Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η κύρια αιτία θανάτου μεταξύ των ανδρών. Αυτή τη στιγμή υπολογίζεται ότι οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις που συνδέονται με το 15-20% όλων των θανάτων από καρκίνο παγκοσμίως. PCA είναι κυριαρχείται από τις επιπλοκές που προκύπτουν από μετάσταση στο κόκκαλο όπου τα καρκινικά κύτταρα αλληλεπιδρούν με το μικροπεριβάλλον των οστών επηρεάζεται η ισορροπία μεταξύ του σχηματισμού των οστών και της υποβάθμισης. Ωστόσο, η μοριακή φύση αυτής της αλληλεπίδρασης δεν είναι πλήρως κατανοητός. Η αίμη οξυγενάσης-1 (ΗΟ-1) αντισταθμίζει οξειδωτική βλάβη και φλεγμονή. Προηγούμενες μελέτες από το εργαστήριο μας έδειξαν ότι ΗΟ-1 εμπλέκεται στην PCa, αποδεικνύοντας ότι η ενδογενής ΗΟ-1 αναστέλλει την οστική προέρχονται-προστάτη καρκινικών κυττάρων τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετανάστευση και μειώνει την ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση

in vivo

. Ο σκοπός της εργασίας αυτής ήταν να αναλύσει τον αντίκτυπο των ΗΟ-1 διαμορφώνεται κύτταρα του προστάτη στον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών

in vitro

και στην οστική αναδιαμόρφωση

in vivo

. Χρησιμοποιώντας ένα σύστημα συν-καλλιέργειας των PC3 κυττάρων με πρωτογενείς οστεοβλάστες ποντικούς (ΟΔΣ), αποδείξαμε ότι ΗΟ-1 φαρμακολογική επαγωγή (θεραπεία αιμίνη) κατήργησε την μείωση του ΟΔΣ πολλαπλασιασμού που επάγεται από τα κύτταρα του προστάτη και μείωσε την έκφραση των παραγόντων οστεοκλαστών διαμόρφωσης σε οστεοβλάστες . Δεν υπάρχουν αλλαγές ανιχνεύθηκαν στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε οστεοβλάστες διαφοροποίηση. Ωστόσο, συν-καλλιέργεια των προ-επεξεργασμένα κύτταρα PC3 αιμίνη (PC3 Hem) με ΟΔΣ προκάλεσε μια οξειδωτική κατάσταση και ενεργοποιείται FOXO σηματοδότησης σε οστεοβλάστες. Το ποσοστό των δραστικών οστεοβλαστών θετικά για ΗΟ-1 αυξήθηκαν σε calvarias έκφυτα συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα PC3 Hem. ΗΟ-1 έκφραση Πυρηνική ανιχνεύθηκε σε όγκους που παράγονται από in vivo έγχυση οστό του ΗΟ-1 σταθερή επιμολυσμένα PC3 (PC3HO-1) κυττάρων στο μηριαίο οστό του

SCID

ποντίκια. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΗΟ-1 έχει τη δυνατότητα να τροποποιήσει το μικροπεριβάλλον των οστών που επηρεάζει την μετάσταση του προστάτη των οστών

Παράθεση:. Ferrando Μ, Wan Χ, Meiss R, Yang J, De Siervi Α, Navone Ν, κ.ά. . (2013) οξυγενάση της αίμης-1 (ΗΟ-1) έκφραση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη διαμορφώνει την οξειδωτική Response σε Bone Cells. PLoS ONE 8 (11): e80315. doi: 10.1371 /journal.pone.0080315

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 29, Αυγούστου 2013? Αποδεκτές: 6, Οκτωβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Νοεμβρίου, 2013

Copyright: © 2013 Ferrando et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Πανεπιστήμιο του Μπουένος Άιρες, Αργεντινή, UBACyT (20020100100179) και ANPCYT (εικ Raíces 2.010 έως 0.431). Μ Φ πραγματοποιήθηκε υποτροφίες από CONICET και UICC International Technology Καρκίνο Fellowship Μεταφοράς. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι οστικές μεταστάσεις κυριαρχούν στην κλινική εικόνα του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη (PCA) και είναι υπεύθυνες για το μεγαλύτερο μέρος της θνησιμότητας και νοσηρότητας της νόσου. Οι μεταστάσεις στα οστά μπορεί να έχει είτε ένα οστεολυτικές (επαναρρόφησης των οστών) ή οστεοβλαστικά φαινότυπο (που παράγει οστών). PCa παράγει χαρακτηριστικά αλλοιώσεων οστεοβλαστική στα οστά, αν και ένας οστεολυτικές συστατικό είναι πάντα παρούσα.

Έχει προταθεί ότι η φλεγμονή αυξάνει την ογκογένεση του προστάτη [1]. Οι κυτοκίνες, χημειοκίνες και μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας είναι μέρος ενός δικτύου προφλεγμονωδών που συμβάλλει στην κακοήθη πρόοδο [2]. Πράγματι, προφλεγμονώδεις παράγοντες που εκκρίνονται από ΠΑΠ και τα κύτταρα των οστών και την επακόλουθη απελευθερώνεται παραγόντων από το οργανικό πλέγμα στο οστό, μεσολαβούν ένα παρακρινή /αυτοκρινή αλληλεπίδραση μεταξύ PCa κύτταρα, οστεοβλάστες και οστεοκλάστες, οι οποίες καθορίζουν τελικά τον φαινότυπο των οστών και την εξέλιξη του προστάτη [3 , 4].

Το οξειδωτικό στρες είναι μια φυσική συνέπεια της φλεγμονώδεις διεργασίες και δρα ως ρυθμιστής της λειτουργίας της ανοργανοποιημένο ιστούς [5]. Επηρεάζει σχηματισμό των οστών με αναστολή της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών και την προώθηση της απόπτωσης [6]. Οι επιδράσεις αυτές επάγονται εν μέρει από αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παράγονται στο πλαίσιο του οξειδωτικού στρες. Κύτταρα εξουδετέρωση των αρνητικών συνεπειών της ROS ενεργοποιώντας διάφορους μηχανισμούς άμυνας, συμπεριλαμβανομένων επαγωγή ελευθέρων ριζών ενζύμων σάρωσης όπως μαγγανίου δισμουτάση υπεροξειδίου (MnSOD), καταλάση, και επίσης τα γονίδια επιδιόρθωσης του DNA. Αυτή η αντίδραση απαιτεί την ενεργοποίηση μιας οικογένειας πανταχού παραγόντων που είναι γνωστό ως forkhead κουτί μεταγραφή O (FOXO) [7], η οποία μέσα από την αλληλεπίδραση με το β-κατενίνης μειώνει το οξειδωτικό στρες και προάγει την επιβίωση των οστεοβλαστών [6].

αίμης οξυγενάσης 1 (ΗΟ-1), το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο στην αποδόμηση της αίμης, αποδείχθηκε να προσδώσουν κυτταροπροστασία κατά του οξειδωτικού στρες και φλεγμονής σε διάφορα ζωικά μοντέλα [8]. Προηγούμενες εκθέσεις από το εργαστήριο μας τεκμηριώνεται για πρώτη φορά τη πυρηνική έκφραση της ΗΟ-1 σε ανθρώπινα πρωτογενή καρκινώματα του προστάτη [9]. Μπορούμε τεκμηριώνεται επίσης ότι ΗΟ-1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μετανάστευση και εισβολή

in vitro

και εξασθενίζει την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη

in vivo

[10]. Επιπλέον, έχουμε προηγουμένως δημιουργήσει ένα ρόλο κλειδί για ΗΟ-1 ως ρυθμιστής της αγγειογόνου διακόπτη στην καρκινογένεση προστάτη [11]. Επιπλέον, δείξαμε απόδειξη ότι η αντι-αγγειογενετική λειτουργία του ΗΟ-1 που προκαλείται από την καταστολή του πυρηνικού παράγοντα κάπα ελαφριάς αλυσίδας-ενισχυτής των ενεργοποιημένων Β κυττάρων (ΝΡ-κΒ) οδού [11] σηματοδότησης. Πρόσφατα, έχουμε αναφερθεί μια νέα λειτουργία για HO-1 στη ΣΕΣΣ. Έχουμε αποδείξει ότι ΗΟ-1 κάτω-διαμορφώνει AR μεταγραφική δραστηριότητα με την παρεμπόδιση της σηματοδότησης STAT3 και προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία του ρόλου της πέραν της υποβάθμισης της αίμης [12].

Οι μελέτες που παρουσιάζονται εδώ έγιναν χρησιμοποιώντας προέρχεται οστών οστεολυτικού προστάτη κυτταρική γραμμή (PC3) που έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών

in vitro

σε ένα σύστημα συγκαλλιέργειας με πρωτογενείς οστεοβλάστες ποντικού (ΟΔΣ) [13]. Στην εργασία αυτή αναφέρει τα δεδομένα που υποστηρίζουν μια νέα λειτουργία για ΗΟ-1 στην αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων του προστάτη και των οστών. Βρήκαμε ότι ΗΟ-1 επαγωγή σε κύτταρα PC3 αποκατέστησε τον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών, η οποία αναστάλθηκε κατά τη διάρκεια συν-καλλιέργεια με γονικά κύτταρα PC3. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι αυτά τα αποτελέσματα που προκαλούνται από την ενεργοποίηση των FOXO σηματοδότησης σε οστεοβλάστες. PC3 κύτταρα που υπερεκφράζουν ΗΟ-1 (PC3HO-1) αυξάνεται στο οστό ποντικών, παρήγαγαν όγκους με πυρηνικό εντοπισμό του ΗΟ-1 όπως ανιχνεύονται με ανοσοϊστοχημεία. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΗΟ-1 παίζει ένα ρόλο στην πρόοδο της PCA σε οστό. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων του προστάτη και οστικές μικροπεριβάλλον μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό νέων στόχων για φαρμακολογική παρέμβαση σε αυτή την ασθένεια.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειες κυττάρων και αντισώματα

Ο καρκίνος του προστάτη PC3 κυτταρική γραμμή ελήφθη από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και συνήθως καλλιεργούνται σε RPMI 1640 (Invitrogen, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). PC3 σταθερό επιμολυσμένα κύτταρα (PC3HO-1 και PC3βgal) δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Η μυοβλάστη κυτταρική γραμμή ποντικού C2C12 ελήφθη από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκε σε DMEM χαμηλής γλυκόζης (Invitrogen, CA, USA) με 10% FBS. Πρωτογενείς καλλιέργειες οστεοβλαστών ποντικών (ΟΔΣ) καθορίστηκαν με μία διαδικασία που δημοσιεύθηκε προηγουμένως [13] και ελήφθησαν από το θόλο του κρανίου του νεογέννητων ποντικών CD1 θυσιάστηκαν 4 ημέρες μετά τη γέννηση. Απομονωμένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε α-ΜΕΜ (Invitrogen, CA, USA) συν 10% FBS για 48 ώρες. Οι ΟΔΣ στη συνέχεια συνέχεια με θρυψίνη και απλώνονται εκ νέου σε τρυβλία καλλιέργειας για την εκτέλεση πειραμάτων. Αντισώματα: αντι-ΗΟ-1 ήταν από την Stressgen Biotechnologies, Corp. (San Diego, CA, USA), αντι-β-κατενίνης ήταν από BD Transduction Laboratories ™ (CA, USA), αντι-β-ακτίνης ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ, USA), αντι-κυκλίνης Β1, αντι-κυκλίνης Α, αντι-κυκλίνης D1, αντι-ρ21, αντι-β-τουμπουλίνης, αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα ήταν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. ( CA, USA) και Alexa Fluor® 594-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα από Invitrogen (CA, USA).

Hemin προ-επεξεργασία των κυττάρων του προστάτη και το σύστημα συγκαλλιέργειας

Ένα

στο vitro

bicompartment σύστημα καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο οστικές μεταστάσεις από προστάτη όπως περιγράφηκε προηγουμένως ελαφρώς τροποποιημένο [13]. Εν συντομία, την ημέρα 0 PC3 κύτταρα σπάρθηκαν (10.500 κύτταρα /cm

2) σε ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας (0.4-mm πόρων? Falcon /Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) και την ημέρα 1 ήταν κατεργάζεται με αιμίνη (80 μΜ, Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA), ένας ισχυρός επαγωγέας της ΗΟ-1 (PC3 Hem). Έλεγχοι λάβει φρέσκο ​​μέσο. Οι ΟΔΣ επίσης σπάρθηκαν την ημέρα 1 σε πλάκες καλλιέργειας ιστού (7300 κυττάρων /cm

2). Την ημέρα 2, τα ένθετα που περιέχει τα κύτταρα PC3 (προ-επεξεργασία ή όχι με αιμίνη) πλύθηκαν διεξοδικά με PBS. Στη συνέχεια, τα ένθετα τοποθετήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστού που περιέχει τις ΟΔΣ έτσι ώστε οι δύο διαφορετικοί τύποι κυττάρων μοιράστηκαν το μέσο καλλιέργειας, αλλά δεν ήταν σε φυσική επαφή. Συν-καλλιέργεια των PC3 κυττάρων με ΟΔΣ διεξήχθη με α-ΜΕΜ συν 2% FBS για 24 ώρες. Την ημέρα 3, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και διαφορετικές παραμέτρους αναλύθηκαν. Ως έλεγχος, κάθε τύπος κυττάρου (κύτταρα PC3 προεπεξεργασία ή όχι με αιμίνη και ΟΔΣ) αναπτύχθηκε μόνο. Συν-καλλιέργειες κυττάρων C2C12 και PC3 έγιναν υπό τις ίδιες συνθήκες όπως η ΟΔΣ και τα κύτταρα PC3. Οι καλλιέργειες έγιναν εις τριπλούν και κάθε πείραμα αναλύθηκε τρεις φορές.

μιτογόνο αποτίμηση

Ο πολλαπλασιασμός και η σύνθεση του DNA αξιολογήθηκαν με προσθήκη [

3Η] -θυμιδίνης (Amershan Biosciencies) κατά τη διάρκεια της τελικής 3 ώρες συν-καλλιέργειας και την ενσωμάτωση μετρήθηκε όπως περιγράφεται αλλού [14].

απομόνωση RNA και RT-qPCR (αντίστροφη μεταγραφή ποσοτική PCR)

το συνολικό RNA απομονώθηκε με το RNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNAs συντέθηκαν με RevertAid RT (Fermentas) και ενισχύθηκαν με PCR πραγματικού χρόνου ενίσχυση με Taq DNA Polimerase (Fermentas). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Beacon Designer 5 και δοκιμαστεί με UCSC γονιδίωμα Browser Αρχική URL. Η PCR διεξήχθη σε μια μηχανή DNA Opticon (MJ Research). αλληλουχίες Ανθρώπινα εκκινητή δόθηκαν ως ακολούθως: ACTB 5′-AAGATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′-και 5′-3’CATACTCCTGCTTGCTGATCCA? ΗΟ-1 5′-GAGTGTAAGGACCCATCGGA-3′-και 5′-3’GCCAGCAACAAAGTGCAAG? PTHrP 5′-GTCTCAGCCGCCGCCTCAA-3′-και 5′-3’GGAAGAATCGTCGCCGTAAA? υΡΑ 5′-GAGATCACTGGCTTTGGAAAA-3′-και 5′-3’CCAGCTCACAATTCCAGTCA? ΤΟΡ-β1 5′-TACCTGAACCCGTGTTGCTC-3′-και 5′-3’GCGAAAGCCCTCAATTTCCC. αλληλουχίες εκκινητών Mouse δόθηκαν ως ακολούθως: ACTB 5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3′-και 5′-3’CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG? Runx-2 5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3′-και 5′-3’AGGCATTTCGGAGCTCGGCG? ALP 5′-AACCCAGACACAAGCATTCC-3′-και 5′-3’GAGACATTTTCCCGTTCACC? COL1A1 5′-CATGTTCAGCTTTGTGGACCT-3′-και 5′-3’GCAGCTGACTTCAGGGATGT? ΟΟΙ_1Α2 5′-GCAGGTTCACCTACTCTGTCCT-3′-και 5′-3’CTTGCCCCATTCATTTGTCT? OCN 5′-GCAGCTTGGTGCACACCTAG-3′-και 5′-3’GGAGCTGCTGTGACATCCATAC? RANKL 5′-TGATTCATGTAGGAGAATTAAACAGG-3′-και 5′-3’GATGTGCTGTGATCCAACGA? OPG 5′-GAAGGGCGCTACCTTGAGAT-3 ‘και 5′-GCAAACTGTATTTCGCTCTGG-3′? CSF-1 5′-CAACAGCTTTGCTAAGTGCTCTA-3’και 5′-CACTGCTAGGGGTGGCTTTA-3′? OPN 5′-CTTTCACTCCAATCGTCCCTA-3′-και 5′-3’GCTCTCTTTGGAATGCTCAAGT? CCL2 5′-TGCTACTCATTAACCAGCAAGAT-3′-και 5′-3’TGCTTGAGGTGGTTGTGGAA? IL-6 5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAGTT-3′-και 5′-3’GAAGTAGGGAAGGCCGTGG? MnSOD 5′-CCACACATTAACGCGCAGATC-3′-και 5’TAACATCTCCCTT GGCCAGAGC-3′? καταλάση 5′-TTGCTGAAGTTGAACAGATGG-3′-και 5’-3’ATCACGCTGGTAGTTGGC.

Western

ανάλυση κηλίδος

Για στύπωμα Western, 50 μα πρωτεΐνη διαχωρίστηκε σε γέλες 12% Τπδ-γλυκίνης πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (BIORAD Powerpac Basic). Οι συγκεκριμένες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με χημειοφωταύγεια (Amersham) όπως περιγράφεται προηγουμένως [10].

πλασμίδια, επιμολύνσεις και αναφοράς λουσιφεράσης δοκιμασία

Ένα μόρφωμα γονιδίου αναφοράς TOP-φλας που περιέχει τέσσερις θέσεις πρόσδεσης συναίνεση TCF, μια ελάχιστη θέση πρόσδεσης Fos και ένας δημοσιογράφος λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε [15]. Μια FOP-φλας κατασκεύασμα με μία μεταλλαγμένη θέση πρόσδεσης TCF χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Ένα πλασμίδιο ρεπόρτερ που περιέχει 6 αντίγραφα του DAF-16 οικογένεια πρωτεϊνών δέσμευσης στοιχείο (FOXO-Ιυο) στον φορέα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας pGL3-βασικό με μια ελάχιστη πλαίσιο ΤΑΤΑ [16] παρασχέθηκε ευγενώς από τον B. Burgering, University Medical Center, Utrecht, Ολλανδία . Λουσιφεράσης κατασκευάσματα ρεπόρτερ εισήχθησαν σε κύτταρα C2C12 με παροδική επιμόλυνση χρησιμοποιώντας 8 μα ΡΕΙ και 4 μg πλασμιδίου. Μετά από 6 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και το C2C12 συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα PC3 προεπεξεργασία ή όχι με αιμίνη ή καλλιεργούνται μόνα για 24 ώρες. κύτταρα C2C12 στη συνέχεια συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε λύση με 40 μΐ Steady Glo λουσιφεράσης System (Promega, Madison, WI, USA). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε ένα φωτόμετρο (Glomax πολλαπλών Detection System? Promega). Ως θετικός έλεγχος του TCF δέσμευσης ενεργοποίησης θέσεις, ΟΔΣ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LiCl 10 mM για 24 ώρες και του FOXO-Luc ενεργοποίηση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε H

2O

2 100 μΜ για 24 ώρες. Κάθε μορφομετατροπή έγινε εις τριπλούν και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε ολική πρωτεΐνη προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία Bradford.

Αξιολόγηση της αντιδραστικά είδη οξυγόνου με κυτταρομετρία ροής

Μετά την συν-καλλιέργεια, οι ΟΔΣ πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 10 μΜ 2 ‘, 7’- Διχλωροφλουορεσκεΐνη διοξεικό (CM2-DCFHDA? Invitrogen-Molecular Probes

TM) για 1 ώρα στους 37 ° C. Τα κύτταρα tripsined και επαναιωρήθηκαν με PBS. Τα επίπεδα του H

2DCFDA μετρήθηκαν με citometry ροή στο κανάλι FITC.

κυτταρικού κύκλου

Μετά την συν-καλλιέργεια, ΟΔΣ μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), και αναλύθηκαν με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17].

ανοσοφθορισμού

ΟΔΣ συν-καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως αλλά σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες. Οι αναλύσεις ανοσοφθορισμού διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Ευρεία μικροσκόπιο πεδίου διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus IX71 με στόχο εμβάπτιση σε νερό (UPLSAPO 60XW 1,2 AN, Όλυμπος). Εικόνες ελήφθησαν με την κάμερα Hamammatsu Orca-ER χρησιμοποιώντας το λογισμικό Andor IQ και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την παρουσίαση με ImageJ (https://rsb.info.nih.gov, National Institutes of Health).

ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις

η ανοσοϊστοχημική τεχνική διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [9,10]. Για την ποσοτική ανάλυση, ο συνολικός αριθμός των οστεοβλαστών σε τουλάχιστον 6 πεδία μετρήθηκε και το ποσοστό των οστεοβλαστών με θετικές ανοσοαντιδραστικότητα για την μελετήθηκε γονίδιο υπολογίστηκε.

πολιτισμό οργάνων

θόλου του κρανίου από 4-ημερών CD1 νεογνά ποντικού ήταν ειδικούς φόρους κατανάλωσης, κομμένα στη μέση και τοποθετούνται σε μέσο bgj (Sigma Aldrich) που περιέχει 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού σε ένα ένθετο κυτταρικής καλλιέργειας ότι αναστέλλει το όργανο των οστών μεταξύ ατμόσφαιρας και μέσο για τη βέλτιστη CO

2 συναλλάγματος. Το μισό από κάθε θόλου του κρανίου ήταν συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα PC3 προεπεξεργασία με αιμίνη και το άλλο μισό με μη επεξεργασμένα κύτταρα PC3. Άλλες calvarias τοποθετήθηκαν σε μέσο bgj περιέχει 0.1% αλβουμίνη βόειου ορού και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Άλλες μισά έλαβαν θεραπεία με ινσουλίνη 20 μg /ml χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι σχηματισμού οστού. Η αντίστοιχη καλλιέργεια PC3 και το μέσο αλλάζονται κάθε 2 ημέρες και τερματίστηκε το πείραμα στο τέλος των 7 ημερών. Εκείνη την εποχή, τα μισά θόλο του κρανίου σταθεροποιήθηκαν, απασβεστωμένες, εγκλεισμένα σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν, κηλιδώθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη ή ανοσοϊστοχημική stainned και αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

In vivo

προστάτη μοντέλο intrabone καρκίνου

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα αποδεκτά πρότυπα φροντίδας των ζώων και εγκρίθηκαν από το φροντίδα ζώων θεσμικές και Χρήση

Επιτροπής του Πανεπιστημίου του Τέξας MD Anderson Κέντρο καρκίνου. PC3HO-1 ή PC3βgal κύτταρα ενέθηκαν μέσα τα μηριαία οστά αρσενικών δΟΙϋ ποντικών (Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [13]. 3 × 10

5 κύτταρα προστάτη ανά ποντικό εγχύθηκαν με βελόνα 28-gauge μέσα στα απομακρυσμένα άκρα των δεξιά μηριαία οστά από 6- έως 8-εβδομάδων άθικτους αρσενικούς SCID ποντίκια (η = 7 ανά ομάδα) σύμφωνα με τις διαδικασίες περιγράφονται αλλού. Ο σχηματισμός οστού εκτιμήθηκε με ανάλυση ακτίνων-Χ. Στο τέλος του πειράματος, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αυχενική εξάρθρωση μετά από αναισθησία με ισοφλουράνιο, (που εξέδωσε το ανοικτού * μέθοδος σταγόνα *) μετά από το οποίο αφαιρέθηκαν τα πίσω πόδια τους και τους ιστούς των μυών ανατέμνονται από τα οστά του τόσο η εγχυθεί και ελέγχου οπίσθια άκρα των ποντικών που φέρουν ξενομοσχεύματα του μηριαίου. Οι αποσυντίθενται οστά στη συνέχεια υπέστησαν επεξεργασία για ιστολογική.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα δίδονται ως μέση τιμή ± SD από 3 ξεχωριστά ανεξάρτητα πειράματα εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να εξακριβωθεί η στατιστική σημαντικότητα με ένα κατώτατο όριο των

P

& lt? 0,05 (*),

P

& lt? 0.01 (**) και

P

& lt ? 0.001 (***)

Αποτελέσματα

ΗΟ-1 έκφραση σε κύτταρα PC3 παρεμποδίζει ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων επί του πολλαπλασιασμού των οστεοβλαστών

In vivo

, τα κύτταρα PC3 παράγουν κυρίως επιδράσεις επαναρρόφησης οστού που οδηγεί σε οστεολυτικές βλάβες των οστών [18].

In vitro

, ήταν καλά τεκμηριωμένο ότι όταν ΟΔΣ συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα PC3, ο αριθμός των ΟΔΣ μειώθηκε σημαντικά [13]. Προκειμένου να αναλυθεί η επίδραση της ΗΟ-1 για την αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων PCa και οστεοβλάστες, ΗΟ-1 έκφραση σε κύτταρα PC3 προκλήθηκε με προ-κατεργασία με αιμίνη (PC3 Hem) (80 μΜ, 24 ώρες). PC3 Hem και τα κύτταρα ελέγχου ήταν τότε συν-καλλιεργήθηκαν με ΟΔΣ κατά τη διάρκεια 24 h. Επιβεβαιώσαμε την ανασταλτική δράση των κυττάρων PC3 επί του πολλαπλασιασμού των οστεοβλαστών, όπως εκτιμάται από

3Η-θυμιδίνης και τον αριθμό των κυττάρων (57% και 28%,

P

& lt? 0,05? Αντιστοίχως) (Σχήμα 1 Α & amp? B ). Αισθητά, ο συν-καλλιέργεια των ΟΔΣ με PC3 Hem αποκατασταθεί πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών σε επίπεδα που βρέθηκαν στο ΟΔΣ αυξάνεται μόνο (amp Σχήμα 1 Α &? Β), περαιτέρω έμφαση στην προ-ομοιοστατική ρόλο της ΗΟ-1. Η επαγωγή της ΗΟ-1 έκφραση σε κύτταρα PC3 επιβεβαιώθηκε σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Εικόνα 1).

Τα πειράματα έγιναν σε ΟΔΣ καλλιεργούνται μόνο (PMO), συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 (PMO PC3) ή με PC3 προ-επεξεργασμένα με αιμίνη (PMO PC3 Hem). Α: Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με

ενσωμάτωση 3Η-θυμιδίνης στα ΟΔΣ μετά από καλλιέργεια 24 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό της μονοκαλλιέργειας ΟΔΣ ορίζεται σε 100%. Β: ο αριθμός των κυττάρων ΟΔΣ. C: ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-κυκλίνης Β1, Α, και D1 και αντι-ρ21

WAF1 /Cip1 αντισώματα. Οι αριθμοί κάτω από τις ζώνες υποδεικνύει την ποσοτικοποίηση ομαλοποιήθηκε σε β-τουμπουλίνης και ΟΔΣ μόνο. Ένας εκπρόσωπος από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (Σημαντική διαφορά, *

P

& lt? 0,05? Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά, NS)

Η

Οι αναλύσεις των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε κυτταρικό κύκλο. ρύθμιση με ανοσοκηλίδωση σε ΟΔΣ μετά από συν-καλλιέργεια με PC3 Hem έδειξαν αύξηση στα επίπεδα του κυκλίνη Α, κυκλίνη Β και κυκλίνη D1, με ταυτόχρονη μείωση της ρ21

έκφραση WAF1 /Cip1 σε σύγκριση με ΟΔΣ αναπτύχθηκαν σε συν-καλλιέργεια με τα κύτταρα ελέγχου PC3 (Εικόνα 1Γ). Επιπλέον, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ΟΔΣ μετά από συν-καλλιέργεια με PC3 Hem επιδείξει σημαντικά αυξημένη σε G2 συσσώρευση /M σε σύγκριση με ΟΔΣ συν-καλλιέργεια με κύτταρα ελέγχου PC3 (

P

& lt? 0,05) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) . Όλα αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΗΟ-1 έκφραση σε κύτταρα προστάτη επάγει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε ΟΔΣ, αποκαθιστώντας τον ρυθμό ανάπτυξης του ΟΔΣ μόνο. Αξίζει να παρατηρήσουμε ότι ο αριθμός των κυττάρων PC3 δεν τροποποιήθηκε στις συνθήκες διαφορετικές συν-καλλιέργειας αναλύθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ΗΟ-1 έκφραση σε κύτταρα PC3 δεν αλλοιώνει τα αποτελέσματα των καρκινικών κυττάρων σε οστεοβλάστες διαφοροποίηση

επίπεδα

Αντίγραφο των διαφόρων οστεοβλάστες συγκεκριμένων γονιδίων εκτιμήθηκαν με RT-qPCR. Η έκφραση του οστεοβλαστών ειδικού παράγοντα μεταγραφής Runx-2, ενός πρώιμου δείκτη διαφοροποίησης (αλκαλική φωσφατάση, ALP), των δεικτών αργά διαφοροποίησης που εμπλέκονται στην εναπόθεση κολλαγονούχου μήτρας (κολλαγόνο τύπου Ι και κολλαγόνο τύπου II) και εναπόθεση μη κολλαγονούχων μήτρα (οστεοκαλσίνη , OCN) αναλύθηκε. Βρήκαμε ότι η έκφραση Runx-2 αυξήθηκε σε ΟΔΣ συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 Hem (130%,

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 2 Α), αλλά δεν υπάρχουν διαφορές ανιχνεύθηκαν στα επίπεδα του ALP, κολλαγόνο τύπου Ι και II σε ΟΔΣ αυξάνεται μόνο του ή σε συν-καλλιέργεια με PC3 Hem ή κύτταρα ελέγχου PC3 (Εικόνα 2 BD). επίπεδα OCN μειώθηκαν σημαντικά σε ΟΔΣ συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 Hem ή PC3 μάρτυρες (81% και 68%,

P

& lt? 0,01? αντιστοίχως) (Σχήμα 2Ε). Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [13,19,20], ΟΔΣ συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα PC3 εμφάνισε μια μείωση του σχηματισμού ασβεστοποιημένο μήτρα όπως εκτιμάται με χρώση νοη Kossa σύγκριση με ΟΔΣ αυξανόμενη μόνο (Σχήμα 2). Δεν ανιχνεύθηκε μεταβολή στην ασβεστοποιημένη μήτρα όταν ΟΔΣ συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 Hem (Σχήμα 2). Αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι PC3-εκκρίνονται παράγοντες, φέρεται να είναι υπεύθυνη για την αναστολή των οστεοβλαστών διαφοροποίηση [13], δεν τροποποιούνται όταν ΗΟ-1 προκαλείται σε κύτταρα όγκου.

Τα πειράματα έγιναν σε ΟΔΣ καλλιεργούνται μόνα (PMO), συν-καλλιεργημένα με PC3 (PC3 PMO) ή με PC3 προ-επεξεργασία με αιμίνη (PMO PC3 Hem). Ολικό RNA εκχυλίστηκε και Runx-2 (Α), ALP (Β), κολλαγόνο τύπου Ι (C), κολλαγόνο τύπου II (D) και OCN (Ε) mRNA επίπεδα αναλύθηκαν με RT-qPCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και εκφράστηκαν ως πλάσια επαγωγή σχέση με ΟΔΣ. Ένας εκπρόσωπος από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (Σημαντική διαφορά, *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01).

Η

HO -1 έκφραση σε κύτταρα PC3 μειωμένα τα επίπεδα των παραγόντων οστεοκλάστες διαμόρφωσης σε οστεοβλάστες

ενεργοποιητή υποδοχέα του πυρηνικού παράγοντα κάππα Β συνδέτη-(RANKL) και οστεοπροτεγερίνη (OPG) παράγονται από στρωματικά οστεοβλαστικά κύτταρα /. RANKL έχει αποδειχθεί για να ενεργοποιήσετε ώριμες οστεοκλάστες και να μεσολαβήσει οστεοκλαστογένεσης. OPG δρα ως δόλωμα υποδοχέας για RANKL [21]. Η συν-καλλιέργεια των κυττάρων ΟΔΣ και Hem PC3 παρήγαγε μια αύξηση στην RANKL και μια μείωση στα επίπεδα μεταγραφής OPG σε οστεοβλάστες? το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε μετά από συν-καλλιέργεια των ΟΔΣ με τα κύτταρα ελέγχου PC3 (Εικόνα 3 A & amp? Β).

Τα πειράματα έγιναν σε ΟΔΣ μεγαλώσει μόνη της (PMO), συν-καλλιεργημένα με PC3 (PMO PC3) ή με PC3 προ-επεξεργασία με αιμίνη (PMO PC3 Hem). Ολικό RNA εκχυλίστηκε και RANKL (Α), OPG (Β), CSF-1 (C), OPN (D), CCL2 (Ε) και IL-6 (Ρ) mRNA επίπεδα αναλύθηκαν με RT-qPCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και εκφράστηκαν ως πλάσια επαγωγή σχέση με ΟΔΣ. Ένας εκπρόσωπος από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (Σημαντική διαφορά, *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt ?. 0.001)

η

Οι οστεοβλάστες παράγουν επίσης κυτοκίνες και άλλους παράγοντες ανάπτυξης που προωθούν την ανάπτυξη οστεοκλαστών και ενεργοποίησης, όπως παράγοντα διέγερσης αποικιών-1 (CSF-1), οστεοποντίνη (ΟΡΝ), χημειοκίνη (CC μοτίβο ) συνδετήρα 2 (CCL2) και η ιντερλευκίνη-6 (IL-6). Βρήκαμε ότι ΟΔΣ συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 Hem εκφράζουν σημαντικά επίπεδα χαμηλότερα μεταγραφής του CSF-1, ΟΡΝ και CCL2, σε σύγκριση με ΟΔΣ καλλιεργούνται μόνο (52%,

P

& lt? 0,01? 53%,

P

& lt? 0.001 και 52%,

P

& lt? 0,05? αντίστοιχα). Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές ανιχνεύθηκαν σε επίπεδα IL-6 (Σχήμα 3 C-F).

κύτταρα του προστάτη εκφράζουν επίσης γονίδια που έμμεσα εμπλέκονται σε οστεοκλάστες διαφοροποίησης. Επομένως, αποφασίσαμε να διερευνήσει την έκφραση σε PC3 κύτταρα παραθυρεοειδούς ορμόνης που σχετίζονται με πεπτίδιο (PTHrP), τύπου ουροκινάσης ενεργοποιητή πλασμινογόνου (υΡΑ) και ο μετασχηματιστικός αυξητικός παράγοντας βήτα 1 (TGF-β1) με RT-qPCR και τη δραστικότητα της μεταλλοπρωτεάσης μήτρας 9 (ΜΜΡ9) από zymography. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα επίπεδα μεταγραφές των επιλεγμένων γονιδίων ή της δραστηριότητας των ΜΜΡ9 (Σχήμα 4), υποδεικνύοντας ότι αυτά τα γονίδια που εμπλέκονται σε οστεοκλάστες διαμόρφωση δεν μεταβάλλονται σε κύτταρα PC3 υπό τις πειραματικές συνθήκες είτε προ-επεξεργασία ή όχι με αιμίνη καλλιέργεια μόνο του ή σε συν-καλλιέργεια.

PC3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε προ-αγωγή με αιμίνη (80 μΜ, 24 ώρες, μαύρες στήλες) ή όχι (έλεγχος, λευκές στήλες) και συν-καλλιεργήθηκαν ή όχι με ΟΔΣ. Ολικό RNA εκχυλίστηκε και PTHrP (Α), υΡΑ (Β) και ΤΟΡ-β1 (Γ) τα επίπεδα mRNA αναλύθηκαν με RT-qPCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και εκφράστηκαν ως πλάσια επαγωγή σχέση με PC3. Η ζελατίνη ζυμογραφία έγινε για να εκτιμηθεί η δραστικότητα ΜΜΡ9 σε ρυθμισμένα μέσα από PC3 αναπτύχθηκαν μόνο (PC3), προ-επεξεργασμένα με αιμίνη (PC3 Hem) και από ΟΔΣ καλλιεργούνται μόνο (PMO) και συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 προ-αγωγή ή όχι με αιμίνη ( PMO PC3 Hem και PMO PC3, αντίστοιχα). Σαφείς ζώνες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ 1.37.v (NIH) και κανονικοποιούνται σε συνολική πρωτεΐνη. Ένας εκπρόσωπος από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (NS: Καμία σημαντική διαφορά? RV: σχετικές τιμές).

Η

Η έναρξη των οστεοβλαστών οξειδωτικής κατάστασης από συγκαλλιέργεια με αιμίνη προεπεξεργασία PC3 κύτταρα

Οι προηγούμενες εκθέσεις δείχνουν ότι το οξειδωτικό στρες οδηγεί σε μείωση του αριθμού των οστεοβλαστών και ρυθμός σχηματισμού οστού [22]. Προκειμένου να διερευνηθεί εάν τα κύτταρα του προστάτη προκαλούν οξειδωτικό στρες στους οστεοβλάστες, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα συν-πολιτισμού μας για να αναλύσει την έκφραση των γονιδίων αντιοξειδωτικής απόκρισης (MnSOD, καταλάση και ΗΟ-1). Η συν-καλλιέργεια των ΟΔΣ με PC3 Hem ή PC3 ελέγχων αύξησε τα επίπεδα μεταγραφής του MnSOD (134% και 206%,

P

& lt? 0,05? Αντιστοίχως) και η καταλάση (95% και 35%,

P

& lt? 0,05? αντίστοιχα) σε ΟΔΣ (Σχήμα 5 Α & amp? Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, ΗΟ-1 έκφραση πρωτεΐνης σε οστεοβλάστες συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 Hem ή PC3 μάρτυρες επάγεται ισχυρά σε σύγκριση με ΟΔΣ αυξανόμενη μόνο του (Σχήμα 5 C). Για τον προσδιορισμό των οξειδωτικών επίπεδα στρες, η παραγωγή ROS μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής παρακολούθησης H

2DCFDA οξείδωση. Σημαντικά αυξημένα επίπεδα ROS βρέθηκαν σε ΟΔΣ συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 Hem σύγκριση με ΟΔΣ αυξανόμενη μόνο (15%,

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 5 D). Μαζί τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η επαγωγή της έκφρασης ΗΟ-1 σε κύτταρα PC3 απελευθερώνει διαλυτό παράγοντες που οδηγούν σε οξειδωτικό στρες στο ΟΔΣ. Αυτό με τη σειρά επάγει ένα αντιοξειδωτικό απόκριση πιθανώς ευνοούν τον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών [6].

Τα πειράματα έγιναν σε ΟΔΣ καλλιεργούνται μόνο (PMO), συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 (PMO PC3) ή με PC3 προ-επεξεργασμένα με αιμίνη ( PMO PC3 Hem). Ολικό RNA εκχυλίστηκε και MnSOD (Α) και η καταλάση (Β) επίπεδα mRNA αναλύθηκαν με RT-qPCR. Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη και εκφράστηκαν ως πλάσια επαγωγή σχέση με ΟΔΣ. επίπεδα ΗΟ-1 πρωτεΐνη (C) προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Οι αριθμοί κάτω από τις ζώνες υποδεικνύει την ποσοτικοποίηση ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη και ΟΔΣ μόνο. επίπεδα ROS (D) προσδιορίστηκαν σε ΟΔΣ επωάστηκαν με CM2-DCFHDA και μετρήθηκε με citometry ροή στο κανάλι FITC (Σημαντική διαφορά, *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01).

Η

ΗΟ-1 έκφρασης σε κύτταρα PC3 ενεργοποιεί την FOXO στα κύτταρα C2C12

Για τον εντοπισμό μονοπάτια που ενεργοποιούνται από το οξειδωτικό στρες σε οστεοβλάστες σηματοδότησης, αναλύσαμε β-κατενίνης /άξονα FOXO. Αν και κανονικά μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών και του σχηματισμού των οστών, είναι γνωστό ότι το διαλυτό β-κατενίνης αλληλεπιδρά με τους παράγοντες μεταγραφής FOXO σε απόκριση προς οξειδωτικό στρες [6]. Να μελετήσει αυτό το σηματοδοτικό μονοπάτι χρησιμοποιήσαμε ένα κατασκεύασμα αναφοράς με στοιχεία απόκρισης έξι FOXO. Λόγω της δυσκολίας να διαμολύνουν ΟΔΣ, χρησιμοποιήσαμε ένα μη δεσμευμένα μεσεγχυματικά κυτταρική γραμμή, C2C12, είναι σε θέση να διαφοροποιούν στην οστεοβλαστική γράμμωσης [23]. Η συν-καλλιέργεια των κυττάρων C2C12 με PC3 Hem διεγείρεται έντονα τη δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς (Σχήμα 6 Α). Ως θετικό έλεγχο C2C12 καλλιέργειες εκτέθηκαν σε H

2O

2 (100 μΜ) (Σχήμα 6 Α). Τα αποτελέσματα που περιγράφονται εδώ δείχνουν ότι οι διαλυτές παράγοντες που παράγονται από PC3 Hem προκαλέσουν FOXO σηματοδότησης σε οστεοβλάστες.

Άνω πάνελ. Πειράματα έγιναν σε C2C12 που καλλιεργούνται μόνο (C2C12), συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 (C2C12 PC3) ή με PC3 προ-επεξεργασμένα με αιμίνη (C2C12 PC3 Hem). Α: Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα κατασκεύασμα γονιδίου αναφοράς FOXO (FOXO-Luc). H

2O

2 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Β: Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα κατασκεύασμα ανταποκριτή TCF γονίδιο (TOP-φλας) ή αρνητικό μάρτυρα του (FOP-φλας). LiCl ήταν ένας θετικός μάρτυρας. Έξι ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα C2C12 συνκαλλιεργήθηκαν και 24h μετά από συν-καλλιέργεια των κυττάρων C2C12 λύθηκαν και δοκιμασία δραστικότητας λουσιφεράσης έγινε. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε τιμές πρωτεΐνη. Ένας εκπρόσωπος από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα (Σημαντική διαφορά, *

P

& lt? 0,05). Κάτω πάνελ. C: β-κατενίνης κυτταρική κατανομή οπτικοποιήθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού (κόκκινο) του ΟΔΣ καλλιεργούνται μόνο (PMO), συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 (PMO PC3) ή με PC3 προ-αγωγή με αιμίνη (PMO PC3 Hem). Ο πυρήνας σημάνθηκε χρησιμοποιώντας Hoescht χρωστική (πράσινο). Η Συγχώνευση αντιπροσωπεύει τις επικαλυπτόμενες εικόνες. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα για κάθε ομάδα παρουσιάζεται. μπαρ κλίμακας: 30 μm.

Η

Στην κανονική οδό Wnt, τα αποτελέσματα ενεργοποίησης β-κατενίνης στην σταθεροποίηση της πρωτεΐνης μετατόπιση εντός του πυρήνα, όπου αλληλεπιδρά με TCF (παράγοντας Τ-κυττάρων, HMG κουτί) και ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων [24]. Έχει προταθεί ότι FOXO εκτροπή β-κατενίνης από το Wnt κανονικό μονοπάτι [6]. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον Wnt κανονική πορεία στο ΟΔΣ μεταβάλλεται μετά από συν-καλλιέργεια με κύτταρα προστάτη, εξετάσαμε β-κατενίνης υποκυτταρικό εντοπισμό και την ενεργοποίηση TCF σε ΟΔΣ αυξάνεται μόνο του ή σε συγκαλλιέργεια με PC3 Hem και ελέγχου PC3 κύτταρα. Οι εικόνες έδειξαν στο σχήμα 6 C δείχνουν ότι β-κατενίνης βρίσκεται τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα σε όλες τις αναλύθηκαν συνθήκες. Για να αξιολογηθεί η ενεργοποίηση του β-κατενίνης /TCF μονοπάτι χρησιμοποιήσαμε ένα γονίδιο αναφοράς. Εμείς συν-καλλιεργημένα κύτταρα PC3 προεπεξεργασία ή όχι με αιμίνη με κύτταρα C2C12 που είχαν επιμολυνθεί με ένα κατασκεύασμα TCF γονιδίου αναφοράς (TOP-φλας) [15]. κύτταρα C2C12 σε επεξεργασία με LiCl (20 mM) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος και η δραστηριότητα ανταποκριτή FOP-φλας ως αρνητικός έλεγχος. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη δραστηριότητα ανταποκριτή TCF ανιχνεύθηκαν όταν τα κύτταρα C2C12 αναπτύχθηκαν μόνο του ή συν-καλλιεργήθηκαν με PC3 Hem ή ελέγχου PC3 κύτταρα (Σχήμα 6 Β).

Bone εκφύτευμα συν-καλλιέργεια με κύτταρα PC3 επάγει την έκφραση ΗΟ-1

Για να επεκτείνει αυτά τα αποτελέσματα, χρησιμοποιήσαμε μια δοκιμασία καλλιέργειας οργάνων των οστών. PC3 Hem ή κύτταρα ελέγχου PC3 συν-καλλιεργήθηκαν με μοσχεύματα θόλου του κρανίου ποντικού. Η ιστολογική ανάλυση δεν έδειξε διαφορές στο σχηματισμό οστού όταν calvarias αναπτύχθηκαν μόνο (έλεγχος), ή σε συν-καλλιέργεια (Σχήμα 7 Α-Ο). Χρησιμοποιώντας την τεχνική ανοσοϊστοχημεία εμείς επόμενη διερεύνησαν την έκφραση της ΗΟ-1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7 (Ε-Η), το ποσοστό των ενεργών οστεοβλαστών με ΗΟ-1 θετική αντιδραστικότητα ήταν υψηλότερη στην συν-καλλιεργήθηκαν με τα κύτταρα του όγκου από ό, τι στους ελέγχους calvarias.