Αφηρημένο

αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS) είναι μια αναδυόμενη τεχνολογία να γίνει σχετική για προσδιορισμό του γονότυπου των κλινικών δειγμάτων. Εδώ, θα αξιολογηθεί η σταθερότητα της αλληλουχίας αμπλικονίου από φορμόλη σταθερό εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) και σε συνδυασμό κατεψυγμένα δείγματα από ορθοκολικό μεταστάσεις καρκίνου με διαφορετικούς αγωγούς ανάλυση. 212 περιοχές amplicon σε 48 γονίδια που σχετίζονται καρκίνος αλληλουχήθηκαν με Illumina MiSeq χρησιμοποιώντας DNA απομονωμένο από δείγματα εκτομής από 17 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου ηπατικές μεταστάσεις. Από δέκα από αυτούς τους ασθενείς, σε συνδυασμό κατεψυγμένα και συνήθως επεξεργασία FFPE ιστού ήταν διαθέσιμα για συγκριτική μελέτη. ποιότητα Δείγμα ιστών FFPE προσδιορίστηκε από την ποσότητα του ενισχύσιμου DNA χρησιμοποιώντας qPCR, βιβλιοθήκες αλληλούχιση αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Bioanalyzer. Τρεις βιοπληροφορικής αγωγών συγκρίθηκαν για την ανάλυση των δεδομένων αλληλούχισης αμπλικονίου. Επιλεγμένα hot spot μεταλλάξεις εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας αλληλουχίας Sanger. Στα αλληλουχία δείγματα από 16 ασθενείς, 29 μη συνώνυμες μεταλλάξεις που κωδικοποιούν ταυτοποιήθηκαν σε έντεκα γονίδια. Συχνότερες ήταν οι μεταλλάξεις στο ΤΡ53 (10), η APC (7), PIK3CA (3) και KRAS (2). Μια υψηλή συμφωνία των FFPE και αντιστοιχισμένο δείγματα κατεψυγμένου ιστού παρατηρήθηκε σε δέκα αντίστοιχα δείγματα, αποκαλύπτοντας 21 πανομοιότυπα κλήσεις μετάλλαξης και μόνο δύο μεταλλάξεις που διαφέρουν. Η σύγκριση αυτών των αποτελεσμάτων με δύο άλλα κοινώς χρησιμοποιούμενα παραλλαγή κλήση εργαλεία, ωστόσο, έδειξαν υψηλή αποκλίσεις. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός αλληλουχίας αμπλικονίου μπορεί δυνητικά να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση μεταλλάξεων hot spot σε ορθοκολικό μεταστάσεις καρκίνου σε κατεψυγμένα και FFPE ιστούς. Ωστόσο, υπάρχουν αξιοσημείωτες διαφορές μεταξύ των αποτελεσμάτων των διαφόρων εργαλείων παραλλαγή καλώντας, οι οποίες δεν σχετίζονται μόνο με την ποιότητα του δείγματος DNA. Η μελέτη μας υπογραμμίζει την ανάγκη για την τυποποίηση και τη συγκριτική αξιολόγηση της παραλλαγής καλώντας αγωγών, που θα απαιτηθούν για την μεταφραστική και κλινικές εφαρμογές

Παράθεση:. Betge J, Kerr G, Miersch Τ, Leible S, Erdmann G, Γαλατά CL, et al. (2015) αμπλικονίου αλληλουχίας του καρκίνου του παχέος εντέρου: Παραλλαγή Κλήση σε κατεψυγμένα και φορμόλη-Σταθερή δείγματα. PLoS ONE 10 (5): e0127146. doi: 10.1371 /journal.pone.0127146

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Jeong-Κυρ Seo, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ Κολέγιο Ιατρικής, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 10 του Ιανουαρίου 2015? Αποδεκτές: 13 Απριλίου 2015? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2015

Copyright: © 2015 Betge et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι διαθέσιμα μέσω του Ευρωπαϊκού νουκλεοτιδικές Αρχείο (ENA) υπό τον αριθμό πρόσβασης PRJEB8754

Χρηματοδότηση:.. JB έχει υποστηριχθεί από μια υποτροφία από το Hartmut-Hoffmann-Berling Διεθνές Graduate School (HBIGS)

ανταγωνιστικά συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Λόγω των τελευταίων εξελίξεων στον τομέα των τεχνολογιών βαθιά αλληλουχίας, αξιόλογες ιδέες έχουν αποκτηθεί στις αλλαγές που αποκτήθηκαν από καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) γονιδιώματα κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης διαδικασία, διευρύνοντας σε μεγάλο βαθμό την άποψή μας για CRC γονιδιωματικής εξέλιξης [1-3]. Η υπόσχεση που μετά δομικός χαρακτηρισμός των γονιδιωμάτων καρκίνο, τη λήψη κλινικών αποφάσεων θα πρέπει να καθοδηγείται από τα επιμέρους γονιδιωματική προφίλ του όγκου, ωστόσο, παραμένει να πληρούνται. Παρ ‘όλα αυτά, η ανάπτυξη νέων στοχευμένων θεραπευτικών τονίζει την ανάγκη για αξιόπιστες και αποδοτικές μεθόδους για μοριακό χαρακτηρισμό των γονιδιωμάτων καρκίνο για τον εντοπισμό των ασθενών που τελικά ανταποκρίνονται στη θεραπεία με βάση druggable μεταλλάξεων, η έξυπνη αλλοιώσεις ή επίκτητη δείκτες αντοχής.

Στοχευμένες αλληλουχίας με βάση αμπλικόνια PCR αποτελεί μια εφικτή προσέγγιση για την αξιολόγηση της προσφυγής μεταλλάξεων, μεταλλάξεων hot spots ή προγνωστική μεταβολές στα γονιδιώματα καρκίνου για κλινικές μελέτες. Σε σύγκριση με γονιδιώματος-ευρεία ή exome σε επίπεδο αλληλουχίας, ένα υψηλό βάθος αλληλουχίας (& gt? 1000 το έχουν διαβάσει) στο επίπεδο του γονιδιώματος τόπους ενδιαφέροντος μπορεί να επιτευχθεί, διευκολύνοντας έτσι την ανίχνευση των παραλλαγών χαμηλής συχνότητας σε δείγματα ετερογενή όγκου αναμειγνύεται με στρωματικά κύτταρα [4 , 5]. Επιπλέον, λόγω του συγκριτικά μικρού αριθμού ζευγών βάσεων προς προσδιορισμό αλληλουχίας ανά ασθενή, πολλαπλά δείγματα, επίσης για την κατά μήκος ανάλυση, μπορούν να αναλυθούν παράλληλα στον πάγκο-top μηχανές όπως Illumina MiSeq, μειώνοντας το κόστος και πιθανώς επιτρέποντας συνήθη κλινική εφαρμογή στη εγγύς μέλλον.

Ωστόσο, για κλινική εφαρμογή και για τις μεταφραστικές σπουδές σε αρχειοθετημένα κλινικά δείγματα, πολλά προβλήματα παραμένουν προς επίλυση. Πιο ευρέως διαθέσιμα δείγματα για την κλινική διάγνωση και μελέτες βιοδεικτών είναι σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) σε ιστούς από τα αρχεία παθολογία, όπως μακροχρόνια αποθήκευσή τους είναι σχετικά απλή και αποτελεσματική από πλευράς κόστους σε σύγκριση με το κατεψυγμένο υλικό. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι η μονιμοποίηση φορμαλίνης προκαλεί ομοιοπολική σύνδεση του DNA, RNA και πρωτεϊνών με γέφυρες μεθυλενίου, αντιδράσεις απαμίνωση και οξείδωση, σχηματισμός κυκλικών παραγώγων βάσης και επίσης σε κατακερματισμό του DNA [6]. Αυτές οι αλλοιώσεις του DNA παρεμποδίζουν τεχνολογίες αλληλουχίας που οδηγεί σε λιγότερο ισχυρά αποτελέσματα και τις δυσκολίες στην ερμηνεία δεδομένων από πειράματα αλληλουχίας. Επιπλέον, ένα χρυσό τυποποιημένη μέθοδος για την ανάλυση της αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) δεδομένα λείπουν και τα προγράμματα διασφάλισης της ποιότητας δεν έχουν ακόμη ξεκινήσει. Διαφορετικές εργαλείων βιοπληροφορικής και αγωγών ανάλυσης έχουν αναπτυχθεί για τα δεδομένα NGS. Ωστόσο, φαίνεται ότι η αναπαραγωγιμότητα μεταξύ τους πρέπει να βελτιωθεί [7]. Επιπλέον, στατιστικά μοντέλα για την παραλλαγή ανακάλυψη και αξιολόγηση παραλλαγή, σχεδιασμένη για τα δεδομένα ολόκληρου exome ή ολόκληρου του γονιδιώματος που αποτελείται από πολλά δείγματα με χαμηλή κάλυψη, μπορεί να μην είναι η βέλτιστη για μικρά σύνολα δεδομένων αμπλικόνιο με λίγες στοχευμένες περιοχές. Έτσι, δεν υπάρχει καμία γενικά αποδεκτό πρότυπο για το πώς να εκτελέσει παραλλαγή καλώντας σε δεδομένα αλληλουχίας αμπλικονίου. Τα προβλήματα αυτά υπογραμμίζουν την ανάγκη για την προετοιμασία των δειγμάτων και ανάλυση δεδομένων αγωγών βελτιστοποιηθεί για αλληλούχιση αμπλικόνιο των κλινικών δειγμάτων.

Στη μελέτη αυτή, περιγράφουμε μια πειραματική και βιοπληροφορικής αγωγών για αλληλούχιση αμπλικόνιο της κλινικής κατεψυγμένα και FFPE δείγματα από CRC. Ιδιαίτερη έμφαση έχει συνταχθεί για την προετοιμασία των βιβλιοθηκών αλληλουχίας από δείγματα FFPE χαμηλής ποιότητας. Ο αγωγός βιοπληροφορικής, χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο Γονιδιώματος Ανάλυσης Toolkit (GATK) Unified Genotyper, εξηγείται λεπτομερώς και σε σύγκριση με άλλες μεθόδους που χρησιμοποιούνται συνήθως παραλλαγή καλώντας σε σχέση με την καταλληλότητά τους για την αλληλούχιση αμπλικόνιο χρήση υλικού FFPE.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς

Τριάντα τρία δείγματα από 17 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε εκτομή ηπατικών μεταστάσεων της CRC στο Τμήμα Χειρουργικής, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Mannheim, από το Φεβρουάριο του 2012 και το Φεβρουάριο του 2013 συμπεριλήφθηκαν στην παρούσα μελέτη. Για όλους αυτούς τους ασθενείς, είτε νωπά είτε κατεψυγμένα σταθεροποιημένο με φορμαλίνη εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστός χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση του DNA. Από 10 ασθενείς, σε συνδυασμό κατεψυγμένα και FFPE ιστούς ήταν διαθέσιμα για μελέτη και από 5 ασθενείς, σε συνδυασμό πρωτογενών όγκων θα μπορούσαν να ληφθούν από τα αρχεία του Ινστιτούτου Παθολογίας, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Mannheim. Επιπλέον, ένα ζεύγος πρωτογενούς μετάσταση από καρκίνωμα νευροενδοκρινή του λεπτού εντέρου (Pat05), πρωτογενές υλικό καλλιέργειας από έναν ασθενή (Pat16), υλικό από έναν ασθενή με καρκίνο του προστάτη και κυτταρικές σειρές DLD-1, HCT116, HT55, HUH7, ΗΕΚ293Τ , HS68 και SW480 περιλήφθηκαν στο τρεξίματα αλληλουχίας και ανάλυση για τα άλλα έργα ή ως μάρτυρες. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε δύο εκτελέσεις της αλληλουχίας, ένας ασθενής (Pat13) αναλύθηκε στα δύο τρεξίματα ως έλεγχος. Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την ATCC. Πληροφορίες για τους ασθενείς μπορεί να βρεθεί στον Πίνακα S1.

Ηθική έγκριση

έγκριση του Διοικητικού Συμβουλίου Δεοντολογίας αποκτήθηκε από την Ιατρική Ηθική Επιτροπή ΙΙ της Ιατρικής Σχολής του Mannheim, του Πανεπιστημίου της Χαϊδελβέργης, Μανχάιμ, Γερμανία (Νο 2012-293N-ΜΑ, 2013-841R-ΜΑ, 2014-551N-ΜΑ). Γραπτή συγκατάθεση από τους δότες των δειγμάτων ιστού που λαμβάνονται για τη χρήση στην έρευνα.

Η προετοιμασία των δειγμάτων

Τα κατεψυγμένα δείγματα και κυτταρικές σειρές.

Τα δείγματα από ηπατικές μεταστάσεις από τους ασθενείς CRC μεταφέρθηκαν σε RPMI μέσο καλλιέργειας κυττάρων και καταψύχθηκαν σε ξηρό πάγο και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C. απομόνωση DNA έγινε με τη Qiagen DNeasy Blood & amp? Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις συστάσεις των κατασκευαστών, συμπεριλαμβανομένης της πέψης ΚΝάσης (Σχήμα 1Α). Οι κυτταρικές σειρές σφαιροποιήθηκαν και απομονώθηκε DNA με το ίδιο πρωτόκολλο. Εκχυλίστηκε DNA αραιώθηκε και απευθείας χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των βιβλιοθηκών αλληλούχιση.

ροής εργασιών παρασκευή (Α) Δείγμα. DNA απομονώθηκε από φρέσκο ​​κατεψυγμένο ή FFPE CRC δείγματα ήπατος μετάσταση εκτομή με Qiagen αίματος και ιστού ή FFPE kit, αντίστοιχα. Κατεψυγμένα δείγματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν άμεσα την προετοιμασία της βιβλιοθήκης αλληλουχίας, την ομαδοποίηση των βιβλιοθηκών, τον έλεγχο της ποιότητας και της αλληλουχίας. δείγματα FFPE υποβλήθηκαν επιπλέον ελέγχονται για την ποιότητα του DNA με qPCR. ποιότητας βιβλιοθήκη ελέγχθηκε με Bioanalyzer. Για δείγματα με χαμηλές ποσότητες σωστά μεγέθους αμπλικόνια DNA (θραύσματα στα 310bp), νέες βιβλιοθήκες προετοιμάστηκαν με συγκεντρώσεις DNA υψηλότερη αρχική και εκ νέου αναλύθηκαν με Bioanalyzer. Δείγματα με ακόμα χαμηλές ποσότητες DNA με το σωστό μέγεθος και άκρως κατακερματισμένο DNA αποκλείστηκαν. (Β) ΔCq τιμές του ποιοτικού ελέγχου PCR δείχνουν κακή ποιότητα του δείγματος. συγκέντρωση DNA θραυσμάτων μεταξύ 250 bp και 450bp μετά την παρασκευή της βιβλιοθήκης υπολογίστηκε με Agilent Bioanalyzer και καταγράφεται σε τιμές ΔCq της FFPE ποιοτικός έλεγχος PCR. (C) υψηλότερη ΔCq τιμές συσχετίζονται με χαμηλότερο μέσο βάθος αλληλούχιση. (D) κατανομή Κάλυψη των αμπλικονίων από όλα τα ζεύγη FFPE και κατεψυγμένα δείγματα, κανονικοποιημένη με συνολική κάλυψη του δείγματος. Κατεψυγμένα δείγματα είχαν ένα μέσο βάθος 4622, δείγματα FFPE 1852.

Η

δείγματα FFPE.

Ιστός από ηπατικές μεταστάσεις είχε καθοριστεί σε φορμόλη und ενσωματωμένο σε παραφίνη, κατά τον συνήθη παθολογικά δούλεμα . Κατάλληλα μπλοκ επιλέχθηκαν και πέντε 10μm φέτες χρησιμοποιήθηκαν για την εκχύλιση του DNA χωρίς μικροδιατομή. Μια διαφάνεια χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) από κάθε μπλοκ χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί το περιεχόμενο των κυττάρων του όγκου των αντίστοιχων φετών από δύο ερευνητές (TG και JB) χρησιμοποιώντας ένα δικέφαλο μικροσκόπιο. DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το Qiagen QIAamp DNA FFPE Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. DNA εκλούστηκε σε 40 μΐ ρυθμιστικού ΑΤΕ και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με NanoDrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, USA) και κιτ qubit BR (Life Technologies, Darmstadt, Germany). Απομόνωση απέδωσε μεταξύ 4.8μg και 22.8μg (μέση 10.23μg) όταν μετρήθηκε με το κιτ qubit BR. Λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με την προετοιμασία των δειγμάτων FFPE μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα S2.

Βιβλιοθήκη Προετοιμασία

ποιότητα του DNA των δειγμάτων FFPE αξιολογήθηκε με προσδιορισμό της ποσότητας του ενισχύσιμου DNA χρησιμοποιώντας το FFPE QC PCR (Illumina, San Diego, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η μέση ΔCq αξία όλων των δειγμάτων FFPE ήταν 2,0 (διάμεση 1,9, Min 0.9, Max 4.1). Εννέα δείγματα (47%) είχαν μια τιμή ΔCq υψηλότερη από τη συνιστώμενη 2.0 (Πίνακας S2). TruSeq αμπλικονίου Panel Καρκίνο (Νο Cat. FC-130 έως 1008, Illumina) βιβλιοθήκες προετοιμάστηκαν με τις συνιστώμενες ποσότητες DNA (150ng για κατεψυγμένα υλικά και κυτταρικές σειρές, 250 ng για δείγματα FFPE). Ο πίνακας περιλαμβάνει 212 αμπλικόνια της 170-190bp μήκους, με στόχο μεταλλάξεων hot spots σε 48 γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο. Οι περιοχές amplicon απεικονίζονται στον Πίνακα S3.

Bioanalyzer (Agilent Technologies, Böblingen, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την επιτυχή ποιότητας ενίσχυσης βιβλιοθήκη και δείγματα FFPE με την αξιολόγηση συγκέντρωση του DNA με φιλοδοξούσε μέγεθος (~ 310bp) και σύντομες θραύσματα DNA (& lt? 150bp). Για να συγκρίνετε ποσότητες DNA μέσα στην επιθυμητή περιοχή μεγέθους, η συγκέντρωση του DNA αμπλικονίων στο εύρος 250-450bp υπολογίστηκε. Συγκέντρωση του DNA με μέγεθος μεταξύ 250 bp και 450bp διέφεραν σημαντικά μεταξύ 51,7 και 93.831,9 pg /μl (μέση 5675.1 pg /μl, η διάμεση 672,2 pg /μl) εντός των βιβλιοθηκών των διαφορετικών δειγμάτων και αντιστρόφως ανάλογη με τιμές ΔCq (συντελεστής Spearman του: -0.805 , Σχήμα 1Β, S2 πίνακα). Για τα δείγματα με χαμηλές συγκεντρώσεις DNA στο αμπλικόνιο 310bp, παρασκεύασμα βιβλιοθήκη επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας υψηλότερη δυνατή ποσότητες DNA (S1 Σχήμα, S2 Πίνακα). Bioanalyzer αποκάλυψε υψηλότερες συγκεντρώσεις του DNA γύρω 250-450bp (365,3 pg /μl-5669.8 pg /μl? Σημαίνουν 6190.9 pg /μl? Διάμεση 1996,3 pg /μl), ωστόσο, με σημαντική φόντο κοντών θραυσμάτων DNA. Μετά την PCR απορρύπανση των βιβλιοθηκών, θραύσματα σύντομο DNA μειώθηκαν, αλλά τρία δείγματα παρουσίασαν επίσης μειωμένη ποσά των αμπλικόνιο 310bp και, συνεπώς, εξαιρούνται από την αλληλούχιση.

Η επεξεργασία δεδομένων

αγωγού βιοπληροφορική ανάλυση είναι φαίνεται στο σχήμα 2Α. Διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν κατά hg19 γονιδίωμα αναφοράς χρησιμοποιώντας το BWA αλγόριθμο υλοποίησε το λογισμικό MiSeq (MiSeq Reporter v2.2.29). αρχεία BAM ήταν ελεγχόμενης ποιότητας με FASTQC (v.0.9.5? https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Indels στα αρχεία ευθυγράμμιση ακολουθίας αφέθηκαν-ευθυγραμμισμένα και τοπικές επανευθυγράμμιση γύρω indels έγινε με την RealignerTargetCreator και τα εργαλεία IndelRealigner από το γονιδίωμα Ανάλυση Toolkit (GATK, έκδοση 2,4 – 9) [8]. Βασική βαθμολογία ποιότητας εκ νέου βαθμονόμηση έγινε. Διπλότυπο χαρτογράφηση και σήμανση δεν κρίθηκε κατάλληλο για αλληλούχιση αμπλικόνιο και, συνεπώς, παραλείπονται.

workflow ανάλυση (Α) αλληλουχίας. αρχεία ευθυγράμμιση ακολουθίας υποβλήθηκαν σε τοπική ευθυγράμμιση γύρω indels, άφησε την ευθυγράμμιση και την ποιότητα βασική βαθμολογία επαναβαθμονόμηση. Μετά παραλλαγή καλώντας με GATK Unified Genotyper, το σχολιασμό και την επίδραση πρόβλεψη ανιχνεύονται παραλλαγές έγινε χρησιμοποιώντας SnpEff. Πρώτες παραλλαγές όλων των δειγμάτων ήταν φιλτράρεται από προσαρμοσμένες παραμέτρους με SnpSift. Παραλλαγές που περιλαμβάνονται στα δεδομένα γονιδιώματος για το Project 1000 εξαιρέθηκαν να αποκτήσουν μόνο σωματικές μεταλλάξεις στον καρκίνο. (Β) Υψηλή συχνότητα ΤΡ53 και APC μεταλλάξεις μεταξύ σωματικές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε ηπατικές μεταστάσεις CRC (κατεψυγμένα και FFPE ιστούς). πεδία Χρωματιστά αντιπροσωπεύουν παρουσία ενός nonsynonymous κωδικεύοντα SNP (μπλε), μια μετάλλαξη που οδηγεί σε ένα stop-κωδικόνιο (γκρι) ή μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου (πορτοκαλί). Μπαρ συνοψίσω μεταλλάξεις που υπάρχουν σε κάθε ασθενή (κάθετες μπάρες) ή κάθε μεταλλαγμένο γονίδιο (οριζόντιες μπάρες). Αξίζει να σημειωθεί ότι ορισμένα γονίδια περιέχουν περισσότερες από μία μετάλλαξη.

Η

Ενιαίου Genotyper αγωγού

Variant κλήση.

Unified Genotyper από την GATK (έκδοση 2,4 – 9) ήταν που χρησιμοποιούνται για την παραλλαγή κλήση. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία παράλληλα και χωρίζεται σε μεμονωμένα αρχεία παραλλαγή για κάθε δείγμα μετά παραλλαγή κλήση. Μέγιστη κάλυψη ανά τόπο αυξήθηκε από την προεπιλεγμένη 250 έως 9.000.000 για να ληφθεί υπόψη το υψηλό βάθος του προσδιορισμού αλληλουχίας αμπλικονίου. (Μείωση δειγματοληψίας σε μικρότερο βάθος γίνεται σε μελέτες σε ολόκληρο exome να αυξήσει την ταχύτητα με την αποθήκευση της μνήμης). Το ελάχιστο όριο εμπιστοσύνης για την κλήση ορίστηκε σε 10, το ελάχιστο όριο εμπιστοσύνης για την εκπομπή έως 30. SNPs και indels αξιολογήθηκαν ταυτόχρονα. Μια λίστα περιοχή όλων των αμπλικονίων χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό περιοχών για πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) και Indel ζητώντας να αυξηθεί η ταχύτητα ανάλυσης. Ως εναλλακτική λύση, το Ενιαίο αγωγός Genotyper χρησιμοποιήθηκε από την επεξεργασία της κάθε δείγμα ξεχωριστά, διαφορετικά χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες παράμετροι

Variant σχολιασμού και το αποτέλεσμα πρόβλεψη

SnpEff (έκδοση 2.0.5, http..: //snpeff.sourceforge.net/) [9] χρησιμοποιήθηκε για την παραλλαγή σχολιασμό και την πρόβλεψη αποτελέσματος και το εργαλείο GATK VariantAnnotator είχε τρέξει με το-μια επιλογή SnpEff να προσθέσετε τις επισημειώσεις SnpEff με την υψηλότερη βιολογική σημασία για κάθε παραλλαγή στην παραλλαγή κλήση μορφή (vcf) αρχεία. Στη συνέχεια, το αρχείο vcf πληροφορίες σχετικά με όλες αλληλουχία δείγματα χωρίστηκε σε μεμονωμένα αρχεία παραλλαγή του δείγματος χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα GATK SelectVariants. Παραλλαγές σχολιασμένη με τις συχνότητες παραλλαγή στα 1000 γονιδιώματα έργο χρησιμοποιώντας το SnpSift (https://snpeff.sourceforge.net/SnpSift.html) χαρακτηριστικό σχολιάσετε [9].

φιλτράρισμα Variant.

SnpSift από το πακέτο SnpEff χρησιμοποιήθηκε για το φιλτράρισμα των πρώτων παραλλαγές. Εφαρμόστηκαν τα ακόλουθα κριτήρια ποιότητας-φίλτρο: ποιότητα με βάθος μεγαλύτερο από 0,8 (QD & gt? 0,8), συνολικό βάθος για την κλήση παραλλαγές σε μια συγκεκριμένη θέση είναι μεγαλύτερη από 200 (DP & gt? 200), Fisher σκέλος (Phred κλίμακας p-value χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher για την ανίχνευση προκατάληψη σκέλος) μικρότερο από 70 (FS & lt? 70), ελάχιστη παραλλαγή της εμπιστοσύνης μεγαλύτερο από ό, τι το 1500 (QUAL & gt? 1500), την ποιότητα χαρτογράφηση μεγαλύτερη από 40 (MQ & gt? 40) και τη δοκιμή χαρτογράφηση της ποιότητας rank ποσό υψηλότερο από -15 (! υπάρχει MQRankSum