Αφηρημένο

Ο επαναπρογραμματισμός του μεταβολισμού της ενέργειας είναι ζωτικής σημασίας για τον καρκίνο, έτσι μιτοχόνδρια είναι πιθανοί στόχοι για αντικαρκινική θεραπεία. Μία προηγούμενη μελέτη έχει καταδείξει την αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα μιας νέας κατηγορίας ροζαμίνες μιτοχονδρίων-στόχευσης. Αυτή η παρούσα μελέτη περιγράφει

in vitro

κυτταροτοξικότητα των αναλόγων rosamine δεύτερης γενιάς, τον τρόπο δράσης τους, και τους

in vivo

απόδοση των σε όγκο αλλογενούς μοντέλο ποντικού. Εδώ, δείξαμε ότι αυτές οι ενώσεις επέδειξαν ισχυρή κυτταροτοξικότητα (μέσος IC

50 & lt? 0.5 μΜ), ανέστειλε Complex δραστηριότητες II και συνθάσης ΑΤΡ της μιτοχονδριακής οδού οξειδωτική φωσφορυλίωση και προκαλούμενη απώλεια μιτοχονδριακής διαμεμβράνης δυναμικό. Ένα κυτταρικές σειρές NCI-60 οθόνη ανέφερε ακόμη ότι rosamine ανάλογα 4 και 5 παρουσίασαν ισχυρά αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα με Σύνδεση

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 μΜ) και ήταν πιο αποτελεσματικό ενάντια σε έναν καρκίνο του παχέος εντέρου υπο-πίνακα σε σχέση με άλλες κυτταρικές σειρές. Προκαταρκτική

in vivo

μελέτες σχετικά με τον καρκίνο του μαστού 4Τ1 που φέρουν θηλυκά ποντίκια /c ποντικού BALB έδειξε ότι η θεραπεία με ανάλογο 5 σε μία μονή δόση των 5 mg /kg ή ένα δοσολογικό σχήμα των 3 mg /kg μία φορά κάθε 2 ημέρες για 6 φορές (q2d × 6) εμφάνισαν μόνο ελάχιστη επαγωγή καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι rosamine ανάλογα μπορεί να αναπτυχθεί περαιτέρω ως μιτοχονδριακό παράγοντες στόχευσης. Χωρίς αμφιβολία θα πρέπει να επινοηθεί για την ενίσχυση της πρόσληψης του όγκου των ροζαμίνες, δηλαδή από την ένταξη σε μόρια φορέα για την καλύτερη θεραπευτική έκβαση κατάλληλες στρατηγικές

Παράθεση:. Lim SH, Wu L, Κίεβο LV, Chung LY, Burgess Κ, Lee HB (2014) ροζαμίνες Στόχευση του καρκίνου οξειδωτική φωσφορυλίωση Pathway. PLoS ONE 9 (3): e82934. doi: 10.1371 /journal.pone.0082934

Επιμέλεια: Siyaram Pandey, Πανεπιστήμιο του Windsor, Καναδάς

Ελήφθη: 13 Ιούνη 2013? Αποδεκτές: 30η Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Μαρ του 2014

Copyright: © 2014 Lim et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον καρκίνο Ίδρυμα Ερευνών πρωτοβουλίες, Υπουργείο Μαλαισία επιχορηγήσεων HIR-Mohe Ανώτατης Παιδείας (UM.C /625/1 /HIR /Mohe /MED /17 και UM.C /625/1 /HIR /Mohe /MED /33), Universiti Malaya Μεταπτυχιακών Ερευνών Grant (PS204 /2010Β), καθώς και από επιχορηγήσεις σε KB από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (GM087981) και το Ίδρυμα Α Welch Robert (Α-1121). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

συμβατική χημειοθεραπεία του καρκίνου εξαρτάται από φάρμακα τα οποία δρουν διακόπτοντας την αντιγραφή του DNA, δηλαδή αναστέλλοντας τη σύνθεση ή την λειτουργία των νέων νουκλεϊκών υλικών, ή προκαλώντας ανεπανόρθωτη βλάβη σε ζωτικά νουκλεϊκά οξέα μέσω παρεμβολής, αλκυλίωση ή ενζυματική παρεμπόδιση. Έλλειψη επιλεκτικότητα για νεοπλασματικών κυττάρων εκτεθεί από αυτά τα φάρμακα συνήθως περιορίζει την επιτυχία τους ως παράγοντες θεραπείας. Σύγχρονη χημειοθεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν οδούς σηματοδότησης ή συγκεκριμένα προϊόντα γονιδίων έχουν την τάση να περιορίζονται σε καρκίνους οδηγείται από ένα κυρίαρχο ογκογονίδιο και είναι συχνά ευάλωτοι στην αντίσταση μέσω της πολλαπλότητας των ογκογένεση μονοπατιών σηματοδότησης [1]. Για παράδειγμα, τα περισσότερα από τα HER-2 ασθενείς θετικό μεταστατικό καρκίνο του μαστού που αρχικά ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία με trastuzumab αναπτύσσουν δευτερογενή αντίσταση trastuzumab μέσα σε ένα χρόνο μετά την έναρξη της θεραπείας [2]. Παρόμοιες παρατηρήσεις έχουν γίνει για BRAF στοχευμένες vemurafenib για θεραπεία μελανώματος [3] και στοχεύει EGFR gefitinib ή erlotinib για τη θεραπεία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα [4].

Μια σχετικά νέα εναλλακτική λύση για το DNA στόχευσης και τα ένζυμα σε ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, ή συγκεκριμένες οδούς σηματοδότησης είναι να επικεντρωθεί σε οργανίδια όπως τα μιτοχόνδρια. Τα μιτοχόνδρια είναι οι γεννήτριες ενέργειας που διατηρούν τη ζωή των κυττάρων και ουσιαστικές λειτουργίες των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών καταρράκτες σηματοδότησης που ρυθμίζουν κύτταρα, για παράδειγμα, το μεταβολισμό, τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, την ανάπτυξη, και θάνατο των κυττάρων [5]. Σε χημειοθεραπεία του καρκίνου, των ναρκωτικών μιτοχόνδρια στόχευση παρεμβαίνουν καρκινικών κυττάρων μεταβολισμό με pertubing το μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό, αναστέλλοντας τα σύμπλοκα αλυσίδα ηλεκτρονίων οξειδοαναγωγής, παρεμβαίνοντας τα μιτοχόνδρια διαμεμβρανική διαπερατότητα, και η στόχευση μιτοχονδριακό DNA-[6],. Οι πιο κοινοί τύποι φαρμάκων μιτοχονδρίων-στόχευσης είναι λιπόφιλες, κατιονικά φάρμακα? αυτές είναι επιλεκτικές για καρκινικά κύτταρα επειδή τείνουν να έχουν υψηλότερα δυναμικά μεμβράνης των μιτοχονδρίων από φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα [8], [9].

Έχουμε αναφέρει προηγουμένως σχέσεις δομής-δραστικότητας (SAR) για τις αντικαρκινικές ιδιότητες της α σειρά ροζαμίνες (Εικ. 1Α) [10], [11]. Αυτές οι ενώσεις είναι μετατοπισμένο λιπόφιλες κατιόντα (DLC) με περιφερική κυκλικές αμίνες και διάφορες ομάδες στο

μεσο

θέση? η πλειοψηφία αυτών των κατιόντων είναι ουσιαστικά περισσότερο ισχυρές από ροδαμίνη-123 το οποίο είναι ένα καλά μελετημένο μετατοπισμένο λιπόφιλο κατιόν. Συνέπεια με αυτό, τα δεδομένα SAR για τις ροζαμίνες προτεινόμενες καλές ικανότητες συσχετίζεται με υδρόφοβο κυκλικές αμίνες και

μεσο

της -αρυλ υποκατάστατα. Thiofuryl και 4-ιωδοφαινυλ

μεσο

υποκατάσταση αντιστοιχούσε σε περίπου 5-πλάσια βελτίωση σε δραστικότητα σε σύγκριση με φαινύλιο υποκατάστασης. Επιπλέον, τα δεδομένα έδειξαν ότι σημαντικά χαμηλότερη IC

50 τιμές ελήφθησαν για ασύμμετρες ενώσεις (Χ

1 δεν ίδιο όπως το Χ

2), αλλά ο συνδυασμός των ασύμμετρων υποκαταστατών αμίνης με thiofuryl και 4-ιωδοφαινυλ

μεσο

υποκατάστασης δεν είχε διερευνηθεί. Η ενδοκυτταρική απεικόνισης για αντιπροσωπευτικά παραδείγματα υποδεικνύονται οι ενώσεις αυτές συσσωρεύονται στα μιτοχόνδρια. Αυτές οι ενώσεις (δηλαδή rosamine 2 και 5) είναι επίσης βρέθηκαν να είναι πιο κυτταροτοξικά κατά των καρκινικών κυττάρων σε σύγκριση με αθανατοποιημένη φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του ίδιου τύπου οργάνου [10].

(Α) από τις βαφές rosamine ποικιλοτρόπως λειτουργοποιημένη στο η

μεσο

θέση όπως αναφέρθηκε προηγουμένως από Lim et al. (Anticancer Drugs 2009, 20: 461-468), αυτές που παρουσιάζονται εδώ με

μεσο

– θειοφουράνιο ή 4-ιωδοφαινυλ είχαν ανώτερη αντικαρκινική δραστηριότητα σε κυτταρικές δοκιμασίες. (Β) οι στόχοι δεύτερης γενιάς εμφανίζονται σε αυτό το έργο

Η

Η έρευνα που αναφέρεται εδώ ανέλαβε να διερευνήσει πώς δύο μοριακές τροποποιήσεις επηρεάζουν κυτταροτοξικότητες σε αυτή τη σειρά:. (I) αντικατάσταση του

para

-ιώδιο ή θειοφουράνιο ομάδες με άλλα

para

αλογονίδιο ή φουρανίου ομάδες? και, (ii) συνδυασμό thiofuryl και 4-ιωδοφαινυλ

μεσο

υποκατάσταση με συνδυασμούς πιπεριδίνη /μορφολίνη. Έτσι αναφέρουμε συνθέσεις των ροζαμίνες δεύτερης γενιάς (Εικ. 1Β) και κυτταροτοξικότητες τους σε σχέση με ένα πάνελ κυτταρικών σειρών συμπαγών όγκων. Ενώσεις με υποσχόμενη δραστηριότητα αξιολογήθηκαν περαιτέρω στην οθόνη γραμμές NCI-60 ανθρώπινο κύτταρο όγκου. Επιλεγμένα ροζαμίνες εξετάστηκαν επίσης για την επίδρασή τους στα συστήματα κυτταρικής οξειδοαναγωγής και για τις επιπτώσεις σε μια

in vivo

μοντέλο όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα ελεγχθεί και εγκριθεί από τον Δρ Haji Azizuddin Bin Haji Kamaruddin, Εργαστήριο ζώων Κέντρο (ΛΑΚ) Φροντίδα ζώων και Χρήση Επιτροπής της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Μαλαισίας (αριθμός αναφοράς FAR /14/07 /2010 /LSH). Θηλυκοί ποντικοί BALB /c ηλικίας μεταξύ 6-8 εβδομάδων με ένα ελάχιστο βάρος 17 g διατηρήθηκαν σε ένα ελεγχόμενο περιβάλλον 12 h φωτός-σκότους κύκλους με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή (τυπική δίαιτα σφαιρίδιο αγοράστηκε από Altromin International, Lage, Γερμανία) και εξαγνισμένο νερό. Θηλυκά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν επειδή το ορμονικό περιβάλλον απαραίτητο για την ανάπτυξη του εμφυτευμένου καρκινώματος μαστού ποντικού 4Τ θα είναι παρόντες.

Υλικά |

Ελάχιστο βασικό μέσο με κόμη αλάτι και L-γλουταμίνη, RPMI 1640 με L -γλουταμίνη, εμβρυϊκό βόειο ορό, Pen-Strep (10 000 U /ml πενικιλίνη, 10 mg /ml στρεπτομυκίνη), θρυψίνη 10 × παρασχέθηκαν από την GIBCO, Invitrogen (Auckland, Νέα Ζηλανδία). JC-1 αγοράστηκε από την Molecular Probes, Invitrogen (Oregon, USA). Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), υδροχλωρικό οξύ 37%, πολυαιθυλενογλυκόλη 400 (PEG 400) και 2-προπανόλη αγοράστηκαν από τη Merck (Hohenbrunn, Γερμανία). Αιθυλενογλυκόλη

δις

(αμινοαιθυλαιθέρας) –

τετρα

οξικού οξέος (EGTA), αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), 3 – (

N-μορφολινο

) προπανοσουλφονικό οξύ (MOPS ), χλωριούχο κάλιο, δισόξινο ορθοφωσφορικό κάλιο, χλωριούχο νάτριο, όξινο ανθρακικό νάτριο, δινάτριο ορθοφωσφορικό άνυδρο, σακχαρόζη και Τρις αγοράστηκαν Fisher Scientific (Leicestershire, UK). Θειαζοϋλίου μπλε τετραζολίου (ΜΤΤ) αγοράστηκε από Amresco (Ohio, USA). Φυσιολογικός ορός (0,9% χλωριούχο νάτριο) ελήφθη από Duopharma Sdn. Bhd. (Selangor, Μαλαισία). κυανιούχο Καρβονυλ 3-χλωροφαινυλυδραζόνη (CCCP) αγοράστηκε από την Sigma (Steinheim, Γερμανία). δοκιμασία Πρωτεΐνης συμπύκνωμα αντιδραστηρίου βαφής λήφθηκε από την Bio-Rad Laboratories (California, USA). Συγκρότημα Ι, ΙΙ Complex, Συγκρότημα IV και του ενζύμου συνθετάση κιτ προσδιορισμού μικροπλάκα δραστηριότητα ΑΤΡ αγοράστηκαν από MitoSciences (Oregon, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Συνθέσεις Rosamine Ανάλογα

ροζαμίνες συντέθηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Η πρώτη ύλη του xanthone τριφθορομεθανοσουλφονικού οξέος παρασκευάστηκε σε διάλυμα με τριφθοροσουλφο-νυλίωσης των φαινολών, που ακολουθείται από κίνηση του τριφλικού με πιπεριδίνη για να δώσει συμμετρικό κυκλικό υποκατάσταση αμίνες (Εικ. 2Α) ή με σταδιακή προσθήκη πιπεριδίνη και μορφολίνη για να δώσει ασύμμετρης κυκλικές υποκατάσταση αμίνες ( Σχ. 2Β) [11]. Το προκύπτον 3,6-διαμινο-ξανθεν-9-όνη αντέδρασε με οργανολιθίου ή Grignard αντιδραστήρια για να δώσει τις επιθυμητές δομές rosamine.

(Α) Η πρώτη ύλη του xanthone τριφθορομεθανοσουλφονικού οξέος παρασκευάστηκε σε διάλυμα με τριφθοροσουλφο-νυλίωσης του φαινόλες, που ακολουθείται από κίνηση του τριφλικού με πιπεριδίνη για να δώσει συμμετρικό κυκλικές αμίνες υποκατάσταση ή? (Β) με σταδιακή προσθήκη πιπεριδίνη και μορφολίνη για να δώσει ασύμμετρης υποκατάσταση κυκλικές αμίνες.

Η

Σε γενικές γραμμές, ένα αντιδραστήριο Grignard ή αντιδραστήριο λιθίου (1,0 mmol) προστέθηκε σε σταγόνες πάνω σε 1 λεπτό στο διάλυμα του 0,2 mmol 3,6-διαμινο-ξανθεν-9-όνη σε 5 ml THF στους 0 ° C. Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε για 12 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, προστέθηκαν 2 ml 2 Μ υδατικού HCl, αναδεύεται επί 10 λεπτά για τη σβέση της αντιδράσεως και αραιώνεται με 20 ml CH

2Cl

2. Η οργανική στιβάδα πλύθηκε με νερό και άλμη, ξηραίνεται πάνω από άνυδρο Ν &

2SO

4 και συμπυκνώθηκε υπό ελαττωμένη πίεση. Το υπόλειμμα καθαρίστηκε με flash χρωματογραφία (5% έως 10% MeOH /CH

2Cl

2) για να δώσει το καθαρό προϊόν.

Τα φασματικά δεδομένα για τις ενώσεις που συντίθενται παρατίθενται εδώ, εκτός της σύνθεσης και φασματικά δεδομένα για ροζαμίνες 1, 2 και 5, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [11]. Είναι το όνομά του κάτω με έναν τρόπο που περιγράφει τις

μεσο-

υποκατάστατα και υποθέτει ότι η ένωση είναι συμμετρική, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

4-Βρωμοβενζινο Rosamine 3.

1Η NMR (300 ΜΗζ,

3) δ 7.72 (d, 2Η,

J

= 8.4 Hz), 7.27 – 7.21 (m, 4Η), 7,09 (dd, 2Η,

J

= 9,6, 2,6 Hz), 6,94 (d, 2Η,

J

= 2.6 Hz), 3.74-3.70 (m, 8Η), 1,74 (br, 12Η)?

13C NMR (75 ΜΗζ,

3) δ 158,1, 156,3, 155,0, 132,2, 131,6, 130,9, 130,5, 124,9, 115,0, 113,3, 97,4, 49,1, 25,9, 24,0? λ

max abs 570 nm, λ

max emiss 590 nm, ε 110800 M

-1 εκατοστά

-1, FWHM 38 nm, Φ 0.78 ± 0.02 στο Χ

2Cl

2? HRMS (ESI) m /z υπολογισθέν για (Μ-ΟΙ)

+ C

29Η

30BrN

2O 501.1542? βρέθηκε 501,1539.

4-χλωροβενζόλιο Rosamine 4.

1Η NMR (300 MHz, ΟϋΟ

3) δ 7.56 (d, 2Η,

J

= 8,4 Hz), 7,30 (d, 2Η,

J

= 8.4 Hz), 7.26 (d, 2Η,

J

= 9,6 Hz), 7,09 (dd, 2Η,

J

= 9,6, 2,4 Hz), 6,95 (d, 2Η,

J

= 2.4 Hz), 3.74-3.70 (m, 8Η), 1,74 (br, 12Η)?

13C NMR (125 ΜΗζ,

3) δ 158,1, 156,3, 155,1, 136,7, 131,6, 130,8, 130,1, 129,3, 115,0, 113,4, 97,5, 49,2, 25,9, 24,1? λ

max abs 570 nm, λ

max emiss 590 nm, ε 119 100 Μ

-1 εκατοστά

-1, FWHM 38 nm, Φ 0,80 ± 0,02 σε CH

2Cl

2? HRMS (ESI) m /z υπολογισθέν για (Μ-ΟΙ)

+ C

29Η

30ClN

2O 457.2047? βρέθηκε 457,2052.

φουρανίου Rosamine 6.

1Η NMR (500 MHz, ΟϋΟ

3) δ 7,97 (d, 2Η,

J

= 9,7 Hz), 7,92-7,91 (m, 1Η), 7,18 (dd, 2Η,

J

= 9,7, 2,6 Hz), 7.15 – 7.14 (m, 1Η), 6,90 (d, 2Η,

J

= 2,6 Hz), 6,82 – 6,81 (m, 1Η), 3,74 – 3,72 (m, 8Η), 1,76 (br, 12Η)?

13C NMR (125 ΜΗζ,

3) δ 158,2, 156,0, 147,3, 145,7, 142,2, 132,0, 120,5, 115,0, 113,3, 111,8, 97,5, 49,0, 25,9, 24,1? λ

max abs 592 nm, λ

max emiss 627 nm, ε 86900 M

-1 εκατοστά

-1, FWHM 105 nm, Φ 0.38 ± 0.01 στο Χ

2Cl

2? HRMS (ESI) m /z υπολογισθέν για (Μ-ΟΙ)

+ C

27Η

29N

2O

2 413,2229? βρέθηκε 413,2232.

Η ασύμμετρη 4-ιωδοφαινυλ Rosamine 7.

1Η NMR (300 MHz, ΟϋΟ

3) δ 7.96 (d, 2Η,

J

= 8,3 Hz), 7,35-7,29 (m, 2Η), 7.17 – 7.9 (m, 6Η), 3,88 (t, 4Η,

J

= 4,7 Hz), 3,783,71 (m, 8Η) , 1.77 (br, 6Η)?

13C NMR (75 ΜΗζ,

3) δ 158,6, 157,9, 156,9, 156,7, 155,9, 138,2, 131,9, 131,5, 131,1, 131,0, 115,5, 114,6, 114,0, 113,7, 98,6, 97,9, 97,1, 66.4, 49.5, 47.4, 26.1, 24.0? λ

max abs 565 nm, λ

max emiss 586 nm, ε 80900 M

-1 εκατοστά

-1, FWHM 39 nm, Φ 0.52 ± 0.02 στο Χ

2Cl

2? HRMS (ESI) m /z υπολογισθέν για (Μ-ΟΙ)

+ C

28Η

28IN

2O

2 551,1195? βρέθηκε 551,1192.

Η ασύμμετρη Thiofuryl Rosamine 8.

1Η NMR (500 MHz, ΟϋΟ

3) δ 7.69 (dd, 1Η,

J

= 4,8, 1,4 Hz), 7,62 (d, 1Η,

J

= 9,7 Hz), 7,59 (d, 1Η,

J

= 9,7 Hz), 7.26 έως 7.22 (m, 2Η) , 7,19 (dd, 1Η,

J

= 9,7, 2,5 Hz), 7,09 (dd, 1Η,

J

= 9,7, 2,5 Hz), 7,00 (d, 1Η,

J

= 2,5 Hz), 6,90 (d, 1Η,

J

= 2,5 Hz), 3,78 (t, 4Η,

J

= 4,9 Hz), 3,68 – 3,65 (m , 8Η), 1.67 (br, 6Η)?

13C NMR (75 ΜΗζ,

3) δ 158,1, 157,5, 156,6, 156,3, 149,8, 132,2, 132,0, 131,7, 130,6, 130,6 (δύο κορυφές: 130,62, 130,56), 128,2, 115,2, 114,6, 114,3, 114,0, 97,8, 97,2, 66,2, 49,1, 47,2, 25,9, 23,9? λ

max abs 576 nm, λ

max emiss 599 nm, ε 87600 M

-1 εκατοστά

-1, FWHM 42 nm, Φ 0.30 ± 0.01 στο Χ

2Cl

2? HRMS (ESI) m /z υπολογισθέν για (Μ-ΟΙ)

+ C

26Η

27Ν

2O

2S 431.1793? βρέθηκε 431,1795.

Cell Culture και

In Vitro

τηλέφωνα Βιωσιμότητας Δοκιμασία

MCF-7 καρκινώματος μαστού και HCT-116 κυτταρικές σειρές καρκινώματος του παχέος εντέρου ελήφθησαν από την American Tissue Culture Collection ( Virginia, USA) και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. HSC-2 κύτταρα της στοματικής κοιλότητας του ανθρώπου πλακώδους καρκινώματος ελήφθησαν από Health Science Research Τράπεζα Πόρων (Ιαπωνία). HK-1, ένα παρελθόν που χαρακτηρίζεται ρινοφαρυγγικής κύτταρα πλακώδους καρκινώματος [12] είναι ένα δώρο από τον καθηγητή Wong Y.C. από το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μέσο ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Για τη δοκιμασία βιωσιμότητας κυττάρων, τα κύτταρα σε 4000 κύτταρα /φρεάτιο σε 80 μΐ μέσου εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με κάθε ένωση σε συγκεντρώσεις κυμαινόμενες από 0.001-10 μΜ δίνοντας τον τελικό όγκο 100 μΐ σε κάθε φρεάτιο. Στο τέλος της περιόδου επώασης, 15 μΙ 5.0 mg /ml ΜΤΤ εντός ρυθμισμένου με φωσφορικά αλατούχου διαλύματος (PBS) προστέθηκε και επωάστηκε για 4 ώρες. Medium και υπερβολική ΜΤΤ αναρροφήθηκαν και το προκύπτον φορμαζάνη διαλύθηκε με 100 μλ διμεθυλοσουλφοξειδίου. Η απορρόφηση διαβάστηκε στα 570 nm με SpectraMax M4 μικροπλάκας φασματοφωτόμετρο (Molecular Devices, CA).

NCI-60 ανθρώπινα καρκινικά Κυτταρικής Γραμμής

Screen

NCI-60 διαλογή πίνακα κυττάρου διεξήχθη από το NCI /National Institutes of Health αναπτυξιακό πρόγραμμα θεραπευτικά (Bethesda, Η.Π.Α.). Η πλατφόρμα αυτή επιτρέπει τον προσδιορισμό των προφίλ αναστολής αύξησης των ενώσεων δοκιμής σε 60 διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, που αντιπροσωπεύουν λευχαιμία, μελάνωμα και τους καρκίνους του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του κεντρικού νευρικού συστήματος, των ωοθηκών, του μαστού, του προστάτη, και η νεφρική υποπίνακα. δοκιμασία σουλφοροδαμίνη Β χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας των παραγόντων δοκιμής σε ένα πάνελ 60 κυτταρικές γραμμές [13]. Εν συντομία, τα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών του πίνακα ελέγχου του καρκίνου αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 5% FBS και 2 mM L-γλουταμίνη. Για ένα τυπικό πείραμα διαλογής, τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες των 96 φρεατίων σε 100 μλ σε πυκνότητες επιμετάλλωσης ανάλογα με τον χρόνο διπλασιασμού των επιμέρους κυτταρικών γραμμών. Μετά τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων, οι πλάκες μικροτίτλου επωάζονται στους 37 ° C, 5% CO

2 και 100% σχετική υγρασία για 24 ώρες. Μετά την επώαση, υποπολλαπλάσια κλάσματα των 100 μΐ της ένωσης σε διαφορετικές αραιώσεις προστέθηκαν στα κατάλληλα φρεάτια μικροτίτλου και επωάστηκαν περαιτέρω για 48 h. Στο δοκιμασία τελικού σημείου, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με τριχλωροοξεικό οξύ που ακολουθείται από χρώση σουλφοροδαμίνη Β για περιεκτικότητα κυτταρικής πρωτεΐνης. Σουλφοροδαμίνη Β απορρόφηση μετρήθηκε σε μήκος κύματος 515 nm ως μία μέτρηση της κυτταρικής πυκνότητας.

μιτοχόνδρια Απομόνωση και διαλυτοποίηση με απορρυπαντικό

λειτουργικά μιτοχόνδρια απομονώθηκαν από ήπαρ ποντικού με την μέθοδο διαφορική φυγοκέντρηση [14]. Εν συντομία, ένα ποντίκι (~ 30 g) στερήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας πριν από θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση. Το ήπαρ συλλέχθηκε αμέσως και ξεπλένεται με ρυθμιστικό παγωμένου μιτοχόνδρια απομόνωση (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA /Tris, 0.2 Μ σακχαρόζη, ρΗ 7.4) μέχρις ότου το αίμα-free. Το ήπαρ στη συνέχεια κόπηκε σε μικρά κομμάτια σε ένα ποτήρι χρησιμοποιώντας ψαλίδι, διατηρώντας παράλληλα σε ένα λουτρό πάγου. Το ρυθμιστικό αντικαταστάθηκε με 5 ml φρέσκου ρυθμιστικού απομόνωσης και το ήπαρ ομογενοποιήθηκε με έναν ανιχνευτή Polytron (Ultra-Turrax Τ8, ΙΚΑ-Werke, Γερμανίας) μέχρι να γίνει λείο. Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε στα 1000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το σφαιρίδιο απορρίφθηκε και το υπερκείμενο φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C για την κατακρήμνιση των μιτοχονδρίων. Τα μιτοχόνδρια πλύθηκαν δύο φορές με επαναιώρηση σε 4 όγκους ρυθμιστικού απομόνωσης που περιέχει αναστολέα κοκτέιλ 1 × πρωτεάσης. Η συγκέντρωση της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford (δοκιμασία πρωτεΐνης Biorad). Τα μιτοχόνδρια καταψύχθηκαν σε 10 mg /ml υποπολλαπλάσιο στους -80 ° C.

Απορρυπαντικό διαλυτοποίηση των πρωτεϊνών μιτοχόνδρια έγινε πριν από τη μέτρηση της ενεργότητας συμπλοκών οξειδωτική φωσφορυλίωση. Τα μιτοχόνδρια αραιώθηκαν σε 5.5 mg /ml με PBS και διαλυτοποιήθηκαν με την προσθήκη ενός /10ου του όγκου του απορρυπαντικού 1 παρέχονται για να δώσει την τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης 5 mg /ml. Το μίγμα επωάστηκε σε πάγο για 30 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στα 17 000 g στους 4 ° C για 20 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και αραιώθηκε σε κατάλληλη συγκέντρωση για κάθε οξειδωτική δραστηριότητα σύμπλοκα φωσφορυλίωση.

Μέτρηση της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης Συγκροτήματα Δραστηριότητα

Οι μετρήσεις των δραστηριοτήτων φωσφορυλίωσης μιτοχονδρίων οξειδωτικό για Complex I, II, IV και ΑΤΡ- συνθάσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας την μικροπλάκα ανοσοσύλληψης κιτ δοκιμασίας ELISA σύμφωνα με τα πρωτόκολλα αντίστοιχο κατασκευαστή τους [15]. Σε γενικές γραμμές, η πλάκα προ-επικαλυμμένη με κατάλληλο αντίσωμα ανοσοσύλληψης επωάστηκε με μιτοχόνδρια εκχύλισμα στις συνιστώμενες συγκέντρωση για να επιτρέψει την ακινητοποίηση των αντίστοιχων συμπλόκων τους. Συγκροτήματα δραστικότητα μετρήθηκε με προσθήκη του μίγματος διαλύματος υποστρωμάτων που παρέχονται με το κιτ και η ένωση προστέθηκε σε συγκέντρωση που κυμαίνεται από 0.01-10 μΜ εις τριπλούν. Φρεάτια ελέγχου έλαβαν θεραπεία με μόνο 0,1% DMSO (ν /ν) και τα φρεάτια χωρίς επώαση εκχύλισμα μιτοχόνδρια συμπεριλήφθηκαν ως πλαίσιο αναφοράς. Η κινητική του δραστηριότητα συγκροτήματα καταγράφηκε με SpectraMax M4 ανάγνωσης μικροπλάκας φασματοφωτόμετρο χρησιμοποιώντας τις προτεινόμενες παραμέτρους μέτρησης.

JC-1 Ανάλυση της μιτοχονδριακής μεμβράνης Πιθανές

Το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης μετρήθηκε με βάση τις δυνατότητες εξαρτώμενη συσσώρευση του κατιονικού JC-1 βαφή η οποία έχει ως αποτέλεσμα μια μετατόπιση της εκπομπής φθορισμού από το πράσινο (~525 nm) έως το κόκκινο (~590 nm) λόγω του σχηματισμού του J-συσσωματωμάτων [16]. Ως εκ τούτου, μιτοχονδριακή αποπόλωση υποδεικνύεται από μια μείωση στην αναλογία κόκκινο πράσινο /ένταση φθορισμού. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και εναιωρήθηκαν σε 1 ml θερμό μέσο σε περίπου 1 × 10

6 κυττάρων /ml. Σε έναν σωλήνα ελέγχου, 1 μΙ 50 mM CCCP προστέθηκε και επωάστηκε στους 37 ° C για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, 10 μΐ 200 μΜ JC-1 προστέθηκε στα κύτταρα και επωάστηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με θερμό PBS, επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ PBS και αναλύθηκαν σε ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur χρησιμοποιώντας 488 nm διέγερση φίλτρα με 530/30 nm και 585/42 nm ζωνοπερατού εκπομπή.

In Vivo

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα

αλλομοσχεύματα όγκων ξεκίνησαν με υποδόρια ένεση 5 × 10

5 4Τ1 καρκίνωμα μαστού ποντικού σε 0,1 ml RPMI 1640 στα βουβωνικό μαστικά λιπώδη ταμπόν ποντικών [17]. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε και θεραπείες άρχισαν όταν οι όγκοι έφθασαν περίπου όγκο 200 mm

3. Για να εκτιμηθεί η αναστολή της ανάπτυξης του όγκου, 4Τ1 ποντικών που φέρουν όγκο τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες με τουλάχιστον οκτώ ζώα ανά ομάδα. Η ένωση 5 παρασκευάστηκε σε 0.3 mg /ml σε φυσιολογικό ορό και θεραπεία χορηγήθηκε ενδοφλεβίως σε δόση 5 mg /kg κατά την ημέρα ενάρξεως ή 3 mg /kg κάθε δεύτερη ημέρα για έξι αγωγές (Q2Dx6). Για την ομάδα ελέγχου, κανονικό αλατόνερο δόθηκε. Ο όγκος βάρη των ζώων και των όγκων μετρήθηκαν τρεις φορές την εβδομάδα για 14 d. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση: (μήκος Χ πλάτος

2) /2 και σχετικός όγκος του όγκου (RTV) υπολογίστηκε για κάθε όγκου του όγκου σε κάθε δεδομένη στιγμή (V

Τ) κατά του όγκου του όγκου κατά στάσης ημέρα (V

0) χρησιμοποιώντας την εξίσωση: V

T /V

0. Το RTV – Προφίλ χρόνου για κάθε ομάδα απεικονίζονται και καθυστέρηση ανάπτυξης του όγκου για την επίτευξη συγκεκριμένου αριθμού διπλασιασμών σύγκριση με τον έλεγχο προσδιορίσθηκε [18], [19]. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως διάμεση διάστημα εμπιστοσύνης ± 95% (n = 8).

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA

post hoc

με δοκιμή Bonferroni (SPSS 16.0, η IBM Corporation, Armonk, NY) και διαφορά θεωρήθηκαν σημαντικές όταν

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Rosamine Ανάλογα

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε δομές em

μεσο

-υποκατεστημένο με 4-ιωδοβενζόλιο 2 και θειοφουράνιο 5 ήταν 5 φορές πιο δραστική από την ένωση φαινύλιο υποκατεστημένο 1. οι ενώσεις 3, 4 και 6 συντέθηκαν να δοκιμαστεί εάν

MESO

-Αντικατάσταση με 4-βρωμοβενζόλιο 3, 4-χλωροβενζόλιο 4 ή 2-φουρυλ 6 ομάδες θα επηρέαζε την αντικαρκινική δράση. Επιπλέον, το 4-ιωδοβενζόλιο 7 ή 2-θειοφουράνιο

μεσο

της υποκατάστατες 8

και

ασύμμετρων υποκαταστατών αμίνη πιπεριδίνη /μορφίνης συντέθηκαν και διερευνήθηκαν. Ροζαμίνες 1-4 και 7 δεν ήταν αισθητά υδατοδιαλυτό έτσι ανασυστάθηκαν σε DMSO σε 10 mM ως απόθεμα θεραπεία. Ροζαμίνες 5, 6 και 8 εύκολα διαλυτοποιούνται σε υδατικά μέσα σε παρόμοιες συγκεντρώσεις, έτσι χρησιμοποιήθηκαν χωρίς DMSO.

In Vitro

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα του Rosamine και NCI-60 Screen

Ο

in vitro

αντικαρκινική δραστικότητα του ροζαμίνες αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία 48 ωρών βιωσιμότητα τελικό σημείο κύτταρο methylthiazolyldiphenyl-τετραζολίου (ΜΤΤ) έναντι μιας ομάδας κυτταρικών σειρών συμπαγών όγκων του ανθρώπου συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος του μαστού (MCF-7), του παχέος εντέρου καρκίνωμα (HCT-116), από του στόματος καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HSC-2) και ρινοφαρυγγικού καρκινώματος (HK-1). Το IC

50 τιμές για αυτά τα ροζαμίνες σε όλον τον πίνακα του καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν κυμαινόταν από 0.07-1.2 μΜ όπως συνοψίζεται στον Πίνακα 1. Από τη μελέτη αυτή, ροζαμίνες φέρει φαινύλιο αλογονίδιο ή ετεροκυκλικά τμήματα ήταν σημαντικά (

P

& lt? 0,05) πιο ισχυρά από φαινύλιο υποκατεστημένο rosamine 1. υποκατάσταση αλογονιδίου οδήγησε σε βελτίωση της κυτταροτοξικότητας? Αυτό ήταν αναμενόμενο λόγω υποκατάσταση

H από

αλογονίδιο χρησιμοποιείται συνήθως για την αύξηση της ένωσης λιποφιλικότητα που βελτιώνει την διαπερατότητα της μεμβράνης λιπίδια διπλής στιβάδας [20]. Στο πλαίσιο της σειράς αλογόνου, κυτταροτοξικότητες αυξάνουν με την ακόλουθη σειρά 4 & gt? 3 & gt? 2 (Cl & gt? Br & gt? Ι), αν και δεν είναι στατιστικά σημαντική (

P

& gt? 0,05). Οι ενώσεις με

meso

-ετεροκυκλικές υποκαταστάτες 5 και 6 ήταν πιο ισχυρές από τα αρωματικά αλογονίδια 2-4. Από τις δύο ενώσεις με το

μεσο

-heterocycles ο θειοφουράνιο-υποκατεστημένη 5 ήταν ελαφρώς πιο δραστικό από 6, η φουραν-υποκατεστημένα μία.

Η

Ενώσεις 7 και 8 έχουν ένα περισσότερο πολικό συνδυασμός υποκαταστάτες αμίνης από το συμμετρικό

δις

πιπεριδίνη 2, και αποδείχθηκε ότι είναι περισσότερο κυτταροτοξικά (Πίνακας 1). Αυτό είναι συνεπές με προηγούμενα δεδομένα μας για 2-methylbenzenes ασύμμετρα υποκατεστημένο με πιπεριδίνη και μορφολίνη η οποία έδειξε σχεδόν 2 φορές χαμηλότερες IC

50 τιμές συγκρίνονται με τη συμμετρική υδρόφοβη δομή που περιέχει μόνο πιπεριδίνη [10]. Εν τω μεταξύ, για το

μεσο

-thiofuran 5, υποκατάσταση μία από τις ομάδες πιπεριδίνη με μορφολίνη δίνει 8, το οποίο έχει μια ελαφρώς

μειώθηκε

δραστηριότητα, σε αντίθεση με τις προσδοκίες μας.

ροζαμίνες μπορεί να εμφανίζουν φωτοτοξικότητα λόγω παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου υπό την παρουσία φωτός. Για να δοκιμαστεί για αυτό, μια διπλή πλάκα ακτινοβολήθηκε με 5,3 J /cm

2 του φωτός ευρέος φάσματος για 2 ώρες μετά τη θεραπεία ένωση παράλληλα με μια πλάκα διατηρείται στο σκοτάδι. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην IC

50 τιμές που ελήφθησαν μεταξύ των δύο ακτινοβολημένα και μη-ακτινοβολημένα πειράματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) δείχνοντας φωτοτοξικότητα δεν ήταν ένα θέμα.

Με βάση τις ανωτέρω διαπιστώσεις, ροζαμίνες 4 ( NSC751819) και 5 (NSC751817) υποβλήθηκαν για NCI-60 ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών όγκου διαλογή για να παρέχουν περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα προφίλ αναστολής αύξησης κατά 60 διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, που αντιπροσωπεύουν λευχαιμία, μελάνωμα και τους καρκίνους του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του κεντρικού νευρικού συστήματος , των ωοθηκών, του μαστού, του προστάτη, και η νεφρική υποπίνακα. Η πλατφόρμα αυτή επιτρέπει ο τρόπος δράσης που πρέπει να συναχθεί από τη σύγκριση με τα πρότυπα ναρκωτικά δραστηριότητα των κλασσικών παραγόντων με γνωστά χαρακτηριστικά στόχευση χρησιμοποιώντας ΣΥΓΚΡΙΣΗ (μηχανογραφικό αλγόριθμο αναγνώρισης προτύπων) αναλύσεις [21]. Η GI

50 τιμές που παράγονται από την οθόνη NCI-60 κυτταρικές σειρές έδειξαν ότι τόσο rosamine 4 και 5 παρουσίασαν ισχυρά αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα με Σύνδεση

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 μΜ) και ήταν ιδιαίτερα περισσότερο αποτελεσματικό ενάντια σε μια υπο-ομάδα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Εικ. 3). ΣΥΓΚΡΙΣΗ αναλύσεις έδειξαν ότι και τα δύο αυτά ροζαμίνες είχαν παρόμοια πρότυπα δραστηριότητας με το ιώδες του μεθυλίου (NSC271967), μια χρωστική κατιονικές τριαρυλομεθανίου το οποίο έχει προηγουμένως χρησιμοποιηθεί στην ιατρική για την αντιμικροβιακή, αντιμυκητιακή και antihelmintic ιδιότητες. Η κατηγορία αυτή των βαφών είχε δειχθεί ότι προάγει μιτοχονδριακής αναπνευστικής αναστολής αναστέλλοντας τη σύνθεση ΑΤΡ, διαλύοντας μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικού και την επαγωγή της μιτοχονδριακής διαπερατότητας μετάβαση [22], [23]. Έτσι, η οθόνη NCI-60 κυτταρικές γραμμές αναφέρονται οι ενώσεις που δοκιμάστηκαν είχαν μια υπογραφή μοναδικό για ενέργεια αντικαρκινικούς παράγοντες μεταβολισμό-στόχευσης.

GI

50 (50% αναστολή ανάπτυξης) μέση γραφημάτων που δείχνουν τα πρότυπα δραστηριότητας του 4, 5 και το ιώδες του μεθυλίου (NSC271967) στις NCI-60 οθόνες κυτταρική σειρά. Τόσο οι ροζαμίνες εμφάνισε ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική αποτελέσματα με Σύνδεση

10GI

50 = -7 (GI

50 = 0,1 μΜ) και ήταν ιδιαίτερα πιο αποτελεσματικά έναντι του ορθοκολικού καρκίνου πίνακα. ΣΥΓΚΡΙΣΗ αναλύσεις έδειξαν 4 και 5 έχουν παρόμοιο πρότυπο της δραστηριότητας όπως ιώδες του μεθυλίου με Pearson τιμές συντελεστή συσχέτισης 0,767 και 0,72, αντίστοιχα.

Η

ροζαμίνες παρενέβαινε η ενέργεια Redox

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι ροζαμίνες εντοπίζεται κυρίως στα μιτοχόνδρια [10] και ότι η συσσώρευση των κυτταροτοξικών DLC είναι γνωστό ότι μεταβάλλουν μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό [24], [25]. Έτσι, οι μεταβολές του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης που προκαλείται από ροζαμίνες 2 και 5 παρακολουθήθηκαν με βάση την συσσώρευση του JC-1 βαφή εξαρτάται από το δυναμικό που οδήγησε σε μετατόπιση της εκπομπής φθορισμού από το πράσινο (~525 nm) έως το κόκκινο (~590 nm) εξαιτίας στο σχηματισμό J-συσσωματωμάτων. Από τη μελέτη, τα κύτταρα HSC-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 2 στα 0,1 μΜ, 9% του πληθυσμού των κυττάρων εμφάνισαν την έναρξη της μιτοχονδριακής διαμεμβράνης πιθανή απώλεια μέσα σε 1 ώρα μετά τη θεραπεία και σταδιακά αυξήθηκε σε 19% (

P

& lt? 0.05) σε 8 ώρες (Εικ. 4). Εν τω μεταξύ, το μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό απώλεια ήταν πιο εμφανείς στα κύτταρα HSC-2 που έλαβαν θεραπεία με 5 στα 0.1 μΜ. Περίπου 21% (

P

& lt? 0,05) του κυτταρικού πληθυσμού επηρεάστηκε κατά την πρώτη ώρα και το ποσοστό αυξήθηκε δραματικά σε 34% σε 8 ώρες. Για τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, ο πληθυσμός των κυττάρων αποπολωμένο στις 8 ώρες παρέμεινε περίπου 8%. Εν τω μεταξύ, τα κύτταρα σε επεξεργασία με 5 μΜ του CCCP για 5 λεπτά είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια του δυναμικού της μεμβράνης σε 70% (

P

& lt? 0,05) του κυτταρικού πληθυσμού. CCCP είναι ένας παράγων αποσύνδεσης της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης το οποίο δρα ως ένας θετικός έλεγχος για το πείραμα.

Αντιπροσωπευτικά περίπτωση μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού απώλεια σε κύτταρα HSC-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 2 και 5 στα 0.1 μΜ. Μετά από 8 ώρες επεξεργασίας με 2 και 5, το ποσοστό του πληθυσμού των κυττάρων με μιτοχονδριακό διαμεμβρανικό δυναμικό απώλεια αυξήθηκε σε 19% και 34%, αντίστοιχα. Το ποσοστό αποπολωμένο κύτταρο του μη επεξεργασμένου ελέγχου σε 8 ώρες παραμένει στο 8%, ενώ για θετικό έλεγχο, κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 5 μΜ καρβονυλ κυανιούχου 3-χλωροφαινυλυδραζόνη (CCCP) για 5 λεπτά καταλήγει σε 70% του πληθυσμού αποπολωμένα κυττάρων. * Διαφορά με

P

-τιμή & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο σε 0 h

Η

Για την περαιτέρω κατανόηση της αναστολής μιτοχόνδρια χαρακτηρίστηκε από τις ροζαμίνες, η επίδρασή τους στην οδό οξειδωτική φωσφορυλίωση διερευνήθηκε . Χρησιμοποιώντας ανοσοσύλληψης δοκιμασία μικροπλάκας ELISA, το ένζυμο κινητική της μιτοχονδριακής φορείς οξειδοαναγωγής Complex I, II Complex, Συγκρότημα IV και ΑΤΡ-συνθετάση παρακολουθήθηκαν κατά την επεξεργασία με 2 ή 5. Η δραστηριότητα του Complex II (Εικ. 5Β) ανεστάλη μερικώς από 5 με IC

50 αξίας 9,6 ± 0,1 μΜ, ενώ για 2, παρατηρήθηκε αναστολή, αλλά δεν φθάσει το 50% έως μέγιστες συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν. Εν τω μεταξύ, και οι δύο 2 και 5 εμφανίζεται η αναστολή των δραστηριοτήτων συνθάσης ΑΤΡ (Σχ. 5D) με IC

50 τιμές των 3,9 ± 0,3 μΜ και 3,0 ± 0,8 μΜ αντιστοίχως. Η δραστηριότητα του συγκρότημα Ι και IV Complex (Σχ. 5Α και 5C) δεν επηρεάστηκαν από τις ροζαμίνες σε συγκεντρώσεις μέχρι το μέγιστο που χρησιμοποιείται, 10 μΜ. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ροζαμίνες 2 ή 5 συμβιβασμό μιτοχονδριακό βιοενεργειακό κυρίως αναστέλλοντας ΑΤΡ συνθάσης, ένα ένζυμο πρωτονίων με γνώμονα που παράγει ΑΤΡ από ADP και ανόργανα φωσφορικά άλατα. Παρόμοια αλληλεπίδραση βιοχημική παρατηρήθηκε σε ροδαμίνη-123 και το αποτέλεσμα αυτό είναι αναμενόμενο καθώς η ένωση έχει στενή δομική ομοιότητα με τις ροζαμίνες [26].

Η αναστολή δόσης-απόκρισης του μιτοχονδριακού οξειδωτική φωσφορυλίωση Complex 1 (Α), Complex