Αφηρημένο

αντίσταση Cisplatin είναι ένας από τους σημαντικότερους λόγους που οδήγησαν στο υψηλό ποσοστό θανάτου από καρκίνο των ωοθηκών. αλληλουχίας μεθυλο-Capture (MethylCap-επόμενα), η οποία συνδυάζει την καθίζηση των μετουσιωμένο DNA με ανασυνδυασμένο περιοχή πρόσδεσης μεθυλο-CpG των MBD2 πρωτεΐνης με NGS, παγκόσμια και αμερόληπτη ανάλυση των παγκόσμιων προτύπων μεθυλίωσης του DNA. Εφαρμόσαμε MethylCap-seq να αναλύσει το γονιδίωμα-ευρεία προφίλ μεθυλίωσης του DNA των ευαίσθητων σισπλατίνη ωοθηκών Α2780 κυτταρική σειρά καρκίνου και ισογονικούς παράγωγο A2780cp ανθεκτική γραμμή. Έχουμε λάβει 21.763.035 πρώτες διαβάζει για την ανθεκτική στα φάρμακα A2780cp κυτταρική γραμμή και 18,821,061reads για την ευαίσθητη κυτταρική σειρά Α2780. Εντοπίσαμε 1224 υπερ-μετουσιωμένο και 1216 μεθυλιωμένος αιτήσεις συντήρησης δεδομένων (διαφορικά μετουσιωμένο περιοχή) σε A2780cp σε σύγκριση με το Α2780. MethylCap-επόμενα δεδομένα μας σε αυτό ωοθηκών ανθεκτικό μοντέλο καρκίνου σισπλατίνη παρείχε μια καλή πηγή για την ερευνητική κοινότητα. Βρήκαμε επίσης ότι A2780cp, σε σύγκριση με το Α2780, έχει χαμηλότερη παρατηρούμενη να αναμένεται μετουσιωμένο αναλογίες CpG, γεγονός που υποδηλώνει μια χαμηλότερη παγκόσμια μεθυλίωσης CpG στα κύτταρα A2780cp. Μεθυλίωσης ειδική PCR και θειώδους αλληλουχίας επιβεβαίωσε υπερμεθυλίωση PTK6, PRKCE και BCL2L1 σε Α2780 σύγκριση με A2780cp. Επιπλέον, η θεραπεία με το αντιδραστήριο απομεθυλίωσης 5-αζα-DC IN Α2780 κύτταρα απομεθυλιωθεί τους φορείς και αποκατέστησε την έκφραση της PTK6, PRKCE και BCL2L1

Παράθεση:. Yu W, Jin C, Lou Χ, Χαν X, Λι L, He Υ, et al. (2011) Παγκόσμια Ανάλυση της μεθυλίωσης του DNA με μεθυλο-Σύλληψη αλληλουχίας αποκαλύπτει Επιγενετική Έλεγχος της Cisplatin Αντίστασης ωοθηκών Cancer Cell. PLoS ONE 6 (12): e29450. doi: 10.1371 /journal.pone.0029450

Επιμέλεια: Matteo Pellegrini, UCLA-DOE Ινστιτούτο για την Γονιδιωματική και Πρωτεϊνωματική, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Οκτωβρίου του 2011? Αποδεκτές: 29 του Νοεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 22 Δεκέμβρη 2011

Copyright: © 2011 Yu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από τα κονδύλια για BL από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας [2006AA02A303, 2006AA02Z4A2, 2006DFA32950, ​​2007DFC30360]. Το έργο αυτό υποστηρίζεται από τα ταμεία για να JZ από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (30921140312), Εθνικό Πρόγραμμα Έρευνας για τη βασική έρευνα (2009CB825606, 2009CB825607 και 2010CB912802) και το Διεθνές Grant Συνεργασία (2009DFA31010) για να XD). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αντίσταση των ναρκωτικών είναι ο κυριότερος λόγος που οδηγεί στο υψηλό ποσοστό θανάτου από καρκίνο των ωοθηκών. Η σισπλατίνη χημειοθεραπευτικό παράγοντα (cis-diamminedi-chloroplatinum (II)) είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική έναντι καρκινώματος ωοθήκης με αρχικό ποσοστό απόκρισης έως και 70% [1]. Ωστόσο, ο καρκίνος των ωοθηκών αναπτύσσεται τελικά ανθεκτικά σε σισπλατίνη, και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για τους ασθενείς είναι μόνο το 15-20% [2]. Η σισπλατίνη μεσολαβεί δράσεις της σχηματίζοντας προσαγωγές-πρωτίστως DNA ενδο-κλώνου σταυροδεσμών προσαγωγές [3] και ενεργοποιεί οδούς μεταγωγής σήματος αρκετών περιλαμβάνουν τα ATR, ρ53, ρ73, και μονοπάτια ΜΑΡΚ, με αποτέλεσμα την απόπτωση [3], [4].

μεθυλίωσης του DNA συνδέεται συχνά με μεταγραφική καταστολή του γονιδίου έκφρασης [5] και με απαντήσεις σε χημειοθεραπεία [6], [7]. Ένα κλασσικό παράδειγμα είναι ότι η μεθυλίωση του MGMT (Ο6-μεθυλγουανίνη-DNA μεθυλοτρανσφεράση) προαγωγό σε γλοιώματα είναι ένα χρήσιμο προγνωστικό της ανταπόκρισης των όγκων να αλκυλίωσης καρμουστίνη παράγοντα [1,3-δις (2-χλωροαιθυλ) -1-νιτροζουρία] , καθώς και συνολικά και ελεύθερη νόσου επιβίωση σε γλοιώματα [6]. Σε καρκίνους των ωοθηκών, Taniguchi et al. προτείνει ένα μοντέλο για την εξέλιξη των ωοθηκών των όγκων στα οποία η αρχική μεθυλίωση του FANCF ακολουθείται από FANCF απομεθυλίωση και τελικά οδηγεί σε σισπλατίνη αντίσταση [7]. DNA μεθυλίωση διαφόρων γονιδίων σε καρκίνους των ωοθηκών, συμπεριλαμβανομένων HSulf-1 [8], ABCG2 [9], ΕΖΗ2 [10] έχουν βρεθεί ότι σχετίζονται με αντοχή φαρμάκου. Boettcher et al. αναλύονται υψηλής ευκρίνειας προφίλ μεθυλίωσης του DNA των 800 νησίδες CpG (CGIs) των επιλεγμένων γονιδίων και προσδιόρισε ότι η υπερ-μεθυλίωση στο CGIs του BRCA1, Cdh1, DNAJC15 και SULF2 καθώς και υπο-μεθυλίωση του CGIs για ABCB1, APC και HIC1 γονίδια έδειξαν αυξημένη δοξορουβικίνη ανοχή [11]. Chang et al. μεταχειρισμένα παγκόσμια γονιδιακής έκφρασης για να αναλύσει τα καρκινικά κύτταρα πριν και μετά την επεξεργασία του ϋΝΑ μεθυλτρανσφεράση inhibitor5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη, η οποία εκ νέου ενεργοποιεί μεθυλίωση σιγήσει γονίδιο [12]. Εντόπισαν αρκετές εκατοντάδες γονίδια που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ανθεκτικά σισπλατίνη καρκινικά κύτταρα και ενεργοποιηθεί από τον αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης DNA 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης [12]. Li et al. σε σύγκριση με το πρότυπο μεθυλίωσης του Α2780 και προέρχονται ανθεκτική κυτταρική σειρά τους μετά από αρκετούς κύκλους των επιλογών των ναρκωτικών, χρησιμοποιώντας παγκόσμια συστοιχίες CGI μεθυλίωση και μικροσυστοιχίες mRNA έκφραση [13].

Αξιοποιώντας την αλληλούχιση η επόμενη γενιά (NGS) τεχνολογίες , το μετουσιωμένο κλάσμα του γονιδιώματος συλλαμβάνεται από MeDIP-seq [14], MethylCap-seq [15] και methylcap-επόμενα [16] έχουν προφίλ σε μεγαλύτερο βάθος από την πλατφόρμα βασισμένη σε πίνακα, αποκαλύπτοντας πολλές νέες περιοχές που είναι διαφορικά μεθυλιωμένα με τις βιολογικές περιεχομένων. Εδώ αναφέρουμε τη σύγκριση των παγκόσμιων προτύπων μεθυλίωσης του DNA του ciplatin ευαίσθητα (Α2780) και ανθεκτικά (A2780cp) κυτταρικές σειρές των ωοθηκών για τα βασικά επιγενετικές ελέγχους υπεύθυνη για την αντίσταση σισπλατίνη. Εντοπίσαμε 1224 υπερ-μετουσιωμένο και 1216 μεθυλιωμένος αιτήσεις συντήρησης δεδομένων (διαφορικά μετουσιωμένο περιοχή) σε A2780cp σε σύγκριση με το Α2780. Βρήκαμε επίσης ότι A2780cp, σε σύγκριση με το Α2780, έχει χαμηλότερη παγκόσμια μεθυλίωσης CpG. Αρκετά γονίδια επιβεβαιώθηκε ότι έχουν τόσο μεθυλίωση προαγωγού και αντίστοιχη έκφραση αλλάζει συμπεριλαμβανομένων PTK6, PRKCE και BCL2L1, και η θεραπεία με το αντιδραστήριο απομεθυλίωσης 5-αζα-DC IN κύτταρα Α2780 απομεθυλιωθεί τους φορείς και αποκατέστησε την έκφρασή τους.

Αποτελέσματα

Methylomic ανάλυση του ανθεκτικού A2780cp σισπλατίνη και ισογονιδιακών σισπλατίνη ευαίσθητη Α2780 κυτταρική γραμμή του

Ανθρώπινο A2780cp κυτταρική γραμμή καρκινώματος ωοθηκών (σισπλατίνη ανθεκτικά) προήλθε από Α2780 (σισπλατίνη ευαίσθητη) κυτταρική γραμμή, αλλά δείχνουν αυξημένη αντοχή στη σισπλατίνη [17]. A2780cp και Α2780 είναι ισογονικά (ίδια γονιδιωματική DNA). Για να επιβεβαιώσετε ότι ο A2780cp κυτταρική σειρά είχαμε ακόμα διατηρείται η αντίσταση σισπλατίνη, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ΜΤΤ για την αξιολόγηση σισπλατίνη απαντήσεις φάρμακο A2780cp και Α2780 κύτταρα. Βρήκαμε ότι η IC50 του A2780cp (5,0 μg /ml) είναι σχεδόν 3 φορές υψηλότερη από εκείνη του Α2780 (1,8 μg /ml) (Εικ. 1). Τα δεδομένα μας είναι συνεπής με το προηγούμενο αναφερόμενη εικόνα απάντησης σισπλατίνης A2780cp [17], υποδεικνύοντας ότι οι κυτταρικές σειρές που είχαμε στο εργαστήριο διατηρεί την διαφορά σε σισπλατίνη αντίσταση.

Τόσο Α2780 και A2780cp υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σισπλατίνη σε διαφορετικές δόσεις από 0 μg /ml έως 16 μg /ml για 72 ώρες.

Η

Έχουμε, συνεπώς, εφαρμόζονται MethylCap-seq να αναλύσει τις methylomic προφίλ και των δύο κυττάρων Α2780 και A2780cp. Έχουμε λάβει 21.763.035 πρώτες διαβάζει για την ανθεκτική στα φάρμακα A2780cp κυτταρική γραμμή και 18,821,061reads για την ευαίσθητη κυτταρική σειρά Α2780. 13950202 (64,1%) και 13.671.899 (72,6%) διαβάζει τα μοναδικά χαρτογραφηθεί στο ανθρώπινο γονιδίωμα για A2780cp και Α2780 αντίστοιχα

σχολιασμένο το διαβάζει σε σχέση με τα νησιά CpG στο ανθρώπινο γονιδίωμα (http:. //Γονιδίωμα .ucsc.edu /) και βρήκαν ότι περίπου το 1,4% και 2,5% του διαβάζει εντοπίσετε μέσα νησίδες CpG, αντίστοιχα, για A2780cp και A2780.The μέσο βάθος ακολουθία για τα νησιά CpG που είναι περίπου 16 και 24,5 φορές. Περίπου το 68% και το 66% των ανθρώπινων νησιών CpG καλύφθηκαν στην ανάλυσή μας για A2780cp και Α2780 αντίστοιχα (Πίνακας 1). Η κάλυψη CpG και το βάθος εμείς που ελήφθη στο μας MethylCap-seq είναι παρόμοιο με αυτό προηγουμένως δημοσιευθέντα [18].

Η

Για την ανίχνευση διαφορικής περιοχές μεθυλίωσης (αιτήσεις συντήρησης δεδομένων) στο ανθρώπινο γονιδίωμα μεταξύ των ευαίσθητων και ανθεκτικών κυττάρων, χρησιμοποιήσαμε MEDIPS, μια πρόσφατα αναπτύχθηκε εργαλείο λογισμικού που ειδικεύεται για την ανάλυση ανοσοκατακρήμνισης με βάση την ανάλυση μεθυλίωσης (π.χ. MeDIP-επόμενα και MethylCap-επόμενα) [19]. Θέτουμε τα κριτήρια για σημαντικές αιτήσεις συντήρησης δεδομένων: το μήκος των κορυφών ορίστηκε στα 500 ζεύγη βάσεων και κορυφές με & gt? 20 rpm (διαβάζει ανά εκατομμύριο), p-τιμή μικρότερη από 0.001 και η αναλογία των στροφών μεταξύ δύο κυτταρική σειρά & gt? 20. Έχουμε λάβει 1224 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων που είναι υπερ-μεθυλιωμένη στο A2780cp σε σύγκριση με το Α2780 (Πίνακας S1) και 1216 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων που είναι υπερ-μεθυλιώνεται Α2780 σύγκριση με A2780cp (Πίνακας S2). Αυτές οι αιτήσεις συντήρησης δεδομένων σχολιάστηκαν με γονιδιωματική θέσεις τους και τις συναφείς γονίδια εντός -5 K bp έως +5 Κ bp στις θέσεις έναρξης της μεταγραφής (Πίνακας S3 και 4).

Σχεδόν οι μισοί από αιτήσεις συντήρησης δεδομένων βρίσκονταν εντός 5 k bp της μεταγραφής ξεκινήσει sites (TSS) των γονιδίων. 190 και 270 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων βρίσκονταν στο upstream του TSS, αντίστοιχα, Α2780 και A2780cp (Πίνακας 1). Το υπόλοιπο αντιστοιχίζονται σε άλλες περιοχές του ανθρώπινου γονιδιώματος συμπεριλαμβανομένης εσώνια, εξώνια, διαγονιδιακές περιοχές και επαναλήψεις (Ensembl επισημειώσεις ανθρώπινο γονιδίωμα) (Σχ. 2Α). Υπερμεθυλίωση περιοχές υποκινητών των γονιδίων είναι γνωστό ότι μειώνουν τη γονιδιακή έκφραση [17], αλλά το αποτέλεσμα των περιφερειών υπερμεθυλίωσης αλλού εντός της περιοχής του γονιδίου παραμένει ασαφής. Η υπερμεθυλίωση επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες γονιδιώματος μπορεί να αποτρέψει την χρωμοσωμική αστάθεια, μεταθέσεις, και διαταραχή του γονιδίου που προκαλείται από την επανενεργοποίηση της μεταθετά ακολουθίες DNA [17], [20].

Α. Ποσοστό υπερμεθυλιωμένων κορυφές με βάση εντοπισμένη γονιδιωματική χαρακτηριστικά τους. Β Κατανομή των CpG

o /e για υπερμεθυλιωμένων κορυφές με βάση την τοπική γονιδιωματικής χαρακτηριστικά τους.

Η

Li et al. σε σύγκριση ισογονιδιακών Α2780 και επιλέγονται ανθεκτικές κυτταρική σειρά τους, χρησιμοποιώντας το μικροσυστοιχιών ολιγο 60-μερές που περιείχε 40.000 CpG πλούσιων σε θραύσματα από 12.000 γνωστούς υποκινητές γονιδίων (Agilent, Santa Clara, CA) [13]. Χρησιμοποιώντας μια τιμή αποκοπής 1,5 φορές, εντόπισαν 595, 870 και 1176 υπερμεθυλιωμένο γονίδια για τις ανθεκτικές υποσειρές Round1, Round3 και Round5 σε σύγκριση με τα γονικά ( «Round0») κύτταρα Α2780 [13]. Η τεχνολογία που χρησιμοποιείται είναι διαφορικό υβριδισμό μεθυλίωση (DMH) [21], στο οποίο μεθυλιωμένο DNA διαχωρίστηκε από το μη μεθυλιωμένο με μεθυλίωση ευαίσθητο ένζυμο diagestion για την ανίχνευση του ολιγονουκλεοτιδίου σειρά του ανθρώπινου νησιωτικών περιοχών CpG. DMH είναι διαφορετικό από MDB-seq, στην οποία μεθυλιωμένο DNA καταβυθίστηκε με ανασυνδυασμένη περιοχή δέσμευσης μεθυλο-CpG του MBD2 πρωτεΐνης, και στη συνέχεια η αλληλουχία τους. Σε DMH, απομονωμένο DNA υποβλήθηκε σε πέψη με τη μεθυλίωση μη ευαίσθητο ένζυμο περιορισμού BfaI (C∧TAG), προσδέθηκε με συνδετήρες, και υπέστη πέψη πάλι με το ευαίσθητο μεθυλίωση ενζύμων HinP1I (G∧CGC) και ΗραΙΙ (C∧CGG). Τα προϊόντα της πέψης μετά ενισχύθηκαν με τη χρήση συνδετήρων και σημασμένο με Cy3 ή Cy5 βαφές για συγκριτικούς υβριδοποιήσεις [21]. Παρά τις διαφορετικές τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται, συγκρίναμε MDB-επόμενα δεδομένα μας με τα δεδομένα ΩΜΗ Li et al.. Βρήκαμε ότι 221 (του 1224, 18,1%) και 142 (του 1216, 11,68%) των υπερμεθυλιωμένων και υπο-μεθυλιώνεται γονιδίων σε A2780cp σε σύγκριση με Α2780 ήταν επίσης στη συστοιχία ότι Li et al. που χρησιμοποιούνται (Πίνακας S3, S4). Βρήκαμε ότι 15 περιφέρειες (που αντιστοιχούν σε 13 γονίδια) και 23 περιοχές (21 γονίδια) που είναι κοινά μεταξύ των δύο συνόλων δεδομένων (Πίνακας 2), τα οποία είναι εξαιρετικά σημαντική επικάλυψη με υπεργεωμετρική πιθανότητες 1.11E-5 και 4.22E-20 αντίστοιχα . Τα κοινά υπερμεθυλίωση γονιδίων στα κύτταρα ανθεκτικά περιλαμβάνουν πρωτεΐνη 8 (RBBP8), SRY-box 1 (SOX1), χωρίς φτερά τύπου MMTV οικογενειακή ιστοσελίδα ολοκλήρωσης (WNT9A), παράγοντας γενικής μεταγραφής IIIA (GTF3), δεσμευτική ρετινοβλάστωμα και τα κοινά μεθυλιωμένος γονιδίων σε τα ανθεκτικά κύτταρα περιλαμβάνουν διαλυμένης ουσίας οικογένεια φορέα 22 (εξωνευρωνική μονοαμίνης μεταφορέα) (SLC22A3), αφυδρογονάση αλδεΰδη 1 οικογένειας (ALDH1A3), υαλουρονάνη συνθάσης 3 (HAS3) και τον τομέα CUB περιέχει πρωτεΐνη 1 (CDCP1) (Πίνακας 2).

υπάρχουν 410 υπερμεθυλιωμένων αιτήσεις συντήρησης δεδομένων (Πίνακας S3) και 316 μεθυλιωμένος (Πίνακας S4) στην A2780cp σε σύγκριση με το Α2780 που δεν ήταν στη συστοιχία ότι Li et al. που χρησιμοποιούνται, και δεν θα έχουν προσδιοριστεί από την προσέγγιση ΩΜΗ. Αυτές οι νέες αιτήσεις συντήρησης δεδομένων αποκάλυψε τη δύναμη του MDB-seq στον εντοπισμό νέων αιτήσεις συντήρησης δεδομένων, χωρίς προηγούμενη γνώση των υποψηφίων υποκινητών να τεθεί σε συστοιχίες για να χρησιμοποιηθεί σε ΩΜΗ. Επιπλέον, αυτές οι νέες αιτήσεις συντήρησης δεδομένων μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στις παράγωγο ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν από τους Li et al. και μας.

Ένα χαμηλότερο παγκόσμια μεθυλίωση CpG στα ανθεκτικά σισπλατίνη κύτταρα A2780cp σε σύγκριση με τα σισπλατίνη ευαίσθητα Α2780 κύτταρα

Για να καταλάβετε το παγκόσμιο πρότυπο της CpG μεθυλίωσης στις δύο κυτταρικές σειρές, αναλύσαμε τα χαρακτηριστικά του υπερμεθυλιωμένων CpGs σε ολόκληρο το γονιδίωμα μετρώντας τον αριθμό των γειτονικών CpGs εντός των περιφερειών 500 bp που περιβάλλουν υπερμεθυλιωμένων χώρων και υπολογίζονται την παρατηρούμενη /αναμενόμενη αναλογία CpG (CpG

o /e) για κάθε CpG χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από Ruike et al . [22]. Βρήκαμε ότι, σε γενικές γραμμές, τα A2780cp έχει χαμηλότερη CpG

o /e από εκείνη του Α2780, υποδηλώνοντας μια χαμηλότερη παγκόσμια μεθυλίωσης CpG σε σύγκριση με τα A2780cp Α2780 (Εικ. 2Β, επάνω αριστερά πάνελ). Οι διαφορές ήταν κυρίως εκδηλώνεται με την υψηλότερη CpG

o /e στο ιντρόνιο και επαναλάβετε ακολουθίες Α2780 σε σύγκριση με εκείνη του A2780cp. Συγκρίνοντας CpG

o /e σε διαφορετικές κατηγορίες γονιδιωματική περιοχή (Εικ. 2Β), το CpG

o /e ήταν μεγαλύτερη από 0,6 στα εξώνια και προαγωγείς για τόσο ανθεκτικά και ευαίσθητα κυτταρικές γραμμές, αλλά λιγότερο από 0,6 σε άλλες γονιδιωματικές περιοχές (επαναλήψεις, εσώνια και διαγονιδιακές περιοχές) (Εικ. 2Β).

Λειτουργική σχολιασμούς και αναλύσεις εμπλουτισμό μονοπάτι για τα γονίδια DMR

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση GO για υπερμεθυλιωμένων γονίδια τόσο στην ανθεκτική (Πίνακας S5) και ευαίσθητη κυτταρική γραμμή (Πίνακας S6). Βρήκαμε ότι υπερμεθυλιωμένων γονίδια στον ευαίσθητο κυτταρική γραμμή εμπλουτίστηκαν για όρους GO: αντι-απόπτωση (GO: 0006916), αρνητική ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (GO: 0060548), και ρύθμιση της ενδοκυτταρικής καταρράκτη κινάσης πρωτεΐνης (GO: 0010627). Οι υπερμεθυλιωμένων γονίδια στην ανθεκτική κυτταρική σειρά έχει πολλές εμπλουτίζεται όρους που σχετίζονται με τη ρύθμιση του παράγοντα μεταγραφής, όπως GO: δραστηριότητα ρυθμιστή 0030528 μεταγραφή και GO: δεσμευτική 0003677 DNA

Θα πραγματοποιηθεί, επίσης, ανάλυση της οδού KEGG για τα γονίδια DRM και βρήκε. ότι τα γονίδια με υπερμεθυλιωμένων υποστηρικτές εμπλουτίστηκαν με τις ακόλουθες οδούς KEGG συμπεριλαμβανομένων των 11 γονιδίων σε hsa04010 (ΜΑΡΚ μονοπατιού σηματοδότησης), 18 γονίδια σε hsa05200 (Pathways στον καρκίνο), 5 γονίδια σε hsa04310 (Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι), 5 γονίδια σε hsa00982 (μεταβολισμό των φαρμάκων ), και 5 γονίδια σε hsa04115 (p53 μονοπάτι σηματοδότησης) (Πίνακας 3).

Η

Είναι ενδιαφέρον, πολλές πρωτεΐνες ECM που σχετίζονται και το κανάλι μεμβράνης υπερμεθυλίωση. Για παράδειγμα, KCNS1 και KCNA1, τασεοελεγχόμενων πρωτεΐνη κανάλι δύο καλίου, και SLC15A4 (διαλυμένης ουσίας φορέα οικογένεια 15, μέλος 4) υπερμεθυλίωση στα κύτταρα A2780cp ενώ SLC4A11 (διαλυμένης ουσίας φορέα οικογένεια 4, βορικό νάτριο μεταφορέα, μέλος 11) υπερμεθυλίωση στο Α2780 κύτταρα. ΟΙ18Α1 (κολλαγόνο, τύπου XVIII, άλφα 1) είναι υπερμεθυλίωση στο Α2780 κύτταρα, ενώ KRTAP10-6 (κερατίνη πρωτεΐνη που σχετίζεται με 10-6) και LRFN5 (πλούσιες σε λευκίνη επανάληψης και φιμπρονεκτίνης τύπου III τομέα που περιέχει 5) υπερμεθυλίωση στα κύτταρα A2780cp. Εντοπίσαμε επίσης υπερμεθυλίωση σε διάφορες θέσεις microRNA συμπεριλαμβανομένων υπερμεθυλίωση MI6A2, MIR129-2, MIR124-1, MIR124-3, και MIR10A σε A2780cp και υπερμεθυλίωση MIR185, MIR548Q, MIR642A και MIR661 σε Α2780 (Πίνακας 4).

Επικύρωση των γονιδίων με αιτήσεις συντήρησης δεδομένων από το MS-PCR και όξινο θειώδες

αλληλούχιση

η έκφραση των γονιδίων με υπερμεθυλιωμένων υποκινητή ελέγχθηκε με RT-qPCR, αν η έκφραση ήταν σημαντική αλλάξει τότε μεθυλίωσης ειδική PCR (MS- PCR) χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση της κατάστασης μεθυλίωσης των περιοχών DMR μεταξύ δύο κυτταρικών σειρών. Έχουμε εντοπίσει τα ακόλουθα γονίδια BCL2L1 (BCL2-όπως 1), PPKCE (πρωτεϊνική κινάση C, έψιλον), PTK6 (PTK6 πρωτεϊνική κινάση της τυροσίνης 6), RAC2 (ras σχετίζονται C3 βοτουλινική τοξίνη υπόστρωμα 2), SECTM1 (εκκρίνεται και διαμεμβρανική 1) και DDIT3 (βλάβη του DNA που επάγεται από απομαγνητοφώνηση 3) που άλλαξε τόσο μεθυλίωση προαγωγού και έκφραση. Σχήμα 3Α έδειξε τις αλλαγές έκφρασης αυτών των γονιδίων, και το Σχήμα 3Β δεικνύει τα μοτίβα μεθυλίωσης προαγωγού αυτών των γονιδίων. DDIT3 ήταν μεθυλιωμένος εις Α2780 κυττάρων σε σύγκριση με τα A2780cp, ενώ το υπόλοιπο έδειξε το αντίθετο (Σχ. 3Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αιτήσεις συντήρησης δεδομένων μεταξύ Α2780 και A2780cp, χρησιμοποιήσαμε διθειώδες την γενετική αλληλουχία των περιοχών προαγωγού του τρία τυχαία επιλεγμένα γονίδιο από τα 6 γονίδια. Σχήμα 3C έδειξε ότι όλες οι περιοχές υποκινητή του γονιδίου πήρε PTK6, PRKCE και BCL2L1 ήσαν υπο-μεθυλιωμένα σε A2780cp σε σύγκριση με το Α2780.

Α. PCR πραγματικού χρόνου που δείχνει τη διαφορική έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων μεταξύ του ευαίσθητου σισπλατίνης Α2780 και τα ανθεκτικά κύτταρα σισπλατίνη A2780cp. δεδομένα B. MS-PCR δείχνει απόκλιση μέλη μεθυλίωσης σε περιοχές υποκινητή των επιλεγμένων γονιδίων μεταξύ Α2780 και A2780cp κύτταρα. αποτέλεσμα αλληλουχίας Γ Bisulfite για τις περιοχές υποκινητή των επιλεγμένων γονιδίων PTK6, PRKCE και BCL2L1 (λευκό κύκλο: μη μεθυλιωμένα CpG, Μαύρο κύκλο: μεθυλιωμένα CpG).

Η

Αποκατάσταση της γονιδιακής έκφρασης της DMR επηρεάζονται γονιδίων από treatmentwith 5 αζα-dc αντιδραστήριο απομεθυλίωσης

για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω στοιχεία μας, χρησιμοποιήσαμε 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης (5-αζα-dC) για να δούμε αν μπορούμε να ενεργοποιήσετε ξανά τα γονίδια μεθυλίωση-σιγήσει ότι εντοπίσαμε. 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) είναι ένα ανάλογο της κυτοσίνης. Όταν ενσωματώνεται σε DNA, συνδέεται μη αντιστρεπτά τα ένζυμα μεθυλοτρανσφεράσης, με αποτέλεσμα παθητική de-methylationand επανενεργοποίηση επιγενετικώς σιγήσει γονιδίων [23]. Χρησιμοποιήσαμε 5-αζα-dC προς θεραπεία και των δύο κυττάρων A2780cp και Α2780 σε διαφορετικές δόσεις από 0 μΜ έως 10 μΜ. Η έκφραση των γονιδίων που έλαβαν θεραπεία με το χαμηλότερο (0 μΜ) σε σύγκριση με εκείνη που έλαβαν θεραπεία με την υψηλότερη (10 μΜ) δόση του αντιδραστηρίου απομεθυλιώσεως.

Δείξαμε ότι ήμασταν σε θέση να απομεθυλίωση τους υποκινητές της υπερμεθυλιωμένων PRKCE, BCL2L1, RAC2, PTK6, SECTM1 (Σχ. 4Α, Β), και αποκαθίσταται η έκφρασή τους μετά από θεραπεία με 5-αζα-dC σε κύτταρα Α2780. Ομοίως, ήμασταν σε θέση να απομεθυλίωση τους υποστηρικτές του υπερμεθυλιωμένων γονιδίου DDIT3, και να αποκατασταθεί η έκφρασή της μετά από θεραπεία με 5-αζα-DC IN κύτταρα A2780cp (Εικ. 4Α, Β).

Α. Επικύρωση των αλλαγών της κατάστασης μεθυλίωσης από το MS-PCR για τα έξι γονίδια υπό θεραπεία με 0 μΜ και 10 μΜ 5-αζα-DC. αλλαγές Β Gene έκφραση (άξονας Υ, σε σχέση μεταβολές φορές) των επιλεγμένων γονιδίων έξι μετά τη θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (Χ-άξονας) του αντιδραστηρίου απομεθυλιώσεως 5-αζα-DC.

Η

Συζήτηση

Περιγράφουμε εδώ για πρώτη φορά ένα MDB-επόμενα ανάλυση ενός μοντέλου απάντηση σισπλατίνη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Οι επιγενετικές αλλαγές μεταξύ των ισογενετικών ζεύγους της ευαίσθητης σισπλατίνη Α2780 και ανθεκτικό παράγωγο κύτταρα A2780cp του προτείνουν μια επιγενετική μηχανισμό ελέγχου για την σισπλατίνη αντίσταση. Η παγκόσμια MDB-επόμενα σετ δεδομένων που παράγονται για αυτό το ζευγάρι των ισογενετικών κύτταρα θα είναι μια χρήσιμη πηγή για την ερευνητική κοινότητα ενδιαφέρεται για την αντίσταση σισπλατίνη και επιγενετική, και στον καρκίνο των ωοθηκών σε γενικές γραμμές. Παγκόσμια μεθυλίωση του DNA αλλάζει κατά τη διάρκεια της καρκινογένεση και είναι συχνά ένα προγνωστικό των απαντήσεων θεραπείας. Για παράδειγμα, Anisowicz et al. έδειξαν ότι ακόμα και η κανονική τμήμα του πνεύμονα από έναν ασθενή με καρκίνο έχει ήδη βιώσει μια απώλεια της παγκόσμιας μεθυλίωσης του DNA σε σύγκριση με ένα κανονικό άτομο [24]. Kim et al. έδειξε ότι η παγκόσμια μεθυλίωση CpG παίζει ένα ρόλο στην επιγενετική έλεγχο της ραδιοευαισθησία σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα [25]. Σε γλοιώματα, LINE-1 μεθυλίωση, ένα παγκόσμιο δείκτη μεθυλίωσης του DNA, είναι ανάλογη με μεθυλίωση MGMT προαγωγό και υψηλότερα LINE-1 μεθυλίωση είναι ένας ευνοϊκός προγνωστικός παράγοντας σε πρωτογενείς GBMs, ακόμη και σε σύγκριση με μεθυλίωση MGMT υποκινητή [26]. Εδώ παρατηρήσαμε μια χαμηλότερη παγκόσμια μεθυλίωσης CpG στα ανθεκτικά σισπλατίνη κύτταρα A2780cp σε σύγκριση με τα ευαίσθητα σισπλατίνη κύτταρα Α2780, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα πρότυπα μεθυλίωσης παγκόσμια DNA μπορεί να είναι σε θέση να προβλέψει σισπλατίνη αντίστασης για καρκίνους των ωοθηκών. Περαιτέρω πειραματισμός είναι απαραίτητο να αξιολογήσει αυτή την υπόθεση.

Έχουμε λάβει 1.224 και 1.216 αιτήσεις συντήρησης δεδομένων που είναι υπερ-μετουσιωμένο ή υπο-μεθυλιώνεται A2780cp σε σύγκριση με το Α2780 κύτταρα (Πίνακας S1, S2). Βρήκαμε ότι υπερμεθυλιωμένων γονιδίων στο ευαίσθητο κυτταρική γραμμή ήταν εμπλουτισμένα για τους όρους GO για αντι-απόπτωση (GO: 0006916) και αρνητική ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου (GO: 0060548), γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή γενική μηχανισμό επιγενετικών αποσιώπηση γονιδίων αντι-απόπτωση, με αποτέλεσμα την ευαισθησία σε σισπλατίνη. Βρήκαμε επίσης ότι οι αιτήσεις συντήρησης δεδομένων εμπλουτισμένα σε αρκετές οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του hsa04010 (ΜΑΡΚ μονοπάτι σηματοδότησης), hsa04310 (μονοπάτι σηματοδότησης Wnt), και το hsa04115 (ρ53 μονοπάτι σηματοδότησης) οδούς (Πίνακας 3). Το μονοπάτι σηματοδότησης Wnt έχει εμπλακεί στην πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών και χημειοαντίσταση [27]. Η ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ ΙΝΚ /ρ38 σε ανταπόκριση στη σισπλατίνη θα μπορούσε να οδηγήσει σε επαγωγή συνδέτη Fas και τον κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών [4]. Ρ53 και μονοπάτι σηματοδότησης της είχαν επίσης εμπλακεί στην σισπλατίνη αντίσταση σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [28], [29]. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η επιγενετική ρύθμιση αυτών των οδών σηματοδότησης είναι ένας από τους μηχανισμούς για τη συμμετοχή αυτών των οδών στην αντίσταση σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Επίσης, εντοπίστηκαν υπερμεθυλίωση σε διάφορες θέσεις microRNA συμπεριλαμβανομένων υπερμεθυλίωση MI6A2, MIR129- 2, MIR124-1, MIR124-3, και MIR10A σε A2780cp και υπερμεθυλίωση του MIR185, MIR548Q, MIR642A και MIR661 σε Α2780 (Πίνακας 4). Οι miRNAs έχουν εμπλακεί στην σισπλατίνη αντίσταση στον καρκίνο των ωοθηκών [30]. Για παράδειγμα, Yang et al. έδειξαν ότι πολλά miRNAs απελευθερωθεί στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών συμπεριλαμβανομένων των miR-214, miR-199α *, miR-200A, miR-100, miR-125b, και αφήστε-7 συμπλέγματος, και ότι miR-214 επάγει κυτταρική επιβίωση και την αντίσταση σισπλατίνη από που στοχεύουν ΡΤΕΝ [30]. έχουν επιγενετικώς αθόρυβη microRNAs έχουν εμπλακεί σε καρκίνους [31], [32]. Ωστόσο, η μεθυλίωση του miRNA locus δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως για καρκίνους των ωοθηκών? ούτε οι εκθέσεις σχετικά με τη σχέση μεταξύ miRNA μεθυλίωση και την αντίσταση σισπλατίνη. Τα στοιχεία μας μπορεί να υποδεικνύει μια νέα κατεύθυνση για τη μελέτη της μεθυλίωσης των microRNA τόπους και σισπλατίνη αντίσταση.

Βρήκαμε ότι BCL2L1 (BCL2-όπως 1), PPKCE (πρωτεϊνική κινάση C, έψιλον), PTK6 (πρωτεΐνη PTK6 τυροσινικής κινάσης 6), RAC2 (ras σχετίζονται C3 βοτουλινική τοξίνη υπόστρωμα 2), SECTM1 (εκκρίνεται και διαμεμβρανική 1) οι υπερμεθυλίωση στα ευαίσθητα σισπλατίνη κύτταρα Α2780 και DDIT3 (βλάβη του DNA που επάγεται από απομαγνητοφώνηση 3) έχει υπερμεθυλίωση στο ανθεκτικά A2780cp σισπλατίνη κύτταρα. Η έκφρασή τους επίσης επίσης αλλάζει ανάλογα με την υπόθεση ότι η υπερμεθυλίωση θα σιγήσει γονιδιακής έκφρασης. Επιβεβαιώσαμε το μοτίβο μεθυλίωσης των γονιδίων αυτών από το MS-PCR, και επίσης ήταν σε θέση να απομεθυλίωση των υποκινητών των γονιδίων αυτών και να αποκαταστήσει την έκφρασή τους μετά από θεραπεία με 5-αζα-dC, ένας παράγοντας ο οποίος απο-μεθυλιώνει και δραστηριοποιεί επιγενετικώς σιγήσει γονιδίων [ ,,,0],23].

Βρήκαμε BCL2L1 είναι υπερμεθυλίωση στα ευαίσθητα κύτταρα Α2780. BCL2L1 (bcl-XL) κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2, των οποίων η πρωτεΐνη τα μέλη ενεργούν ως αντι- ή προ-αποπτωτικά ρυθμιστές [33]. Υπερ-έκφραση της πρωτεΐνης Bcl-xL είναι γνωστό ότι προσδίδουν αντίσταση σε ένα ευρύ φάσμα δυνητικά αποπτωτικών ερεθισμάτων σε διεργασίες καρκινογένεση συμπεριλαμβανομένων ογκογονιδίου ενεργοποίησης, υποξία και αποκόλλησης μήτρας [34] – [37]. Το αποτέλεσμά μας αποκαλύπτει ότι η υπομεθυλίωση του BCL2L1 στα ανθεκτικά κύτταρα (δηλαδή υπερμεθυλίωση BCL2L1 στα ευαίσθητα κύτταρα) θα οδηγήσει σε αυξημένη έκφραση BCL2L1, πράγμα που παρέχει αντοχή στην σισπλατίνη. Τα δεδομένα μας είναι συνεπές με την παρατήρηση από τους Williams et al. ότι η έκφραση των Bcl-xL σε καρκίνωμα των ωοθηκών συνδέεται με χημειοαντίσταση και υποτροπιάζουσα ασθένεια [38]. Λαμβάνοντας μαζί, αυτό δείχνουν ότι διαμορφώνει την έκφραση του BCL2L1 (Bcl-XL) με επιγενετικές μέσο μπορεί να είναι ένας τρόπος για να ξεπεραστεί η αντίσταση σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Επίσης προσδιορίζονται PTK6 (κινάση τυροσίνης πρωτεΐνης 6) όπως υπερμεθυλίωση στα σισπλατίνη ευαίσθητα κύτταρα Α2780 σύγκριση με τα κύτταρα A2780cp. PTK6 φωσφορυλιώνει άμεσα ΑΚΤ και προωθεί την ενεργοποίηση ΑΚΤ σε απόκριση σε επιδερμικό αυξητικό παράγοντα [39]. Η σχέση του PTK6 με σισπλατίνη δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί. Περαιτέρω λειτουργική ανάλυση του ρόλου PTK6 στη διαμόρφωση της αντίστασης σισπλατίνη είναι δικαιολογημένη. PPKCE (πρωτεϊνική κινάση C, έψιλον) είναι ένα άλλο γονίδιο που έχει υπερμεθυλίωση σε ευαίσθητους σισπλατίνη κύτταρα Α2780 σύγκριση με τα κύτταρα A2780cp. PPKCE είναι ένα μέλος της οικογένειας της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC), τα μέλη της οποίας φωσφορυλιώνει μία μεγάλη ποικιλία στόχων πρωτεΐνης και εμπλέκονται σε ποικίλες οδούς κυτταρικής σηματοδότησης [40]. Είναι ενδιαφέρον, σισπλατίνη ήταν σε θέση να διεγείρει φωσφορυλίωση και μετατόπιση του PPKCE από την μεμβράνη πλάσματος προς τον πυρηνική μεμβράνη και το κυτοσολικό κλάσμα [41]. Η υπερμεθυλίωση PPKCE στα ευαίσθητα κύτταρα θα μειώσει την έκφραση του, με αποτέλεσμα μικρότερη μετατόπιση από την πυρηνική μεμβράνη ή κυτοσολικό κλάσμα κατά την προσθήκη της σισπλατίνης. Ωστόσο, αν η μειωμένη έκφραση του PPKCE προσδίδει ευαισθησία στη σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών παραμένει να μελετηθεί.

Τέλος, προσδιορίσαμε DDIT3 (DNA-βλάβη που επάγεται μεταγραφή 3) όπως υπερμεθυλίωση στα ανθεκτικά cisplatin κύτταρα σε σύγκριση με τα A2780cp Α2780 κύτταρα. Επίσης ονομάζεται GADD153 (διακοπή αύξησης και βλάβη του DNA που επάγεται από πρωτεΐνη 153), DDIT3 κωδικοποιεί ένα μέλος της πρωτεΐνης CCAAT /ενισχυτή δέσμευσης (C /EBP) οικογένεια παραγόντων μεταγραφής, και ενεργοποιείται από στρες ενδοπλασματικό δίκτυο, και προωθεί την απόπτωση. DDIT3 (GADD153) έκφραση θα μπορούσε να προκληθεί με σισπλατίνη [42]. Παρατηρήσαμε ότι είναι υπερμεθυλίωση στα ανθεκτικά κύτταρα, τα οποία θα οδηγήσει σε μειωμένη έκφραση του DDIT3. Είναι πιθανό ότι η σισπλατίνη δρα μέσω DDIT3 για την προώθηση της σύλληψης της ανάπτυξης και της απόπτωσης, και μειωμένη έκφραση των DDIT3 στα κύτταρα θα τα καταστήσει πιο ανθεκτικά σε σισπλατίνη. Ωστόσο, η λεπτομερής μηχανισμός παραμένει προς διερεύνηση.

Εν ολίγοις, έχουμε δημιουργήσει ένα παγκόσμιο σύνολο δεδομένων για ένα μοντέλο αντίστασης των ωοθηκών καρκίνο σισπλατίνη και εντοπίστηκαν διάφορα γονίδια που υποβλήθηκαν σε επιγενετικών ελέγχου για τη ρύθμιση της αντίστασης σισπλατίνη. Αυτά τα γονίδια θα μπορούσαν χρησιμεύει ως στόχοι για την αντιμετώπιση χημειοαντίσταση στη σισπλατίνη σε καρκίνους των ωοθηκών.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Α2780 και A2780cp καλλιεργήθηκε σε RPMI 1640 (Invitrogen) που περιέχει 10 % Εμβρυϊκό Βόειο ορό (10099-141) στους 37 ° C και

2 5% CO. Τα κύτταρα ευγενώς από το Δρ Stephen Collins από UC San Diego (CA, USA).

Η κυτταροτοξικότητα ανάλυση

Τόσο ανθεκτικά και ευαίσθητα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε συγκέντρωση 4000 κύτταρα /φρεάτιο σε πέντε αντίγραφα με πλήρες μέσο καλλιέργειας. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη σε διαφορετική δόση από 0 μg /ml έως 16 μg /ml. Μετά από 72 ώρες επώασης, τόσο βιώσιμα και νεκρά κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ΜΤΤ, και μόνο τα βιώσιμα κύτταρα περιλαμβάνονται στην ανάλυση των δεδομένων.

όξινο θειώδες τροποποιημένου αλληλουχίας του DNA και ειδική της μεθυλίωσης PCR

Παρασκευάσαμε γονιδιωματικό DNA από καλλιεργημένα κύτταρα με τη χρήση της DNeasy Blood & amp? Κιτ ιστού (Qiagen). Περίπου 200 ng του DNA ήταν διθειώδες-επεξεργασία με το EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold kit (Zymo Research) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ZymoTaq Πρόμιγμα χρησιμοποιήθηκε για ειδική της μεθυλίωσης PCR (MSP) και σύμφωνα με αυτούς τους εκκινητές (Πίνακας S7). Μεθυλίωσης-ειδική PCR διεξήχθη σε ένα συνολικό όγκο 25 μL χρησιμοποιώντας ZymoTaq Πρόμιγμα (έρευνα ZYMO). MSP αντιδράσεις υποβλήθηκαν σε αρχική επώαση στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και ανόπτησης σε κατάλληλη θερμοκρασία για 35 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 40 δευτερόλεπτα. Τελική επέκταση έγινε με επώαση στους 72 ° C για 7 λεπτά. προϊόντα MSP διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου

Οι εκκινητές για αλληλούχιση όξινο θειώδες τροποποιημένων (Πίνακας S7) και MSP σχεδιάστηκαν από εργαλεία web MethPrimer (http:. //www.urogene. org /methprimer /index1.html) [43]. Οι συνθήκες για την αντίδραση αλληλούχισης όξινο θειώδες τροποποιημένου είναι ίδια με MSP. Τα προϊόντα καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού MinElute PCR, κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα PMD 18-Τ (Takara) και αλληλουχήθηκε.

απομόνωση του RNA και πραγματικού χρόνου RT-PCR

RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο για το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). 2 μg RNA ήταν αρχικά μεταγράφηκε ανάστροφα σε 25 μL με Archive Kit (Applied Biosystems) και 2 μλ ενισχύθηκαν με Real Time PCR (Bio-Rad CFX96 Rea-Time System). δείγματα cDNA ενισχύθηκαν με SYBR® Προ-αναμίξτε Ex Taq ™. Το προφίλ θερμική κυκλοποίηση αποτελούνταν από αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 40 κύκλους στους 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 15 δευτερόλεπτο και 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα. Κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία εις τριπλούν.

Θεραπεία

5-Αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη

Ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος ωοθηκών Α2780 και A2780cp αναπτύχθηκαν επί 5 ημέρες παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων 5-Αζα -dC (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5 και 10 μΜ). Φρέσκο ​​φάρμακο προστέθηκε κάθε 24 ώρες.

μεθυλιωμένο ϋΝΑ Binding αλληλούχισης πρωτεΐνης (MethylCap-seq)

3 μg γονιδιωματικού DNA που απομονώθηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω κατακερματισμένη με κατεργασία υπερήχων με Bioruptor (Diagenode, Βέλγιο) και επισκευάστηκε στο άκρο, A-ουρά, και προσδέθηκε με 2,5 mmol «ζεύγη-end» προσαρμογείς (IDT Inc.) παρακάτω προτείνουμε το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Illumina Inc.). 1,2 μg του DNA κλασματοποιήθηκε πάνω σε μια σπιτική GST-MBD ρητίνη με ένα ρυθμιστικό διάλυμα μιας σταδιακής αυξημένη συγκέντρωση άλατος [16]. Η υψηλή κλάσμα άλας ενισχύθηκε άμεσα από 12-κύκλος PCR [18]. Το κλάσμα 350-450 bp των προϊόντων PCR καθαρίστηκε σε πήκτωμα και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας έναν Agilent DNA 1000.

Τα κλάσματα 250-400 bp DNA αποκόπηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα προϊόντα αξιολογήθηκαν και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία 1000 Agilent DNA σειρά II και Qubitfluorometer (Invitrogen), αντίστοιχα. Κάθε βιβλιοθήκη αραιώθηκε σε 8 ηΜ για αλληλούχηση επί Illumina Γονιδίωμα Analyzer II παρακάτω συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Λαμβάνονται εικόνες αναλύθηκαν και τη βάση που ονομάζεται χρησιμοποιώντας Illumina παρεχόμενο λογισμικό αγωγού GA OLB 1.6.0 με προεπιλεγμένη ρύθμιση. Οι πρώτες διαβάζει από MethylCap-επόμενα υποβλήθηκαν GEO βάση δεδομένων η οποία αριθμό ένταξης isGSE31418.

Το κλάσμα 250-400 bp DNA του ενισχυμένου κλάσματος ήταν παρόμοιο με πήγμα καθαρισμένο. Κάθε βιβλιοθήκη αραιώθηκε σε 8 ηΜ για αλληλούχιση με Illumina Genome Analyzer II παρακάτω συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Λαμβάνονται εικόνες αναλύθηκαν και βάση αποκαλούμενο χρησιμοποιώντας Illumina παρεχόμενο λογισμικό αγωγού GA OLB 1.6.0 με προεπιλεγμένη ρύθμιση. Οι πρώτες διαβάζει από MethylCap-επόμενα υποβλήθηκαν GEO βάση δεδομένων (αριθμός ένταξης GSE31418).

Χαρτογράφηση της ακολουθίας Διαβάζει

Ανθρώπινο αλληλουχία του γονιδιώματος και πληροφορίες χαρτογράφησης (Φεβρουάριος 2009, GRCh37 /hg19) ήταν