERK 1/2, 1/2 JNK και ρ38), ή Akt με τα ειδικά αντισώματα για μη φωσφορυλιωμένα ή φωσφορυλιωμένες μορφές της αντίστοιχης ERK 1/2, 1/2 JNK , p38 και Akt. Οι κηλίδες κατόπιν επωάστηκαν με μία υπεροξειδάση αρμορακίας κατσίκας αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού IgG για 1 ώρα. Στη συνέχεια, το σήμα ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) εμπορικό κιτ (Amersham Biosciences) και η σχετική φωτογραφική πυκνότητα ποσοτικοποιήθηκε με σάρωση των φωτογραφικά αρνητικά σε ένα σύστημα τεκμηρίωσης γέλης και ανάλυση (AlphaImager 2000, η ​​Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA ).

προετοιμασία RNA και TaqMan ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

το συνολικό RNA απομονώθηκε από τον καρκίνο του στόματος κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Taqman ενός σταδίου PCR Master Mix (Applied Biosystems). 100 ng του συνολικού cDNA προστέθηκαν ανά 25 μΐ αντίδραση με ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 ή εκκινητές GAPDH και ανιχνευτές Taqman. Η εκκινητές GAPDH ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικό λογισμικό (ΑΒΙ PRISM Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας? Applied Biosystems). Ποσοτική PCR δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο διεξήχθησαν εις τριπλούν σε ένα StepOnePlus σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας. Το όριο ορίστηκε παραπάνω υπόβαθρο ελέγχου μη-πρότυπο και εντός της γραμμικής φάσης της ενίσχυσης του γονιδίου-στόχου για τον υπολογισμό του αριθμού του κύκλου κατά την οποία ανιχνεύθηκε η μεταγραφή.

Η επιμόλυνση και ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 υποκινητή με γνώμονα προσδιορισμοί λουσιφεράσης

HSC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 5 x10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 6 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες επώασης, pGL3-βασικό (vector), ΜΜΡ-2 ή ΜΜΡ-9 πλασμιδίου υποκινητή συν-επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης β-γαλακτοσιδάσης (pCH110) σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Turbofect (Fermentas, Carlsbad, CA). Μετά από 12 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή STE (0 ή 100 μg /mL) για 24 ώρες. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης. Η αξία της δραστηριότητας της λουσιφεράσης κανονικοποιήθηκε προς αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης και παρακολουθούνται από την έκφραση β-γαλακτοσιδάσης.

ανάλυση ανοσοκαθίζησης χρωματίνης (μάρκας)

ανάλυση ανοσοκαθίζησης χρωματίνης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [23,24] . DNA ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-CREB, αντι-SP1 ή αντι c-fos ήταν καθαρισμένα και εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας φαινόλη-χλωροφόρμιο. Ανοσοκαταβυθίστηκαν DNA αναλύθηκε με PCR ή ποσοτική PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές, όπως περιγράφεται προηγουμένως [23].

Στατιστική ανάλυση

Για όλες τις μετρήσεις, χρησιμοποιήθηκε ανάλυση διακύμανσης ακολουθούμενη από Scheffe σύγκριση των υστέρων να αξιολογήσει τις διαφορές μεταξύ ελέγχου και κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις STE. Μια διαφορά σε ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Αποτελέσματα

Επιπτώσεις του

Selaginella

tamariscina

σε HSC-3 κυτταρικής βιωσιμότητας και κινητικότητα

HSC-3 κυτταρική βιωσιμότητα σε παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων (0-100 μg /ml) του

Selaginella

tamariscina

για 24 ώρες παρουσιάζεται στο Σχήμα 1Α . Ακόμη και η μέγιστη συγκέντρωση, 100 μg /mL, δεν έχουν κυτταροτοξική επίδραση στα κύτταρα HSC-3. Χρησιμοποιήσαμε 0-100 μg /mL του

Selaginella

tamariscina

να διεξάγει τα ακόλουθα πειράματα. Το Σχήμα 1Β δείχνει τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας δοκιμασία γρατσουνιά-πληγή για τον υπολογισμό της ικανότητας μετανάστευσης των HSC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με διάφορες συγκεντρώσεις

Selaginella

tamariscina

. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι

Selaginella

tamariscina

σημαντικά μειωμένη κινητικότητα των κυττάρων τόσο χρόνου και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (ρ & lt? 0.001). (Εικόνα 1Β και 1C)

(Α) HSC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με STE (0, 25, 50, 75 και 100 μg /mL) για 24 ώρες πριν να υποβληθεί σε δοκιμασία ΜΤΤ για βιωσιμότητα των κυττάρων. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. (Β) κύτταρα HSC-3 τραυματίστηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όχημα (DMSO) ή STE (0, 25, 50, 75 και 100 μg /mL) για 0h, 12h και 24 h σε 10% FBS μέσου που περιέχει. Στο 0, 12 και 24 ώρες, ελήφθησαν εικόνες αντίθεσης φάσης των πληγών σε τρεις διαφορετικές θέσεις.

Η

Επιπτώσεις του

Selaginella

tamariscina

για τη μετανάστευση και εισβολή των HSC-3 κύτταρα

για να εξεταστούν τα αποτελέσματα των

Selaginella

tamariscina

για τη μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία θαλάμου Boyden για την ανίχνευση κυτταρικής κινητικότητας. Το Σχήμα 2Α δείχνει ότι

Selaginella

tamariscina

ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο για 24 ώρες. Ομοίως, το Σχήμα 2Β δείχνει ότι η διεισδυτικότητα του HSC-3 κύτταρα μειώθηκε επίσης μετά από επώαση με διαφορετικές συγκεντρώσεις (0-100 μg /ml) του

Selaginella

tamariscina

για 24 ώρες.

(Α) Η μετανάστευση των κυττάρων και (Β) των κυττάρων εισβολή μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν θάλαμο Boyden για 16 ώρες και 24 ώρες με πολυανθρακικά φίλτρα αντίστοιχα. Οι ικανότητες μετανάστευση και εισβολή του HSC-3 κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων που εισέβαλαν στην κάτω πλευρά του πορώδους πολυανθρακικού, όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

τμήμα. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα οχήματος.

Η

Επιδράσεις της

Selaginella

tamariscina

στην έκφραση και δραστικότητα του ενζύμου της πρωτεΐνης ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9

Η ικανότητα του

Selaginella

tamariscina

να καταστείλει τις μεταναστευτικές και επεμβατική ικανότητες των HSC-3 κύτταρα με μείωση ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ζυμογραφία ζελατίνης. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι το ένζυμο δραστηριότητα του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 καταστάλθηκε από

Selaginella

tamariscina

σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Η υψηλότερη συγκέντρωση του

Selaginella

tamariscina

, 100 μg /mL, ανέστειλε ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 δραστηριότητα κατά 57% και 51%, αντίστοιχα (Σχήμα 3Β).

Selaginella

tamariscina

επίσης σημαντικά μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, όταν ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (Εικόνα 3C). Έτσι, προτείνουμε ότι η αντι-μεταστατική ικανότητα του

Selaginella

tamariscina

τουλάχιστον εν μέρει ανέστειλε την έκφραση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Διερεύνηση των επιδράσεων του STE επί της πρωτεΐνης έκφρασης του αναστολέα ΜΜΡ ενδογενή, ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2, έδειξε ότι STE επάγεται ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 προς τα πάνω ρύθμιση σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικόνα 3C και 3D)

(Α και Β) HSC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με STE (0-100 μg /mL) για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ζυμογραφία ζελατίνης για να αναλυθεί η δραστικότητα του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, αντίστοιχα. (C) κύτταρα HSC-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με STE (0-100 μg /mL) για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western για να αναλυθούν τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2. (D) Ποσοτικά αποτελέσματα της ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, τα επίπεδα ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 πρωτείνη η οποία προσαρμόστηκαν με επίπεδο πρωτεΐνης β-ακτίνης. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα οχήματος.

Η

Επιδράσεις της

Selaginella

tamariscina

στην έκφραση του mRNA των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και η δραστικότητα δέσμευσης DNA

Selaginella

εξετάστηκαν επίσης οι επιπτώσεις της tamariscina

στην MMP-2 και την έκφραση του mRNA MMP-9. Ένα χαμηλό επίπεδο έκφρασης του mRNA των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 παρατηρήθηκε στην υψηλότερη δόση του

Selaginella

tamariscina

(100 μg /mL) για 6 ώρες (Σχήμα 4Α και 4Β). Για να διερευνήσουν περαιτέρω το πώς

Selaginella

tamariscina

ρυθμίζει τη μεταγραφική δραστηριότητα των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης στην οποία τόσο

Selaginella

tamariscina

και τα κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με μια κατασκευή υποκινητή ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Το Σχήμα 4C δεικνύει ότι η δραστικότητα προαγωγέα ΜΜΡ-2 μειώθηκε κατά

Selaginella

tamariscina

με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ομοίως, περίπου 50% αναστολή της δραστικότητας προαγωγού ΜΜΡ-9 ήταν εμφανής στα 100 μg /mL του

Selaginella

tamariscina

(Εικόνα 4D). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι

Selaginella

tamariscina

ρυθμίζει MMP-2 και MMP-9 δραστηριότητα στο μεταγραφικό επίπεδο.

Η

HSC-3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με STE ( 0, 25, 50, 75 και 100 μg /mL) για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR για να αναλυθεί η έκφραση του mRNA της ΜΜΡ-2 (Α), ή ΜΜΡ-9 (Β). (C) ΜΜΡ-2 ή (D) δοκιμασία ανταποκριτή ΜΜΡ-9 υποκινητή για να αναλυθεί η δραστικότητα προαγωγού των ΜΜΡ. Η δραστικότητα λουσιφεράσης, προσδιορίζεται εις τριπλούν, ομαλοποιήθηκε με β-γαλακτοσιδάση δραστικότητα. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα οχήματος.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι οι υποκινητές ΜΜΡ ρυθμίζονται από αρκετούς παράγοντες μεταγραφής, όπως ΑΡ-1, ΝΡκΒ, CREB, και SP-1 [23,25,26]. Πραγματοποιήσαμε μια χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (chip) θα δοκιμασία για να αξιολογηθεί η εμπλοκή των παραγόντων μεταγραφής στα ανασταλτικά αποτελέσματα του

Selaginella

tamariscina

επί ΜΜΡ-2 και δραστικότητα ΜΜΡ-9 (Σχήμα 5Α και 5Β) . δοκιμασία chip και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR έδειξε ότι

Selaginella

tamariscina

ουσιαστικά κατέστειλε σύνδεση του CREB και SP-1 με τον προαγωγό ΜΜΡ-2 (Σχήμα 5Α). Το Σχήμα 5Β δείχνει ότι

Selaginella

tamariscina

σημαντικά ανέστειλε ΑΡ-1, αλλά όχι ο ΝΡ-κΒ δέσμευσης DNA στον προαγωγό ΜΜΡ-9. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το

Selaginella

tamariscina

ανέστειλε ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έκφραση με τη ρύθμιση της συνδετικής δραστικότητας των παραγόντων μεταγραφής στο cis-στοιχείο υποκινητών ΜΜΡ.

Η

HSC-3 κύτταρα επεξεργάστηκαν με STE 100 μg /mL για 24 ώρες και στη συνέχεια το πυρηνικό κλάσμα παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται στο «

Υλικά και Μέθοδοι

«. ανάλυση τσιπ του συνδέσμου διάφορους παράγοντες μεταγραφής με την ΜΜΡ-2 (Α) ή ΜΜΡ-9 (Β) περιοχή προαγωγέα σε HSC-3 κύτταρα. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα του οχήματος.

Επιπτώσεις του

Selaginella

tamariscina

για ΜΑΡΚ και Akt

Για την περαιτέρω διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών του ανάντη μονοπάτια της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σηματοδότησης, χρησιμοποιήσαμε western blotting για την αξιολόγηση των επιδράσεων του

Selaginella

tamariscina

στις οδούς ΜΑΡΚ και Akt. Εικόνα 6Α-6C δείχνουν ότι η οδός ΜΑΡΚ, η οποία περιλαμβάνει ERK, JNK, και πρωτεϊνικές κινάσες ρ38, δεν ήταν ιδιαίτερα αναστέλλεται. Ωστόσο,

Selaginella

tamariscina

μειωμένη φωσφορυλίωση της Akt σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 6D). Έτσι, προτείνουμε ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Akt απαιτείται για

Selaginella

tamariscina

να καταστείλει ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9.

Η

HSC- 3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις STE (0, 25, 50, 75 και 100 μg /mL) για 24 ώρες, και στη συνέχεια τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE ακολουθούμενη από κηλίδες Western με (Α) αντι-ERK1 /2, (Β) αντι-ΙΝΚ, (Γ) αντι-ρ38 και (D) αντι-Akt (συνολική και φωσφορυλιωμένο) αντισώματα όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Αποφασισμένοι δραστηριότητες αυτών των πρωτεϊνών στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση με εκείνη του ελέγχου είναι 100% όπως φαίνεται ακριβώς κάτω από τα δεδομένα γέλη. Οι τιμές αντιπροσωπεύονται τα μέσα ± SD από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα του οχήματος.

Συζήτηση

Πολλά φαρμακευτικά φυτά έχουν μελετηθεί για την αντικαρκινική εφαρμογές, όπως

Dioscorea

nipponica

Makino [23 ] και

Terminalia

Catappa [26]. Κατά την τελευταία δεκαετία,

Selaginella

tamariscina

έχει γίνει μια παραδοσιακή θεραπεία για διάφορες ασθένειες [14,15,18,19]. Σε αυτή τη μελέτη, προτείνουμε ότι

Selaginella

tamariscina

, επιδεικνύει ευεργετικά αποτελέσματα για τη θεραπεία από το στόμα των καρκινικών κυττάρων με (1) την αναστολή της HSC-3 από το στόμα των καρκινικών κυττάρων μετανάστευση και την εισβολή, (2) μείωση της MMP- έκφραση και δραστικότητα ενζύμου 2 και ΜΜΡ-9 γονίδιο, (3) αναστολή της φωσφορυλίωσης του ΑΚΤ, (4) μείωση πυρηνική μετατόπιση του CREB και SP-1 σε ένα προαγωγό ΜΜΡ-2, και (5) μείωση πυρηνική μετατόπιση του ΑΡ-1 προς ένας προαγωγός ΜΜΡ-9. Πολλά φλαβονοειδή βρίσκονται στα ακατέργαστα εκχυλίσματα του

Selaginella

tamariscina

οποία εμφανίζουν διάφορες φαρμακολογικές επιδράσεις. Αμεντοφλαβόνη αισθητά συλληφθεί κυτταρικούς κύκλους και επαγόμενη απόπτωση των ανθρώπινων μαστού και του τραχήλου καρκινικών κυττάρων [21,27,28]. Επιπλέον, sumaflavone ασκείται αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις αναστέλλοντας την έκφραση iNOS μέσω του ΑΡ-1 αναστολή [29]. Επιπλέον, Mirzoeva κ.ά. έδειξαν ότι η απιγενίνη παρουσιάζει αντιαγγειογόνο δυναμικό σε κύτταρα καρκινώματος προστάτη μέσω αναστολής Smad2 /3 και Src /FAK /Akt οδοί [30]. Οι προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα φλαβονοειδή παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην αντι-μεταστατική δράση του

Selaginella

tamariscina

, αλλά οι υποκείμενοι μηχανισμοί αυτής της διαδικασίας απαιτούν περαιτέρω εξηγήσεις.

Metastasis, η οποία προκαλεί το 90% περίπου των θανάτων από καρκίνο, είναι η διαδικασία με την οποία τα καρκινικά κύτταρα εξαπλωθεί από την αρχική θέση του όγκου σε απομακρυσμένα όργανα [31]. Η αποικοδόμηση των συστατικών ECM και της βασικής μεμβράνης είναι ένα κρίσιμο στάδιο στη μετάσταση. Υπάρχουν πολλοί τύποι πρωτεασών που ελέγχουν αποικοδόμηση ECM και αναδιαμόρφωση. ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 είναι η πιο εκτεταμένα μελετηθεί της οικογένειας ΜΜΡ, λόγω της υψηλής σχέσης τους με τη μετανάστευση και εισβολή καρκίνου του [5]. Αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα φυσικά προϊόντα αναστέλλουν τη μετάσταση του καρκίνου με αναστολή ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έκφραση [23,26]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το

Selaginella

tamariscina

ανέστειλαν δραστικότητα του ενζύμου ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, όπως επίσης και την έκφραση της πρωτεΐνης. Μια μείωση στη μετανάστευση και εισβολή ικανότητες που προκύπτουν από την καταστολή της ΜΜΡ-2 και δραστικότητα ΜΜΡ-9 έχει προταθεί. Τα αποτελέσματα είναι παρόμοια με προηγούμενη μελέτη μας, στην οποία οι αντι-μεταστατική δράση του

Selaginella

tamariscina

σε πνεύμονα καρκινικά κύτταρα προκύψει με μειωμένη έκφραση ζελατινάσης [19]. Πολυάριθμες εκθέσεις δείχνουν ότι η έκφραση του γονιδίου ΜΜΡ ειδικώς ρυθμίζεται από μιτογόνο ενεργοποιημένη πρωτεΐνη κινάσες (MAPKs), μία οικογένεια κινασών σερίνης /θρεονίνης συμπεριλαμβανομένων ERKs, JNKs και ρ38 [31-33]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν ότι δεν υπάρχουν παρατηρήσιμες επιπτώσεις επί της οδού σηματοδότησης ΜΑΡΚ προέκυψε από τη ρύθμιση της παραγωγής MMP από

Selaginella

tamariscina

. Επιπλέον, η συμμετοχή της φωσφατιδυλοϊνοσιτολικής-3 κινάσης (PI3K) /AKT μεταγωγή σήματος πορείας στα MMP γονιδιακή έκφραση και την κυτταρική μετανάστευση έχει μελετηθεί επαρκώς. Wang et al αποκάλυψε ότι isoliquiritigenin ανέστειλε την έκφραση και την ζελατινολυτική δραστηριότητα του ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 με τη ρύθμιση της ανάντη ΑΚΤ οδούς στον καρκίνο του μαστού MDA-MB-231 κύτταρα [34] σηματοδότησης. Μια άλλη μελέτη κατέληξε στο συμπέρασμα ότι berberine, ένα αλκαλοειδές ισοκινολίνη, ανέστειλε την μετάσταση των κυττάρων του καρκίνου του μαστού με τη διαμόρφωση της ΑΚΤ οδού [35]. Τα δεδομένα μας πρότεινε, επίσης, ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K /AKT συμμετέχει ως ανάντη ενεργοποίησης της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 του κανονισμού.

Η έκφραση των MMPs μπορεί να ρυθμιστεί σε πολλαπλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφής, μετά τη μεταγραφή , τα επίπεδα μετάφραση, προένζυμο-ενεργοποίηση, και καταστολή, από ειδικούς αναστολείς [36]. Προτείνεται ότι

Selaginella

tamariscina

ρυθμίζεται ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στο μεταγραφικό επίπεδο, επειδή δραστηριότητα προαγωγέα και έκφρασης του mRNA ανεστάλησαν. υποκινητές ΜΜΡ έχουν διάφορες cis-στοιχεία τα οποία μπορούν να μετενεργοποιηθεί από αρκετούς παράγοντες μεταγραφής, όπως ΝΡ-κΒ, ΑΡ-1, CREB, και SP-1. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ΑΚΤ /SP-1 μονοπάτι ρυθμίζεται δραστικότητα προαγωγού ΜΜΡ-2 και επηρέασε την ικανότητα μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων [24,37]. Satpathy et al έδειξαν ότι τρανσγλουταμινάση ιστού 2 ρυθμίζει την ενεργοποίηση CREB και ΜΜΡ-2 μεταγραφή στον καρκίνο των ωοθηκών [38]. Η προς τα πάνω αλληλουχία προαγωγέα του γονιδίου ΜΜΡ-9 περιέχει θέσεις ΑΡ-1 και ΝΡ-κΒ. Επιγαλλοκατεχίνη (EGCG) ασκεί αντι-διεισδυτική δράση του με την καταστολή της ενεργοποίησης ΑΡ-1 σε ανθρώπινα γαστρικά καρκινικά κύτταρα [39]. Επιπλέον, ΝΡ-κΒ ρυθμίζει την έκφραση της ΜΜΡ-9 σε διάφορους καρκίνους [33,40,41]. Αν και MMP-9 mRNA έκφραση ρυθμιζόταν από

Selaginella

tamariscina

, εμείς δεν παρατηρούμε μια αξιοσημείωτη επίδραση στις δραστηριότητες NF-κΒ DNA-δεσμευτική. Η μελέτη μας δείχνει ότι η έκφραση της ΜΜΡ-2 ρυθμίζεται από CREB και SP 1-δραστηριότητες δέσμευσης του DNA, όταν επηρεάζεται από

Selaginella

tamariscina

, και ΑΡ-1 ιστοσελίδα ήταν απαραίτητες για την αναστολή της ΜΜΡ -9 έκφρασης.

Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι

Selaginella

tamariscina

μειωθεί το στόμα της μετανάστευσης του καρκίνου και η εισβολή με την αναστολή της γονιδιακής έκφρασης της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, και ενζυμική δραστικότητα. Αυτά τα κατά του όγκου αποτελέσματα επί OSCC που συνδέονται με την καταστολή της ΑΚΤ και την καταστολή των δραστηριοτήτων δέσμευσης DNA για ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 προαγωγούς. OSCC εισβολή και τη μετάσταση είναι ένα σημαντικό εμπόδιο για τη θεραπεία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, η αναστολή της μετάστασης από

Selaginella

tamariscina

θα μπορούσε να παρέχει ζωτική προληπτικό και θεραπευτικό όφελος για τη θεραπεία του καρκίνου του στόματος.