Αφηρημένο

APE1 /Ref-1 είναι ένας κύριος ρυθμιστής της κυτταρικής απόκρισης στο οξειδωτικό στρες

μέσω

λειτουργία επιδιόρθωσης DNA και συν-ενεργοποίηση δραστηριότητα μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ. APE1 είναι κεντρικής σημασίας για τον έλεγχο των οξειδωτικό στρες που βασίζεται φλεγμονωδών διεργασιών μέσω διαμόρφωσης της έκφρασης κυτοκινών και η υπερέκφραση της είναι υπεύθυνη για την έναρξη της χημειοαντίσταση σε διαφορετικούς όγκους, συμπεριλαμβανομένων καρκίνο του ήπατος. Εξετάσαμε το λειτουργικό ρόλο των APE1 υπερέκφραση κατά τη διάρκεια της ηπατικής βλάβης των κυττάρων που σχετίζονται με την συσσώρευση των λιπαρών οξέων και το ρόλο της λειτουργίας οξειδοαναγωγής του APE1 στη φλεγμονώδη διεργασία. κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν σταθερώς με λειτουργικές και μη λειτουργικές κωδικοποιεί πλασμίδια APE1 και την προστατευτική επίδραση του APE1 υπερέκφρασης προς γονιδιοτοξικές ενώσεις ή συσσώρευση ΕΧΟ, ελέγχθηκε. κύτταρα JHH6 διεγέρθηκαν με ΤΝΡ-α με την παρουσία ή απουσία του E3330, έναν αναστολέα οξειδοαναγωγής APE1. δραστικότητα προαγωγέα IL-8 αξιολογήθηκε με ένα λουσιφεράσης δοκιμασία ρεπόρτερ, η γονιδιακή έκφραση με πραγματικού χρόνου PCR και κυτοκίνες (IL-6, IL-8, IL-12) επίπεδα μετρήθηκαν με ELISA. APE1 υπερέκφραση δεν εμπόδισε κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από τη συσσώρευση λιπιδίων. θεραπεία E3330 εμπόδισε την λειτουργική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ

μέσω

τη μεταβολή της APE1 υποκυτταρικής κυκλοφορίας και μειωμένη IL-6 και IL-8 έκφραση επάγεται από τον TNF-α και συσσώρευση ΕΧΟ μέσω απόφραξη του οξειδοαναγωγής διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της NF-κΒ. APE1 υπερέκφραση που παρατηρείται σε ηπατικό καρκινικά κύτταρα μπορεί να αντανακλούν μια προσαρμοστική απόκριση σε βλάβη των κυττάρων και μπορεί να είναι υπεύθυνη για την περαιτέρω κύτταρο ανθεκτικότητα σε χημειοθεραπεία και για την έναρξη της φλεγμονώδους απόκρισης. Η αποτελεσματικότητα της αναστολής της δραστηριότητας οξειδοαναγωγής APE1 στην αναστολή του TNF-α και ΕΧΟ που προκαλείται από φλεγμονώδη απόκριση ανοίγει νέες προοπτικές για τη θεραπεία της φλεγμονώδους-based ασθενειών του ήπατος

Παράθεση:. Cesaratto L, Codarin Ε, Vascotto C, Leonardi A , Kelley MR, Tiribelli C, et al. (2013) Ειδική Αναστολή της Redox Δραστικότητα Ape1 /Ref-1 από E3330 Blocks TNF-Α-Induced Ενεργοποίηση της παραγωγής IL-8 στον καρκίνο του ήπατος Κυτταρικές Γραμμές. PLoS ONE 8 (8): e70909. doi: 10.1371 /journal.pone.0070909

Επιμέλεια: Gordon Langsley, Institut national de la Santé et de la recherche médicale – Institut Cochin, Γαλλία

Ελήφθη: 11 Μαρτίου του 2013? Αποδεκτές: 24 του Ιούν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Αυγ του 2013

Copyright: © 2013 Cesaratto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα που οδηγεί σε αυτά τα αποτελέσματα έχει λάβει χρηματοδότηση από το έβδομο πρόγραμμα-πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Ένωσης (FP7 /2007-2013) στο πλαίσιο της συμφωνίας επιχορήγησης Υγεία-F2-2009-241762, για το πορτάκι του έργου και από επιχορηγήσεις από Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (IG10269) και Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) (FIRB_RBRN07BMCT) σε GT. Οικονομική υποστήριξη για το έργο αυτό είχε προβλεφθεί από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας NCICA121168, CA114571 και του Ιδρύματος του Riley Παιδική να MRK. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και δηλώνουν ότι δεν έχουν καμία σύγκρουση συμφερόντων, με την εξαίρεση του Δρ Mark R. Kelley, ο οποίος είναι ο επικεφαλής των επιστημονικών ιδρυτής και σύμβουλος για Apex Therapeutics, μια εταιρεία που έχει άδεια IP από τη δουλειά του. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) ορίζει μια ξεχωριστή ηπατική διαταραχή που παρατηρείται σε ασθενείς χωρίς ιστορικό κατάχρησης αλκοόλ που μοιάζει με ιστολογικά αλκοόλ που προκαλείται από βλάβη του ήπατος και περιλαμβάνει κυτταρική βλάβη, φλεγμονή και ίνωση [1] και μπορεί να εξελιχθεί προς κίρρωση, ηπατική ανεπάρκεια και HCC [2]. Οι μηχανισμοί αυτής της εξέλιξης και την παθογένεση της NASH δεν είναι επαρκώς κατανοητές αν και το οξειδωτικό στρες, που παράγεται ως συνέπεια της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας, φαίνεται να συνδέεται άμεσα με την έναρξη των φλεγμονωδών κυκλωμάτων υπεύθυνες για την εξέλιξη αυτής της παθολογίας. Ένα από τα βασικά προ-φλεγμονωδών κυτοκινών που φαίνεται να εμπλέκεται στην ρύθμιση της φλεγμονώδους απόκρισης σε διάφορες μορφές ηπατικής βλάβης είναι η ιντερλευκίνη-8 (IL-8) [3], μία χημειοκίνη CXC, ότι προσλαμβάνει και ενεργοποιεί τα ουδετερόφιλα, βασεόφιλα και Τ κύτταρα [4]. Δεδομένου ότι οι ασθενείς με NASH έχουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα στον ορό του IL-8 σε σύγκριση με υγιή άτομα, η IL-8 μπορεί να παίξει ένα ρόλο κλειδί στην παθογένεση της NASH [5]. Σε διαφορετικές ηπατική

in vitro

μοντέλα, συσσώρευση λιπιδίων μπορεί να διεγείρει παραγωγή IL-8 [6] μέσω της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ [7]. Στο ήπαρ του αρουραίου, ελεύθερα λιπαρά οξέα (FAS) ενεργοποιούν το μονοπάτι ΝΡ-κΒ και αυξάνουν την έκφραση ορισμένων προ-φλεγμονωδών κυτοκινών (ΤΝΡ-α, IL-1β, IL-6) [8], [9].

Ο συντελεστής τελεστή απουρινική απυριμιδινικές Ενδονουκλεάση /Redox 1 (APE1 /Ref-1) είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη που δρα ως κύριος ρυθμιστής της κυτταρικής απόκρισης σε οξειδωτικές συνθήκες στρες και συμβάλλει στη διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιώματος. APE1 εμπλέκεται τόσο η επισκευή βάσης εκτομή (BER) οδοί των αλλοιώσεων του DNA, που ενεργεί ως το κύριο απουρινική /απυριμιδινική (AP) ενδονουκλεάση, και στην μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, ως οξειδοαναγωγικό συν-ενεργοποιητή διαφορετικών παραγόντων μεταγραφής, όπως ΝΡ κΒ και άλλοι [10], [11]. Στο γαστρικό επιθηλιακά κύτταρα APE1 διαδραματίζει ηγετικό ρόλο στον έλεγχο της εμφάνισης οξειδωτικού στρες φλεγμονώδεις διεργασίες που βασίζονται μέσω διαμόρφωσης NF-κΒ με τη μεσολάβηση της έκφρασης του γονιδίου της IL-8 [12]. έκφραση APE1 είναι επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω κατά τη διάρκεια της ηπατικής συσσώρευσης λιπιδίων σε ασθενείς NASH [13], αν και είναι ακόμα άγνωστο εάν αυτό προς τα πάνω ρύθμιση έχει έναν αιτιώδη ρόλο στην έναρξη της NASH ή συνδέεται με μια προστατευτική λειτουργία σε λιπιδική συσσώρευση κυτταροτοξική δράση.

APE1 υπερεκφράζεται σε καρκίνους του ήπατος [14], αλλά ο λειτουργικός ρόλος αυτής της υπερέκφρασης στην παθογένεση και την εξέλιξη του όγκου δεν είναι ακόμη σαφής. λειτουργία οξειδοαναγωγής APE1 ασκείται μέσω ενός νέου οξειδοαναγωγής με βάση μηχανισμού που περιλαμβάνει τρία υπολείμματα κυστεΐνης (δηλαδή C65, C93 και C99) [15]. Πρόσφατες

in vitro

μελέτες έδειξαν ότι APE1 υιοθετεί διαφορετικές εκτυλίχθηκε διαμορφώσεις ανάλογα με την κατάσταση οξειδοαναγωγής των υπολειμμάτων της Cys [15]. Το (Ε) -3- (2- [5,6-διμεθοξυ-3-μεθυλ-1,4-βενζοκινονυλ]) – 2-εννεϋλο προπενοϊκό οξύ (E3330), έχει αναφερθεί ότι συνδέεται άμεσα APE1 πρωτεΐνη και να αναστέλλουν οξειδοαναγωγής του δραστηριότητα, χωρίς να παρεμβαίνει με ενδονουκλεάση δραστηριότητα, αυξάνοντας το σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών περιλαμβάνει την οξειδοαναγωγική ενεργό Cys65, μεταβάλλοντας την αναδίπλωση του APE1 πρωτεΐνης και μειώνοντας την πρωτεΐνη redox ενεργού πληθυσμού [16], έτσι επιδρούν στην APE1 υποκυτταρικό διακίνηση [17]. E3330 κατέχει κλινικές θεραπευτικές δυνατότητες ως ειδικός αναστολέας της APE1 λειτουργία οξειδοαναγωγής [18]. Η σημασία αυτής της λειτουργίας τονίζεται από τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι το ΝΡ-κΒ-διαμεσολαβούμενη γονιδιακή έκφραση ρυθμίζεται από δραστικότητα οξειδοαναγωγής APE1, χωρίς επιπτώσεις στην αποικοδόμηση ΙκΒα [19]. E3330 βρέθηκε επίσης ότι αναστέλλει επιλεκτικά την ανάπτυξη /μετανάστευση των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παγκρέατος [20], υποδηλώνοντας ότι η λειτουργία οξειδοαναγωγής APE1 θα μπορούσε να αποτελέσει ένα καλό υποψήφιο για την αναστολή της εισβολής όγκου και μετάσταση. E3330 καταστέλλει την φλεγμονώδη απόκριση σε ενεργοποιημένα μακροφάγα [21], υποδεικνύοντας την πιθανή χρήση E3330 για τη μείωση των φλεγμονωδών διεργασιών σε ασθένειες του ήπατος, όπως αυτές που συνδέονται με NASH.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε

in vitro

μοντέλα του λίπους υπερφόρτωση που λαμβάνεται με έκθεση ηπατικά κύτταρα σε ένα μίγμα μακριάς αλυσίδας ΕΧΟ (παλμιτικό (C16:0) και ελαϊκό (C18:1) οξέα που είναι το πιο άφθονο ΕΧΟ στο ήπαρ τριγλυκερίδια [22], [23 ]. Επιπροσθέτως, η παρούσα μελέτη αποσκοπούσε στην εξέταση του λειτουργικού ρόλου του APE1 υπερέκφραση κατά τη διάρκεια της ηπατικής βλάβης των κυττάρων που σχετίζονται με τη συσσώρευση λιπιδίων και τον ρόλο της λειτουργίας οξειδοαναγωγής του APE1 στη φλεγμονώδη διαδικασία που ενεργοποιείται από τον TNF-α και τη συσσώρευση FAS. τα δεδομένα μας καταδεικνύουν ότι APE1 υπερέκφραση δεν προστατεύει από ΕΧΟ προκαλούμενη βλάβη των κυττάρων και ότι APE1 και NF-κΒ παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην ΤΝΡ-α επαγόμενη μεταγραφική ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου IL-8 σε ηπατική καρκινικές κυτταρικές σειρές. η αναστολή της δραστηριότητας οξειδοαναγωγής APE1 από την οξειδοαναγωγική αναστολέας E3330 είναι αποτελεσματική στην πρόληψη τόσο ΤΝΡ-α ή συσσώρευση λιπιδίων επαγόμενη ενεργοποίηση της IL-8 έκφραση στο μεταγραφικό επίπεδο μέσω της απόφραξης του redox-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση του NF-κΒ.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και θεραπείες

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το Huh-7 (διαφοροποιημένα ηπατοκύτταρα που προέρχονται κυτταρική σειρά κυτταρικό καρκίνωμα) [24], η HepG2 (διαφοροποιείται ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα) [25] και η JHH6 ( αδιαφοροποίητο καρκίνωμα στο ήπαρ) [26], όπως τα μοντέλα της ογκογόνο διαδικασία ήπαρ. Huh-7 και JHH6 αγοράστηκαν από την Health Science Research Τράπεζα Πόρων (Osaka, Ιαπωνία) ενώ HepG2 από την ATCC. Huh-7 και HepG2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (EuroClone, Pero, IT), κύτταρα JHH6 καλλιεργήθηκαν σε μέσο Ε του William (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ), και οι δύο συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (EuroClone, Μιλάνο, Ιταλία).

κλώνους κυττάρων HepG2 καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 70.000 κυττάρων /cm

2 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές δόσεις μεθυλ μεθανοσουλφονικό (MMS) ή 2,5 mM h

2O

2 (και τα δύο αντιδραστήρια διανέμονται από Sigma-Aldrich) για 2 ώρες ή 1 ώρα αντίστοιχα.

για τη θεραπεία ετοποσίδη, HepG2 κυτταρικοί κλώνοι θρυψινοποιήθηκαν και 400.000 κύτταρα σπάρθηκαν επί γυάλινων καλυπτρίδων σε πλάκες καλλιέργειας 6-πηγαδιών. Μετά από 24 ώρες, το μέσο αντικαταστάθηκε με Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM) με ή χωρίς ετοποσίδη (Sigma, St Louis, ΜΟ) 50 μΜ επί 1 ώρα. (2Ε) -3- [5- (2,3-διμεθοξυ-6-μεθυλ-1,4 βενζοκινουλ)] -2-εννεϋλ-2-προπενοϊκό οξύ (E3330? Έθιμο συντίθεται) [16] διαλυτοποιήθηκε σε DMSO. Η θεραπεία με E3330 πραγματοποιήθηκε σε ελεύθερο ορού μέσο Ε του William, προκειμένου να αποφευχθούν τα επίπεδα λευκωματίνης ορού να επηρεάσει E3330 τελική συγκέντρωση.

Η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TNF-α (Peprotech Inc., Rocky Hill, NJ) ήταν εκτελούνται σε 2000 U /ml σε μέσο Ε άνευ ορού William να ελαχιστοποιήσει IL-8 απελευθέρωση ορού που επάγεται.

για να προκληθεί λίπος-υπερφόρτωση των κυττάρων, κυτταρικών κλώνων JHH6 ή HepG2 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 14.000 και 57000 κύτταρα /cm

2, αντιστοίχως, και μετά από 24 ώρες τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ένα μίγμα ΕΧΟ μακράς αλυσίδας (ελαϊκό και παλμιτικό) σε 2:01 αναλογία. Στοκ διαλύματα των 100 mM ελαϊκού οξέος (Sigma-Aldrich) και 100 mM παλμιτικό οξύ (Sigma-Aldrich), παρασκευάστηκε σε DMSO, βολικά αραιώνονται σε μέσο Ε του William ή ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης που περιέχει 60 μΜ αλβουμίνη από βόειο ορό (Sigma-Aldrich) για να ληφθούν οι επιθυμητές τελικές συγκεντρώσεις. Με μίγματα ΕΧΟ και αλβουμίνη, η πρόσληψη είναι συνάρτηση του ελεύθερου λιπαρού οξέος (FAS), η οποία είναι η μονομερής μορφή σε ισορροπία με ΕΧΟ λευκωματίνη δεσμευμένη [27].

Δημιουργία APE1 υπερεκφράζουν ηπατικών κυτταρικών σειρών

Για την παραγωγή του APE1 υπερεκφράζουν κυτταρικές γραμμές, ένας φορέας έκφρασης APE1 παράχθηκε με κλωνοποίηση ενός θραύσματος EcoRI-BamHI από pFLAG-CMV-5,1 /APE1 (Sigma, Μιλάνο, Ιταλία) σε p3XFLAG-CMV-14 φορέα (Sigma ). Η APE1

διαγραφή NΔ33 μετάλλαγμα δημιουργήθηκε με PCR και υποκλωνοποίησης από την αλληλουχία cDNA πλήρους μήκους. Ορθότητας της διαδικασίας κλωνοποίησης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA. Στη συνέχεια, τα κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με p3XFLAG-CMV /APE1, η άγριου τύπου APE1 (APE1

WT) και η μετάλλαξη απαλοιφής (APE1

NΔ33), προηγουμένως πέψη με ScaI (Fermentas, St. Leon Rot, Ηνωμένο Βασίλειο )? 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επιλογή με G418 (Invitrogen, Μιλάνο, Ιταλία) για 14 ημέρες και έχουν επιλεγεί για την επίκτητη αντοχή. Ξεχωριστοί κλώνοι απομονώθηκαν με τη χρήση κυλίνδρων κλωνοποίησης κυττάρων (Sigma), μεταφέρθηκε και αναπτύχθηκε κατά βήματα σε 24-φρεατίων, 12-φρεατίων, και οι πλάκες 6 φρεατίων για επέκταση προς 10

7 κύτταρα υπό την παρουσία επιλεκτικό αντιβιοτικό. Ως μάρτυρας, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικοί κλώνοι επιμολύνθηκαν με το p3XFLAG-CMV-14 κενό φορέα. Geneticin (G418) (ΡΑΑ Laboratories GmbH, Pasching, ΑΤ) προστέθηκε στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας σε τελική συγκέντρωση 300 μg /ml κατά τη διάρκεια της κυτταρικής ανάπτυξης. Ολικό κυτταρικό εκχυλίσματα αναλύθηκαν ως προς την έκφραση APE1 με ανοσοκηλίδωση, αποκαλύπτοντας έτσι την έκφραση του έκτοπη σημαία WT και τη μεταλλαγμένη μορφή της πρωτεΐνης.

ΜΤΤ και την ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορισμούς

Για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα του κύτταρα HepG2 υπερεκφράζουν APE1 πρωτεΐνη, ένα 3 (4,5-διμεθυλοθειαζολυλ-2) -2,5 διφαινύλ τετραζολίου (ΜΤΤ) δοκιμασία διεξήχθη [28]. έλεγχος HepG2 και υπερεκφράζουν κλώνοι APE1 σπάρθηκαν σε 96 πλάκες πολλαπλών φρεατίων σε πυκνότητα 70.000 κυττάρων /cm

2 για κάθε φρεάτιο. Την ημέρα μετά, τα κύτταρα επωάστηκαν με MMS ή H

2O

2, όπως υποδεικνύεται. Μετά τις θεραπείες, σε κάθε όγκο του διαλύματος ΜΤΤ καλά 1/10 (4 mg /ml σε PBS) προστέθηκε και επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και ένας ίσος όγκος DMSO προστέθηκε στα κύτταρα και το φορμαζάνη ΜΤΤ διαλύθηκε με σιφώνιο. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε αναγνώστη πλάκας ELISA (Instruments EL808 Ultra Microplate Reader Bio-Tek, Winooski, VT) με ένα τεστ και αναφορά μήκος κύματος 570 και 630 nm, αντίστοιχα.

Για trypan blue πειράματα αποκλεισμού, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 0.08% w /v κυανούν τρυπανίου (Sigma) σε πλήρες μέσο, ​​και μετρήθηκαν μετά από 3-5 λεπτά επώασης.

τα δεδομένα εκφράστηκαν ως ποσοστό των επιζώντων κυττάρων σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο.

MTS δοκιμασία

Η ημέρα πριν από τη θεραπεία, τα κύτταρα JHH6 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 26000 κύτταρα /cm

2. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της θεραπείας από την άποψη της βιωσιμότητας των κυττάρων, η CellTiter 96

® AQ

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού ueous One Λύση κυττάρων (Promega Corporation, Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτή η δοκιμασία περιλαμβάνει μία νέα ένωση τετραζολίου [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο, εσωτερικό άλας? MTS] που βιοανάγεται από κύτταρα σε ένα έγχρωμο προϊόν φορμαζάνης το οποίο είναι διαλυτό στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με ανάγνωση της απορρόφησης στα 490 nm.

κόκκινο του Νείλου χρώση

το λιπιδικό περιεχόμενο σε καλλιεργημένα κύτταρα προσδιορίσθηκε φθορομετρικά χρησιμοποιώντας Nile Red χρώση (Sigma-Aldrich, Μιλάνο, Ιταλία), ένα ζωτικό λιπόφιλη και επιλεκτική φθορίζουσα χρωστική για ενδοκυτταρική συσσώρευση σταγονίδια λιπιδίων [29].

στοκ διαλύματα του κόκκινου του Νείλου (100 ή 1000 μg /ml) σε ακετόνη παρασκευάστηκαν και αποθηκεύτηκαν προστατευμένο από το φως. Χρώση έχει πραγματοποιηθεί επί σταθεροποιημένων κυττάρων (1,5% γλουταραλδεΰδη, 5 λεπτά). μονοστοιβάδες κυττάρων πλύθηκαν δύο φορές με PBS, κατεργάστηκαν για 5 λεπτά με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS και επωάστηκαν για 1 ώρα με κόκκινο του Νείλου διάλυμα για να πραγματοποιηθεί αραίωση 1:100 σε PBS. Μετά κόκκινου του Νείλου θεραπεία, πυρήνες βάφτηκαν με επώαση 5 λεπτών σε 300 ηΜ διάλυμα 4 ‘, 6’-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (DAPI) (Sigma) σε PBS. Οι μονοστοιβάδες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και χρησιμοποιήθηκαν για μικροσκοπία φθορισμού. Ανοσοφθορισμού εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica DM IRB /E, Wetzlar, Γερμανία) στο μήκος κύματος διέγερσης, 450-500 nm και μήκος κύματος εκπομπής & gt?. 528 nm

Προετοιμασία του συνόλου των κυτταρικών εκχυλισμάτων

για την παρασκευή του συνολικά κυτταρολύματα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και φυγοκεντρήθηκαν στις 250 χ

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το σφαιρίδιο πλύθηκε μία φορά με παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν και πάλι όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, και 1% (β /ο) Triton Χ-100 συμπληρωμένο με 1χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma), 0,5 mM φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF), 1 mM NaF και 1 mM Να

3νο

4, σε μία κυτταρική πυκνότητα 10

7 κύτταρα /ml για 30 λεπτά στους 4 ° C. Μετά από φυγοκέντρηση στα 12.000 χ

g

για 30 λεπτά στους 4 ° C, το υπερκείμενο συλλέχθηκε ως σύνολο υλικό κυτταρικής λύσεως. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την Bio-Rad αντιδραστήριο δοκιμασίας πρωτεΐνης (Bio-Rad, Hercules, CA).

Western ανάλυση κηλίδος

Οι αναφερόμενες ποσότητες κυτταρικών εκχυλισμάτων ηλεκτροφορήθηκαν επί ενός 12% SDS -ΣΕΛΊΔΑ. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Schleicher & amp? Schuell, Keene, ΝΗ). Οι μεμβράνες κορεσμένες με επώαση στους 4 ° C όλη τη νύκτα με 5% (β /ο) άπαχο ξηρό γάλα σε PBS-0.1% (β /ο) Tween 20 και κατόπιν επωάστηκαν με το πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-APE1 [17] για 3 ώρες. Μετά από τρεις πλύσεις με PBS-0.1% (β /ο) Tween 20, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντι-κουνελιού Ig συζευγμένη με υπεροξειδάση (Sigma). Μετά από 60 λεπτά επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες πλύθηκαν τρεις φορές με PBS-0.1% Tween 20 και τα στυπώματα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν με χρήση του ECL διαδικασία ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Pierce, Rockford, IL). Η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε με το πολυκλωνικό αντι-β-τουμπουλίνης αντίσωμα (Sigma). Οι κηλίδες ποσοτικά με τη χρήση ενός πυκνομέτρου Chemi DOC XRS (Bio-Rad).

Ανοσοφθορισμός και συνεστιακή ανάλυση

Είκοσι τέσσερις ώρες πριν από το πείραμα, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 4 Χ 10

5 κύτταρα /cm

2, αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες. Για τα πειράματα ανοσοφθορισμού APE1, κυτταρικοί κλώνοι HepG2 σταθεροποιήθηκαν σε 4% (β /ο) παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, διαπερατά επί 5 λεπτά με PBS-0,25% (β /ο) Triton Χ-100 και στη συνέχεια επωάζονται για 30 λεπτά με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) σε PBS (διάλυμα αποκλεισμού) για να εμποδίσει μη ειδική πρόσδεση των αντισωμάτων. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι-FLAG

® Μ2 μονοκλωνικό αντίσωμα-FITC Conjugate (Sigma) αραιωμένο 1:100 σε διάλυμα αποκλεισμού. Μετά την πλύση, ένα δεύτερο στάδιο αποκλεισμού για 30 λεπτά στο σκοτάδι διεξήχθη, και στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 ώρες με το δεύτερο πρωτεύον αντίσωμα, κουνέλι-πολυκλωνικό να ιστόνης Η3 (Ακετυλ Κ18) (Abcam, Cambridge, UK) στο μπλοκάρισμα λύση. Μετά την πλύση, τα κύτταρα επωάστηκαν για 90 λεπτά με δευτερογενές αντίσωμα Alexa Fluor 546-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (1:500? Molecular Probes, Monza, ΙΤ). Τα παρασκευάσματα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές για 5 λεπτά η κάθε μία στο σκοτάδι. Οι πυρήνες αντιχρωματίζεται από 5 λεπτά επώασης σε 300 ηΜ διάλυμα 4 ‘, 6’-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης διυδροχλωρίδιο (DAPI) (Sigma) σε PBS. Τα παρασκευάσματα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS για 5 λεπτά. Οι πλάκες μικροσκοπίου στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε πλάκες με ένα αντιδραστήριο αντι-ξεθωριάζει. Οι καλυπτρίδες οπτικοποιήθηκαν μέσω ενός Leica TCS SP συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία) εξοπλισμένη με ένα λέιζερ 488-nm αργόν, ένα λέιζερ HeNe 543-nm, και ένα αντικειμενικό φθορισμού 63x έλαιο.

για τα πειράματα ανοσοφθορισμού γ-H2A.X, τον έλεγχο και τα κύτταρα ετοποσίδη επεξεργασμένα πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν για 20 λεπτά με 4% (β /ο) παραφορμαλδεΰδη σε PBS, και κατέστησαν διαπερατά επί 5 λεπτά με 0,25% (β /ο) Triton Χ-100 σε PBS. Τα πλακίδια αποκλείστηκαν με 10% (ν /ν) FBS σε PBS, στους 4 ° C, όλη τη νύκτα, επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με αντι-γ-H2A.X αντίσωμα (Stressgen, Αηη Harbor, ΜΙ) και πλύθηκε με 0,1 % (β /ο) Triton Χ-100 σε PBS. Anti-γ-H2A.X αντισώματος χρησιμοποιήθηκαν στα 1:500 αραίωση. Για την ανίχνευση, τα κύτταρα επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα Alexa Fluor-488-επισημασμένο αντι-ποντικού (Invitrogen, Monza, ΙΤ). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα επώαση κυττάρων με 0,3 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) για 5 λεπτά, στους 37 ° C. Τα κύτταρα πλύθηκαν και τοποθετήθηκαν σε Mowiol

® 4-88 (Sigma) συμπληρωμένο με 1:05 DABCO (Sigma) ως αντιδραστήριο αντι-ξεθωριάζει. Εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Η ποσοτικοποίηση των γ-H2A.X εστίες πραγματοποιήθηκε από BD Pathway 855, χρησιμοποιώντας αντικειμενικά 20Χ. Αυτοματοποιημένη ανάλυση εικόνας έγινε με προσαρμόσιμη και ιδιαίτερα ευέλικτα εργαλεία λογισμικού. Πυρηνική όρια παρήχθησαν χρησιμοποιώντας τις εικόνες Hoechst. Οι εικόνες γ-H2A.X αποκτήθηκαν και η ένταση δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό σύστημα BD Pathway ™ εντός των πυρηνικών ορίων

πειράματα παροδικής επιμόλυνσης

Τα κατασκευάσματα της ανθρώπινης IL-8 υποκινητή,. – 1498 /+ 44 hIL-8 /Luc και -162 /+ 44 hIL-8 ΔNF-κΒ /Luc, παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. SE Crowe [30].

Μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν JHH6 εις τριπλούν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 31.000 κυττάρων /cm

2. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 200 ng ολικού DNA (hIL-8 /Luc υποκινητή και pRL-CMV Renilla κατασκευάσματα λουσιφεράσης σε αναλογία 49:1) ανά φρεάτιο, χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το αντιδραστήριο διαμόλυνσης αφαιρέθηκε 4 ώρες μετά την διαμόλυνση και τα κύτταρα επωάστηκαν με πλήρες μέσο για 16 ώρες. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS, προ-επεξεργασμένα με E3330 σε μέσο Ε του William ελεύθερο ορού και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΝΡ-α όπως αναφέρεται στο κείμενο. Τέλος τα κύτταρα λύθηκαν με Dual-Glo

®Luciferase σύστημα προσδιορισμού (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα σήματα φωταύγεια μετρήθηκαν με ένα συντελεστή

TM II μικροπλάκας Πολύτροπες Reader (Turner Biosystems Inc., Sunnyvale, CA). δραστικότητα λουσιφεράσης Firefly κανονικοποιήθηκε στην δραστικότητα της λουσιφεράσης της Renilla.

Real Time PCR

Το ολικό RNA από κύτταρα εξήχθη χρησιμοποιώντας το σύστημα απομόνωσης SV Total RNA (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μονόκλωνο cDNA ελήφθη χρησιμοποιώντας το iScript

TM cDNA Σύνθεση κιτ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με CFX96

Συστήματα TM Real-Time PCR ανίχνευσης (Bio-Rad Laboratories)? Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: IL-8 Για 5′-CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3 ‘, IL-8 Rev 5′-CCTTGGCAAAACTGCACCTT-3′? 18S Για 5’-CTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAG-3 ‘, 18S Rev 5′-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTC-3′? GAPDH Για 5’-CCCTTCATTGACCTCAACTACATG-3 ‘, GAPDH Rev 5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAGC-3′? HPRT Για 5’-AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG-3 ‘, HPRT Rev 5′-GTCTGGCTTATATCCAACACTTCG-3’.

cDNA ενισχύθηκε σε πλάκες 96-φρεατίων χρησιμοποιώντας εκκινητές για IL-8, 18S, GAPDH και HPRT σε ξεχωριστά φρεάτια χρησιμοποιώντας η 2X iQ

TM SYBR

® Πράσινη Supermix (Bio-Rad Laboratories) [100 mM ΚΟΙ? 40 mM Tris-HCl, ρΗ 8.4? 0,4 mM εκάστου dNTP? 50 U /ml iTaq DNA πολυμεράση? 6 mM MgCl

2, SYBR Green Ι, 20 ηΜ φλουορεσκεΐνη, και σταθεροποιητές] και 300 ηΜ συγκεκριμένη έννοια και αντι-νόημα εναρκτήρες σε ένα τελικό όγκο 15 μΐ για κάθε φρεάτιο. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν. Ένα δείγμα χωρίς πρότυπο, ως αρνητικός έλεγχος, και ένα δείγμα με μη retro-μεταγραμμένο mRNA αντί του cDNA πρότυπο, όπως έλεγχος για γονιδιωματικό μόλυνση DNA, συμπεριλήφθηκαν. Οι παράμετροι κυκλοποίησης ήταν: μετουσίωση στους 95 ° C για 10 s και ανασύνδεσης /επέκτασης στους 60 ° C για 30 s (επαναλαμβάνεται 40 φορές). Προκειμένου να επαληθεύσει την ειδικότητα της ενίσχυσης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση τήξη-καμπύλη, αμέσως μετά το πρωτόκολλο ενίσχυσης.

Οι διαλυτές κυτοκίνες αποφασιστικότητα

IL-8 και IL-12 πρωτεΐνη επίπεδα του TNF -α-θεραπεία υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας FlowCytomix (Bender MEDSYSTEMS, Atlanta, GA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

η στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση σχετικά με τα βιολογικά δεδομένα ήταν πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ανάλυσης δεδομένων του Microsoft Excel για

t-test

ανάλυση του Student. P & lt? 0,05 ή P & lt? 0,01 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Η έκφραση της έκτοπης APE1

πρωτεΐνη WT παρέχει ηπατική προστασία των κυττάρων προς γενοτοξική βλάβη

Πρέπει πρώτα. ερεύνησε τις βιολογικές επιδράσεις των APE1 υπερ-έκφραση στα ηπατικά κύτταρα, χρησιμοποιώντας κύτταρα HepG2, σταθερώς υπερ-εκφράζουν την έκτοπη μορφή της πρωτεΐνης άγριου τύπου (APE1

WT) ή μετάλλαξη διαγραφής της (APE1

NΔ33) λείπει η πρώτη 33 υπολείμματα [31]. Οι κυτταρικοί κλώνοι, στην οποία η ενδογενής πρωτεΐνη APE1 συν-εκφράζεται με μια έκτοπη Flag-tagged ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη APE1, αντιπροσωπεύουν ένα πρότυπο υπερέκφρασης την διερεύνηση του ρόλου των λειτουργικών και μη-λειτουργικών πρωτεϊνών APE1 σε λιπίδιο που προκαλείται από κυτταροτοξική δράση και μιμείται την κατάσταση βρέθηκαν σε προχωρημένα στάδια της εξέλιξης του καρκίνου του ήπατος (Εικ. 1Α) [14]. Εμείς χαρακτηρίζεται δύο μοντέλα κυττάρων για APE1 εντοπισμού με ανάλυση ανοσοφθορισμού, αποδεικνύοντας ότι, ομοίως με την ενδογενή πρωτεΐνη, η έκτοπη APE1

WT εντοπίζεται κυρίως στο πυρηνικό διαμέρισμα των κλώνων των κυττάρων HepG2, ενώ η APE1

NΔ33 μετάλλαξη έδειξε μια κατσαρόλα -cellular διανομής και στις δύο κυτταροπλασματικό και πυρηνικό διαμερίσματα, ως συνέπεια της έλλειψης της διμερούς NLS αλληλουχία [32] και όπως έχει ήδη παρατηρηθεί σε άλλα συστήματα κυττάρων (Εικ. 1Β) [33].

Πίνακας Α:. ανάλυση

Western Blot των συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων που προέρχονται από κλώνους σταθερές κυτταρικές HepG2

έχουν σταθερά επιμολυσμένων κλώνων έχουν ληφθεί όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι τμήμα. Δώδεκα μικρογραμμάρια εκχυλισμάτων πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και μετά μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη NC. Η μεμβράνη ανοσοαποτύπωση με αντι-APE1 αντίσωμα. Οι τιμές που αναφέρονται παραπάνω αφορούν με τις αναλογίες των εντάσεων ζώνης μεταξύ εκτοπικά-εκφράζεται και ενδογενή APE1, όπως μετρήθηκε με πυκνομετρία. Η έκτοπη Flag-tagged ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη τόσο στο APE1

WT και την APE1

κλώνους κυττάρων NΔ33 εκφράζεται σε παρόμοιο βαθμό σε διαφορετικές ημέρες καλλιέργειας κυττάρων. α: κλώνοι μετά την έκτη

in vitro

πέρασμα? b: κλώνοι μετά τη δέκατη

in vitro

πέρασμα. Πίνακας Β:

APE1 εντοπισμό εντός κλώνους κυττάρων HepG2

HepG2 κυτταρικών κλώνων μονιμοποιήθηκαν και ανοσοχρώστηκαν για ιστόνης Η3 (κόκκινο) και για Flag-tagged APE1 με ένα αντίσωμα α-Flag (πράσινο).. Συγχωνευθείσας εικόνες (κίτρινο) δείχνουν τον εντοπισμό των APE1

WT μέσα σε πυρήνες κυττάρων και colocalization με ιστόνης Η3. Η διαγραφή μεταλλαγμένο APE1

NΔ33 συνεντοπίζεται με ιστόνης Η3 μέσα σε πυρήνες κυττάρων αλλά δείχνουν επίσης κυτταροπλασματική θετικότητα. Πίνακας C:.

καμπύλη ανάπτυξης κυτταρικών κλώνων HepG2

HepG2 άδειο κλώνος, APE1

WT κλώνο και APE1

NΔ33 κλώνου κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας και κυτταρικής ανάπτυξης 24 φρεατίων παρακολουθήθηκε κάθε δύο ή τρεις ημέρες όπως υποδεικνύεται, με εξαίρεση κυανούν τρυπανίου. APE1

κύτταρα NΔ33 (τρίγωνο) αυξήθηκαν με βραδύτερο ρυθμό από ό, τι το APE1

WT (πλατεία) και τα κενά κλώνους (τελεία). Πίνακας D:.

Η κυτταρική ανάπτυξη με ΜΤΤ χρωματομετρική δοκιμασία

Τριάντα χιλιάδες κύτταρα του ελέγχου (άδειο κλώνος), APE1

WT και APE1

NΔ33 κλώνοι σπάρθηκαν σε φρεάτια εις τετραπλούν σε μικροκαλλιέργειας 96 φρεατίων πλάκα. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε μετά από 72 ώρες καλλιέργειας. δοκιμασίας ΜΤΤ επίσης αποκάλυψε ότι ο κλώνος κυττάρων APE1

NΔ33 έχει ένα χαμηλότερο επίπεδο του πολλαπλασιασμού των κενών και APE1

WT κλώνους. Δεδομένα, που εκφράζεται ως το ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων σε σχέση με τον έλεγχο άδειο κλώνο, είναι τα μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Το πάνελ Ε

:. Επίδραση της MMS στη βιωσιμότητα των κυτταρικών κλώνων HepG2 κυτταρικοί κλώνοι

HepG2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 2 ώρες με 1,6 ή 2,0 mM MMS και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με την χρωματομετρική δοκιμασία ΜΤΤ. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2,0 mM MMS, η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά το APE1

κλώνος NΔ33 κυττάρων αλλά όχι στον κλώνο APE1

WT, υποδηλώνοντας ότι η έκτοπη έκφραση της APE1

WT προστατεύει τα κύτταρα έναντι MMS- που προκαλείται κυτταροτοξικότητας. Τα δεδομένα που δεικνύονται είναι οι μέσες ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Πίνακας ΣΤ:

Επίδραση H

2O

2 στη βιωσιμότητα των HepG2 κυτταρικών κλώνων

. κυτταρικοί κλώνοι HepG2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2.5 mM υπεροξείδιο του υδρογόνου για 1 ώρα, στη συνέχεια η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Μετά από έκθεση σε 2,5 mM H

2O

2 δεν υπάρχει σημαντική μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε για APE1

WT κλώνο σε σύγκριση με άδειο και APE1

κλώνους κυττάρων NΔ33. Τα ιστογράμματα δείχνουν τα μέσα ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. G Πίνακας:

Η ποσοτικοποίηση των γH2A.X εστίες σε απάντηση ετοποσίδη θεραπεία

Οι εστίες γH2A.X ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία και ποσοτικά με ανάλυση εικόνας.. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ετοποσίδη (50 μΜ) για 1 ώρα και ο αριθμός των θραύσεων διπλής έλικος DNA (DSBs) προσδιορίστηκε σε διαφορετικούς χρόνους απελευθέρωσης (0 h, 15 h και 24 h). επίπεδα εστίες γH2A.X παραμένουν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι οι έλεγχοι σε 15 ώρες και 24 ώρες σε ετοποσίδη αντιμετωπίζονται κλώνο APE1

NΔ33 κυττάρων (τρίγωνο). βλάβη του DNA ήταν ασθενέστερη για APE1

κλώνος WT (πλατεία) σε σχέση με άδειο (dot) και APE1

NΔ33 κυτταρικών κλώνων, γεγονός που υποδηλώνει έναν προστατευτικό ρόλο των APE1 υπερέκφραση στην επιδιόρθωση του DNA.

Η

Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την επίδραση της υπερ-έκφραση της APE1

WT και APE1

NΔ33 λειτουργικών μεταλλαγμένων στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Υπερ-έκφραση του APE1

WT προκάλεσαν αυξημένο ποσοστό κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενώ η έκφραση του APE1

μορφή πρωτεΐνης NΔ33 εμφάνισε μία φαινόμενη δυσλειτουργία της κυτταρικής ανάπτυξης σε σύγκριση με το κύτταρο ελέγχου κλώνο (Εικ. 1 C). Τα κύτταρα ελέγχου παρουσίασαν ένα ενδιάμεσο φαινότυπο οφείλεται στην έκφραση μόνο του ενδογενούς πρωτεΐνης APE1. δοκιμές βιωσιμότητας των κυττάρων, αξιολογήθηκε μέσω της ανάλυσης ΜΤΤ, έδειξε ότι η εξασθενημένη πολλαπλασιασμός που παρατηρήθηκε στην APE1

NΔ33 μεταλλαγμένο συσχετίστηκε σε μειωμένο κυτταρικής βιωσιμότητας σε σχέση με τον APE1

WT που εκφράζει τον κλώνο (Σχ. 1D). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η διαγραφή μεταλλαγμένο NΔ33 μπορεί να δράσει ως κυρίαρχη αρνητική μορφή APE1 άμεσα αντίκτυπο στην βιωσιμότητα των κυττάρων, η οποία παρατηρείται και σε άλλα μοντέλα των καρκινικών κυττάρων [17], [34].

Στη συνέχεια δοκιμάστηκε η ικανότητα των APE1 υπερέκφραση να προστατεύουν τα κύτταρα από γονιδιοτοξική θεραπείες, όπως περιγράφεται για άλλα μοντέλα κυττάρου [35], [36], [37] αλλά ποτέ σε ηπατικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, APE1

WT και APE1

κυτταρικοί κλώνοι NΔ33 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το μεθανοσουλφονικό αλκυλιωτικό παράγοντα για το DNA μεθύλιο (MMS) [38], με υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2), ή με ετοποσίδη , η οποία προκαλεί διπλή διάσπαση της έλικας (DSBs) στο DNA. κλώνοι κυττάρων επωάστηκαν με αυξανόμενες δόσεις MMS για 2 ώρες, και η κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Κατά την επεξεργασία με 2.0 mM MMS, η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη στην APE1

NΔ33 εκφράζουν τον κλώνο σε σύγκριση με APE1

WT και κλώνοι ελέγχου (Σχ. 1Ε). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν στην περίπτωση του H

2O

2 όπως genotoxicant (Εικ. 1 F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι σταθερώς υπερ-εκφράζεται APE1

WT προστατεύει τα κύτταρα έναντι γονιδιοτοξικότητα επάγεται από αλκυλίωση κατεργασία και το οξειδωτικό στρες, όπως ήδη παρατηρήθηκε σε άλλες κυτταρικές γραμμές [36].

Στην περίπτωση του DNA διπλής έλικος σπάσει ανάλυση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με 50 μΜ ετοποσίδη, ένας αναστολέας της τοποϊσομεράσης II που προκαλεί κυτταροτοξικές σχηματισμό DSBs [39]. Καθώς η φωσφορυλίωση που συμβαίνουν στο S139 του H2A.X, που ονομάζεται γH2A.X, είναι σημαντικό κατά τη διάρκεια του DNA διπλής έλικας επισκευή και θεωρείται δείκτης της βλάβης των κυττάρων DSBs [40], αναλύσαμε την κινητική της ετοποσίδης επαγόμενης επισκευή DSB από τη διαφορετική κυτταρικοί κλώνοι.