Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν αναδειχθεί ως σημαντικοί ρυθμιστές γονιδίων και αναγνωρίζονται ως βασικοί παράγοντες στην ογκογένεση. miR-145 αναφέρεται ότι κάτω-ρυθμίζονται σε διάφορες μορφές καρκίνου, αλλά η γνώση των στόχων της στον καρκίνο του παχέος εντέρου παραμένει περιορισμένη.

Μεθοδολογία Κύρια Ευρήματα /

Για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-145 σε καρκίνο του παχέος εντέρου, έχουμε απασχολούνται μια μικροσυστοιχία προσέγγιση για τον εντοπισμό miR-145 στόχους. Βασισμένο σε εμπλουτισμό ιστοσελίδα σπόρων αναλύσεις και αναλύσεις αμερόληπτη λέξη, βρήκαμε ένα σημαντικό εμπλουτισμό των θέσεων δέσμευσης miRNA στα 3′-αμετάφραστες περιοχές (UTRs) των μεταγραφών κάτω-ρυθμίζονται κατά miRNA υπερέκφραση. Γονιδιακή Οντολογία ανάλυση έδειξε μια υπερεκπροσώπηση των γονιδίων που εμπλέκονται σε κυτταρικό θάνατο, κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου, η έκφραση γονιδίου και τον καρκίνο. Ένας αριθμός των προσδιορισμένων στόχων miRNA έχουν προηγουμένως εμπλακεί στον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των

ΝΑΙ

,

FSCN1

,

ADAM17

,

BIRC2

,

VANGL1

καθώς και ο παράγοντας μεταγραφής

STAT1

. Τόσο

ΝΑΙ

και

STAT1

ελέγχθηκαν ως άμεσοι στόχοι miR-145.

Συμπεράσματα /Σημασία

Οι εντοπίζει μελέτη και επικυρώνει νέα καρκίνο σχετικών άμεσων στόχοι του miR-145 στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου και δια του παρόντος προσθέτει σημαντικό μηχανιστική κατανόηση των όγκων-κατασταλτική λειτουργίες του miR-145

Παράθεση:. Gregersen LH, Jacobsen AB, Frankel LB, Wen J, Krogh Α, Lund AH (2010) microRNA-145 Στόχοι

ΝΑΙ

και

STAT1

στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 5 (1): e8836. doi: 10.1371 /journal.pone.0008836

Επιμέλεια: Grzegorz Kudla, Πανεπιστήμιο του Εδιμβούργου, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 28 του Οκτώβρη του 2009? Αποδεκτές: 31 Δεκεμβρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιαν., 2010

Copyright: © 2010 Gregersen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εργασία σε των συγγραφέων εργαστήριο υποστηρίζεται από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή (ΕΚ) χρηματοδότηση του 7ου ΠΠ (ONCOMIRS, τον αριθμό συμφωνίας επιχορήγησης 201102. Η παρούσα δημοσίευση δεσμεύει μόνο τους συντάκτες των απόψεων. Η Επιτροπή δεν είναι υπεύθυνη για οποιαδήποτε χρήση που μπορεί να γίνει των πληροφοριών στο παρόν), το Novo Nordisk Foundation, Ίδρυμα Lundbeck, το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Δανίας, το Ιατρικό Ερευνητικό Συμβούλιο της Δανίας, η δανική Εταιρεία Καρκίνου και το Εθνικό Ίδρυμα Τεχνολογίας προχωρημένους της Δανίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα τελευταία χρόνια έχουν μικρό μη-κωδικοποίησης RNAs έχουν αναγνωριστεί ως σημαντικοί ρυθμιστές γονιδίων [1] – [4]. miRNAs είναι μια άφθονη ομάδα ενδογενών μικρών μη-κωδικοποίησης RNAs που λειτουργούν ως ρυθμιστές των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη μέσω μεταφραστικής καταστολής ή /και της υποβάθμισης των mRNAs στόχο τους [1]. Εκτεταμένη έρευνα miRNA έχει αποκαλύψει ότι οι miRNAs εμπλέκονται στην ρύθμιση πολυάριθμων βασικών κυτταρικών λειτουργιών όπως ο μεταβολισμός, πολλαπλασιασμός των κυττάρων, την ογκογένεση, απόπτωση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση [1], [3], [4]. Για τη ρύθμιση mRNAs στόχος είναι ώριμη miRNAs δεσμεύονται με πριν από πρωτεΐνες και καθοδηγούν την AGO που σχετίζονται με το RNA που προκαλείται φίμωση συγκρότημα (RISC) τους στόχους του mRNA μέσω ατελής σύζευξη βάσης μεταξύ του miRNA και στόχου. Αυτό συνεπάγεται συχνά τέλεια φλούδι βάσης μεταξύ του 5 ‘άκρου του κλώνου miRNA και του στόχου του, που ονομάζεται επίσης την περιοχή του σπόρου. Βιοπληροφορική αναλύσεις δείχνουν ότι το καθένα miRNA μπορεί να ελέγξει εκατοντάδες γονιδίων στόχων σε ανθρώπους και έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι πάνω από το 60% των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες βρίσκονται υπό επιλεκτική πίεση για τη διατήρηση αντιστοίχιση με miRNAs, υποδεικνύοντας ότι miRNAs έχουν τη δυνατότητα να ρυθμίζουν την πλειονότητα των πρωτεϊνών γονίδια που κωδικοποιούν [5].

Ακατάλληλος έκφραση των miRNAs, τα οποία ρυθμίζουν τα γονίδια λειτουργούν είτε ως όγκου-καταστολείς ή ογκογονίδια μπορεί τελικά να οδηγήσει σε απόκτηση από τα χαρακτηριστικά του καρκίνου, καθορίζοντας έτσι miRNAs καθώς και οι δύο όγκων-καταστολείς και ογκογονιδίων [ ,,,0],3], [6], [7]. Ειδικές αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης miRNA έχουν συσχετιστεί με διάφορες μορφές καρκίνου [8] και ενός μεγάλου αριθμού miRNAs εντοπίζονται στις λεγόμενες περιοχές του γονιδιώματος που σχετίζονται με τον καρκίνο, οι οποίες εκτίθενται συχνά σε αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα [9]. Ωστόσο, σε αντίθεση με τον μεγάλο αριθμό των miRNAs που έχει ταυτοποιηθεί τα τελευταία χρόνια, μόνο σχετικά λίγοι στόχοι miRNA έχουν πειραματικά επικυρωθεί. Με δεδομένη την συντριπτική απόδειξη ότι miRNAs είναι σημαντικοί ρυθμιστές της ογκογένεσης [3], [6], ο προσδιορισμός των στόχων miRNA είναι απαραίτητη προκειμένου να κατανοήσουν τη μηχανιστική βάση για τη συμμετοχή των miRNAs στον καρκίνο.

miR-145 συχνά έχουν αναφερθεί ως κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [10], [11], ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης [12], ο καρκίνος του παχέος εντέρου [13] – [18], τον καρκίνο των ωοθηκών [19], [20], καθώς και Β β-κυττάρων κακοήθειες [21], [22], και έχει αναφερθεί ότι η γονιδιωματική περιοχή που κωδικοποιεί miR-145 βρίσκεται σε μια εύθραυστη θέση συχνά διαγράφεται στον καρκίνο [23]. Κατά συνέπεια, miR-145 υπερέκφραση έχει αποδειχθεί να έχει μια επίδραση αναστολής της ανάπτυξης [16], [17], [24], [25] και για την καταστολή αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη [16]. Έχει επιπλέον αποδειχθεί ότι η έκφραση miR-145 διεγείρεται από ρ53 [16]. Εδώ, αναφέρθηκε ότι miR-145 στόχων c-Myc μέσω ατελή βάσης σπόρος ζευγαρώματος [16] και προτάθηκε ότι η ρ53-διαμεσολαβούμενη προς τα κάτω ρύθμιση της c-Myc είναι, τουλάχιστον εν μέρει, λόγω της ρ53-διαμεσολαβούμενη αυξητική ρύθμιση του miR-145 . Μια άλλη μελέτη διαπίστωσε επίσης ένα αυξημένο επίπεδο miR-145 που προκαλείται από δοξορουβικίνη [26]. Ωστόσο, αντί για ένα μεταγραφική ενεργοποίηση του miR-145, διαπιστώθηκε ότι η ρ53 ενεργοποιεί την επεξεργασία των πρωτογενών miR-145 μεταγραφές σε miR-145 προδρόμους [26]. Αυτό το φαινόμενο δεν περιορίζεται μόνο στα miR-145, αλλά εφαρμόζεται επίσης και σε διάφορα άλλα miRNAs με λειτουργίες κατασταλτική γνωστών αυξητικών, υποδεικνύοντας ρ53-διαμεσολαβούμενη ρύθμιση της επεξεργασίας miRNA ως τρόπος άσκησης ογκο-κατασταλτική λειτουργία του [26]. Εκτός από την c-myc, miR-145 έχει επίσης προταθεί για τη στόχευση του ανθρώπινου υποδοχέα ινσουλίνης υπόστρωμα-1 (IRS-1) και τύπου Ι που μοιάζει με ινσουλίνη υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα (IGF-IR) σε καρκίνο του παχέος εντέρου [25], [ ,,,0],27]. Ωστόσο, η ιδιαιτερότητα της αλληλεπίδρασης στόχου δεν επιβεβαιώθηκε από ανάλυση μεταλλάξεων των θέσεων σπόρων σε καμία από αυτές τις περιπτώσεις.

Το επίπεδο έκφρασης του miR-145 επάγεται κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των ανθρώπινων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων και miR-145 υπερέκφραση έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν τη πλειοδυναμία σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα με τη στόχευση των

Oct4

,

SOX2

και

KLF4

που εμπλέκονται στη διατήρηση της αυτο-ανανέωση ικανότητας των ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [28]. Αυτός ο ρόλος του miR-145 ως επαγωγέα διαφοροποίησης σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα είναι σε συμφωνία με το ρόλο των miR-145 ως καταστολέας της ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα. Ένα μοντέλο ποντικού σχεδιασμένη να διερευνήσει το πρότυπο έκφρασης του miR-145 αποκάλυψε έκφραση του miR-145 σε πολυδύναμων προγονικών κυττάρων καρδιακών και λείων μυϊκών κυττάρων [29] και πρότεινε ότι miR-145 προάγει την διαφοροποίηση σε λεία μυϊκά κύτταρα [29]. Ωστόσο, μια άλλη μελέτη έδειξε ότι τα ποντίκια που στερούνται miR-145 ήταν βιώσιμο χωρίς εμφανείς ανωμαλίες στη διαφοροποίηση των λείων μυϊκών κυττάρων [30], γεγονός που αποδεικνύει την ύπαρξη πρόσθετων υποστηρικτές της διαφοροποίησης.

Στο σύνολό τους, miR-145 φαίνεται να έχει λειτουργίες καταστολής όγκων όταν υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα και μπορεί κανονικά να παίζει ρόλο στις διαδικασίες διαφοροποίησης. Εδώ, έχουμε επικεντρωθεί στην αναγνώριση στόχου της miR-145 στον καρκίνο του παχέος εντέρου, με βάση τα προφίλ έκφρασης μικροσυστοιχιών των κυττάρων που υπερεκφράζουν το miR-145. Γονιδιακή Οντολογία αναλύσεις του miR-145 γονιδίων που αποκρίνονται επιβεβαιώσετε ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στον κυτταρικό θάνατο, τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και του καρκίνου. Έχουμε εντοπίσει μια σειρά από miR-145 στόχους που θα μπορούσαν να είναι ενδιαφέρον σε ένα πλαίσιο καρκίνο και επαλήθευσε ότι miR-145 στόχους ΝΑΙ και STAT1 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Με αφορμή τις πολυάριθμες εκθέσεις του miR-145 προς τα κάτω ρύθμιση στον καρκίνο επιδιώξαμε να εντοπίσει miR-145 στόχους που θα μπορούσε να εξηγήσει το ρόλο του miR-145 στον καρκίνο. Για να κατανοηθεί καλύτερα η τα επίπεδα έκφρασης του miR-145 σε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές, μπορούμε προφίλ τα επίπεδα έκφρασης σε έναν αριθμό κυτταρικών σειρών καρκίνου καθώς επίσης και σε μη ογκογόνων κυτταρικών σειρών (ΣΧΗΜΑ S1). Τα προφίλ έκφρασης του miR-145 έδειξε ότι, εκτός από ΜΟΡ10Α όλα τα ελεγμένα μη ογκογόνα κύτταρα γραμμές εξέφρασαν miR-145, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του miR-145 ήταν πολύ χαμηλή σε όλες τις εξετασθείσες καρκινικές κυτταρικές σειρές, υποστηρίζοντας τα προηγούμενα ευρήματα, όπου miR-145 είναι κάτω-ρυθμίζονται ή χάνεται στον καρκίνο. Λόγω των συνεπειών του καρκίνου του παχέος εντέρου [13] – [18], αποφασίσαμε να διερευνηθεί ο ρόλος του miR-145 στην κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου DLD-1. Η συν-επιμόλυνση του miR-145 duplex με ένα ρεπόρτερ λουσιφεράσης που περιέχει ένα τέλειο συμπληρωματικό χώρο για τα ώριμα miRNAs οδήγησε σε αξιοσημείωτη αρνητική ρύθμιση της δράσης της λουσιφεράσης, επιδεικνύοντας ένα εξαιρετικά αποτελεσματικό υπερέκφραση (ΣΧΗΜΑ S2A). Όπως καταδεικνύεται και από τα δύο κρυσταλλικό ιώδες και ανάπτυξη ΜΤΤ δοκιμασίες, η υπερέκφραση του miR-145 οδήγησε σε μειωμένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Εικόνα 1 και Εικόνα S3).

DLD-1 κύτταρα επιμολυσμένα με 50 ηΜ miR-145 duplex δεικνύουν μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως μετράται με τη δοκιμασία κρυσταλλικού ιώδους ανάπτυξη. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.D. των τεσσάρων επαναλήψεων.

Η

Αναγνώριση του miR-145 Στόχοι

Με δεδομένες τις ενδείξεις ότι το miR-145 παίζει ένα ρόλο στον καρκίνο, σε συνδυασμό με την περιορισμένη γνώση των στόχων της στον καρκίνο του παχέος εντέρου, ο στόχος ήταν να εντοπιστούν λειτουργικά σχετικούς στόχους που θα μπορούσε να βοηθήσει να εξηγήσει το ρόλο του miR-145 στον καρκίνο. Για να επιτευχθεί αυτό, χρησιμοποιήσαμε μια στρατηγική που βασίζεται μικροσυστοιχιών παρόμοιο με εκείνο που χρησιμοποιήθηκε προηγουμένως για τον προσδιορισμό miR-21 στόχων [31]. κύτταρα DLD-1 επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ miR-145 duplex ή ψευδο-διαμολυσμένα. Ολικό RNA συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και αναλύθηκαν σε Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 ανθρώπινο συστοιχίες. Ένα σύνολο οκτώ συστοιχίες αναλύθηκαν. Για το φιλτράρισμα, uninformative γονίδια με το ίδιο επίπεδο έκφρασης σε όλες τις συστοιχίες (συμπεριλαμβανομένων των μη-εκφρασμένα γονίδια) απομακρύνθηκαν και οι διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, που αντιστοιχούν ρ-τιμές τους και ψευδείς τιμές ανακάλυψη υπολογίστηκαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι.

για να καθοριστεί εάν τα γονίδια ρυθμίζονται κατά miR-145 υπερέκφραση σχετίζονταν με συγκεκριμένες κυτταρικές λειτουργίες, μια αναζήτηση μέσα στα λειτουργικά τους σχολιασμούς στη βάση δεδομένων Ingenuity (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) πραγματοποιήθηκε για όλα τα miR-145 αποκριτικών γονιδίων. Οι πέντε πρώτες εμπλουτισμένες λειτουργικές κατηγορίες της ανάλυσης Gene Ontology παρατίθενται στον Πίνακα 1. Μεταξύ των κατηγοριών αυτών είναι ο κυτταρικός θάνατος, κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και τον καρκίνο. Αντίστοιχες αναλύσεις χρησιμοποιώντας τυχαία σύνολα γονιδίων που παράγεται από Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 σχολιασμούς, σε ορισμένες περιπτώσεις οδήγησε σε εμπλουτισμό των ίδιων κατηγοριών που βρήκαμε εμπλουτισμένο στο miR-145 σύνολο δεδομένων, αλλά με τιμές p 10 τάξεις μεγέθους υψηλότερη από ό, τι η miR-145 σύνολο δεδομένων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

ανάλυση εμπλουτισμό χώρο σπόρων των περιστατικών του miR-145 sites σπόρων στα 3’UTRs αποδειχθεί ένα εξαιρετικά σημαντικό εμπλουτισμό μεταξύ των κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές (ΕΙΚΟΝΑ 2Α). Οι p-τιμές για τον εμπλουτισμό του miR-145 sites σπόρων (συμπεριλαμβανομένων 7mer, 7mer-1A και 8-μερούς sites) ήταν 1.4 · 10

-21 και 7,6 · 10

-8 κατά την εξέταση των κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές vs . up-ρυθμίζονται μεταγραφές και κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές εναντίον κανένα μεταγραφές αλλαγής, αντίστοιχα. Δύο εναλλακτικές μέθοδοι υπολογισμού του εμπλουτισμού ιστοσελίδα σπόρων, είτε ως περιστατικά ιστοσελίδα σπόρων μετά τη διόρθωση της πάνω, κάτω και καμία αλλαγή θέτει στο ίδιο μέγεθος ή ως γεγονότα ιστοσελίδα σπόρου ανά kb, έδειξε μια παρόμοια εμπλουτισμό των κάτω-ρυθμίζονται 3’UTRs ( ΕΙΚΟΝΑ S4). Στο σύνολό τους, αυτό επιβεβαιώνει ότι η προσέγγιση που βασίζεται μικροσυστοιχιών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιορίσει τους στόχους των miRNAs. Όταν ολόκληρη η αλληλουχία cDNA των μεταγραφών χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση εμπλουτισμό τοποθεσία σπόρου (αναφέρεται ως το ποσοστό των μεταγραφών με τοποθεσίες σπόρος), έχουμε βρει ακόμα μια σημαντική εμπλουτισμό των χώρων σπόρων, ακόμη και αν ο εμπλουτισμός είναι λιγότερο έντονη σε σύγκριση με μόνο την εξέταση του 3 ‘UTR αλληλουχίες (S5A ΕΙΚΟΝΑ). Μια παρόμοια ανάλυση των ακολουθιών κωδικοποίησης και 5’ΙΙΤΚ αλληλουχιών αποκάλυψε καμία σημαντική ιστοσελίδα σπόρων εμπλουτισμού (ΕΙΚΟΝΑ S5B και S5c).

Ένα, Τα ποσοστά των γονιδίων στο επάνω, κάτω (dn) και καμία αλλαγή (NC ) ορίζει με σπόρους sites στο 3’UTRs τους. Μόνο αυτές οι 6mers που δεν αποτελούν μέρος μιας 7mer ή 8-μερούς αναφέρονται ως 6mers και μόνο αυτών των 7mers που δεν περιέχονται μέσα σε ένα 8-μερούς υπολογίζονται ως 7mers. Η μέση log πτυσσόμενο αλλαγές ήταν 0,36, 0,02 και -0,40 για το πάνω, κάτω και καμία αλλαγή σετ, αντίστοιχα. Οι ρ-τιμές που υπολογίστηκαν έλεγχο της μηδενικής υπόθεσης ότι το ποσοστό των γονιδίων με θέσεις σπόρος είναι τα ίδια για το κάτω-ρυθμιζόμενη και ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια (dn vs. πάνω) ή στο κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια σε σύγκριση με την μη μεταβολή γονίδια (dn εναντίον NC). Ρ-τιμές για τον εμπλουτισμό ιστοσελίδα 7mer σπόρων ήταν 1,7 · 10

-33 (dn εναντίον up) και 2,9 · 10

-11 (dn εναντίον NC). Ρ-τιμές για 7mer-1A εμπλουτισμό ιστοσελίδα σπόρων ήταν 3,7 · 10

-18 (dn εναντίον up) και 7,8 · 10

-7 (dn εναντίον NC). Β, αμερόληπτη ανάλυση λέξη που δείχνει το τρέχον άθροισμα της βαθμολογίας υπερεκπροσώπηση για την 7mer ιστοσελίδα σπόρων miR-145 σε πίνακα κατάταξης των αλληλουχιών 3’ΙΙΤΡ (μαύρη γραμμή) σε σύγκριση με παραλλαγές του πίνακα κατάταξης γονίδιο (κόκκινες γραμμές). Κατάντη και up-ρυθμιζόμενα γονίδια (που ορίζεται ως γονίδια με FC & lt? -1.1 Ή FC & gt? 1.1) στον πίνακα κατάταξης του γονιδίου υποδεικνύονται στο γράφημα. C, την επικύρωση Ποσοτική RT-PCR των δεδομένων μικροσυστοιχίας. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ miR-145 duplex ή ψευδο-διαμολυσμένα και το ολικό RNA που συγκομίζονται 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι 3’UTRs του

IQGAP1

και

STAT1

δεν περιέχουν miR-145 αγώνες σπόρων, αλλά και τα δύο γονίδια που περιέχουν ένα 7mer αγώνα σπόρων στην περιοχή κωδικοποίησης τους. Όλα τα άλλα miR-145 ανταποκρίνεται γονίδια περιέχουν τουλάχιστον μία ιστοσελίδα σπόρων 7mer στην 3’ΙΙΤΡ τους. Το επίπεδο έκφρασης του κάθε μεταγραφής παρουσιάζεται σε σχέση με το επίπεδο σε ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.D. από τρεις επαναλήψεις.

Η

Προτάσεις λέξη αναλύσεις των 3’ΙΙΤΡ ακολουθίες που ταυτοποιούνται την ιστοσελίδα σπόρων 7mer του miR-145 ως το πιο σημαντικά εμπλουτισμένη 7mer λέξη στα 3’UTRs της κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές (ΠΙΝΑΚΑΣ 2). Αρκετά από τα άλλα υψηλά εμπλουτισμένου λόγια ήταν παραλλαγές του site σπόρων miR-145 και η τέταρτη πιο εμπλουτισμένη λέξη ήταν ο αγώνας σπόρων 7mer-1A (πίνακας 2). Μια αντίστοιχη 6mer ανάλυση λέξη εντόπισαν επίσης miR-145 αγώνες σπόρους ως τα πιο σημαντικά εμπλουτισμένη λέξεις (FDR & lt? 0.005) (ΣΧΗΜΑ S6). Χάραξη της τρέχει άθροισμα των βαθμολογιών υπερεκπροσώπηση του site σπόρων 7mer σε μεταγραφές κατατάσσονται ανάλογα με logFC τους έδειξε σαφώς ότι οι 3’UTRs της κάτω-ρυθμίζονται οι μεταγραφές είχαν υψηλό εμπλουτισμό του miR-145 7mer σπόρους (μαύρη γραμμή), το οποίο δεν παρατηρήθηκε για μεταθέσεις του πίνακα κατάταξης γονίδιο (κόκκινες γραμμές) (Σχήμα 2Β).

η

Πιθανές miR-145 Στόχοι

από το miR-145 ρυθμίζεται προς τα κάτω ή χάνεται στον καρκίνο, την εκ νέου -Εισαγωγή του miR-145 θα πρέπει να αναμένεται να προκαλέσει μια άμεση ρύθμιση προς τα κάτω του ογκογονιδίου στόχων. Πράγματι, ένας αριθμός γονιδίων με ογκογόνο λειτουργία ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω κατά miR-145 υπερέκφραση συμπεριλαμβανομένου του μέλους της οικογένειας Src

ΝΑΙ

και η ακτίνη διασταυρούμενης σύνδεσης πρωτεΐνης

FSCN1

, το οποίο βρίσκεται στο κελί προεξοχές επιφάνεια εμπλέκεται στην κυτταρική κινητικότητα [32]. Η μεταλλοπρωτεϊνασών

ADAM17

και μέλος του αναστολέα της απόπτωσης (ΙΑΡ) της οικογένειας

BIRC2

(επίσης γνωστή ως

cIAP1

), τα οποία αμφότερα περιέχουν 8-μερούς miR-145 sites σπόρων σε 3’UTRs τους, παρατηρήθηκαν επίσης ως προς τα κάτω-ρυθμιζόμενη κατά miR-145 υπερέκφραση. Επιπλέον,

VANGL1

η οποία εμπλέκεται στην επούλωση των πληγών ανταπόκριση των εντερικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών μέσω της προώθησης της κυτταρικής μετανάστευσης αναγνωρίστηκε επίσης ως ένα υποθετικό miR-145-στόχου [33].

Μερικά από τα κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια δεν είχε χώρο σπόρο miR-145 στην 3’UTR τους, αλλά, αντίθετα, είχαν ένα ή περισσότερα ένα σπόρο τοποθεσίες στην περιοχή κωδικοποίησης. STAT1, ένας πολύ γνωστός παράγοντας μεταγραφής [34], [35] και IQGAP1 ένας αρνητικός ρυθμιστής του κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις και διεγέρτης της κυτταρικής κινητικότητας και εισβολή [36], και οι δύο είχαν miR-145 θέσεις σπόρων στις περιοχές κωδικοποίησης των μεταγραφών τους. Στην περίπτωση του

STAT1

, η περιοχή σπόρων miR-145 βρίσκεται στην προτελευταία εξόνιο της μεταγραφής. Δεδομένου ότι

STAT1

ήταν μεταξύ των πιο κάτω ρυθμίζεται μεταγραφές στην ανάλυση μικροσυστοιχιών, κρίθηκε επίσης ως πιθανός στόχος και περιλαμβάνεται στις επόμενες έρευνες. Οι προηγουμένως ταυτοποιηθεί miR-145 στόχους

Oct4

,

SOX2

και

KLF4

σε ανθρώπινα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα δεν εκφράστηκαν σε κύτταρα DLD-1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

MYC

,

ISR-1

και

IGF-1R

, που προτείνεται από τους άλλους ως miR-145 στόχοι [16], [25], [27], δεν έδειξε μεταβολή στο επίπεδο έκφρασης κατά miR-145 υπερέκφραση στη δέσμη στοιχείων μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο πλήρης κατάλογος των προσδιορισμένων πιθανών στόχων miR-145 που περιέχουν θέσεις σπόρων σε 3’ΙΙΤΡ τους παρουσιάζεται στον ΠΙΝΑΚΑ S1.

Target Επικύρωση

Εμείς επιβεβαίωσε επόμενο τα δεδομένα μικροσυστοιχιών με ποσοτική RT-PCR για επτά επιλεγμένα προϊόντα μετεγγραφής που βρέθηκαν κάτω-ρυθμίζονται στην ανάλυση μικροσυστοιχιών (Σχήμα 2C). Αξίζει να σημειωθεί ότι,

STAT1

και

ΝΑΙ

, οι οποίες έχουν miR-145 ιστοσελίδες σπόρων στην περιοχή κωδικοποίησης και 3’UTR, αντίστοιχα, έδειξαν μια σαφή ρύθμιση προς τα κάτω από το επίπεδο μεταγραφής κατά miR-145 υπερέκφραση. Για να προσδιορίσετε αν το miR-145 ρυθμίζει άμεσα

ΝΑΙ

και

STAT1

, κατασκευάσματα ανταποκριτή λουσιφεράσης κλωνοποιήθηκαν. Το ζευγάρωμα βάσεων μεταξύ των θέσεων των σπόρων miRNA και των πιθανών στόχων mRNA απεικονίζονται στο ΣΧΗΜΑ 3Α. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, η υπερέκφραση του miR-145 οδήγησε σε μειωμένη δραστικότητα λουσιφεράσης, υποδεικνύοντας ότι το miRNA μπορεί να δεσμεύσει τόσο το

ΝΑΙ

3’UTR και η

STAT1

cDNA και άμεσα διαμεσολαβούν καταστολή (Σχήμα 3Β ). Αυτό δεν ήταν η περίπτωση με τα κατασκευάσματα ανταποκριτή, όπου οι θέσεις των σπόρων είχαν μεταλλαχθεί (ΣΧΗΜΑ 3Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η miRNA μεσολάβηση μειορύθμιση STAT1 και YES σε επίπεδο πρωτεΐνης, αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν σε δύο κύτταρα DLD-1 και HCT116 του κόλου. Η αποτελεσματικότητα υπερέκφραση του miR-145 σε HCT116 μετράται από λουσιφεράση κατασκευάσματα αναφοράς ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε κύτταρα DLD-1 (Σχήμα S2B). Μια αξιοσημείωτη μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης ΝΑΙ διαμεσολαβείται από miR-145 παρατηρήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση σε αμφότερες κύτταρα DLD-1 και HCT116 (Σχήμα 3C). Μια πιο λεπτές, αλλά ακόμη σαφής ρύθμιση προς τα κάτω των STAT1 διαμεσολαβείται από miR-145 παρατηρήθηκε επίσης (ΕΙΚΟΝΑ 3D). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο βαθμός της καταστολής STAT1 κυμαινόταν μεταξύ DLD-1 και HCT116 κύτταρα, με την ισχυρότερη καταστολή της STAT1 παρατηρήθηκε σε κύτταρα DLD-1.

Α, ευθυγράμμιση αλληλουχίας της περιοχής σπόρου miR-145 και στόχους mRNA. Οι συντεταγμένες θέσης που αναφέρονται για τα ισόμορφα μεταγραφής που αναφέρονται παρακάτω.

YES1

3’ΙΙΤΡ: ENSG00000176105: ENST0000035983

STAT1

cDNA: ENSG00000115415: ENST00000361099. Β, δοκιμή λουσιφεράσης Firefly με pGL3 + κατασκευάσματα που κατέχουν ένα θραύσμα 3’UTR του

ΝΑΙ

ή ένα θραύσμα cDNA του

STAT1

, προς τα κάτω με το γονίδιο της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με πυγολαμπίδας ρεπόρτερ λουσιφεράσης μαζί με ένα

Renilla

πλασμιδίου λουσιφεράσης έλεγχος επιμόλυνσης είτε μόνο του είτε με 50 ηΜ miR-145 διπλής όψης και 50 ηΜ AllStar duplex ως αρνητικός έλεγχος. Σε pGL3 + mut φορείς έχουν δύο ζεύγη βάσεων στο site σπόρων miR-145 έχουν μεταλλαχθεί. Η φωταύγεια μετρήθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και η αναλογία της πυγολαμπίδας στο

Renilla

δραστικότητα παρουσιάζεται σε σχέση με την επιμόλυνση χωρίς RNA διπλής όψης και τον κενό φορέα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± S.D. από τέσσερις επαναλήψεις. *, Ρ & lt? 0.05 με χρήση δύο tailed t-test, *** ρ & lt? 0.01 με χρήση δύο tailed t-test. Γ και Δ, ανάλυση κηλίδας Western των DLD-1 και HCT116 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-145 διπόλων ή ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα στυπώθηκαν για ΝΑΙ (C) και STAT1 (D). Βινκουλίνης ή τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης. Οι ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν σε σχέση με τους κατάλληλους ελέγχους φόρτωση χρησιμοποιώντας το λογισμικό TotalLab και εμφανίζονται σε σχέση με το επίπεδο πρωτεΐνης σε ψευδο-διαμολυσμένα κύτταρα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των δύο πειραμάτων.

Η

δευτερογενείς επιπτώσεις Λόγω STAT1 Απορρύθμιση

STAT1 είναι ένα καλά χαρακτηρισμένο παράγοντα μεταγραφής καλύτερα αναγνωρίζεται ως μεταγραφικός ενεργοποιητής, αλλά παραδείγματα αρνητική ρύθμιση της μεταγραφής έχουν επίσης περιγραφεί [34]. Το μοτίβο δέσμευσης STAT1, όπως ορίζεται από τη βάση δεδομένων JASPAR CORE [37] δείχνεται στο ΣΧΗΜΑ S7A. Για να προσδιορίσετε αν το miR-145 με τη μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των STAT1 προκάλεσε επίσης μια αλλαγή του επιπέδου έκφρασης των γονιδίων στόχων STAT1 στην ανάλυση μικροσυστοιχιών, μια αναζήτηση για STAT1 τόπους στα υποστηρικτές της δέσμευσης το κάτω-ρυθμίζονται, up-ρυθμίζονται και οι μεταγραφές χωρίς μεταβολή στο επίπεδο έκφρασης διεξήχθη. Από όλους τους παράγοντες πυρήνα της μεταγραφής JASPAR, STAT1 ήταν η πιο σημαντικά εμπλουτισμένη θέση δέσμευσης και όταν το (p-value = 4,18 · 10

-4) ρυθμίζεται προς τα κάτω και τα πάνω-ρυθμιζόμενα γονίδια (p-value = 1,34 · 10

-4) συγκρίθηκαν με τα γονίδια χωρίς μεταβολή στην έκφραση (ΠΙΝΑΚΑΣ 3). Αυτή δεν ήταν η περίπτωση για μια permuted μήτρα δεσμευτική STAT1 κατά τη σύγκριση up-ρυθμιζόμενα γονίδια στα γονίδια χωρίς αλλαγή στο επίπεδο έκφρασης (ΕΙΚΟΝΑ S7B). Ωστόσο, κατά την εξέταση των γονιδίων ρυθμίζεται προς τα κάτω σε σχέση με τα γονίδια μηδενικής μεταβολής, υπήρχε επίσης μία ελαφρά εμπλουτισμός του STAT1 μετατεθούν θέσεις πρόσδεσης, υποδεικνύοντας ότι ορισμένα από τα παρατηρούμενα αποτελέσματα μπορούν να είναι μη ειδική (ΣΧΗΜΑ S7C).

Συζήτηση

miRNAs αναδεικνύεται ως σημαντικοί ρυθμιστές γονιδίων και εντατική έρευνα των λειτουργιών και των στόχων τους έχουν αποκαλύψει ένα ρόλο των miRNAs σε πολλές βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Ακόμα κι αν η κατανόηση των λειτουργικών ρόλων των miRNAs σε καρκίνους αυξάνεται σταθερά, οι γνώσεις για το miR-145 και τους στόχους της στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι ακόμα σε μεγάλο βαθμό λείπει. Εμείς, ως εκ τούτου επικεντρώνεται στον εντοπισμό των στόχων miR-145 στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Στήριξη προηγούμενα ευρήματα ότι το miR-145 είναι κάτω-ρυθμίζονται σε όγκους [10] – [13], [15], [16], [18] – [21], [38] – [42], το προφίλ του ΜΙΚ 145 έκφρασης σε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-145 μειώθηκαν σημαντικά σε καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σχέση με μη ογκογόνα κυτταρικές σειρές. Σε συμφωνία με τις εκθέσεις που δείχνει μια ανασταλτική της ανάπτυξης δράση του miR-145 [16], [17], [41], παρατηρούμε επίσης μια μείωση της ανάπτυξης των DLD-1 κύτταρα μετά από παροδική επιμόλυνση miR-145, το οποίο σημαίνει ότι το miR-145 διαθέτει μια λειτουργία ογκοκατασταλτικών

in vitro

.

Εδώ, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχιών προφίλ κατά miR-145 υπερέκφραση ως μέθοδος ταυτοποίησης των πιθανών στόχων. προφίλ έκφρασης μικροσυστοιχιών σε συνδυασμό με την ανάλυση εμπλουτισμού ιστοσελίδα σπόρος είναι μια εδραιωμένη προσέγγιση που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό πιθανών στόχων των miRNAs [31], [43], [44]. Έχει το πλεονέκτημα έναντι αυστηρά υπολογιστική πρόβλεψη στόχος ότι δεν βασίζεται μόνο στην παρουσία μιας θέσης σπόρων και χαρακτηριστικά ακολουθία του πιθανού στόχου, αλλά λαμβάνει υπόψη εάν ο στόχος εκφράζεται κατά την υπό εξέταση κυτταρική γραμμή και αν ο στόχος ρυθμίζεται στο επίπεδο μεταγραφής. Δεδομένου ότι αυτή η προσέγγιση βασίζεται αποκλειστικά σε αλλαγές που παρατηρούνται σε επίπεδο μεταγραφής, οι στόχοι ρυθμίζονται αποκλειστικά από την μεταγραφική καταστολή δεν θα αναγνωρίζονται.

ανάλυσης των σπόρων εγκατάστασης εμπλουτισμού και αμερόληπτη ανάλυση λέξη έδειξε μια σαφή εμπλουτισμό του miR-145 sites σπόρων στην 3’UTRs της κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές, επιβεβαιώνοντας την προσέγγισή μας για τον εντοπισμό του miR-145 στόχους. Εμείς δεν τήρησε καμία εμπλουτισμό του miR-145 sites σπόρων στην περιοχή κωδικοποίησης του κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές. Ωστόσο, δεδομένου ότι ορισμένα από τα γονίδια που περιέχουν θέσεις σπόρων εντός της περιοχής κωδικοποίησης στο παρελθόν είχε εμπλακεί στον καρκίνο, έχουμε σκεφτεί ότι αυτοί οι υποψήφιοι στόχος μπορεί επίσης να παίζει ένα λειτουργικό ρόλο κατάντη miR-145. Η αμερόληπτη ανάλυση λέξη, χρησιμοποιείται εδώ για να αξιολογήσει τον εμπλουτισμό των λέξεων σε 3’UTRs σύμφωνα με την logFC της απομαγνητοφώνησης κατά miR-145 υπερέκφραση, παρουσιάζει μια εξαιρετικά χρήσιμη μέθοδος για την οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων των miRNA υπερέκφραση χωρίς να κάνει καμία προκατάληψη υπόθεση σχετικά αποκοπής αξίες. Το σχήμα της καμπύλης τρέχει άθροισμα δείχνει μια απότομη κορυφή του miR-145 7mer sites σπόρων για τα πιο κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια που υποδηλώνει ότι η μεταγραφή στόχος κάτω ρύθμιση σε μεγάλο μέρος οφείλεται στην άμεση επίδραση του miR-145 στόχευση. Η αμερόληπτη ανάλυση λέξη επιβεβαίωσαν προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι μια Α στη θέση 1 του site σπόρου είναι επωφελής, ανεξάρτητα από τη δυνατότητά της να ζεύγος βάσεων με το miRNA [2], [45].

Πολλοί από τους στόχους που προσδιορίζονται εδώ έχουν προηγουμένως εμπλακεί στον καρκίνο. Τα εμπλουτισμένα λειτουργικές κατηγορίες όλων των στόχων που ανταποκρίνονται σε miRNA υποστήριξε περαιτέρω την επίπτωση των miR-145 στον καρκίνο και υποδηλώνουν ότι τόσο οι άμεσες επιπτώσεις του miR-145, καθώς και δευτερογενείς επιπτώσεις μπορεί να εξηγήσει το ρόλο του miR-145 στον καρκίνο. Ένας αριθμός γονιδίων με ογκογόνο λειτουργία, πολλά από τα οποία έχουν επίσης συσχετιστεί με τον καρκίνο του παχέος εντέρου, ταυτοποιήθηκαν ως πιθανοί στόχοι miR-145 με βάση την ανάλυση μικροσυστοιχίας. Αυτές περιλαμβάνουν

ADAM17

,

BIRC2

και

VANGL1

. ADAM17 έχει αναφερθεί πάνω ρυθμισμένα σε καρκινώματα του παχέος εντέρου και έχει δειχθεί ότι προάγουν την απελευθέρωση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) συνδέτες από την κυτταρική μεμβράνη, ενεργοποιώντας έτσι EGFR [46]. BIRC2 έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της επιβίωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αγγειακή ακεραιότητα στο ψάρι zebra ενεργοποιώντας το σχηματισμό του συμπλόκου υποδοχέα TNF Ι, καθώς και η προώθηση της αποδόμησης του ΙκΒ, πάνω στην οποία απελευθερώνεται NF-κΒ και μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου ενεργοποιεί τα γονίδια προ-επιβίωσης σε ενδοθηλιακά κύτταρα [47]. Η συνδεδεμένη κλάσμα κυτταρικής μεμβράνης των VANGL1 αυξάνει με διαφοροποίηση και αποδείχθηκε να συν-εντοπίζεται με Ε-καδερίνης σε ανθρώπινα κύτταρα του παχέος εντέρου [33]. Επιπλέον, δείχθηκε ότι η υπερέκφραση του

VANGL1

διεγερμένη τραύματος κλείσιμο των εντερικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών, ενώ siRNA που κατευθύνεται έναντι Vangl1 ανέστειλαν την μεταναστευτική απόκριση [33]. Έχουν αναφερθεί στο παρελθόν miR-145 στόχους συμπεριλαμβανομένων των

Oct4

,

SOX2

και

KLF4

εμπλέκονται στην προώθηση του πολλαπλασιασμού των βλαστικών κυττάρων δεν εκφράστηκαν σε DLD-1 κύτταρα, πράγμα που σημαίνει ότι η αναστολής αύξησης επίδραση του miR-145 υπερέκφραση σε κύτταρα DLD-1 δεν οφείλεται σε αρνητική ρύθμιση αυτών των γονιδίων. Ένα άλλο βασικό ρυθμιστή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού,

MYC

, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ως στόχο miR-145 δεν έδειξε καμία αλλαγή στο επίπεδο έκφρασης κατά miR-145 υπερέκφραση στο περιβάλλον μας.

Πειραματική επικύρωση της

ΝΑΙ

και

STAT1

ως miR-145 στόχους αποδειχθεί μια σημαντική προς τα κάτω-ρυθμίζονται σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης, που αποδεικνύουν ότι η βιολογική επίδραση του miR-145 για τις ενδογενείς στόχους. Η ρύθμιση προς τα κάτω σε δοκιμασίες /cDNA λουσιφεράσης 3’ΙΙΤΡ επικυρώνει περαιτέρω ότι αυτό είναι το αποτέλεσμα της άμεσης αλληλεπιδράσεων, δεδομένου ότι οι μεταλλάξεις των θέσεων σπόρων miR-145 καταργήσουν αυτήν την ρύθμιση προς τα κάτω. Ο λόγος των διαφορετικών αποτελεσμάτων της miR-145 στις διάφορες δοκιμασίες είναι πιθανόν να οφείλεται σε έλλειψη απευθείας συγκρισιμότητα μεταξύ αυτών των προσδιορισμών. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε άλλους δεσμευτικούς παράγοντες που εμπλέκονται στην ρύθμιση της ενδογενούς μεταγράφου, καθώς αυτές οι θέσεις πρόσδεσης δεν είναι παρόντα στα θραύσματα 3’UTR ή cDNA που χρησιμοποιείται στα κλωνοποιημένα μορφώματα αναφοράς λουσιφεράσης.

Ένας αριθμός οι μελέτες που συνδέονται αυξημένη έκφραση του ΝΑΙ σε καρκίνο με αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων και εισβολή όγκου [48], [49]. ΝΑΙ είναι μέρος της οικογένειας Scr κινασών [50] και η δραστικότητα κινάσης τυροσίνης του έχει δειχθεί ότι είναι αυξημένα σε κολικό αδενώματα συγκρίθηκε με τη δράση της σε γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο [51]. Επιπλέον ΝΑΙ δραστικότητα βρέθηκε να συσχετίζεται με την πρόγνωση του κινδύνου καρκίνου του με βάση το μέγεθος, ιστολογία, και το βαθμό της δυσπλασίας [51]. Λαμβανόμενα μαζί, τα παρόντα δεδομένα δείχνουν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του ΝΑΙ είναι σημαντική για την ανάπτυξη και το μετασχηματισμό των εντερικών κυττάρων.

πρωτεΐνες STAT λειτουργήσει κατάντη JAKs και MAPKs, οι οποίες επάγουν την διμερισμό των πρωτεϊνών STAT, επιτρέποντας έτσι την μετατόπιση των STAT πρωτεΐνες εντός του πυρήνα [34], [35]. STAT1 είναι περισσότερο γνωστή για προ-αποπτωτική ρόλο της στην απόκριση σε ιντερφερόνες, αλλά STAT1 έχει επίσης αναφερθεί ότι έχει ένα ρόλο προ-επιβίωσης σε μερικούς καρκίνους [35]. Παρατηρήσαμε μια ρύθμιση προς τα κάτω των

STAT1

στο επίπεδο μεταγραφής και το επίπεδο της πρωτεΐνης κατά miR-145 υπερέκφραση. Επιπλέον, δείχνουμε ότι αυτό προς τα κάτω ρύθμιση του STAT1 μεταφράζεται σε μία επίδραση στο επίπεδο έκφρασης των πιθανών στόχων STAT1. Αυτή είναι η περίπτωση για τα γονίδια και θετικά και αρνητικά ρυθμίζεται από STAT1, αλλά το αποτέλεσμα είναι η μεγαλύτερη σε γονίδια που ρυθμίζονται από αρνητικά STAT1. Ακόμα κι αν STAT1 έχει αναφερθεί τόσο ως μεταγραφικός ενεργοποιητής και καταστολέα, ο κύριος μηχανισμός της STAT1 μεταγραφική ρύθμιση είναι η ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων του [34]. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η μεταγραφική καταστολή είναι πιο διαδεδομένη από ό, τι προηγουμένως αναγνωρίστηκαν. Για να συνοψίσω, μεταγραφικός παράγοντας αναλύσεις των υποκινητών της απελευθερωμένης γονιδίων παρέχει ένα μέσο για να χαρακτηρίσει δευτερογενείς επιδράσεις όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί για miR-34a [52]. Το ταυτοποιημένο εμπλουτισμός του STAT1 θέσεων σύνδεσης σε υποκινητές ρυθμιζόμενης γονιδίων καταδεικνύει ότι οι δευτερογενείς επιδράσεις της υπερέκφρασης miRNA προφέρεται ήδη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να εξεταστεί δευτερογενή αποτελέσματα κατά την ανάλυση των miRNA σύνολα δεδομένων υπερέκφραση.

Εν κατακλείδι, χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση που βασίζεται μικροσυστοιχιών έχουμε εντοπίσει πρόσθετους στόχους για τον καρκίνο που σχετίζεται με miRNA miR-145 στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Οι στόχοι miRNA εντοπίζονται στην παρούσα μελέτη μπορεί να χρησιμεύσει για να διευκρινιστεί ο ρόλος του miR-145 σε καρκίνους του παχέος εντέρου, καθώς και άλλους τύπους καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Πολιτισμών

DLD-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM GlutaMAX ™ -Ι υψηλή μέση γλυκόζη (31966, Gibco Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου βοός (FBS, CH30160.03, Hyclone), 50 U /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη (P /S, 15140 Gibco Invitrogen) και επωάζονται σε

2 συν 20% οξυγόνο 5% CO. κύτταρα HCT116 καλλιεργήθηκαν σε 5A L-Γλουταμίνη μέσο McCoy (22330, Gibco Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και P /S. Η υπερέκφραση του miR-145 επιτεύχθηκε με επιμόλυνση με ένα διπλό miR-145 που μιμείται την ώριμη miR-145 (PM11480? Ambion). Επιμόλυνση με

Caenorhabditis elegans

lin-4 duplex (PM10768, Ambion) ή AllStar αρνητικό siRNA ελέγχου (1027281, Qiagen) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Όλες οι επιμολύνσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine ™ 2000 Επιμόλυνσης (11668-019, Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.