Abstract

SSX είναι ένας παράγοντας μεταγραφής με φευγαλέα ογκογόνο λειτουργίες εκφράζεται σε μία ποικιλία ανθρώπινων όγκων επιθηλιακής και μεσεγχυματικής προέλευσης. Έχει αυξηθεί ουσιαστικό ενδιαφέρον ως στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου, δεδομένου ότι προκαλεί χυμικές αποκρίσεις και εμφανίζει περιορισμένη έκφραση στον καρκίνο, σπερμογονίων και μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα. Εδώ, ερευνήσαμε τις ογκογόνο ιδιότητες του SSX χρησιμοποιώντας μια παρεμβολή RNA να χτυπήσει κάτω την ενδογενή έκφραση του SSX σε κυτταρικές σειρές μελανώματος και οστεοσαρκώματος. Η εξάντληση της έκφρασης SSX οδήγησε σε μειωμένη πολλαπλασιασμού με κύτταρα συσσωρεύεται στην φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Βρήκαμε ότι η αύξηση προώθηση και ιδιότητες επιβίωση του SSX μεσολάβηση εν μέρει αν και διαμόρφωσης της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και Wnt σηματοδότηση μονοπατιών, δεδομένου ότι SSX φίμωση ανέστειλε Erk μεσολάβηση σηματοδότηση και τη μεταγραφή του cmyc και Akt-1. Βρήκαμε επίσης ότι SSX σχηματίζει ένα παροδικό σύμπλεγμα με β-κατενίνης στο σύνορο φάση G1-S με αποτέλεσμα την αλλαγμένη έκφραση των γονιδίων στόχων β-κατενίνης, όπως Ε-καδερίνης, σαλιγκάρι-2 και βιμεντίνης, που εμπλέκονται σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μεταβάσεις. Είναι σημαντικό ότι η αποσιώπηση της έκφρασης SSX σε

in vivo

εξασθενημένη σημαντικά την αύξηση ξενομοσχευμάτων όγκου μελανώματος. Όγκου βιοψίες από SSX σιγήσει όγκους που αναγράφεται μειωθεί κυκλίνη Α χρώση, ενδεικτικό της χαμηλής διάδοσης και κυρίως cycloplasmic β-κατενίνης σε σύγκριση με το SSX εκφράζοντας όγκους. Η παρούσα μελέτη δείχνει μια προηγουμένως άγνωστη λειτουργία του SSX, ότι ως ένα ογκογονίδιο και ως στόχος όγκου για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων

Παράθεση:. D’Arcy Ρ, Maruwge W, Wolahan Β, Ma L, Brodin Β (2014) τον ογκογόνο Λειτουργίες του Καρκίνου-Όρχεων αντιγόνου SSX στον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, και τα μονοπάτια σηματοδότησης των καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 9 (4): e95136. doi: 10.1371 /journal.pone.0095136

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Σεπ 2013? Αποδεκτές: 24 του Μαρτίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 D’Arcy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το σουηδικό ίδρυμα για παιδιά του καρκίνου, την Lillian Sagens och Curt Ericssons Forskningsstiftelse, και το Ίδρυμα της Στοκχόλμης τον Καρκίνο να Bertha Brodin. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

SSX

αρχικά αναγνωρίζονται ως μέρος του

SS18 /SSX

γονίδιο σύντηξης στο αρθρικό σάρκωμα [1] και ως το αντιγόνο που σχετίζεται με όγκους μελανώματος HOM-Mel40 [2] . Αποτελείται από μια οικογένεια εννέα, ιδιαίτερα ομόλογα γονίδια οργανώνονται σε ομάδες για το Χ χρωμόσωμα με τα προϊόντα που ταξινομούνται ως αντιγόνα καρκίνου όρχι με βάση την περιορισμένη έκφρασή τους σε όγκους και όρχεις. Σε φυσιολογικά κύτταρα, η έκφραση SSX έχει βρεθεί σε σπερματογόνια [3], [4], μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα [5]. Η έκφραση των μελών της οικογένειας SSX στους όγκους έχει ερευνηθεί εκτενώς και έχει δειχθεί ότι η SSX1, SSX2, SSX4 και SSX5 εκφράζονται ανεξάρτητα ή ταυτόχρονα συχνά εμφανίζουν διαδεδομένη, διάσπαρτα ή εστιακή πρότυπα έκφρασης σε όγκους επιθηλιακής, αιμοποιητικών, νευρικά και μεσεγχυματικών . προέλευσης [3], [6] – [8]

Η πρωτεΐνη είναι πλούσια σε φορτισμένα αμινοξέα [9], και περιέχει δύο λεγόμενες περιοχές καταστολέα που καταστέλλει τη μεταγραφή

in vitro

? ένα Krüppel σχετίζεται κουτί εντοπίζεται στο Ν άκρο, και μια περιοχή ισχυρότερη καταστολέα (RD) στο C-άκρο [10], [11]. Σε κύτταρα, SSX έχει κοκκώδη μορφή έκφρασης και εντοπίζεται στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα [5], [12]. Άμεση αλληλεπίδραση του SSX με DNA δεν έχει αποδειχθεί, είναι ως εκ τούτου υποτίθεται ότι SSX καταστέλλουν μεταγραφή με σχηματισμό συμπλοκών με δέσμευσης DNA πρωτεΐνες. Προς υποστήριξη αυτού του μοντέλου τόσο SSX και προϊόν γονιδίου σύντηξης SS18 /SSX έχουν δειχθεί ότι αλληλεπιδρούν με μέλη της Polycomb σύμπλεγμα καταστολέα Bmi-1 και ο δακτύλιος 1 [13], και ο πυρήνας ιστόνες [14] υποδηλώνοντας ότι SSX μπορεί να ελέγχει την έκφραση του γονίδια που ρυθμίζουν τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Άλλες πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με SSX είναι οι Ras-όπως δεσμευτικός ΟΤΡάσης πρωτεΐνη RAB3IP, η πυρηνική πρωτεΐνη SSX2IP [15], και η LIM πρωτεΐνη ομοιοακολουθίας LHX4 [16].

Από την ανακάλυψή του ως αντιγόνο καρκίνου των όρχεων, η ανοσοθεραπευτική στόχευση του SSX έχει προκαλέσει μεγάλο ενδιαφέρον ως μια στρατηγική για την καταπολέμηση του καρκίνου που οφείλεται σε ανοσογονικότητα της έκφρασης όγκου [2], [3], περιορισμένη, και η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης SSX και την εξέλιξη της νόσου [8], [17], [18] . Οι Τ-κυττάρου αποκρίσεις κυτταροτοξικών έχουν δημιουργηθεί

in vitro

έναντι επιτόπων SSX [19] – [21], ωστόσο, η επικύρωση των SSX ως θεραπευτικός στόχος

in vivo

δεν έχει αναφερθεί. Στην παρούσα έρευνα έχουμε αξιολογήσει το ρόλο του SSX στη μεσολάβηση της κυτταρικής ανάπτυξης και επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων, στο

vitro

και

in vivo

, και προσδιόρισε μονοπάτια σηματοδότησης ανάπτυξη έκφρασης SSX.

Αποτελέσματα

SSX2 εκφράζεται κατά προτίμηση σε μεταστατικό μελάνωμα αλλοιώσεις και Παράγωγα κυτταρικών σειρών αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα

Ερευνήσαμε την έκφραση του SSX1 να SSX5 σε 12 μεταστατικών βλαβών μελάνωμα, 9 νωρίς ανακαλλιεργήθηκαν κυτταρικές σειρές μελανώματος, φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά μελανοκύτταρα (ΝΗΕΜ) και ανθρώπινους διπλοειδείς ινοβλάστες (HDF) χρησιμοποιώντας μία επικυρωμένη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας RT-PCR που περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Παρόμοια με άλλες δημοσιευμένες μελέτες βρήκαμε ότι πολλές μεταγραφές SSX ταυτοχρόνως εκφράζεται σε όλους τους μελανώματα και κυτταρικές σειρές μελανώματος που εξετάστηκαν. Είναι ενδιαφέρον SSX2 ανιχνεύθηκε σε σχεδόν όλους τους ιστούς του μελανώματος και κυτταρικές σειρές που προέρχονται (95%) σε σύγκριση με SSX4 (57%), SSX1 (38%), SSX5 (33%) και SSX3 (19%) της έκφρασης. Κανένα από τα μέλη της SSX ανιχνεύθηκαν σε φυσιολογικό ανθρώπινο επιθηλιακό μελανοκύτταρα (ΝΗΕΜ) ή σε φυσιολογικούς ανθρώπινους διπλοειδείς ινοβλάστες (HDF) (Σχήμα 1). Η αλληλουχία των εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση του SSX-1 προς SSX-9 και η έκφραση του SSX σε κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματα συμπεριλαμβανομένης της γραμμής που χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη SAOS-2 δείχνεται στο Σχήμα S1.

Έκφραση

SSX ήταν αναλύθηκε με μια ένθετη μέθοδο RT-PCR που περιγράφεται προηγουμένως χρησιμοποιώντας εκκινητές αναγνωρίζοντας SSX1 να SSX 9 cDNA. Φρέσκα βιοψίες ελήφθησαν από μεταστατικών βλαβών των ασθενών με μελάνωμα. Η κυτταρική γραμμή μελανώματος DFW που εκφράζουν υψηλά επίπεδα SSX1 να SSX5 χρησιμοποιήθηκε για μελέτες RNAi. ΝΗΕΜ: φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά μελανοκύτταρα, HDF:. Διπλοειδείς ινοβλάστες ανθρώπου

Η

Η υπό όρους κατασιγάσει του SSX Αναστέλλει όγκου κυτταρικό πολλαπλασιασμό φραγής της εισόδου των κυττάρων όγκου σε S-φάση

Για να δημιουργήσετε μια εικόνα για τη λειτουργία του SSX σε κύτταρα όγκου, εμείς σιγήσει SSX στην κυτταρική σειρά μελανώματος που εκφράζει DFW SSX1 να SSX5 (Σχήμα 1) με τη χρήση πλασμιδίων και για τις δύο σταθερές και δοξυκυκλίνη υπό όρους έκφραση μορίων shRNA στόχευσης SSX1-9 μεταγραφών (Σχήμα 2Α και το Σχήμα S2) όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους.

Α) Γραφική αναπαράσταση της αλληλουχίας shRNA (συμπληρωματική προς SSX1 να SSX9) προσδέθηκε σε φορείς shRNA για σταθερή και δοξυκυκλίνη ρυθμισμένη έκφραση shRNA (βλέπε υλικά και μέθοδοι). Β) κηλίδα Western που δείχνει έκφραση SSX σε έλεγχο-shRNA και SSX-shRNA επιμολυσμένα κύτταρα 24 ώρες μετά την προσθήκη ντοξυκυκλίνης στο μέσο καλλιέργειας. C) ποσοτικός προσδιορισμός αποικίας κυττάρων στον έλεγχο και SSX-shRNA επιμολυσμένα κύτταρα DFW αναπτύσσονται παρουσία δοξυκυκλίνης για 8 ημέρες. Οι καμπύλες Α) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των ζωντανών κυττάρων στον έλεγχο και καλλιέργειες σιωπή SSX χρησιμοποιώντας μπλε χρώση trypan. Ε) S-φάση εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ενσωμάτωση BrdU σε ένα ενεργοποιημένο με φθορισμό ταξινομητή κυττάρων (FACS). F) Ποσοστό κυττάρων σε G1, G2 και S φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε έλεγχο και SSX shRNA γκρέμισε κύτταρα DFW επί περίοδο 96 ωρών.

Η

Υπό προϋποθέσεις αποσιώπηση του SSX προκλήθηκε με την προσθήκη δοξυκυκλίνης εντός του μέσου και οδήγησε σε μια σημαντική μείωση του SSX πρωτεΐνης μετά από 24 ώρες (Σχήμα 2Β). Οι αριθμοί κυττάρων βιωσιμότητα χρησιμοποιώντας trypan blue κύτταρα αποκλεισμού έδειξε την παρουσία βιώσιμων αλλά μη πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα με την παρουσία δοξυκυκλίνης υποδεικνύει ότι η έκφραση SSX είναι απαραίτητη για την κυτταρική ανάπτυξη (Σχήμα 2D). Να διερευνήσει την εγκυρότητα αυτής της παρατήρησης πραγματοποιήσαμε επίσης siRNA νοκ ντάουν της έκφρασης SSX σε δύο επιπλέον κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος, U2-OS και Saos-2, χρησιμοποιώντας μόρια RNAi που στοχεύουν SSX1-9, ή ειδικά για SSX1 και SSX2. Παρομοίως με τα προηγούμενα αποτελέσματα εξάντληση SSX οδήγησε σε μειωμένη πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA υποδεικνύει ότι ο φαινότυπος που παρατηρείται είναι ένα bona fide επίδραση του SSX knockdown και δεν οφείλεται σε επιδράσεις εκτός στόχου (Σχήμα S2). Σε κλωνογονική προσδιορισμούς, η αποσιώπηση του SSX σε κύτταρα όγκου DFW αποτέλεσμα μια εξασθενημένη σχηματισμό αποικίας όπως παρατηρείται από μια τετραπλάσια μείωση του αριθμού των αποικιών σε κύτταρα που αναπτύσσονται με την παρουσία δοξυκυκλίνης για 14 ημέρες σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 2C). Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων DFW σε μετά την προσθήκη της δοξυκυκλίνης έδειξαν ότι τα κύτταρα απέτυχαν να εισέλθουν στην S-φάση του κυτταρικού κύκλου (Σχήμα 2D). Το ποσοστό των κυττάρων στην S-φάση ελαττώθηκε από 50% (σε 0 και 24 ώρες) σε 5% (στις 72 και 96 ώρες), μαζί με μια ταυτόχρονη συσσώρευση των κυττάρων στην G1 φάση, ενδεικτική ενός ελαττώματος σε εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ( Σχήμα 2F). Για να επιβεβαιώσετε αυτό το αποτέλεσμα της έκφρασης SSX την είσοδο S φάση, έχουμε συγχρονισμένη άγριου τύπου (SSX +) και SSX νοκ-κάτω κύτταρα DFW στην G1 /S φάση με διπλό μπλοκ θυμιδίνης και αφήστε το σε κανονική FBS μέσο που περιέχει. Ελέγχου των κυττάρων (SSX +) DFW προχώρησε γρήγορα από G1 σε S-φάση 4-10 ώρες μετά την απελευθέρωση από μπλοκ θυμιδίνης. Σε αντίθεση SSX-knockdown κυττάρων δεν μπορούσε να διασχίσει το όριο φάσης G1 /S, με κύτταρα που παραμένουν συνελήφθησαν στη φάση G1 (Εικόνα 3Α). Σε συμφωνία με αυτό παρατηρήσεις, τα επίπεδα της κυκλίνης Ε, το ρυθμιστικό συστατικό του συμπλόκου κυκλίνης E-CDK2 και ένας ρυθμιστής κλειδί της G1 και της εξέλιξης της φάσης S, μειώθηκε παράλληλα με την προς τα κάτω ρύθμιση του SSX. (Σχήμα. 3Β).

Ελέγχου (SSX +) και φιμώνονται κύτταρα μελανώματος (SSX-) DFW συγχρονίστηκαν στο G1 /S φάσης με διπλό αποκλεισμό θυμιδίνης και κυκλοφόρησε σε κανονικό μέσο, ​​όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Α) Εισαγωγή των κυττάρων στη φάση S (S) αναλύθηκε με την ποσοτικοποίηση του περιεχομένου του DNA χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) ενσωμάτωση και ένα ενεργοποιημένο φθορίζον FACS ταξινομητή κυττάρων. Β) κηλίδα Western που δείχνει εξαρτάται από το χρόνο έκφραση του SSX και κυκλίνης Ε στον έλεγχο και SSX σιωπήσει (+ κύτταρα Dox) DFW. Τα κύτταρα συγχρονίζονται σε G1 /S (0 h), που τίθενται σε κανονικό μέσο που περιέχει FBS και συλλέχθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία.

Η

SSX Μεσολαβεί Ανάπτυξης Όγκου κύτταρο μέσω Mapk /ΕΚΚ μονοπάτι σηματοδότησης

το εύρημα ότι SSX συντηρεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και απαιτείται για την είσοδο των κυττάρων του όγκου σε S-φάση μας ώθησε να διερευνήσει εάν αυτή η επίδραση σχετίζεται με καταρράκτες που διεγείρουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση σηματοδότησης. Ξεκινήσαμε, συγκρίνοντας το δυναμικό των SSX έκφραση και νοκ ντάουν κύτταρα για να ενεργοποιήσετε (φωσφορυλίωση) τα ενδοκυτταρικά αγγελιοφόρους Erk και Akt-1, μετά από τον αυξητικό παράγοντα διέγερσης.

Η απώλεια της έκφρασης SSX συσχετίστηκε με μειωμένη φωσφορυλίωση της εξωκυτταρικό σήμα -regulated κινάσης (Erk) 1 και 2, αλλά όχι της Akt-1 μετά από διέγερση με FBS. Μία μείωση στα επίπεδα πρωτεΐνης Akt-1, ωστόσο παρατηρήθηκε σε SSX σιγήσει κύτταρα (Σχήμα 4). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι επιδράσεις του SSX επί ​​του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου που συνδέεται τουλάχιστον εν μέρει να διαμορφώνει την δραστηριότητα του μονοπατιού σηματοδότησης ΜΑΡΚ /ΕΚΚ.

στυπώματος Western που δείχνει την έκφραση των Erk1-2 και Akt-1 και ενεργοποιημένη (φωσφορυλιωμένη) μορφές τους pAkt (Ser 473) και ζωντανέψει (Thr202 /Tyr204) στον έλεγχο shRNA και τα κύτταρα SSX-shRNA DFW. Τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής εντός μέσο ελεύθερο ορού για 36 ώρες (0 h) και κυτταρική σηματοδότηση ενεργοποιήθηκε με την προσθήκη ορού στο μέσο. Τα δείγματα συλλέχθηκαν στα 10 και 30 λεπτά (10 ‘και 30’) και στις 6 και 24 ώρες (6 ώρες, 24 ώρες) μετά από διέγερση ορού. έκφραση SSX προσδιορίστηκε με ανοσοκαταβύθιση (fl188 αντίσωμα) και Western Blot (N18 αντισωμάτων) οι μετέπειτα ταινίες recognozing περίπου 22 και 14 kDa.

Η

SSX Ανταποκρίνεται με β-κατενίνης στην ρύθμιση της μεταγραφής του EMT Associated β κατενίνης γονίδια

3 ‘περιοχή του SSX-1, 2 και 4 γονίδια συντήκονται σε σχεδόν ολόκληρο το γονίδιο SS18 στο αρθρικό σάρκωμα. Είναι ενδιαφέρον ότι η πρωτεΐνη σύντηξης /SSX2 SS18 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με β-κατενίνη με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση ενός κατασκευάσματος ανταποκριτή παράγοντα TCF Τ-κυττάρων /παράγοντα ενισχυτή λεμφοκυττάρων (Lef) όταν εκτοπικά εκφραζόμενη σε κύτταρα θηλαστικών [22]. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε εάν αυτή η αλληλεπίδραση είναι διατηρημένη για τις πρωτεΐνες πλήρους μήκους SSX.

Από έκφραση SSX ποικίλλει ανάλογα με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, έχουμε συγχρονισμένα DFW και κύτταρα Saos-2 (χρόνος 0) στο G1 /S φάσης όριο και απελευθερώνεται εντός των κυττάρων του κύκλου για 6 και 24 ώρες και πραγματοποιείται ανοσοκαθίζηση σε κυτταρολύματα με SSX αντισώματα και ανοσοκηλίδωση με β-κατενίνης αντισώματα (Σχήμα 5α). β-κατενίνης ήταν συν-καθιζάνει με SSX και από τις δύο Saos-2 και κύτταρα DFW αποκλείστηκε σε G1 /S (χρόνος 0), καθώς και από κύτταρα που κυκλοφόρησαν σε κυτταρικό κύκλο για 6 και 24 ώρες. Για να εξασφαλιστεί η ειδικότητα, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης Saos-2 κυτταρικά εκχυλίσματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με άσχετο ανοσοσφαιρινών από ποντικού (Μ) και κουνελιού (R) ως έλεγχοι (Σχήμα 5Α).

Α) κυτταρικές σειρές DFW και Saos-2 συγχρονίστηκαν σε G1 /S με διπλό αποκλεισμό θυμιδίνης όπως υποδεικνύεται στο υλικό και τις μεθόδους (0 ώρες), και απελευθερώνεται στο φυσιολογικό μέσο που περιέχει FBS επί 6 και 24 ώρες. SSX ανοσοκατακρημνίσθηκε από τα εκχυλίσματα πρωτεϊνών που συλλέγονται στις υποδεικνυόμενες χρονικές στιγμές χρησιμοποιώντας την κουνελιού αντι αντίσωμα SSX (FL188, ανίχνευση SSX1-9). Μία ισοδύναμη ποσότητα πρωτεΐνης από G1 /S μπλοκάρει κύτταρα Saos-2 ανοσοκαταβυθίστηκε με ένα άσχετο αντι ποντικού (m) ή (R) αντίσωμα ant-κουνελιού. Το σύμπλεγμα πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε αναγωγικές συνθήκες και στυπώθηκε αιθέρα με κατσίκα αντι SSX (Ν18) ή αντισωμάτων αντι β-κατενίνης ποντικού. Τα συνολικά επίπεδα εισόδου του β-κατενίνης που φαίνεται στο άνω εικόνα γέλη. Β) δραστηριότητας μιας TCF ανταποκριτή /Lef λουσιφεράσης σε SSX σιγήσει και τον έλεγχο DFW και Saos-2 κύτταρα, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση των μορίων siRNA (n = 5). Η δραστικότητα του ανταποκριτή TCF /Lef σε SSX σιγήσει κυττάρων είναι σε σχέση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (= 1). C) μεταγραφή γονίδιο που σχετίζεται με την έκφραση SSX σε αμφότερες κύτταρα Saos-2 και DFW, εξαρτάται και από συστοιχίες PCR που περιέχει 84 γονίδια που συνδέονται με επιθηλιακά να μεσεγχυματικά μετάβασης (n = 5) και επιβεβαιώθηκε από Q-RT PCR σε SSX σιγήσει και τον έλεγχο DFW και Saos -2 κύτταρα όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. SSX χτυπήθηκε κάτω σε κύτταρα Saous-2 ή DFW χρήση μορίων siRNA ή φορείς shRNA όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και απομονώθηκε RNA 6 δικός μας μετά την επιμόλυνση siRNA ή 6 ώρες μετά την προσθήκη της δοξυκυκλίνης εντός του μέσου (υπό όρους shRNA). Η απώλεια της έκφρασης μετά SSX RNAi σίγηση επιβεβαιώθηκε με κηλίδα western πριν από κάθε συστοιχία Q-RT-PCR, όπως φαίνεται στο σχήμα. Πολλαπλή μεταβολή [2∧ (-Delta Delta CT)] είναι το κανονικοποιημένο γονιδιακή έκφραση [2∧ (-Delta Ct)] σε SSX σιγήσει κύτταρα διαιρούμενη με την κανονικοποιημένη έκφραση του γονιδίου στον έλεγχο (SSX +) κύτταρα. Οι τιμές λιγότερο από ένα υποδεικνύουν μια αρνητική ή ρύθμιση προς τα κάτω.

Η

Το αντίστροφο πείραμα εκτελέστηκε επίσης με την οποία κυτταρικά εκχυλίσματα από DFW καταβυθίστηκαν με αντισώματα β-κατενίνης και στυπώθηκαν με αντι-SSX αντισώματα. Ανοσοκαταβύθιση β-κατενίνης είχε ως αποτέλεσμα την συν-καταβύθιση του SSX. Της ανακοίνωσης είναι ότι η απόδοση του SSX λαμβάνονται μετά αντισώματα β-κατενίνης ήταν χαμηλότερη από ό, τι το αντίστροφο ανοσοκατακρήμνιση, η οποία μπορεί να οφείλεται σε αύξηση του ανταγωνισμού της δέσμευσης με άλλες πρωτεΐνες (Σχήμα S3) β-κατενίνης.

Στην κανονική Wnt μονοπάτι, β-κατενίνης συνδέεται με TCF /Lef να ενεργοποιήσει μεταγραφή των γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την κινητικότητα και τη διαφοροποίηση [23]. Με βάση αυτό ερευνήσαμε εάν η αλληλεπίδραση της β-κατενίνης με επιπτώσεις SSX η μεταγραφή των γονιδίων στόχων /β-κατενίνης TCF. Αρχικά προσδιορίζεται η δραστηριότητα των ρεπόρτερ TCF /Λεφ-λουσιφεράσης στα κύτταρα (SSX +) SSX-νοκ-κάτω και ελέγχου. DFW και κύτταρα Saos-2 επιμολύνθηκαν σε tetraplicates με TCF /Lef- πυγολαμπίδας αναφοράς λουσιφεράσης και είτε με siRNA να SSX ή μόρια ελέγχου. Η δραστικότητα του ανταποκριτού αξιολογήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήθηκε μια μείωση σε κύτταρα κατεργασμένα δραστηριότητα ανταποκριτή siRNA-SSX σε πέντε ανεξάρτητα πειράματα (Σχήμα 5Β). Στην συνέχεια διερευνήσαμε εάν η αλληλεπίδραση /β-κατενίνης SSX συνδέθηκε με αλλαγές στη μεταγραφή των ενδογενών γονιδίων στόχου β-κατενίνης /TCF. Για το σκοπό αυτό συγκρίναμε τα προφίλ μεταγραφής του ελέγχου και SSX knockdown χρησιμοποιώντας συστοιχίες RT-PCR για 84 μεταγραφές που σχετίζονται με Επιθηλιακά να Mesenchyma (ΕΜΤ) μεταβάσεις σε κύτταρα Saos-2. Επιλέξαμε γονιδίων που σχετίζονται με EMT με βάση το ρόλο του β-κατενίνης στην προώθηση της ΕΜΤ και προηγούμενη αναφορά μας δείχνει ότι η έκφραση SSX συνδέεται με την επεμβατική ικανότητα των κυττάρων του όγκου και με την έκφραση των γονιδίων μεσεγχυματικών [5]. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε 5 ανεξάρτητες συστοιχίες επιβεβαιώθηκαν με RT-PCR στην κυτταρική γραμμή DFW. 84 ανάλυσης των γονιδίων βρήκαμε ότι η απώλεια της έκφρασης SSX σε Saos-2 και DFW συνδέθηκε με μειωμένη μεταγραφή της Akt-1, Ε-καδερίνης (Cdh1), ΟδΚ3β, σαλιγκάρι 2 (SNAI2), c-myc (cmyc), και βιμεντίνης (VIM) (Σχήμα 5C). Με την εξαίρεση των Akt-1, όλα αυτά τα γονίδια φέρουν αλληλουχίες πρόσδεσης DNA για την TCF /Lef και ως εκ τούτου θεωρούνται στόχοι β-κατενίνης. Παρατηρήσαμε επίσης μια αυξημένη μεταγραφή 3Α κολλαγόνου μετά από κάτω ρύθμιση των SSX σε Saos-2 (Πίνακας S1).

siRNA Στόχευση του SSX βλάπτει όγκου Ανάπτυξης ξενομοσχεύματος

Έχοντας δείξει ότι SSX απαιτείται για όγκο κυττάρων αυξηθεί

in vitro

, εξετάσαμε την αύξηση του ελέγχου και της SSX σιγήσει ξενομοσχευμάτων σε ποντίκια. Εμείς υποδορίως SCID ποντίκια είτε με έλεγχο-shRNA (SSXm) ή SSX-shRNA (SSXi) σταθερούς επιμολυσμένα κύτταρα DFW (Σχήμα 5Α-Β), ή με κύτταρα DFW στα οποία η έκφραση shRNA ήταν υπό όρους ρυθμίζεται με δοξυκυκλίνη (Σχήμα 5C-D ). Στο υπό όρους σύστημα, SSX knockdown προκλήθηκε με υποδόρια εμφύτευση σφαιριδίων βραδείας αποδέσμευσης δοξυκυκλίνη, όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. Σε σύγκριση με τον έλεγχο (SSX +) ξενομοσχεύματα όγκου, SSX όγκους knockdown έδειξαν εξασθενημένη ανάπτυξη όπως παρατηρείται από την μειωμένη καμπύλες ανάπτυξης όγκου και από τη μειωμένη όγκου του όγκου στο ακραίο σημείο του ποσοτικού προσδιορισμού (Σχήμα 6 Α-Δ). Μικροσκοπικά, SSX αρνητικούς όγκους εμφανίζεται εκτεταμένη νέκρωση, έως και 80% και είχε οριοθετείται σύνορα (Σχήμα 6Ε, HTX) με τοπικές πολλαπλασιαζόμενα κυκλίνη Α θετικά κύτταρα. Σε αντίθεση με τους όγκους ελέγχου έδειξε ακτινική ανάπτυξη των κυττάρων με άφθονη πολλαπλασιαστική (κυκλίνης Α θετικά) περιοχές και τα πυρηνικά της β-κατενίνης (Σχήμα 6Ε). Είναι ενδιαφέρον ότι οι όγκοι SSX knockdown έδειξε κυρίως κυτταροπλασματική εντόπιση της β-κατενίνης σε σύγκριση με όγκους ελέγχου, πιθανώς υποδεικνύοντας ένα ρόλο για SSX στο κυτταρικό εντοπισμό του β-κατενίνης (Σχήμα 6Ε). Επιβεβαιώσαμε SSX νοκ ντάουν σε όγκους με κηλίδα western για τα νωπά βιοψίες των όγκων. (Σχήμα 6F).

Α) κύτταρα μελανώματος DFW σταθερά επιμολυσμένα με SSX-shRNA (SSXi) ή με ένα μάρτυρα shRNA (SSXm) φορέα, επεκτάθηκε και ξενομόσχευμα σε SCID ποντίκια. Α) Το μέγεθος του όγκου προσδιορίζεται σε χρόνους που υποδεικνύονται. Β) Ο όγκος του όγκου στο τελικό σημείο του πειράματος (21 ημέρες). καμπύλες Γ) Ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων από όρους SSX-shRNA σιγήσει κύτταρα DFW (SSX-) και τα κύτταρα ελέγχου shRNA (SSX +). Η δοξυκυκλίνη χορηγήθηκε σε όλα τα ποντίκια με υποδόρια εισαγωγή μιας αργής απελευθέρωσης πέλλετ στην συντήρηση σταθερή συγκέντρωση της δοξυκυκλίνης (10 μΜ) για 21 ημέρες. Δ) Ο όγκος του όγκου στο τελικό σημείο του πειράματος. Ε) Η ανοσοϊστοχημεία των όγκων ορατές σε οπτικό μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας 10χ αντικειμενικό, ένθετα 63x μεγέθυνση:. Hematoxillin (HTX), ο δείκτης πολλαπλασιασμού (Ki-67) και β-κατενίνη (β-cat)

Η

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω της έκφρασης SSX παρεμποδίζει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

και τα αποτελέσματα σε τροποποιημένη β-κατενίνης εντοπισμό.

Συζήτηση

Οι πρωτεΐνες SSX είναι κωδικοποιημένα από τα γονίδια που εκφράζονται μόνο σε αρκετές υποτύπους καρκίνου με έκφραση σε φυσιολογικούς ιστούς περιορίζεται σε γεννητικά κύτταρα, τροφοβλάστες και εμβρυϊκά μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα. Δεδομένης αυτής της περιορισμένης έκφρασης, τα αντιγόνα SSX είναι ελκυστικοί στόχοι για ανοσοθεραπεία όγκου [21]. Ωστόσο, η λειτουργία των πρωτεϊνών SSX σε σπερματογένεση ή ογκογένεση είναι ακαθόριστα. SSX εκφράζεται σε διακριτές υποπληθυσμούς σπερμογονίων και σε εμβρυϊκό μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα, προτείνοντας ένα ρόλο για SSX σε κυτταρική διαφοροποίηση [4], [5]. Σε όγκους, SSX αυξάνει επεμβατική δυναμικό και καταστέλλει την έκφραση Ε-καδερίνης, όπως έχει αποδειχθεί σε μελάνωμα [5] και κύτταρα καρκίνου του μαστού, αντίστοιχα [24]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση του SSX είναι απαραίτητη για την είσοδο των κυττάρων του όγκου σε S-φάση του κυτταρικού κύκλου και, κατά συνέπεια, τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν SSX διατηρήσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη μακροπρόθεσμη επιβίωση. Αυτές οι λειτουργίες μπορεί να σχετίζεται με την ικανότητα του να διαμορφώνει SSX ΜΑΡΚ /ΕΚΚ, Akt και μονοπάτια σηματοδότησης β-κατενίνης. Συνεπής με τον ρόλο της SSX στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, knockdown του SSX μπλοκάρει pERK ενεργοποίηση βασικό συστατικό του καταρράκτη πολλαπλασιασμού ξεκίνησε με εξωκυτταρικό κινάσες παράγοντα ανάπτυξης. Επιπλέον SSX knockdown είχε επίσης ως αποτέλεσμα τη μειωμένη έκφραση του Akt, ένα κύτταρο κινάση σηματοδότησης με ένα κεντρικό ρόλο σε έναν μεγάλο αριθμό κυτταρικών λειτουργιών συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, του μεταβολισμού και της επιβίωσης [25]. Προς υποστήριξη αυτού, πρόσφατες αναφορές έχουν δείξει ότι SSX είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μελανώματος [26] και για την ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων του μαστού [24].

Βρήκαμε ότι SSX αλληλεπιδρά άμεσα με β-κατενίνης G1 συλληφθεί κύτταρα και ότι αυτή η αλληλεπίδραση επηρεάζει την μεταγραφή του β-κατενίνης /TCF γονίδια στόχους, δεδομένου ότι η αποσιώπηση της έκφρασης SSX συνδέθηκε με τη μειωμένη δραστικότητα μιας κατασκευής αναφοράς TCF /Lef και μειωμένη μεταγραφή του β-κατενίνης γονιδίων στόχων /TCF όπως Ε -cadherin, GSK3b, σαλιγκάρι-2, βιμεντίνη και c-Myc.

β-κατενίνης είναι ένας ισχυρός παράγοντας μεταγραφής με ένα μεγάλο κατάλογο των γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, stemcellness και σε επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μεταβάσεις (EMT ). Σε μια προηγούμενη αναφορά προτείναμε ένα ρόλο για SSX σε EMT με βάση τα ευρήματα μας ότι σε μια κυτταρική γραμμή μελανώματος και σε εμβρυϊκό μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα, η έκφραση του SSX σχετίστηκε με φαινότυπο μεσεγχυματικά όπως αυξημένη ικανότητα εισβολής κυττάρων, μειωμένη Ε-καδερίνης και αυξημένη πρωτεϊνάσης μήτρας 2 (ΜΜΡ2) έκφραση [5]. Μπορούμε πλέον να καταδείξει ότι SSX αλληλεπιδρά με β-κατενίνης και με βάση τα στοιχεία του προφίλ μεταγραφής μας προτείνουν ότι η αλληλεπίδραση αυτή μπορεί να προκαλέσει ή να διατηρήσουν ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά. Η δραστικότητα του συμπλόκου /β-κατενίνης SSX σε ενδογενείς θέσεις στόχους μπορεί ωστόσο να εξαρτάται από την κυτταρική καταγωγή, τον χρόνο και τη σηματοδότηση από το μικροπεριβάλλον.

SSX είναι μια τρέχουσα στόχος για την ανάπτυξη του immunovaccines με βάση κύτταρα . HLA A2 περιορισμένο έχουν κυτταροτοξικά Τ-κύτταρα (CD8 +) τα οποία αναγνωρίζουν SSX πεπτίδια έχουν απομονωθεί από λεμφαδένες από έναν οροθετικό SSX2 ασθενή με μελάνωμα [19] και έχουν επίσης δημιουργήθηκε για το immunotargeting των κυττάρων καρκίνου του προστάτη

in vitro

[ ,,,0],21]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η θεραπεία με αυτόνομη δενδριτικά κύτταρα που πριμοδοτήθηκαν με SSX πεπτίδια οδήγησε σε υποχώρηση του όγκου του αρθρικού σαρκώματος ασθενούς [27]. Στην παρούσα έκθεση, δείχνουμε ότι η μεταγραφική σίγηση του SSX αναστέλλει την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων μελανώματος ενισχύει έτι περαιτέρω τη σημασία του SSX ως θεραπευτικό στόχο.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλες οι εργασίες των ζώων έχει εγκριθεί από τη σουηδική κεντρική πλακέτα για μελέτες σε ζώα (Centrala Försöksdjur nämnden, CFN), Στοκχόλμη Βορρά. Ηθικές αριθμούς έγκρισης N399 /07, N340 /10 έως Β.Β. το ζώο μελέτες που έχουν διεξαχθεί σύμφωνα με τους ηθικούς κανόνες τους. Η συλλογή των κλινικών δειγμάτων για την έρευνα έγινε με τη concent ασθενή και εγκρίθηκε από το Karolinska, forskningsetikkommitté Nord Δεν 03-019. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν ανώνυμα και σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

τηλέφωνα Γραμμές

DFW είναι μια κυτταρική γραμμή μελανώματος HLA-A2 που λαμβάνεται από ένα μεταστατικό όγκο μελανώματος. Η γραμμή δημιουργήθηκε στο Karolinska Institutet [28], και ευγενώς από τον R. Kiessling. SAOS-2 (σάρκωμα οστεογονική) είναι μία κυτταρική γραμμή που παράγεται από ένα πρωτεύον οστεοσάρκωμα [29] και U2OS είναι μία κυτταρική γραμμή οστεοσαρκώματος, και οι δύο κυτταρικές σειρές που παρέχονται από τον Μ Fritsche, Universität Freiburg, Γερμανία. Όλες οι κυτταρικές σειρές ανιχνεύουν υψηλά επίπεδα od SSX1 να SSX5, προσδιορίζεται με τη χρήση RT-PCR (Εικόνα 1 και Εικόνα S1). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως μονοστρωματικές καλλιέργειες σε μέσο RPMI (Sigma) συμπληρωμένο με 10% FBS χωρίς τετρακυκλίνη (Clonetech), 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 2 mM L-γλουταμίνη με υγροποιημένη ατμόσφαιρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

SSX-RNA παρέμβαση

Μια κατάλληλη παρεμβολή RNA (RNAi) ολιγονουκλεοτιδίων που στοχεύουν όλες SSX ισομορφών SSX (1, ​​2, 3, 4, 4Β, 5 , 7, 8, και 9) και το SS18 /SSX1, SS18 /SSX2 και SS18 /SSX4 μεταγραφές σύντηξης που εκφράζονται σε αρθρικό σάρκωμα ταυτοποιήθηκε με ευθυγράμμιση των αλληλουχιών mRNA του εξονίου 5, το εξόνιο 6 και περιοχή 3’UTR του SSX1 να SSX5 χρησιμοποιώντας καθιερωμένα κριτήρια RNAi. Εισάγει σχεδιάστηκαν για να περιέχουν ένα 19-bp αλληλουχία SSX mRNA διαχωρίζονται από μια 9-νουκλεοτιδίου μη-συμπληρωματική αποστάτη, και ακολουθείται από την αντίστροφη συμπληρωματική 19-bp αλληλουχία mRNA (Σχήμα 2Α). Για τον έλεγχο των φορέων shRNA, μια ομελέτα αλληλουχία που περιέχει 3 αταίριαστων θέσεις κλωνοποιήθηκε επίσης μέσα στους φορείς. shRNA ολιγονουκλεοτίδια κλωνοποιήθηκαν σε pSuper (για σταθερή) και pSuperior (δοξυκυκλίνη επαγώγιμη) φορείς (Oligoengine) και υποβλήθηκαν σε διαλογή με PCR και αλληλούχιση του DNA.

Για SSX αποσιώπηση στις κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιούνται τόσο διανύσματα shRNA και επίσης μόρια siRNA . Για να διερευνηθεί η εξειδίκευση του συστήματος RNAi-SSX και για τον έλεγχο των off-στόχου επιδράσεις Η επίδραση του siRNA-SSX που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη συγκρίθηκε με εμπορικά διαθέσιμοι φορείς shRNA στόχευση SSX1 και SSX2 σε κυτταρικές σειρές 3 independet (DFW, U2OS και SAOS- 2. Αυτό φαίνεται στο συμπληρωματικό σχήμα 2.

Για παροδικές επιμολύνσεις DFW επιμολύνθηκε με pSuper SSX shRNA (SSXi) ή φορέα ελέγχου RNA (SSXm) μαζί με ένα άδειο φορέα που φέρει ένα νεομυκίνη κασέτα αντίστασης. Τα κύτταρα επιλέγονται μετά από επιμόλυνση σε μέσα που περιέχουν G418 και επεκτάθηκαν σε χύμα πριν από τις δοκιμασίες. για την παραγωγή των κυττάρων που επάγονται siRNA, κύτταρα DFW επιμολύνθηκαν με τον καταστολέα τετρακυκλίνης που εκφράζουν διάνυσμα pcDNA6 /TR (Invitrogen) και pSuperior χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και επιλέγονται με 8 μg /ml βλαστισιδίνη και 1 μg /ml πουρομυκίνη. κυτταρικοί κλώνοι επιλέχθηκαν με βάση την αποτελεσματικότητά τους στην φίμωση έκφραση SSX μετά την προσθήκη της δοξυκυκλίνης σε συγκέντρωση 10 μg /ml όπως αξιολογείται με κηλίδα western.

Για τις μελέτες γονιδιακής μεταγραφής, άγριου τύπου DFW ή Saos-2 επιμολύνονται με siRNA-SSX ή ελέγχουν μόρια siRNA (Ambion). Αποδοτική αποσιώπηση της SSX επιβεβαιώθηκε στα επιμολυσμένα κλώνους σε 8 και 24 ώρες πριν την απομόνωση RNA και συστοιχίες Q-RT-PCR.

Για την απλοποίηση SSX σιγήσει κύτταρα αναφέρονται ως κύτταρα SSX- και ελέγχου SSX +.

κυτταρικού κύκλου συγχρονισμού και Ανάλυση

τα κύτταρα συγχρονίστηκαν σε G1 /S φάση με διπλό μπλοκ θυμιδίνης

Εν συντομία.? κύτταρα επιστρώθηκαν σε 50% συρροή και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2 mM θυμιδίνη για 12 ώρες, tripzinized, επαναποτέθηκαν και απελευθερώνεται στο φυσιολογικό μέσο για 8 ώρες, και μπλοκάρει και πάλι σε μέσο που περιέχει 2 mM θυμιδίνης για 12 ώρες. Για όρους αποσιώπηση του SSX σε συγχρονίζονται κύτταρα DFW, δοξυκυκλίνη (10 μg /ml) προστέθηκε σε κύτταρα 2 ώρες πριν από την αποδέσμευση κυττάρων σε κανονικό μέσο και τα κυτταρικά δείγματα στη συνέχεια συλλέγονται σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία και αναλύθηκαν με χρώση ιωδιούχου προπιδίου, ή 5′- βρωμο-2′-Δεοξυ-ουριδίνη (BrdU) (Roche Diagnostics) χρώση και ανάλυση FACS. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ModFit.

Αντισώματα, Ανοσοκηλίδωση και Ανοσοκαταβύθιση

Για SSX ανοσοκαταβύθιση, καλλιεργημένα κύτταρα λύθηκαν σε RIPA ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM Tris λύσης -ΗΟΙ ρΗ 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.25% δεοξυχολικό, 1% ΝΡ-40) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης (Roche). Τα δείγματα στη συνέχεια σε επεξεργασία με υπερήχους και φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά (14.000 χ g). 100 μα πρωτεΐνης από το υπερκείμενο που προέκυψε επαναιωρήθηκε σε ένα συνολικό όγκο 1 ml με PBS που περιείχε αναστολείς πρωτεασών και ανοσοκαταβυθίστηκαν επί μία νύκτα στους 4 ° C με με 3 μg fl188 αντι SSX 1-9 αντίσωμα (Santa Cruz Technologies) συζευγμένο με πρωτεΐνη G-Dynabeads (Invitrogen). Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και δύο φορές με PBS επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (Invitrogen), θερμαίνεται στους 70 ° C για 5 λεπτά και να επιλυθούν σε γέλες πολυακρυλαμιδίου 4-12% για western αποτύπωση.

Για την ανίχνευση πρωτεΐνες με κηλίδα western, τα κύτταρα λύθηκαν

in situ

με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης /φόρτωση? επεξεργασία με υπερήχους και θερμάνθηκε στους 70 ° C και να επιλυθούν ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου 4-12% για western αποτύπωση

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα:. FL188 (ανέκυψε στο κουνέλι) για την ανίχνευση του SSX 1-9, και Ν18 ( έθεσε σε κατσίκα) για την ανίχνευση του SSX1-4, 6 και 8, (Santa Cruz Biotechnologies), και ένα στο σπίτι παράγονται πολυκλωνικό αντίσωμα κατά ενός πεπτιδική αλληλουχία SSX (SSX PAb)? αντισώματα έναντι κυκλίνης-E (HE-12, Santa Cruz)? β-κατενίνης (BD Biosciences Pharmingen), Erk, Perk, Akt, pAkt (Cell σηματοδότηση). Για την ανίχνευση χημειοφωταύγειας χρησιμοποιήσαμε συζυγή υπεροξειδάση συζευγμένη horseradish και βελτιωμένη ανίχνευση υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (ECL και Super Signal West Femto, Pierce).

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Κυτταρική βιωσιμότητα εκτιμήθηκε μετρώντας τον αριθμό των ζωντανός και τα νεκρά κύτταρα χρησιμοποιώντας trypan αριθμό των κυττάρων του αποκλεισμού μπλε χρωστική ουσία στο τριπλούν. Εν συντομία 50000 σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μg /ml δοξυκυκλίνης. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με μπλε τρυπάνης σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Κάθε συνθήκη διεξήχθη εις τριπλούν και όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε σε πραγματικό χρόνο με τη χρήση του αναλυτή xCELLigence κύτταρο (Asea Biosciences) που μετρά την ηλεκτρική σύνθετη αντίσταση των προσφυόμενων κυττάρων και εκφράζεται σε αυθαίρετες μονάδες (δείκτης κυττάρου). δείκτης των κυττάρων εξαρτάται από την προσκόλληση των κυττάρων, την μορφολογία και τον πολλαπλασιασμό.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

1 × 10

3 κύτταρα DFW SSXi απλώθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 3 cm (εις τριπλούν).