Αφηρημένο

Εισαγωγή

Στις περισσότερες περιπτώσεις καρκίνων του τραχήλου, του HPV DNA έχει ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του κύτταρα καρκινώματος. Αυτή η μεταλλακτική παρεμβολή αποτελεί ένα πολύ συγκεκριμένο μοριακό δείκτη του DNA του όγκου για κάθε ασθενή. Κυκλοφορούντων DNA του όγκου (ctDNA) είναι μια αναδυόμενη δείκτη της δυναμικής όγκου που ανίχνευσης απαιτεί ειδικές μοριακές μοτίβο. Για να καθοριστεί εάν η αλληλουχία του κόμβου κυττάρου-ιικά θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην κλινική πράξη ως ειδικός δείκτης ctDNA, αναλύσαμε μια σειρά τραχηλικού ορών ασθενών με καρκίνο.

Μέθοδοι και Εκτίμηση

Serum δείγματα των 16 ασθενών που έχουν διαγνωστεί με HPV16 /18 που σχετίζεται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, και για την οποία ο γεωμετρικός τόπος ιική ενσωμάτωση είχε προηγουμένως εντοπιστεί, αναλύθηκαν. Διαδοχική δείγματα ορού, που λαμβάνονται σε διαφορετικούς χρόνους κατά την πορεία της νόσου, ήταν επίσης διαθέσιμα για δύο από αυτές τις περιπτώσεις. ctDNA βρέθηκε σε 11 από 13 ασθενείς με το μέγεθος του όγκου μεγαλύτερο από 20 mm κατά τη διάγνωση, και την ανάλυση των διαδοχικών δειγμάτων ορού έδειξαν ότι η συγκέντρωση ctDNA σε ασθενείς ορό σχετίζονται με τη δυναμική του όγκου.

Συμπεράσματα

Σας αναφέρουμε ότι μεταλλάξεων εισαγωγής HPV αποτελεί ένα πολύ συγκεκριμένο μοριακό δείκτη του ctDNA σε ασθενείς με όγκο του HPV-συνδέονται. Χρησιμοποιώντας αυτήν την πρωτότυπη προσέγγιση, ctDNA ανιχνεύθηκε σε ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου πιο πάνω στάδιο Ι και συγκέντρωση ctDNA βρέθηκε να αντανακλά το φορτίο του όγκου. Εκτός από τη δυνητική προγνωστική και διαγνωστική αξία της, την εισαγωγή μετάλλαξη HPV είναι πιθανό να αποτελέσει ένα νέο μοριακό υποκατάστατο της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου και της υποκλινικής υποτροπής σε HPV-που σχετίζονται με όγκο. Αυτό έχει μεγάλη σημασία στην προοπτική των ειδικών αντι-HPV θεραπεία

Παράθεση:. Campitelli Μ, Jeannot Ε, Peter M, Lappartient Ε, Saada S, de la Rochefordière A, et al. (2012) Ιού των Ανθρώπινων Θηλωμάτων μεταλλάξεων Εισαγωγή: Ειδικοί δείκτης των κυκλοφορούντων DNA των όγκων σε καρκίνο του τραχήλου ασθενείς. PLoS ONE 7 (8): e43393. doi: 10.1371 /journal.pone.0043393

Επιμέλεια: Rui Medeiros, IPO, Inst Λιμάνι Ογκολογίας, Πορτογαλία

Ελήφθη: 23 Φεβρουαρίου 2012? Αποδεκτές: 20 Ιουλ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 24, Αύγ, 2012

Copyright: © Campitelli et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια συνεργασία με το La Maison Goyard και από μια γενναιόδωρη δωρεά από την κα Α Μορεσμό. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την συνεργασία της La Maison Goyard, πολυτελή luggage- maker, μέσα από την εκδήλωση «Un bagage ρίχνουμε Κιουρί». Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Τα Εισαγωγή

Ειδικοί τύποι ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV), που αναγνωρίζεται ως ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας στην τραχήλου της μήτρας νεοπλασία [1]. Στην προ-επεμβατική βλάβες, τα ιικά γονιδιώματα βρίσκονται ως μόρια επισωματικό στον πυρήνα των μολυσμένων κυττάρων. Στις περισσότερες περιπτώσεις διηθητικού καρκινώματος, ωστόσο, οι HPV DNA αλληλουχίες ενσωματώνονται στο κυτταρικό γονιδίωμα [2], [3], [4]. Viral ενσωμάτωση του γονιδιώματος αντιπροσωπεύει έτσι ένα κρίσιμο βήμα στην ογκογένεση [5]. Μια ενιαία μοναδική θέση ιική ενσωμάτωση έχει βρεθεί σε περισσότερο από το 80% των καρκίνων του τραχήλου [6].

Το χαρακτηριστικό κλωνικότητα, ειδικότητα και σταθερότητα διαχρονικά εισαγωγής HPV DNA στο γονιδίωμα των κυττάρων καρκινώματος αποτελούν ένα πολύ συγκεκριμένο γενετικός δείκτης του DNA του όγκου. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι η μετάλλαξη DNA μπορούσε να ανιχνευθεί στο αίμα των ασθενών με όγκους και ότι η ποσότητα των κυκλοφορούντων DNA όγκου (ctDNA) είχε σχέση με τη δυναμική του όγκου [7]. Αυτό ανοίγει μεγάλες προοπτικές για τη χρήση ctDNA ως βιοδείκτη όγκου σε ασθενείς με καρκίνο [8]. Σε προχωρημένο στάδιο του καρκίνου του τραχήλου, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει στοιχεία κυκλοφορούντος HPV DNA (c-HPV DNA) [9], [10], [11] ή κυκλοφορούντος HPV ΚΝΑ [12]. Αυτές οι μελέτες έδειξαν ότι ήταν δυνατόν να ανιχνευθεί ιικών νουκλεϊκών οξέων στο αίμα των ασθενών με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, αλλά λόγω της έλλειψης ευαισθησίας [10], [13], [14] και αμφισβητήσιμη ειδικότητα [11], [13], η δεδομένα ήταν μικρή κλινική σημασία. Σε αυτό το πλαίσιο, σχεδιάσαμε μια μελέτη για να εκτιμηθεί η αξία του μετάλλαξη παρεμβολής του HPV DNA ως δείκτης για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ctDNA στην διάγνωση στον ορό των ασθενών με διηθητικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Επίσης κοίταξε για τις διακυμάνσεις της συγκέντρωσης ctDNA κατά τη διάρκεια της νόσου. Επιπλέον, για να συγκριθεί η ευαισθησία της αρχικής και των ειδικών μας δοκιμασία σε εκείνες που βασίζονται στην ανίχνευση του HPV DNA αλληλουχιών, μπορούμε επίσης να εξεταστεί για c-HPV DNA χρησιμοποιώντας εκκινητές που βρίσκονται στο γονίδιο Ε7 HPV16 /18.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ασθενείς και οι όγκοι

από μια σειρά από HPV16 (14 περιπτώσεις) ή HPV18 (2 περιπτώσεις) καρκινώματος του τραχήλου συσσωρευτεί μεταξύ του 2001 και του 2011, προσδιορίσαμε το ιικό γενετικό τόπο εισαγωγής χρησιμοποιώντας το DIPS- μέθοδος PCR [15]. Στις 16 περιπτώσεις, τα δείγματα ορού που λαμβάνονται κατά τη διάγνωση πριν από τη θεραπεία ήταν διαθέσιμα. Σε δύο από αυτές τις περιπτώσεις, επιπλέον διαδοχική δειγμάτων ορού που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια της νόσου ήταν επίσης διαθέσιμα. Δεκατέσσερις όγκοι ήταν επεμβατική πλακώδες καρκίνωμα και δύο ήταν αδενικό. Σύμφωνα με τη γαλλική ρύθμιση, όλοι ασθενείς ενημερώθηκαν και δεν προέβαλαν αντιρρήσεις ως προς βιολογικών δειγμάτων τους που χρησιμοποιούνται για την έρευνα. Η ιικό φορτίο, σε δείγματα βιοψίας του όγκου εκτιμήθηκε με ποσοτική PCR (qPCR) χρησιμοποιώντας εκκινητές σχεδιασμένους στο γονίδιο Ε7 HPV16 /18, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Από ολοκληρωμένο αλληλουχίες HPV DNA μπορεί να παρουσιάσει ενίσχυση στον τόπο εισαγωγής, αριθμός μεταλλάξεων αντίγραφο εισαγωγής αξιολογήθηκε επίσης με qPCR χρησιμοποιώντας εκκινητές και τα αντιδραστήρια που παρέχονται στον Πίνακα S1.

KLK3

κατάσταση γονίδιο λήφθηκε ως σημείο αναφοράς δύο αντίγραφα.

ορού αναλύσεις DNA

DNA απομονώθηκε από 200 μl ορού με QIAamp Ελάχιστη Εκλούστε Kit Virus Spin (Qiagen @ , Courtaboeuf, Γαλλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το στάδιο έκλουσης έγινε με 25 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος που παρέχεται. Απομονωμένα συγκεντρώσεις DNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μια ποσοτική PCR σύστημα (RT-qPCR) Real-Time βασίζεται στο Long διάκενα μεταξύ Πυρηνική στοιχεία ανίχνευσης (LINE) αλληλουχία [16]. Αραιώσεις του φυσιολογικού ανθρώπινου DNA χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα και PCR πραγματοποιήθηκε σε 25 μΙ με Sybr® Πράσινο PCR Master Mix (Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, France), εκκινητές μίγματος (1 μΜ) και 2 μΙ εκλουσμένου DNA με το ακόλουθες συνθήκες κύκλου: 15 λεπτά στους 95 ° C και 45 κύκλους (15 s, 95 ° C? 15 s, 61 ° C? 1 λεπτό, 72 ° C) που ακολουθείται από ένα στάδιο διαχωρισμού (15 s, 95 ° C? 15 s , 60 ° C? 15 s, 95 ° C). RT-qPCR δοκιμασία χρησιμοποιώντας Sybr®Green (Applied Biosystems) σχεδιάστηκε για να ενισχύσει ειδικά αλληλουχίες συνδέσεως κυττάρου-ιού DNA (έκλουση DNA 2 μΙ) ή HPV16 Ε7 DNA (έκλουση DNA 2 μΐ) με 400 ηΜ του κάθε εκκινητή σε ένα τελικό όγκο 25 μλ. Κάθε σετ εκκινητών δοκιμάστηκε σε σειριακές αραιώσεις (από 50 ng /μl σε 0,5 pg /μl) του ταιριάζουν DNA όγκου σε Tris-EDTA ρυθμιστικό διάλυμα με συνθήκες θερμοκυκλοποιητή 15 λεπτά στους 95 ° C και 45 κύκλους (15 s, 95 ° C ? 1 λεπτό, 62 ° C) που ακολουθείται από ένα στάδιο διαχωρισμού (15 s, 95 ° C? 1 λεπτό, 60 ° C? 15 s, 95 ° C). Οι αλληλουχίες των εκκινητών και

2 συγκεντρώσεις MgCl δίνονται στον Πίνακα S1. Η ευαισθησία της δοκιμασίας PCR έπρεπε να είναι ίση ή μεγαλύτερη από 5 pg /μl για την επικύρωση των σύνολα εκκινητών. Προκειμένου να αυξηθεί η ευαισθησία της ανίχνευσης, 10 επαναλήψεις δοκιμασίας RT-qPCR διεξήχθησαν σε κάθε δείγμα ορού για την ανίχνευση ctDNA και του c-HPV DNA. Η ποσότητα του ctDNA σε 200 μΙ ορού αντιστοιχούσε στο άθροισμα της ctDNA ανιχνεύεται σε κάθε θετική αντίγραφο. Η συγκέντρωση των ctDNA τελικά εκφράζεται σε αντίγραφα /ml ορού.

Αποτελέσματα

Κλινικά, ΦΥΓΩ στάδια ήταν από Ιβ IVa και μία περίπτωση ήταν μια πυελική υποτροπή του τραχήλου της μήτρας SCC (Πίνακας 1). Το μέγεθος του όγκου κυμαινόταν από 10 έως 120 mm. Οι τιμές (SCC) διατίθεται πλακωδών αντιγόνο καρκίνωμα κυμαίνονταν από 1,1 ng /ml έως 17,4 ng /ml (όριο θετικότητας: 1,5 ng /ml). HPV DNA ενσωματώθηκε σε διαφορετικούς τόπους (Πίνακας 1). Το ιικό φορτίο σε δείγματα όγκων κυμαινόταν 0,5 με 160 γονιδιώματα HPV 16 ανά κύτταρο (0.8 10

6 – 24 Οκτ

6ης HPV16 αντίγραφα /μg DNA). Η συγκέντρωση των κυκλοφορούντων DNA ξενιστή κυμαινόταν από 6 10

1 να 77 10

3 αντίγραφα /ml στον ορό (Πίνακας 1). Ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει ctDNA σε 11 από τους 16 ασθενείς που διαγνώστηκαν με διηθητικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Τρεις αρνητικές περιπτώσεις αντιστοιχούσε στο καρκίνωμα πρώιμο στάδιο (Ib) με ένα μέγεθος που κυμαίνεται από 10 έως 20 mm (Πίνακας 1). Η συγκέντρωση του ορού ctDNA κυμαινόταν από 5 έως 890 αντίγραφα /ml ορού, που αντιπροσωπεύουν από 0,01% έως 25% των κυκλοφορούντων DNA ξενιστή. c-HPV DNA ανιχνεύθηκε σε 13/16 περιπτώσεις, οι τρεις περιπτώσεις πρώιμο στάδιο παραμένει αρνητική. Οι τιμές κυμαινόταν από 5 έως 8,5 10

3 αντίγραφα /ml στον ορό (Πίνακας 1). Οι τρεις υψηλότερες τιμές (8,5, 3,5 και 3,4 10

3 αντίγραφα /ml) αντιστοιχούσαν σε περιπτώσεις με υψηλό ιικό φορτίο σε δείγματα βιοψίας του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει ότι το DNA που προέρχεται από μόρια επισωματικό ανιχνεύθηκε επίσης με την δοκιμασία.

δυναμική ctDNA αναλύθηκαν σε διαδοχικές δείγματα ορού σε δύο ασθενείς. Ο πρώτος ασθενής έλαβε συνδυασμό χημειοραδιοθεραπεία ακολουθείται από μήτρα-κολπική βραχυθεραπεία και η χειρουργική επέμβαση (Σχήμα 1, περίπτωση n ° 6). Η τιμή ctDNA μειώθηκε κατά τη διάρκεια θεραπείας και ήταν άκυρο με το τέλος της θεραπείας κατά τον οποίο χρόνο παρατηρήθηκε μία πλήρης ιστολογική απόκριση στο παρασκεύασμα υστερεκτομή. Δύο μήνες αργότερα, ο ασθενής ανέπτυξε μια μετάσταση στο ήπαρ 8 mm και ctDNA έγινε ανιχνεύσιμο και πάλι. Η αύξηση των επιπέδων της ctDNA βρέθηκαν αργότερα, όταν ο ασθενής ανέπτυξε κοιλιακή υποτροπή κόμβο. Τα ίδια δυναμική παρατηρήθηκαν κατά το δεύτερο ασθενή αντιμετωπίζεται αποκλειστικά με χημειοακτινοθεραπεία (Σχήμα 1, περίπτωση n ° 13). Των τόκων κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης, ενώ η πυελική MRI δεν έδειξαν καμία σημαντική τροποποίηση, παρατηρήθηκε αύξηση της ctDNA. Λίγο αργότερα ο ασθενής παρουσίασε ένα κοιλιακό υποτροπής που σχετίζονται με τα υψηλά επίπεδα των ctDNA. Τα ίδια δυναμική παρατηρήθηκαν με c-HPV DNA.

Η

Συζήτηση

Αναφέρουμε εδώ ότι, με τη χρήση μετάλλαξη HPV ολοκλήρωση ως μοριακού δείκτη, ctDNA μπορούσε να ανιχνευθεί στον ορό των περισσοτέρων ασθενών που έχουν διαγνωστεί με διηθητικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας κατά το στάδιο Ib και ότι το ποσό της ctDNA αντανακλάται δυναμικής όγκου. Δεδομένου ότι η τοποθεσία ιική ενσωμάτωση είναι μοναδική για κάθε ασθενή, ο δείκτης αυτός είναι πολύ ειδικά, πολύ περισσότερο από το SSC δείκτης [17]. Αναφορικά με την ευαισθησία, θα μπορούσαμε να ανιχνεύσουν ctDNA σε 11 από 13 (85%) ασθενείς με σταδίου ΙΙ-ΙV όγκων, ένα ποσοστό σε μεγάλο βαθμό υψηλότερο από το 12% [9], 18% [13], 20% [14] και 50% [ ,,,0],11] της θετικότητας αναφερθεί μέχρι τώρα για c-HPV DNA. Η πρακτική της 10 επαναλήψεων για την ανίχνευση ctDNA σε κάθε δείγμα ορού μπορεί να ευθύνεται για την αυξημένη ευαισθησία ποσοτικού προσδιορισμού μας. Για παράδειγμα, στις περισσότερες των θετικών περιπτώσεων μας, λιγότερο από το 50% των επαναλήψεων που παρέχονται αποδείξεις ctDNA. Ωστόσο, σε 2 από τις 13 περιπτώσεις με το μέγεθος του όγκου & gt? 20 mm, δεν ctDNA βρέθηκε ενώ c-HPV ανιχνεύτηκε DNA. Και στις δύο περιπτώσεις αντιστοιχούσαν σε όγκους με χαμηλό φορτίο εισαγωγής HPV (≤1 αντίγραφο /κύτταρο). Σε αντίθεση, τα κύτταρα τραχηλικού καρκινώματος συχνά φιλοξενούν δωρεάν HPV γονιδιωμάτων που απελευθερώνονται επίσης στη γενική κυκλοφορία, αυξάνοντας έτσι το ποσοστό των ανίχνευση των κυκλοφορούντων DNA του ιού. Παρ ‘όλα αυτά αυτό το περιουσιακό στοιχείο μπορεί να αντισταθμιστεί από τον κίνδυνο της ψευδούς θετικότητας. Για παράδειγμα, οι προσδιορισμοί βασίζονται στην ανίχνευση επί HPV DNA παρείχε ψευδείς θετικούς ρυθμούς 13,5% σε φυσιολογικά άτομα και 33% σε ασθενείς που CIN3 [11]. Επιπλέον, η συχνή αποκλίσεις μεταξύ HPV γονότυπων βρεθεί στον καρκίνο του τραχήλου και στον ορό τους ίδιους ασθενείς έχουν επίσης αναφερθεί [13]. Αυτές οι δυσκολίες θα πρέπει να ξεπεραστούν με κατάλληλους ελέγχους εξειδίκευσης και, για την κλινική σκοπό αυτό, η ανάλυση c-HPV DNA μπορεί να αντιπροσωπεύουν μια χρήσιμη εναλλακτική λύση όπου είναι δύσκολη η ταυτοποίηση ή η χρήση των αλληλουχιών συνδέσεως ιού-κυττάρου.

Ανάλυση διαδοχικής δείγματα ορού έδειξαν τη δυναμική των αποτελεσμάτων: η συγκέντρωση των ctDNA μειώθηκε υπό θεραπεία και αυξημένο κατά το χρόνο της υποτροπής. Η θετικότητα των ctDNA προηγήθηκε ακτινολογική υποτροπή σε μία περίπτωση και σχετίζεται με μετάσταση στο ήπαρ 8 mm το άλλο. Tumor DNA θα μπορούσαν πιο εύκολα να απελευθερώνεται από ιστό όγκου που αντιστοιχεί σε υποτροπή ή μετάσταση από την πρωτογενή αλλοίωσης. Θα μπορούσε επίσης να προέρχονται από κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων. Μια ειδική και ποσοτική μοριακό δείκτη του ctDNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ακολουθήσει την πορεία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Κατά τη διάρκεια της αρχικής θεραπείας, ctDNA μπορεί να βοηθήσει να αξιολογήσει την πρόγνωση της νόσου και την ευαισθησία του όγκου στη θεραπεία. Μεγαλύτερες προοπτικές μελέτες θα είναι απαραίτητες για την επικύρωση αυτό το βοηθητικό πρόγραμμα. Κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης, συγκέντρωση ctDNA μπορούσε να είναι ένα πολύ συγκεκριμένο υποκατάστατος δείκτης της ελάχιστης υπολειμματικής νόσου και υποκλινική υποτροπής. Αυτό έχει μεγάλη σημασία στην προοπτική της ειδική θεραπεία αντι-HPV [18] των οποίων το δυναμικό απόδοσης εξαρτάται από την μάζα του όγκου σε μεγάλο βαθμό. Αυτές οι προσεγγίσεις θα μπορούσαν εύκολα να επεκταθεί και σε άλλους τύπους HPV που σχετίζονται με όγκους, πρωκτικό κανάλι και το κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα, για παράδειγμα. Εντοπισμού της θέσης του HPV ολοκλήρωση δεν είναι επί του παρόντος αξιολογείται σε κλινική πρακτική. Οι νέες τεχνολογίες, όπως η Next Generation Sequencing [19], ωστόσο, θα πρέπει να διευκολύνουν αυτήν την αποφασιστικότητα και να παρέχουν τη βέλτιστη μοριακό χαρακτηρισμό των όγκων να διαμορφώσετε το χειρισμό ασθενών. Επιπλέον, η ευαισθησία της ανίχνευσης του ctDNA μπορεί να αυξηθεί εύκολα, απλώς με ανάλυση μεγαλύτερη ποσότητα ορού ή /και αυξάνοντας την αποτελεσματικότητα της δοκιμασίας PCR, για παράδειγμα χρησιμοποιώντας την ψηφιακή PCR [20] .Οι πρόοδοι θα διευκολυνθεί η αξιολόγηση της χρήσης ctDNA στην κλινική ογκολογία και θα βελτιώσει τη βιολογική παρακολούθηση των ασθενών που έλαβαν θεραπεία με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

πίνακα S1.

Εναρκτήρες αλληλουχίες και αντιδραστήρια για την ανίχνευση του CT-DNA.

doi: 10.1371 /journal.pone.0043393.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον κ F Radvanyi για γόνιμες συζητήσεις και η κα A. Le Cunff και Z. Maciorowski για τη βοήθειά τους στην προετοιμασία του χειρογράφου.